Unidad2_PrincipiosDelCultivoDeMicroorganismos_Parte1_2023.pdf
- 2. Microbiología Industrial y Ambiental C. Paz Torres Praderio| Profesora [email protected]
- 3. UNIDAD 2: PRINCIPIOS DEL CULTIVO DE MICROORGANISMOS 2.1 Medios de cultivo. Requerimientos nutricionales. Medios de cultivo complejos y definidos. 2.2 Influencia de los factores ambientales. Temperatura. pH. actividad de agua. Nutrientes. Oxigeno Potencial redox. 2.3 Diseño de medios de cultivo. Crecimiento microbiano. Cuantificación del crecimiento. Cinética de cultivo por lotes. Rendimiento de un nutriente en células. Rendimiento de oxígeno. 2.4 Cinética de formación de productos. Rendimiento. Productividades. Clasificación cinética de fermentaciones por lotes.
- 4. Conservación de los microorganismos • Consiste en la conservación de los microorganismos y sus características por periodos largos. • Se busca reducir su actividad metabólica • Depende de varios factores que tipo de conservación seleccionar. • Susceptibilidad del microorganismo (al proceso de conservación). • Factibilidad con la que puedan ocurrir cambios genéticos en la cepa. • N ° de muestras por conservar. • Costo del proceso de conservación. • T° que se desea conservar el microorganismo. • Tipo de equipo disponible. • Probabilidad de contaminación que exista en el medio.
- 5. Conservación de los microorganismos • Se busca que las células sufran el mínimo daño y se conserven por el mayor tiempo posible. • Garantizar viabilidad, pureza y estabilidad genética de cultivos. • Debe garantizar el 70% de supervivencia de las células por un periodo considerable de tiempo. • 4 técnicas: Resiembra, desecación, congelación y liofilización.
- 6. Conservación de los microorganismos Resiembra • Consiste en sembrar al microorganismo en cierto medio de cultivo y luego mantenerlo en refrigeración. • Permite la supervivencia por tiempos cortos • Expuesto a un elevado riesgo de contaminación y variabilidad de las características de la cepa. Desecación • Técnica a mediano plazo. Viabilidad de los cultivos 2-5 años. • Eliminar la cantidad de agua disponible, lo que detiene el crecimiento celular. Se seca con aire al vacío.
- 7. Conservación de los microorganismos Congelación • Es el más utilizado poque logra periodos más largos de conservación (10 años o más). • -70ºC a -196ºC • Minimizan el riesgo de cambio genético • Equipos más caros. • Corte de luz puede ocasionar perdida de material. • Crioprotectores: como el glicerol ayudan a proteger a los MO’s durante la congelación. • La congelación debe ser rápida para evitar que se rompan las membranas celulares. Se busca evitar que se formen cristales del líquido de las células.
- 8. Conservación de los microorganismos Liofilización • Mantener largos periodos de tiempo con buena estabilidad genética. • Muy utilizado para preservar bacterias tanto como en la investigación, como en la industria. • Se retira el agua de un producto congelado por sublimación bajo presión reducida. • Primero, se pre congela la muestra para mantener su estructura inicial solida congelada. • Luego, viene el secado primario donde se remueve entre el 90% al 9% de agua. • Finalmente, el restante del agua es retirado por un secado secundario. • Para devolverlos a su estado inicial deben se re hidratados y colocados en un medio de cultivo adecuado.
- 9. Conservación de los microorganismos Importancia de la conservación. Las colecciones de cultivos juegan un papel vital en la conservación y el uso sostenible de los recursos microbianos. También proporcionan el material biológico auténtico para la investigación y la enseñanza de alta calidad en forma de cepas de referencia, reactivos para el control de calidad, etc. la necesidad de preservarlos para hacerlos accesibles a otros investigadores para la investigación, la docencia y la explotación biotecnológica.
