République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Djilali Bounaama de Khemis Miliana

Faculté des sciences de la nature et de la vie et des sciences de la terre

Département des sciences biologique

Mémoire de fin d’étude

En vie de l’obtention d’un diplôme de Master en

Analyses Biologiques et Biochimiques

Thème

Evaluation de la capacité des souches de Staphylococcus spp à former des

biofilms dans l’industrie laitière

Soutenu le 19/06/2017 Présentée par

Bentiba Khadidja

Bentiba Lamya

Devant le jury

Mr Badache. H Président MCB UDB Khemis Miliana

Mr Amrouche. Z Examinateur MAA UDB Khemis Miliana

Mr Ait ouazzou. A Examinateur MCA UDB Khemis Miliana

Mme Didouh. N Promotrice MCB UDB Khemis Miliana

Année universitaire : 2016 /2017

 Remerciements

Avant toute chose, nous remercions(Dieu), le tout puissant, pour la

santé, la patience et le courage qu’il nous à donner, pour la réalisation

de ce modeste travail.

Tout d’abord, Nous remerciements les plus vifs s’adressent à Mme

Didouh N. pour son encadrement.

Nous remercions Mr Badache maitre de conférence classe B d’avoir

accepté de présider le jury de ce travail.

Nous remercions également très sincèrement Mr Amrouche maitre

assistant classe A d’avoir accepté de présider le jury de ce travail.

Nous remercions Mr Ait ouazzou. maitre de conférence classe A

d’avoir accepté d’examiner ce modeste travail.

Nous remercions également Mme Nadjiba, Aicha et Mme Affafe

techniciennes aux laboratoires de microbiologie pour la réalisation de

travail.

Nous remercions également l’ensemble des personnelle du laboratoire

d’analyses médicales de Dr Zibouche en particulier Asma et Yassine

pour leur disponibilité et leur aide dans la réalisation de différentes

manipulation au service de microbiologie.

Nous remercions toutes personnes ayant participé de prés ou de loin

d’avoir à la réalisation de ce modeste travail.

Nous remercions énormément tous nos collègues de la spécialité

analyses biologiques et biochimiques

Khadidja et lamya
 Dédicace

Je remercie tout d'abord Dieu de m’avoir accordé des

connaissances de la science et de m’avoir aidé à réaliser ce

travail.

Avant tous, je dédie ce travail :

A tous ceux qui me sont proches et chers, mes parents, qu’ils
trouvent ici gratitude pour leur soutien, leur confiance en
moi, leur encouragements.

A mes sœurs : Fatima, Djamila, Aicha, Nacera et Amina.

A mes frères : Moustapha et Mohamed que dieu les émisses.

A tous ma famille : Oncles, Tantes, Cousins et cousines.

A tous mes filles étrangères de l’université de Khemis

Miliana.

A tout mes amis surtouts : Hanane, Kheira, Nawel et

Zahra

Mon cher binôme : Lamya

Sans oublier mes collègues les étudiants de 2éme Année

Master Analyses Biologiques et Biochimiques.

Promotion 2016-2017

Khadidja
 Dédicace

Je remercie tout d'abord Dieu de m’avoir accordé des

connaissances de la science et de m’avoir aidé à réaliser ce

travail.

A la bougie de ma vie, la fleur de mes jours, A ma chère

maman qui n’a jamais cessé de ménager ses efforts pour que

j’atteigne ce niveau. Ses sacrifices et privations ne l’ont pas

empêché d’accomplir son devoir de mère soucieuse de

l’’avenir de ses enfants.

A mon père qui a sacrifie sa vie pour notre instruction.

A mes chers frères : Mohammed, Ahmad et Abd el-wahab.

A mes chères sœurs :Fatima, Amina, Khalida , Hizia et

Affaf pour leurs disponibilités, leurs encouragements.

A mes oncles et mes tantes , Cousins et cousines.

A tout mes amis :hanane ,samira , khadidja, Zahra, fatima

,Wahiba et Hajdira

A toute ma grande famille : BENTAIBA

Mon cher binôme et mon cousines : Khadîdja.

A tous mes camarades de promotion de master II d’analyses

biologiques et biochimiques.

lamya
 Sommaire

Liste d’abréviations
Liste des figures
Liste des tableaux

Introduction 01

Partie I : Synthèse bibliographique 03

I : Biofilm du Staphylococcus 03

II-Définition 03

III- La formation de biofilm par Staphylococcus spp dans l'industrie 04

alimentaire

IV- Les compositions de biofilms 05

V- Les étapes de formation des biofilms. 06

V.1. Film de conditionnement 06

V.2. L’adhérence réversible 06

V.3. L’adhérence irréversible 07

V.4. Le développement précoce du biofilm 07

V.5. La maturation du biofilm 07

V.6. Le détachement de bactéries 07

VI. Facteurs favorisant la formation d’un biofilm 09

VI-1. Caractéristiques de la surface 09

VI-2. Caractéristiques du milieu 10

 VI-3. Propriétés des cellules 11

VII- Les effets bénéfiques et néfastes de biofilms 12

VII- Problèmes liés aux biofilms dans les industries laitières 13

IX- Prévention et élimination des biofilms 15

Partie II : Partie Expérimentale

I. Matériels et Méthodes
I. Lieu d’étude 17

II.L’origine des souches 17

III. Matériel 17

IIII. Revification et vérification de la pureté des souches 18

V. Evaluation de la formation de biofilm in vitro 18

V.1 .La méthode du Rouge Congo Agar 18

V.2. La méthode en tube (TM) 19

V.3.La technique MATH (Microbial Adhesion To Hydrocarbon 19

V.4. Evaluation de la capacité des souches à formé le biofilm 20

V.4.1. Nettoyage des lames d’acier inoxydable 21

V.4.2.Essai d’obtention d’un biofilm expérimental 22

II : Résultats et Discussions
I.- Caractères phénotypiques des Staphylococcus spp isolés 23

II- Evaluation de la formation de biofilm 23

II-1- Technique Rouge Congo Agar 24

II-2- Technique TM 26

II.3- Technique MATH 29

 II.4- .Evaluation de formation de biofilm sur l’acier inoxydable 31

Conclusion 34

Références bibliographiques

Annexe
 Liste des figures et des tableaux

Figure n°01: Composition du biofilm 05

Figure n°02 : Schéma présentant les étapes du développement du biofilm 08

Figure n°03 : Représentation schématique du test de MATH permettant la mesure 20

d’affinité des Staphylococcus spp à l’’héxadécane.

