separacion de fosfolipidos por cromatografia de capa fina
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Este documento describe dos técnicas para analizar lípidos en la yema de huevo. La primera es la cromatografía en capa fina para separar fosfolípidos, mostrando sus ventajas sobre la cromatografía en papel. La segunda es el método de Lieberman-Burchard para determinar la concentración de colesterol, basado en la reacción del colesterol con anhídrido acético y ácido sulfúrico para formar un complejo de color verde cuantificable. Se aplicaron ambos métodos para
separacion de fosfolipidos por cromatografia de capa fina
- 1. INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Separación de fosfolípidos por cromatografía de capa fina. Determinación de colesterol en la yema de huevo. Laboratorio de Bioquímica
- 2. OBJETIVOS: ▪ Aplicar la técnica de cromatografía en la capa fina para la separación de fosfolípidos de yema de huevo. ▪ Discutir las ventajas de la técnica de separación respecto a la cromatografía en papel. ▪ Determinar la concentración de colesterol en la yema de huevo, por el método de Lieberman- Burchard.
- 3. INTRODUCCIÓN: Los lípidos son biomoléculas de alto peso molecular, conformadas por C,H y deficientes en O. Se clasifican en simples y compuestos. Los fósfolipidos son lípidos complejos antipáticos que contienen grupos fosfato en su estructura, se encuentra en yema de huevo como fosfatidilcolina. Entre los lípidos simples, que son derivados del isopreno, se encuentra el colesterol. La cromatografia en capa fina determina el grado de pureza, da seguimiento a alguna reacción y compara muestras que determinen distinción química entre varios reactivos a través de una placa cubierta por el adsorbente.
- 4. SEPARACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA. 15 ml Cloroformo-metanol (2:1) MEZCL AR AGITA R 20 min Mezclar filtrado con 5ml de KCl O.1ml Repos o Acuos a Orgáni ca
- 5. Molibdat o Bismut o Yod o Ninhidrin a 1c m Fosfolípido s con colina Fosfolípidos con dobles enlaces Fosfolípidos con grupos amino Prueba general de fosfolípidos
- 6. Determinación de colesterol en la yema de huevo Serie de 7 tubos (B,1,2,3,4,5,6,P b). Estándar de colesterol (ml) *B, Pb* Cloroformo (ml) *5* Extracto de lípidos (ul) solo al Pb Anhídrido acético (ml) 0.40 Acido sulfúrico conc. (ul) 50.
- 7. Fundamento de la reacción de Lieberman-Burchard. En solución clorofórmica, el colesterol reacciona con anhídrido acético y acido sulfúrico para dar un complejo de color verde que resulta de la mezcla de dos compuestos: uno azul y uno amarillo y se cuantifican a 640 nm.
- 8. El colesterol reacciona con anhídrido acético y ácido sulfúrico concentrado. Se produce una pérdida de agua y una protonización del colesterol. Se constituyen en medio anhidro polímeros de hidrocarburos no saturados de intenso color verde azulado.
- 9. CURVA TIPO Absorbancia Conc. de colesterol µg / ml
- 10. 1ml 80Μg/ml 0.25 ml 20Μg/ml 0.50 ml 40 Μg/ml 0.75 ml 60 Μg/ml 1.0 ml 80 Μg/ml 1.25 ml 100 Μg/ml CALCULO DE CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL Μg/ml
- 11. OBTENCIÓN DE COLESTEROL EN LA MUESTRA FILTRADO DE YEMA CONVERTIDO A Μg Muestra prueba 5 ΜL – 60 Μg colesterol 5.5 ml * 1000 Μl = 5500 Μl Filtrado obtenido de cada equipo – 66,000 Μg 66,000 Μg / 1000 mg = 66 mg 66mg * 2 = 132 mg de colesterol