- 10. Aislamiento de Microorganismos: Cultivos puros y mixtos Cultivos Puros y Mixtos. • En algunos procesos industriales es crucial que se encuentre solo un tipo de microorganismos, mientras que en otros es necesario un consorcio microbiano. • Por ejemplo, para los tratamientos de aguas residuales se utilizan diferentes tipos de microorganismos para degradar la carga orgánica presente en estas. • Para la producción de cerveza a partir de Saccharomyces cerevisiae se requiere solo de esta especie. • Las características de cada proceso definen que tipo de cultivo utilizar.
- 11. Cultivo puro • Población de microorganismos de un mismo tipo y provienen de la misma célula • El estudio cientifico es más fácil. • Es más fácil detectar contaminación • En fermentaciones industriales el control del balance óptimo es más sencillo. Cultivo Mixto • Población de varios tipos de microorganismos. • El rendimiento del producto puede ser mayor. • La tasa de crecimiento puede ser mayor. • Sustratos más baratos y menos puros • La prepraración del inóculo toma más tiempo Aislamiento de Microorganismos: Cultivos puros y mixtos
- 12. Cultivo puro • Siempre se debe realizar en un ambiente estéril como por ejemplo cerca de la llama de un mechero de bunsen o en una campana de flujo laminar. • Además, todos los materiales de laboratorio necesarios para llevar a cabo el cultivo deben haber sido esterilizados en un autoclave. • Si se desea realizar el cultivo en un medio de cultivo líquido se usan matraces o tubos de ensayo. • Si es en un medio sólido se utilizan placas Petri o tubos de ensayo.
- 13. Cultivo puro Técnicas para obtener cultivos puros Aislamiento por agotamiento o en estría Siembra en placa inver4da Diluciones en serie
- 14. Cultivo puro Técnicas para obtener cultivos puros: Aislamiento por agotamiento o en estría • El inóculo original se diluye al extenderlo en la superficie de la placa de agar. Se dispersan los MO’s. • Se arrastran los MO’s con un asa de siembra obteniendo cada vez un número más pequeño de individuos. • La primera sección es la que tiene una mayor cantidad de MO’s, luego de esta sección se arrastra una pequeña parte y se forma la segunda sección que tendrá un menor número de MO’s y así hasta formar 3 o 4 secciones en total. • El objetivo es obtener a partir de un elevado número de MO’s, un número reducido distribuidos individualmente en la placa con el fin de conseguir colonias aisladas a partir de un inoculo.
- 15. Cultivo puro Técnicas para obtener cultivos puros: Siembra en placa vertida • Se pipetea un volumen conocido (0,1- 1 mL) de inóculo. • Se añade medio de agar fundido, es decir, por encima de la temperatura de solidificación. • Se mezcla con cuidado moviendo la placa. • Se lleva a una incubadora con la temperatura necesaria para el crecimiento • Se observarán colonias tanto en la profundidad como en la superficie • .
- 16. Cultivo puro Técnicas para obtener cultivos puros: Diluciones en serie • Se basa en la dilución de la muestra o inóculo en tubos. El medio se mantiene líquido para permitir que la muestra se distribuya adecuadamente en el medio. • Se busca bajar la concentración de una muestra para después sembrarla y enumerar los microorganismos.
- 17. Tipos de medios de cultivo • Para estudiar algún tipo o tipos de microorganismos(consorcios microbianos) es necesario cultivarlos en condiciones controladas de laboratorio. • Los medios de cultivo poseen los nutrientes necesarios para un crecimiento óptimo de los microorganismos. • Los componentes básicos de un medio de cultivo contemplan: una fuente de carbono(glucosa, fructosa, sacarosa), una fuente de nitrógeno(Amonio, extracto de levadura), soluciones tampones o buffer(mantener pH), micronutrientes o elementos trazas(Magnesio, Fierro entre otros.). • Los medios de cultivo pueden ser clasificados según: formas físicas(consistencia), uso, naturaleza, entre otros.