Figure n°04 : aspect macroscopique des colonies de Staphylococcus sur Gélose 23

Chapman

Figure n°05: Production de Slime chez les souches Staphylococcus spp isolées sur milieu 24
Rouge Congo Agar

Figure n°06: Répartition des souches Staphylocoques spp isolées d’industrie laitière en 25
fonction de production de Slime bactérien

Figure n°07 : Evaluation de la production de biofilm par la méthode TM 27

Figure n°08 : Répartition des souches Staphylocoques spp isolées d’industrie laitière en 27
fonction de la production de biofilm

Figure n°09 : Pourcentage d’affinité des souches Staphylococcus spp al’héxadecane 29

Figure n°10 :L’adhésion des souches Staphylococcus spp sur l’acier inoxydable 31

Tableau n°01 : La comparaison des résultats de la technique RCA et la méthode TM 28

. Résumé :
La formation de biofilm pose des problèmes dans beaucoup de branches de
l'industrie alimentaire. En industrie laitière, les biofilms de Staphylococcus se forment
habituellement sur les surfaces qui sont en contact avec des fluides, et peuvent être une source
de contamination bactérienne et la transmission de maladies.
Dans ce travail, on a évalué la capacité de 19 souches de Staphylococcus spp isolées
d’industrie laitière à former un biofilm par différents méthodes : méthode RCA, méthode
TM, méthode MATH et la capacité de formation d’un biofilm sur l’acier inoxydable.
La production de Slime sur milieu rouge Congo a révélé que 04 souches sont
productrices de Slime (21.05%), 08 souches sont intermédiaire (42.10%) et 07 souches non
productrice du Slime (36.84%).Selon la technique TM, 5 souches ont été fortement
formatrices du biofilm (26,31%), 09 souches étaient modérément (47,36%) et 05 souches ont
été non formatrices du biofilm (26,31%).
Pour la technique MATH, 09 souches sont hydrophobes, 08 moyennement
hydrophobes et 02 souches sont hydrophiles. L’étude de la formation de biofilm sur l’acier
inoxydable montre que le nombre maximum des cellules adhérentes a été de l'ordre de
5,80x106 UFC/cm2 et un nombre minimum de 1,2x105 UFC/cm2.
La comparaison des résultats de la technique RCA, la technique TM, MATH et la
technique d’adhésion sur acier inoxydable permet d’observer qu’il y a une relation entre la
production de slime, l’hydrophobicité et la formation de biofilm soit sur le verre ou sur l’acier
inoxydable.
Mots clés : Staphylococcus spp, biofilm, hydrophobicité, Slime.

Abstract:
The formation of biofilm is problimatic in many branches of the food industry. In the dairy
industry, biofilms of Staphylococcus are usually formed on the surfaces which are in contact with
fluids, and can be a source of bacterial contamination and the transmission of diseases.
In this work, we assessed the ability of 19 strains of Staphylococcus spp isolated from dairy
industry to form a biofilm by different methods: RCA method, method TM, MATH method and the
ability to form biofilm on the Stainless Steel surface.
The production of slime on medium Congo Red Agar revealed that 04 strains are producing
Slime (21.05%), 08 strains are intermediate (42.10%) and 07 strains, non producer of the Slime
(36.84%).According to the method TM, 5 strains have been strongly the biofilm-forming (26,31%), 09
strains were moderately (47,36%) and 05 strains were not biofilm-forming (26,31%).
For the technical MATH, 09 strains are hydrophobic, 08 moderately hydrophobic and 02 strains
are hydrophilic. The study of ability to form biofilm on the stainless steel surface shows that the
maximum number of adherent cells was of the order of 5,80x106 CFU/cm2 and a minimum number of
1.2x105 CFU/cm2
The comparison of the results of the technique, RCA, the TM, MATH and the ability to form
biofilm on stainless steel allows to observe that there is a relationship between the production of slime,
hydrophobicity, and biofilm formation either on the glass or on the stainless steel.

Key words: Staphylococcus spp, biofilm, hydrophobicity, slime.

 ‫الملخص‬
‫يسبب تشكيل بيوفيلم مشاكل في العديد من فروع الصناعات الغذائية‪ .‬في صناعة األلبان‪ ،‬بيوفيلم المكورات العنقودية عادة‬
‫ما تكون شكلت على السطوح التي تتالمس مع السوائل‪ ،‬ويمكن أن تكون مصدرا للتلوث البكتيري وانتقال األمراض‪.‬‬
‫في ھذا العمل‪ ،‬قمنا بتقييم قدرة ‪ 19‬سالالت المكورات العنقودية المعزولة من مصانع األلبان على تشكيل البيوفيلم بطرق‬
‫مختلفة‪ :‬طريقة ‪ ،RCA‬طريقة‪ ، TM‬طريقة ‪ MATH‬والتصاق على الفوالذ المقاوم للصدأ‪.‬‬
‫كشفت إنتاج ‪ Slime‬في وسط ‪ rouge Congo‬أن ‪ 04‬سالالت منتجة ‪ 08 ،(٪21.05) Slime‬سالالت كانت متوسطة‬
‫)‪ (٪42.10‬و‪ 07‬سالالت غير منتجة )‪ .(٪36.84‬وفقا لتقنية ‪ ،TM‬كانت ‪ 5‬سالالت مكونة للبيوفيلم للغاية )‪،(٪26.31‬‬
‫‪ 09‬سالالت كانت متوسطة )‪ ،(٪47.36‬وكانت ‪ 05‬سالالت غيرقادرة على تشكيل البيوفيلم )‪ .(٪26.31‬كشفت تقنية‬
‫‪MATH‬أن ‪ 09‬سالالت نافرة من الماء‪ ،‬سالالت ‪ 08‬معتدلة و‪ 02‬محبة للماء ‪.‬‬
‫مقارنة مع نتائج تقنية ‪ ، CAR‬تقنية ‪ TM‬وتقنية االلتصاق على الفوالذ المقاوم للصدأ يمكن مالحظة أن ھناك عالقة بين‬
‫إنتاج ‪ ، Slime‬الال مائية وتشكيل البيوفيلم إما على الزجاج و إما على الفوالذ المقاوم للصدأ‪.‬‬
‫الكلمات المفتاحية‪ :‬المكورات العنقودية ‪،‬بيوفيلم‪ ،‬لال مائية‪. Slime،‬‬
Introduction
 Introduction

Introduction

Dans l'industrie alimentaire les bactéries pourraient être en mesure de fixer et à former
des biofilms sur la surface de la transformation des aliments (Langoni et al., (2008) ;( Aung
et al., 2011). et qui sont particulièrement connus par leurs effets négatifs sur la santé. Parmi
leurs impacts négatifs les plus connus, on peut citer les contaminations de produits
alimentaires, la bio détérioration des matériaux (en particulier la bio corrosion, etc). (Klinger
et al., 2005).