- 18. Tipos de medios de cultivo Forma física o consistencia: Líquidos, Sólidos, Semisólidos. • Sólidos: Contienen una proporción de agar(agente solidificante) y suelen ser depositados en placas Petri o tubos de ensayo. • Líquidos: Se les suele denominar “caldos”. No contienen ningún agente solidificante. Los MO’s crecen por todo el medio. • Semisólidos: Contienen una proporción menor de agente solidificante que los sólidos.
- 19. Tipos de medios de cultivo Uso: Medios simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales • Medios simples: requisitos nutricionales para permitir el desarrollo bacteriano general. Ejemplos: Agar nutritivo o caldo nutritivo • Medios enriquecidos: Son simples, pero se les añaden algunos compuestos como sangre, suero, vitaminas, glucosa ente otros para aportar mayores factores de crecimiento o sustancias que neutralicen agentes inhibidores. Este medio se utiliza para el cultivo de microorganismos nutricionalmente exigentes, muchos de los cuales son patógenos,
- 20. Tipos de medios de cultivo Uso: Medios simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales • Medios selectivos: contiene compuestos que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos, pero no de otros. Por ejemplo, existen medios selectivos para el aislamiento de determinados patógenos, como cepas de Salmonella o Escherichia coli • Medios diferenciales: Se añade un indicador, normalmente un colorante, que mediante un cambio de color nos señala que durante el crecimiento se ha producido una reacción metabólica determinada. Los medios diferenciales son útiles para distinguir las bacterias, y se usan mucho en los diagnósticos clínicos y en microbiología sistemática. Xilosa-Lisina-Desoxilato Manitol sal
- 21. Tipos de medios de cultivo Naturaleza: Sintéticos o químicamente definidos y Complejos o Naturales Los medios químicamente definidos se preparan añadiendo cantidades precisas de productos orgánicos o inorgánicos puros a agua destilada. Por tanto, en un medio definido se conoce la composición exacta (tanto en sentido cualitativo como cuantitativo). Los medios complejos están hechos con hidrolizados de productos microbianos, animales o vegetales, como caseína (proteína láctea), carne (extracto de carne), soja (caldo tríptico de soja), células de levadura (extracto de levadura), o algún otro de una larga serie de sustancias altamente nutritivas
- 22. Tipos de medios de cultivo
- 23. Tipos de medios de cultivo: ¿Cómo se preparan los medios de cultivo? Compuestos Concentración (g/L) Glucosa 50 Extracto de levadura 6 CaCl2 * 2 H2O 0,3 (NH4)2SO4 4 MgSO4 * 7 H2O 1 KH2PO4 1,5 Ejemplo: Medio de cultivo para Saccharomyces cerevisiae para trabajos de laboratorio Supongamos que queremos 300 mL de medio de cultivo
- 24. Tipos de medios de cultivo: ¿Cómo se preparan los medios de cultivo? Supongamos que queremos 300 mL de medio de cultivo 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 ⇒ 50𝑔 1𝐿 = 𝑥 𝑔 0,3 𝐿 = 15 𝑔 𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎 ⇒ 6 𝑔 1𝐿 = 𝑥 𝑔 0,3 𝐿 = 1,8 𝑔 Y así sucesivamente con cada reactivo…
- 25. Tipos de medios de cultivo: ¿Cómo se preparan los medios de cultivo? Si hay compuestos que se deben preparar por separado para evitar la precipitación del medio, se debe dividir el volumen total de agua a usar entre los compuestos. E S T E R I L I Z A R
- 26. Tipos de medios de cultivo Entonces, un medio de cultivo es un conjunto de componentes o nutrientes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Composición general Macronutrientes Micronutrientes o elementos trazas Factores de crecimiento
- 27. Medios de cultivo: Macronutrientes La fuente de carbono constituye la principal fuente de carbono de los MO’s La fuente de nitrógeno es la segunda más abundante.