Parmi les microorganismes qui ont la capacité de former un biofilm sur les surfaces des
équipements, Staphylococcus spp: un pathogène alimentaire est régulièrement rencontré dans
de très nombreux environnements, en particulier ceux de la chaîne alimentaire. La capacité de
Staphylococcus spp à former des biofilms fournit un important facteur de virulence
(Costerton et al., 1994)..

La fixation des bactéries sur les surfaces est influencée par les propriétés physico-
chimiques de l'environnement (température, pH) et de la bactérie elle-même telle que
l’hydrophobicité, production des substances extracellulaires telles que le slime, la mobilité qui
permet aux bactéries de s’adhérer à des surfaces biotique et abiotiques comme l’acier
inoxydable qui est couramment utilisé en industrie laitière.( Moltz et Martin, 2005; Folsom
et Fank, 2006 ; Shi et Zhu, 2009).

Ce travail entre dans ce contexte. Il a pour principal objectif de caractériser 19 souches

de Staphylococcus spp isolées d’équipements laitières à former un biofilm. Le travail porte
sur Caractérisation des souches de Staphylococcus spp isolées d‘équipements laitiers, capacité
de formation de biofilm par l’étude des facteurs qui peuvent influencer ce processus tels que
l’hydrophobicité de la surface cellulaire (CSH), la production de Slime ainsi que l’adhésion
bactérienne à l’acier inoxydable par la formation d’un biofilm expérimental.

Le travail comporte trois grandes parties :

1. Une mise au point bibliographique traitant du biofilm, ses étapes de formation, les
problèmes causés par le biofilm en industrie agroalimentaire ainsi que des procédés de control
et d’élimination de biofilm.

1
 Introduction

2. Une partie expérimentale comprenant : La mise au point d’une collection de souches

de Staphylococcus spp isolées à partir des canalisations d’une usine laitière, et la détection de
la capacité de ces souches à formé de biofilm par 4 méthodes expérimentaux : RCA, TM,
MATH et adhésion à l’acier inoxydable.

3. Une troisième partie rend compte des résultats expérimentaux obtenus. Enfin, nous
présenterons la principale conclusion de ce travail.

2
 Partie I
Synthèse
Bibliographique
 Synthèse bibliographique

Partie I : synthèse bibliographique

I. Biofilm de Staphyloccoccus

I-Historique :

La découverte du biofilm remonte au début des années 40 depuis les travaux de Henrici
1933 et Zobell 1943.Le terme « biofilm » a été utilisé pour la première fois par Zobell en
1943.

Les biofilms sont un ensemble de micro colonies, entourées d’une matrice hautement
hydratée, anionique et constituée d’exopolysaccharides (EPS). Christensen et al. (1982) ont
été les premiers à observer la formation d’un biofilm chez une souche de S. epidermidis isolée
d’un cathéter. Ils ont noté la formation d’un film gluant, filamenteux sur des tubes de cultures,
puis ils ont visualisé cette substance extracellulaire par une coloration au bleu alcian en
microscopie électronique à balayage. Ces auteurs ont noté que la plupart des souches avaient
une production variable de cette substance qui dépendait du milieu et de la supplémentassions
en glucose. Ils ont suggéré que la formation de biofilm était un facteur critique dans la
pathogénèse de S. epidermidis. Ces faits ont été confirmés la même année par Peters et al.
(1982) qui ont montré une corrélation entre la capacité de colonisation du matériel médical
par S. epidermidis et les infections nosocomiales (Planchon, 2006).

II. Définition :

Le biofilm est une communauté structurée de micro-organismes, se fixant à une surface

inerte ou vivante et réunis au sein d’une matrice d’exo-polysaccharides (Jain et al., 2011)
adhésive et protectrice qu’ils secrètent. C’est une structure très organisée avec de nombreuses
communications intercellulaires pour assurer un équilibre et un mode de vie coopératif
(Characklis, 1989 ; Bourion, 1995 ; Bosgiraud, 2003 ; Boutaleb, 2007 ; Salaun, 2009).

Un biofilm peut être constitué d’une ou plusieurs espèces de microorganismes (Behlau

et Gilmore, 2008).

3
 Synthèse bibliographique

III- La formation de biofilm par Staphylococcus spp dans l'industrie

alimentaire :

Dans l'industrie alimentaire, il est important de connaître les conditions dans les quelles
S. aureus est capable de survivre, adhérer aux surfaces et former des biofilms (Futagawa-
Saito et al., 2006), conduisant à la contamination des produits alimentaires. En forme
planctonique, S. aureus n'apparaît pas résistant aux désinfectants, comparativement à d'autres
bactéries, mais il peut être parmi les plus résistants lorsqu'il est attaché à une surface
(Fratamico et al., 2009). S. aureus peut produire un biofilm multicouche incorporés dans un
glycocalix avec l'expression des protéines hétérogènes dans l'ensemble, formant au moins
deux types de biofilms : ica-dépendant, médiée par adhésine intercellulaires
polysaccharidique (PIA)/poly-N-acétyl-glucosamine β-1,6 (PNAG) et ica-indépendante,
médiée par des protéines (Beloin et Ghico, 2005).

Les souches de Staphylococcus sont des bactéries productrices des entérotoxines

thermorésistantes pouvant provoquer une intoxication chez l'homme.

Neuf types antigéniques majeurs de la SE ( Entéro-toxine Staphylocoocus ) ont été

désignés : SEA, SEB, SEC, SED, SEF, SEG, SEH, SEI et SEJ ( Zhange et al., 1998).Toutes
ces toxines présentent une activité super antigéniques en interagissant avec les cellules
présentatrices d’antigène et, stimulent la prolifération non spécifique des cellules T (
Balabon et al., 2000 ;Nehal et al., 2010).

La toxine se forme dans l'aliment et même si la bactérie est détruite par la cuisson,
ces toxines restent présentes dans l'aliment (Balaban et al.,2000). Les symptômes d’une
intoxication par Staphylococcus se présentent très rapidement après l'ingestion de l'aliment
contaminé, et se manifestent essentiellement par des nausées, vomissements, douleurs
abdominales et diarrhées. Le plus souvent, il n'y a pas de fièvre. La gravité et la durée de la
maladie dépendent de la quantité de toxine ingérée et de l'état de santé et de la sensibilité de
la personne. Généralement, les symptômes disparaissent d'eux-mêmes après 6 à 12 heures.
Dans la plupart des cas, la bactérie est transmise dans la nourriture via les personnes
préparant les aliments qui sont porteuses du germe, par exemple par leurs mains ou
lorsqu’elles éternuent.

4
 Synthèse bibliographique

Dans l'environnement de la transformation des aliments, il est admis que l'adhésion

microbienne est généralement précédée par l'adsorption de molécules organiques et
inorganiques formant un film de conditionnement. Ce dernier de modifier le propriétés
physico-chimiques du substrat en surface (Chmielewski et Frank, 2003; Lorite et al .,2011).

Les biofilms ont le potentiel d'agir comme une source de contamination microbienne
chronique qui peut compromettre la qualité des aliments et représentent un danger important
pour la santé (Marques et al., 2007).

IV- Les compositions des biofilms :

Les bactéries ayant la capacité de former un biofilm présentent des caractéristiques

conjointes (Tremblay, 2014).Ces cellules bactériennes sont recouvertes d’une matrice
polymérique fortement hydratée (>90% d’eau) et composée d’exo-polysaccharides, de
protéines et d’acides nucléiques Cependant, leur répartition est fonction de l’espèce
concernée. Par exemple, chez S. aureus, le polysaccharide le plus fréquemment retrouvé est
un polymère de N-acétyl-D-glucosamine (nommé PNAG ou PIA, « polysaccharide
intercellular adhesin ») . (Arciola et al ., 2015) (Voire figure n° 01).

Figure n°01: Composition du biofilm (Lister et al., 2014).

5
 Synthèse bibliographique

V- Les étapes de formation de Biofilm :

Les bactéries semblent initier la formation d’un biofilm en réponse à une pression
environnementale (Annous et al., 2009), telle que le manque d’oxygène et de nutriments ou la
présence d’un traitement (Vu et al., 2009).
Les biofilms peuvent se développer sur une grande variété de surfaces incluant les
tissus vivants, les dispositifs médicaux, ou tout autre support retrouvé dans le sol ou dans les
milieux aquatiques et/ ou sur les équipements de l’industrie agroalimentaire (Talaro, 2008).

V-1.Film de conditionnement :

En premier lieu, un film de conditionnement, est produit pendant l'immersion dans un

liquide (Belmar-Beiny et Fryer, 1992 ; Boyd et al., 2000). Le film de conditionnement peut
être constitué par des composés chimiques inorganiques ou organiques ou des composés
biologiques de l'environnement (Zottola et Sasahara, 1994). La nature du film de
conditionnement sera affectée par la nature de la surface et la source du film de
conditionnement (Pratt-Terpstra et Busscher, 1998 ; Boyd et al., 2000).

Le rôle du film primaire n’est pas clairement élucidé, il modifierait les propriétés
physicochimiques de surface influençant ainsi l’adhésion bactérienne.

V.2- L’adhérence réversible :

En milieu liquide ou exposé à l’humidité, les bactéries planctoniques s’approchent

d’une surface solide (Høiby et al. 2011) par mouvement brownien, par sédimentation ou par
mobilité active (présence de flagelles). Elles s’y attachent de manière réversible des
interactions non spécifiques, électrostatiques et électrodynamiques. Cette étape est influencée
par des conditions environnementales impliquant le pH, l’osmolarité, la température, la
concentration en oxygène et en nutriments et l’hydrodynamique de fluide (Beloin et al.,
2008).
L’adhérence des bactéries est également influencée par la nature de la surface,
notamment sa rugosité et son hydrophobicité. Les bactéries adhèrent facilement sur une
surface rugueuse, hydrophobe et non polaire (Beloin et al., 2008)

6
 Synthèse bibliographique

V.3. L’adhérence irréversible :

La fixation à la surface solide devient irréversible en raison de la production

d’exopolysaccharides par les bactéries (Høiby, 2011) et surtout grâce à des structures
d’adhérence variables selon les espèces bactériennes, par exemple les fimbriae et les curli
pour E.coli, qui interagissent avec des récepteurs spécifiques présents sur la surface (Beloin et
al., 2008).

V.4. Le développement précoce du biofilm :

Les bactéries se multiplient lentement et continuent de produire des exopolysaccharides.

Elles s’agrègent entre elles et forment des microcolonies, qui sont protégées par la matrice
exopolysaccharidique (Jacolosen et al., 2008).

V.5. La maturation du biofilm :

L’architecture complexe du biofilm se met en place avec la formation de canaux aqueux

et de pores entre les microcolonies (Folkesson et al., 2008), permettant l’acheminement
d’oxygène et de nutriments nécessaires à la croissance de micro-organismes, ainsi que
l’élimination des déchets (Tenke et al.,2006).

La production et la sécrétion d’enzymes ou de toxines provoque la dégradation des

résidus présentent dans les surfaces environnantes et permet ainsi la libération de nutriments
(Jacolosen et al., 2008).

V.6. Le détachement du biofilm :

Les bactéries se détachent du biofilm et se dispersent dans le milieu environnement

après un retour à l’état planctonique.

Traditionnellement, le détachement de bactéries est considéré comme un phénomène

passif, dépendant notamment des forces du flux du milieu dans lequel le biofilm se trouve.
Cependant, le détachement de bactéries peut aussi être une stratégie active, initiée par les

7
 Synthèse bibliographique

bactéries elles mêmes, leur permettant de coloniser de nouvelles surfaces et de survivre

lorsque l’espace et les nutriments deviennent limités.

Les bactéries peuvent se détacher seules ou par petits ou gros amas selon les
mécanismes impliqués (Kaplan, 2010). Comme pour les autres étapes, le détachement de
bactéries est un processus complexe qui implique des signaux environnementaux et une
communication entre les bactéries (Joshi et al., 2010).