- 28. Medios de cultivo: Macronutrientes Fuente: Seminarios de Microbiología, Doménech
- 29. Medios de cultivo: Micronutrientes o elementos traza
- 30. Medios de cultivo: Factores de crecimiento Ácidos grasos y aminoácidos.
- 32. Tipos de metabolismo Fuente de energía Fuente de electrones Fuente de Carbono Tipo de nutrición Luz Photo- Orgánico -organo- Orgánica -heterotroph Fotoorganoheterótrofo Dióxido de carbono -autotroph - Inorgánico -litho- Orgánica -heterotroph - Dióxido de carbono -autotroph Fotolitoautótrofo Compuestos químicos Chemo- Orgánico -organo- Orgánica -heterotroph Quimioorganoheterótrofo Dióxido de carbono -autotroph - Inorgánico -litho- Orgánica -heterotroph Quimiolitoheterótrofo Dióxido de carbono -autotroph Quimiolitoautótrofo
- 34. Influencia de los factores ambientales: Temperatura, pH, actividad de agua, Oxígeno Potencial redox. Además de los nutrientes empleados en los medios de cultivo para favorecer la proliferación de microorganismos, existen otros factores importantes para su crecimiento. •Temperatura. •pH •Tensión de CO2. •Potencial oxidoreducción. •Disponibilidad de agua. •Presión osmótica •Oxigenación. •Otros Factores externos que deben ser controlados para optimizar la velocidad de crecimiento.
- 35. Influencia de los factores ambientales: Temperatura • Los microorganismos tienen un margen de temperatura en la cual pueden crecer. • Sobre la temperatura máxima de crecimiento pueden llegar a no crecer e inclusive morir. • Bajo la temperatura mínima no pueden crecer (generalmente no mueren) • Existe una temperatura óptima a la cual crecen mejor. • La temperatura óptima dependerá de cada microorganismo Fuente: Brock, Madigan et al., 2015
- 36. Influencia de los factores ambientales: Temperatura Fuente: Brock, Madigan et al., 2015
- 37. Influencia de los factores ambientales: pH La acidez o la alcalinidad de una solución se expresa mediante el valor de su pH en una escala logarítmica en la que la neutralidad corresponde al pH 7 Fuente: Brock, Madigan et al., 2015
- 38. Influencia de los factores ambientales: pH Fuente: Brock, Madigan et al., 2015 Los organismos que crecen de manera óptima a un valor de pH en el intervalo neutro (pH de 5,5 a 7,9 se llaman neutrófilos. Por otra parte, los que crecen mejor a pH por debajo de 5,5 se llaman acidófilos. Los microorganismos con crecimiento óptimo a pH de 8 o más se llaman alcalófilos.
- 39. Influencia de los factores ambientales: pH ¿Cómo controlamos el pH en los medios de cultivo? El pH óptimo para el crecimiento de un organismo se refiere únicamente al ambiente extracelular; el pH intracelular debe permanecer cerca de la neutralidad para impedir la destrucción de las macromoléculas. Para impedir grandes variaciones de pH durante el crecimiento microbiano en cultivos discontinuos se suelen añadir soluciones amortiguadoras (tampones) a los medios de cultivo junto con los nutrientes necesarios.
- 40. Influencia de los factores ambientales: pH ¿Cómo controlamos el pH en los medios de cultivo? Ejemplos solución tampón: Para pH casi neutros se usa normalmente el fosfato de potasio (KH2PO4) o el bicarbonato de sodio (NaHCO3) Una solución tampón se forma al combinar un ácido débil con su base conjugada, o una base débil con su ácido conjugado. Estas soluciones son utilizadas para mantener constante el pH de otra solución con la que se mezclan, proporcionando estabilidad en su nivel de acidez o alcalinidad.