Ainsi un biofilm établi constitue un réservoir de bactéries viables, capables d’aller

coloniser d’autres surfaces (Joshi et al., 2010).(Voir la figure n°02).
.

Figure n°02: Schéma présentant les étapes du développement du biofilm

(Yannick et al., 2014)

8
 Synthèse bibliographique

VI- Facteurs favorisant la formation d’un biofilm :

La formation d’un biofilm est un phénomène complexe, sous l’influence de nombreux

facteurs : caractéristiques du substrat sur lequel les bactéries vont se fixer, forces s’exerçant
dans le milieu aqueux (hydrodynamique du fluide), caractéristiques du milieu et propriétés de
la surface des cellules ( Donlan, 2002).

VI.1. Caractéristiques de la surface :

N’importe quel matériau en contact avec un fluide contenant des bactéries est un
support potentiel pour la formation d’un biofilm. La rugosité, les propriétés chimiques d’une
surface et la présence préalable de films protéiques influent sur l’attachement des bactéries à
cette surface et à la formation d’un biofilm (De Chalvet et De Rochemonteix, 2009).

VI.1.1 Rugosité de la surface :

Plus une surface est rugueuse, plus la colonisation de cette surface par des
microcolonies est importante (Characklis, 1990). Les surfaces rugueuses sont colonisées de
façon préférentielle car les forces répulsives sont moindres et la surface de fixation est
augmentée, grâce à la présence d’aspérités (Donlan, 2002).

Néanmoins, certaines souches sauvages de bactéries colonisent aussi des surfaces

lisses. Les biofilms auront ainsi tendance à se former au niveau des aspérités des matériaux,
formant des recoins propices aux proliférations bactériennes et moins sensibles aux agents
désinfectants ou antiseptiques (Donlan et Costerton, 2002).

VI.1.2. Propriétés physico-chimiques de la surface :

Les propriétés physico-chimiques de la surface peuvent exercer une influence sur le

taux d’attachement et sur son ampleur. Les micro-organismes se fixent plus facilement à des
surfaces hydrophobes et non polarisées comme le Teflon ou d’autres matières plastiques, que
sur des matériaux hydrophiles comme le verre ou les métaux (Bendinger, 2003).

9
 Synthèse bibliographique

VI.1.3. Présence de films protéiques sur la surface :

La présence de polymères sur un matériau modifie les propriétés physico-chimiques de

sa surface, et a une influence directe sur l’attachement de bactéries à cette dernière. En effet,
la présence préalable sur un biomatériau d’un film protéique comme le sang, les larmes,
l’urine, la salive, le liquide interstitiel et les sécrétions respiratoires influence l’attachement de
bactéries à sa surface, et favorise la formation de biofilms (Nobbs, 2009).

VI.2. Caractéristiques du milieu :

La formation et la dispersion d’un biofilm nécessitent des équipements enzymatiques

précis et des entités structurales particulières, dont l’activation dépend de facteurs
environnementaux clefs (O’Toole et al., 2000; Donlan, 2002 ; Martinez, 2007 ; Goller,
2008):

a.Température : est importante non seulement parce qu'elle affecte l’activité métabolique et
enzymatique des bactéries, mais aussi parce qu'elle influence certains paramètres
physicochimiques (pH, activité ionique, agitation thermique et solubilité des gaz) ainsi que les
propriétés de surface des microorganismes. La température de croissance peut avoir un effet
significatif sur la mobilité cellulaire et la production de flagelles et, ainsi sur l’adhésion
(Dumas, 2007).

b. ph : du milieu environnant modifie la charge de surface des microorganismes ainsi que

celle des supports solides suite au déplacement des équilibres d’ionisation
(protonation/déprotonation) des groupements fonctionnels exposés selon leur pKa (Hamadi et
al., 2004) ce qui peut avoir comme conséquence une réduction ou une augmentation des
interactions électrostatiques répulsives défavorables à l’adhésion (Boutaleb, 2007).

c. Concentration en oxygène.

d. Concentration en fer.

10
 Synthèse bibliographique

e. Osmolarité.

f. Sources de carbone disponibles : elles ont une influence sur la formation d’un biofilm et
sur sa maturation (Martinez, 2007).

g. Concentrations en nutriments : dans un milieu statique, la concentration en nutriments

doit être élevée pour qu’il puisse y avoir formation d’un biofilm ; ce n’est pas le cas pour un
milieu hydrodynamique (Spormann, 2008).

h. Concentrations en certains cations : l’augmentation de la concentration de plusieurs

cations (sodium Na+, Calcium Ca2+, ion ferrique Fe3+) influence l’attachement de
Pseudomonas fluorescens sur des surfaces en verre, en réduisant les forces répulsives
s’exerçant entre les bactéries chargées négativement et la surface de verre (Fletcher, 1988).

i. Hydrodynamique du fluide : selon la position du matériau dans un fluide, il sera plus ou

moins exposé à des turbulences. La zone de moindres turbulences, à l’écart des flux
laminaires, est appelée zone de fixation.

C’est précisément dans cette zone qu’il est plus facile pour les micro-organismes de
se fixer sur une surface, puisqu’ils sont moins soumis aux forces exercées par le fluide
(Donlan, 2002).

VI.3. Propriétés des cellules :

L’hydrophobicité de la surface de la cellule, la présence de fimbriae et de flagelles, et

la production d’exopolysaccharides influencent l’attachement des bactéries sur une surface.
L’hydrophobicité d’une surface est importante dans l’adhésion des micro-organismes à cette
dernière. Moins les matériaux sont polarisés, plus les liaisons hydrophobes deviennent
importantes (Donlan, 2002).

11
 Synthèse bibliographique

La plupart des bactéries sont chargées négativement et présentent à leur surface des
zones hydrophobes. Plusieurs éléments structuraux des bactéries interviennent dans leur
attachement à une surface : flagelles, fimbriae, polysaccharides. Il peut y voir des
compétitions ou des coopérations entre cellules lorsque plusieurs espèces de bactéries sont 19
concernées . Les polymères apolaires situés à la surface des cellules comme les fimbriae,
certaines protéines, et les acides mycoliques (composants de certaines bactéries Gram
positives) semblent s’attacher de façon prédominante à des surfaces hydrophobes.

Les Exoploysacchardies et les lipopolysaccharides sont plus importants dans les

mécanismes d’attachement à des surfaces hydrophiles (Donlan, 2002).

VII- Les effets bénéfiques et néfastes de biofilms :

VII.1. Les effets bénéfiques :

Les biofilms jouent un rôle positif pour notre santé. La surface de notre peau est
recouverte d’un biofilm dont la présence engendre une compétition microbienne rendant plus
difficile la colonisation par des organismes pathogènes (Percival et al., 2012).Les biofilms
gastro-intestinaux assurent également un rôle de protection et participent au processus de
digestion (Macfarlane et al., 2011). Ils jouent aussi un rôle clé dans la production et la
dégradation de la matière organique, dans les cycles d’azote, de soufre, ainsi dans la
dégradation des polluants (Marchall, 2010).

Les biofilms peuvent se révéler très utiles dans le domaine agroalimentaire. La

production d'éthanol dans des réacteurs dans lesquels des levures Saccharomyces cerevisiae
sont immobilisées sous forme de biofilm, sont utilisés également dans la production du
vinaigre (acide acétique) (Alnnasouri, 2010).

VII.2. Les effets néfastes :

Les biofilms peuvent entraîner de sévères problèmes de santé lorsqu‘ils induisent

l‘apparition d‘espèces pathogènes. Malgré les procédures de nettoyage et de désinfection, les
biofilms posent des problèmes divers en médecine : biofilm de bactéries pathogènes se
développement dans des systèmes digestifs, urinaire et respiratoire ou contamination

12
 Synthèse bibliographique

d‘implants ou de tubulures lors des opérations médicales. L‘implantation des biofilms dans les
réseaux de distribution d‘eau est également un des problèmes importants rencontrés dans le
maintien de la qualité de l'eau potable (contamination, mauvais goût) (Block et al, 1993).

Les biofilms sont responsables de la dégradation de la qualité des aliments et de

contamination dans les équipements de l‘industrie agro-alimentaire (Fournaud et al, 1978).

La formation de biofilms sur les plaques de certains d‘échangeurs de chaleur à

température base, dans l‘industrie alimentaire, peut diminuer leur capacité de transfert
thermique (Characklis et al., 1980) et entraîner l‘augmentation de pression sur les pompes à
cause de la diminution de diamètres dans ses tuyaux (Hamilton, 1987).

VIII- Problèmes liés aux biofilms dans les industries laitières :

La formation de biofilm pose des problèmes dans beaucoup de branches de l'industrie

alimentaire (Poulsen ,1999). En industrie laitière, les biofilms se forment habituellement sur
les surfaces qui sont en contact avec des fluides, et peuvent être une source de contamination
bactérienne responsable de la réduction de la durée de conservation des produits et de la
transmission de maladies (Carpentier et Cerf, 1993 ; Zottola et Sasahara, 1994 ; Dunne,
2002 ; Agarwal et al., 2006). Ils peuvent en effet servir de niche à des espèces pathogènes
comme Listeria monocytogenes (Wong, 1998) et causent alors de sévères problèmes de santé
publique (Cerf, 2002). La formation des biofilms sur les équipements d'industrie laitière peut
mener à des problèmes d'hygiène et à des pertes économiques (Bremer et al., 2006; Zhao et
Liu,2006 ;Gram et al., 2007).

Les biofilms sont plus résistants aux agents antimicrobiens comparés aux cellules
planctoniques ce qui fait de leur élimination à partir des équipements de traitement des
denrées alimentaires un défi important (Simöes et al., 2006 ; Simöes et Vieira, 2009). Des
études ont montré que les micro-organismes organisés en biofilm sur une surface sont plus
résistants aux antibiotiques et aux désinfectants, que les cellules planctoniques, cette
résistance dépend de leur activité métabolique et augmente avec l'âge du biofilm (Mattila-
Sandholm et Wirtanen, 1992 ; Lechevallier et al., 1998 ; Zottola et Sasahara ,1994 ;
Costerton et al ., 1995), l'état de la matrice d'exopolymères, la surface et les conditions de

13
 Synthèse bibliographique

croissance (Muatapha et Liewen,1989 ;Frank et Koffi,1990). Généralement, les micro-

organismes vivant dans les biofilms sont beaucoup plus résistants aux désinfectants que des
micro-organismes dans une culture planctonique. La résistance accrue est provoquée par
plusieurs facteurs. Le glycocalyx limite la diffusion et peut causer la désactivation des
désinfectants. La densité de la suspension bactérienne à l'intérieur du biofilm et l'état
physiologique de cellules affectant la production des enzymes dégradantes sont également
impliqué (Vidal et al., 1997 ; Wirthlin et al., 2005).

Les micro-organismes dans les biofilms peuvent catalyser des réactions chimiques et
biologiques (sulfate-réductases ou les bactéries productrices d'acide) causant ainsi la corrosion
des canalisations et des tanks de stockage. Ils peuvent également réduire l'efficacité de
transfert de chaleur si les biofilms deviennent suffisamment épais (Costerton et Lappin-
Scott, 1989 ; Vieira et al., 1993 ; Mittelman, 1998). Dans les biofilms, la concurrence pour
les nutriments a comme conséquence une insuffisance nutritive, a également un rôle important
dans la plus grande résistance des biofilms aux traitements antimicrobiens (Berg et al., 1982 ;
Jones et Pickup, 1989). Certaines études ont montré que les bactéries portées par les aliments
étaient plus résistantes aux divers désinfectants. Cette résistance est encore plus grande dans
des biofilms âgées (plus de 24 h) que dans des biofilms jeunes (Anwar et al., 1990 ; Frank et
Koffi, 1990 ; Lee et Frank, 1991 ; Wirtanen et Mattila-Sandholm, 1992).

Compte tenu des différents facteurs décrits précédemment, les micro-organismes

adhérents et/ou en biofilms sont très difficiles à éliminer et sont donc une source récurrente de
contamination des aliments dans le secteur agro-alimentaire et les biofilms formé sur les
canalisations ou d'autres surfaces dans l'environnement de traitement des denrées alimentaires
sont identifiées comme source potentielle pour l'intoxication alimentaire (Allion, 2004). La
résistance des biofilms aux traitements conventionnels augmente la nécessité de développer
de nouvelles stratégies de prévention (Singh et al., 2002 ; Simoes et al., 2009).