- 41. Influencia de los factores ambientales: Actividad de agua La disponibilidad de agua es un factor importante para el crecimiento de los microorganismos, y no solo depende de la humedad del ambiente, sino que también es función de la concentración de solutos (sales, azúcares u otras sustancias) disueltas en el agua presente. La disponibilidad de agua se expresa en términos de actividad de agua o actividad acuosa (aw), que es la relación entre la presión de vapor de aire en equilibrio con una sustancia o una solución y la presión de vapor del agua pura. Los valores de aw varían de 0 a 1. Mientras más cercano es el valor a 0, significa que esta menos disponible para los microorganismos. Fuente: Brock, Madigan et al., 2015
- 42. Influencia de los factores ambientales: Actividad de agua • El citoplasma de una célula tiene, normalmente, mayor concentración de solutos que el ambiente, de manera que la tendencia es que el agua se difunda hacia el interior. En estas condiciones se dice que la célula tiene un balance de agua positivo, que es su estado normal. • No obstante, cuando una célula se encuentra en un medio en el que la concentración de solutos supera la del citoplasma, el agua saldrá hacia el medio. Si la célula no tiene una estrategia para evitarlo, se deshidratará y será́ incapaz de crecer. OSMOSIS Bajar el gradiente de concentración
- 43. Influencia de los factores ambientales: Actividad de agua • Cuando un organismo se transfiere de un medio con aw alto a otro con aw bajo, mantiene el balance positivo aumentando su concentración interna de soluto. Esto es posible bombeando solutos hacia la célula desde el ambiente o sintetizando un soluto citoplasmático • En cualquier caso, el soluto no debe inhibir los procesos celulares de manera significativa. Estos compuestos se llaman solutos compatibles, y son normalmente moléculas orgánicas muy solubles en agua como azúcares, alcoholes o derivados de aminoácidos. • La concentración de un soluto compatible en una célula es función de la concentración del soluto en el ambiente, y se realizan ajustes en respuesta al reto que suponen estas concentraciones externas. No obstante, para cada organismo, la cantidad máxima de soluto compatible es una característica codificada genéticamente OSMOSIS
- 44. Influencia de los factores ambientales: Actividad de agua Por lo tanto, los efectos osmóticos son importantes especialmente en medios de altas concentraciones de sal. • Halófilos: necesitan al menos un poco de sal. • Halotolerantes: pueden tolerar cierta concentración de solutos disueltos, pero crecen mejor en ausencia de solutos añadidos. • Halófilos extremos: Requieren concentraciones muy altas de NaCl para crecer óptimamente(15% – 30%) • Osmofilos (alta concentración de azúcar) • Xerófilos(ambientes secos)
- 45. Influencia de los factores ambientales: Oxigeno “Potencial Redox” Para muchos microorganismos, el oxígeno (O2) es un nutriente esencial; sin él no pueden llevar a cabo el metabolismo ni crecer. Otros organismos, por el contrario, no pueden crecer, e incluso pueden morir, en presencia de O2.
- 46. Influencia de los factores ambientales: Oxigeno “Potencial Redox” • Las bacterias varían mucho en su capacidad para emplear el oxígeno (O2). En situaciones donde hay oxígeno, este desempeña un papel importante al aceptar los electrones finales en la cadena de transporte de electrones que está en la membrana exterior de los microorganismos simples. • Las bacterias aprovechan este procedimiento para crear ATP, que es la fuente principal de energía para la mayoría de los procedimientos dentro de la célula. • Sin embargo, en ausencia de oxígeno (O2), ciertas bacterias tienen la habilidad de usar vías metabólicas diferentes. Estas incluyen la respiración anaeróbica y/o la fermentación. Durante la respiración anaeróbica, se emplean otras moléculas alternativas para recibir los electrones finales en la cadena de transporte de electrones. Estas moléculas pueden ser el nitrato (NO3), el sulfato (SO4) y el carbonato (CO3).
- 47. Influencia de los factores ambientales: Oxigeno “Potencial Redox” Al final de la cadena de transporte de electrones, los electrones se transfieren a una molécula de oxígeno, la cual se rompe a la mitad y recolecta H+ para formar agua. Los electrones se mueven desde un donador a un receptor. Reacciones de oxido-reducción