14
 Synthèse bibliographique

IX- Prévention et élimination des biofilms :

Beaucoup de travaux ont cherché à améliorer l'efficacité du nettoyage en place (NEP)

en étudiant le rôle des produits chimiques (Peng et al., 2002), de la température (Wilson,
2005), du temps de contact (Lelièvre et al., 2002), des propriétés des matériaux (Jullien et
al., 2003 ; Speranza et al., 2004; Zhao, 2004 ; Whitehead et Verran, 2006 ; Hadjiev et al.,
2007; Sheng et al., 2007). Palmer et al.(2007) ont également souligné l'importance de la
conception des installations sur la facilité du nettoyage des surfaces d'équipement.

En effet, l'hydrodynamique est un paramètre principal dans le nettoyage. Cependant,

relativement peu d'études (Lelièvre et al., 2002 ;Herrera et al., 2007) ont rendu compte de la
cinétique de détachement des bactéries adhérentes ( Faille et al., 2013).

Une stratégie pour empêcher la formation du biofilm est de désinfecter régulièrement,

avant la formation d’un nouveau biofilm (Das et al., 1998). L’implémentation d'une étape de
germination avant le NEP peut réduire le nombre de spores dans la chaîne de fabrication
(Hornstra et al ., 2007).

L’l'inhibition de la formation de biofilm peut être la meilleure manière pour les

contrôler dans les équipements de transformation alimentaire. Furukawa et al. (2009) ont
montré que les esters d'acide gras et de sucre (additifs utilisés comme émulsifiants dans les
aliments traités) sont des agents prometteurs pour l’inhibition de la formation de biofilm par
des bactéries d'intoxication alimentaire.

Les mécanismes inhibiteurs et les modalités pratiques d'utilisation de ces esters dans la
transformation alimentaire devraient être étudiés.

Les biosurfactants ont plusieurs propriétés qui pourraient être utiles dans beaucoup de
domaines de l'industrie alimentaire, leur activité antiadhésive a attiré l'attention comme
nouvel outil pour empêcher et perturber les biofilms formés dans des surfaces de contact
alimentaire (Nitschke et Costa, 2007). L’argent est utilisé pour retarder ou empêcher la
formation des biofilms (Cicalini et al., 2004 ; Gentry et Cope, 2005 ; Ashraf et al., 2014).

15
 Synthèse bibliographique

La formation de biofilm sur les appareils médicaux implantés est une cause fréquente
de rejet d’implant. Plusieurs auteurs rapportent l’inhibition de la formation de biofilm sur de
tels dispositifs in vitro en les enduisant d’argent (Klueh et al., 2000 ; Hashimoto, 2001).

Les enzymes et les bactériocines sont aussi considérés en tant qu’agents améliorant
l’efficacité de nettoyage et de désinfection, cependant, plus d'études devraient être effectuées
pour affirmer leur efficacité contre des biofilms.

Eviter la formation de biofilm par l'incorporation des produits antimicrobiens dans les
matériaux extérieurs (Weng et al., 1999 ;Park et al., 2004), ou en modifiant les propriétés
physico-chimiques de surfaces (Whitehead et al.,2004, 2005 ; Rosmaninho et al., 2007) est
également une voie de progrès.

16
 Partie II
Partie Expérimentale
 Partie expérimentale

Partie I : Matériel et méthode

I. Lieu d’étude
Ce travail a été réalisé au laboratoire de microbiologie à université Djilali Bounaama.
Durant la période allant du février au Mai 2017.
II. L’origine des souches
Les 19 souches utilisées dans notre travail issu d’une collection de souches isolées à
partir d’une canalisation post et pré pasteurisation de lait de vache de l’usine Arib –Ain Defla.

III. Matériel :
• Anse de platine
• Pipette pasteur
• Boites de pétri
• Tubes à essais
• Tubes à hémolyse
• Etuve
• Bec bunsen
• La hôte
• Vortex
• Spectrophotomètre
• Les lames d’acier inoxydable.
Milieux de culture
Milieux de culture liquides
• Bouillon cœur cervelle (BHIB).

• Bouillon nutritif (BN).

Milieux de culture solides
• Gélose Chapman.
• milieu Rouge Congo Agar.
Réactifs :
• Cristal violet.
• PBS : Phosphate buffered saline.
• TSE : Tryptone sel eau.
17
 Partie expérimentale

IIII. Revivification et vérification de la pureté des souches

La revivification des souches a été effectuée dans le bouillon nutritif. L’incubation se
fait à 37°C pendant 48h.

La vérification de la pureté des souches à été réalisé sur gélose Chapman qui est un
milieu sélectif pour les staphylocoques, sa teneur élevée en chlorure de sodium limite le
développement de certains germes autres que Staphylococcus. Les micro-organismes
fermentant le mannitol donnent des colonies jaunes. Ce caractère est un critère d’orientation
pour l’identification de Staphylococcus aureus (Leyral et Vierling ,2007).

La purification consiste à réaliser des repiquages successifs sur gélose Chapman avec
incubation à 37°C pendant 24-48h, jusqu’à l’obtention des colonies de même taille, même
forme et même couleur renseignent sur la pureté des souches.

V. Evaluation de la formation de biofilm in vitro :

V.1 .La méthode du Rouge Congo Agar :

La gélose Rouge Congo Agar est un milieu très convenable pour la détection des
souches productrices de Slime. Sur ce milieu les souches exprimant le PIA (Polysaccharide
Intercellular Adhésion) donnent des colonies noires avec une surface rugueuse contre des
colonies de couleur rouge et à surface lisse pour les souches PIA négatives (Ziebuhr et al.,
2001).
La production de Slime a été recherchée sur le milieu Rouge Congo Agar(RCA).
Selon Freeman et al. (1989), le milieu a été préparé avec 37 g/L BHIB, 50 g/L de saccharose,
10 g/L d’agar et 0,8 g/L du Rouge Congo, puis autoclavé à 121°C pendant 15 minutes (Nasr
et al., 2012). Le milieu est ensemencé avec une anse d’une suspension de notre souche. La
lecture à été faite après 24 heures à 37°C (Jain et Agarwal, 2009).

Les souches productrices de Slime donnaient des colonies noires à surface rugueuse
contre des colonies rouges à surface lisse pour les souches non productrices. Les souches de
phénotype variables donnaient des colonies à centre noir et à contour rouge ou à centre rouge
et à contour noir (Nasr et al., 2012).

18
 Partie expérimentale

V.2. La méthode en tube (TM) :

C’est une technique qui permet une évaluation qualitative de la formation du biofilm
décrite par Christensen et al. (1982).
A partir d’une boite de culture 18-24 heures, ensemencer une colonie dans 10 mL de
BHIB supplémenté de 2% de saccharose puis incube à 37°C pendant 24 h. Les tubes ont été
lavés avec du PBS (pH=7,3) puis séchés. Chaque tube a été ensuite coloré par le cristal violet
0,1%) pendant 15 minutes. L’excès de colorant a été enlevé et les tubes ont été lavés avec de
l’eau distillée, puis séchés en position renversée (Mathur et al., 2006).
La formation du biofilm est considérée comme positive quand un film visible double et
recouvre le mur et le bas du tube. La formation d’un anneau à l’interface liquide n’est pas
indicative de la formation du biofilm. La formation de biofilms est notée comme de 0 pour
absent, + pour modéré et +++ pour fort (Stepanovic et al., 2000).

V.3.La technique MATH (Microbial Adhesion To Hydrocarbon) :

Plusieurs travaux rapportent que le caractère hydrophobe de la surface des cellules
bactériennes a été déterminé par plusieurs méthodes. Des méthodes fondées sur la
précipitation des cellules par les sels (Lindahl et al., 1981), des méthodes utilisant la
Chromatographie d'interaction hydrophobe (Smyth et al.,1978 ; Doyle et al., 1984) et des
méthodes mettant en évidence l'adhérence à diverses hydrocarbures liquides, y compris
l'hexadécane (Rosenberg et al., 1980 ; Doyle et al., 1984 ;Craven et Blankenship, 1987 ;
Kutima et Foegeding, 1987).

L'utilisation de la méthode MATH –pour Microbial adhesion to hydrocarbons- est une

des méthodes les plus simples et les plus rapides. Cette méthode est basée sur l’affinité à
l’hexadécane.

la densité optique initiale des suspensions (DOi) à 600 nm est ajustée à une valeur
proche de 0,600 par addition de bouillon nutritif dans les tubes à hémolyse (Bos et al., 1999).

La mesure de l’affinité pour l’hexadécane a été réalisée par le mélange dans des tubes
à hémolyse de 3 ml de suspension bactérienne avec 0,5 ml d’hexadécane. Une émulsion fine
entre les deux phases est obtenue par agitation au Vortex pendant une minute. Après un repos

19
 Partie expérimentale

de 30 min à la température ambiante, la DO de la phase aqueuse est lue à 600 nm (DOeq =

DO après une minute d’agitation).

Lee pourcentage d’adhésion au solvant est alors calculé par la relation suivante :

CSH% = [(DOi-DOf)/ DOi] x100

DOi : Densité Optique
ptique initiale
DOf : Densité Optique finale
Lorsque la :
CSH(%) ˂ 20% hydrophile
CSH(%) > 40% hydrophobe
20% ˂ CSH(%) ˂ 40% moyennement hydrophobe.
hydrophobe
CSH : hydrophobicité de surface cellulaire
L’expérience est réalisée trois fois pour chaque souche.
souche

Figure n°03 : Représentation schématique du test de MATH permettant la mesure

d’affinité des Staphylococcus
S spp à l’’héxadécane. (Didouh ,2015)

20
 Partie expérimentale

V.4. Evaluation de la capacité des souches à formé le biofilm :

V.4.1. Nettoyage des lames d’acier inoxydable :

Les lames sont préparées suivant la technique de Peng. (2001).

-Les lames coupées dans des dimensions de 5 cm sur 1 cm sont submergées dans un mélange
d’éthanol et d’acétone (v/v) pendant une heure, afin d’éliminer les traces des matières grasses.

-Rinçage à l’EDS.

-Elles sont ensuite submergées dans une solution de NaOH à 2% pendant 5 minutes à 75°C.

-Un deuxième rinçage des lames à l’EDS.

-Puis elles sont submergées dans la solution de HNO3 à 1% pendant 5 minutes à 75°C.

enfin un dernier rinçage à l’EDS.

Avec un marqueur hydrophobe et indélébile, un carré est délimité sur les coupons
d’aciers d’une dimension de 1cm sur 1cm, puis recouverts avec du papier aluminium pour enfin
être stérilisés.

V.4.2.Essai d’obtention d’un biofilm expérimental :

La méthode utilisée pour la formation du biofilm à Staphylococcus spp se fait selon la

technique de Marques et al. (2007) afin de réaliser une adhésion et une formation complète du
biofilm. Les étapes de formation se résument comme suit :

*Préparer un inoculum bactérien d’une charge de 105 UFC /ml

*Les lames ainsi préparées, est submergé dans la suspension contenant 105 UFC /ml, et
incubées à 37°C pendant 24 heures.

Après cette durée d’incubation, les surfaces subissent certaines opérations qui se résument
come suit :

-Les surfaces sont d’abord rincées au PBS pour éliminer les cellules non adhérées à la
surface.

21
 Partie expérimentale

-les lames vont être placé dans des tubes de TSE (tryptone sel eau) additionné de 2% de
tween 20 et agité au vortex pendant 1 minute.

-A partir de ce tube, des dilutions sont préparées jusqu’à 10-5(tube contenant de l’eau
physiologie 9g/L).

-Un ensemencement est réalisé en inoculant 0,1 ml sur gélose nutritive.

-Et enfin, les boites sont dénombrées après 48 heures d’incubation à 37°C.

Le nombre de cellules adhérées est calculé par la formule suivante :

UFC/cm2=(Ne/A) ×d

A : la surface de la lame.

Ne : nombre de bactéries dans la boite.

d : facteur de dilution

22
 Partie expérimentale

II. Résultats et discussions

I. Caractères phénotypiques des Staphylococcus spp isolés :

Sur la Gélose Chapman, les colonies présentant l’aspect macroscopique caractéristiques

du genre Staphylococcus. Le développement bactérien sur le milieu Chapman ne constitue
qu’une indication, d’autres bactéries (entérocoques) peuvent y cultiver. Sur ce milieu, les
colonies de Staphylococcus apparaissent souvent pigmentées et entourées d’une auréole jaune
dans le cas où le mannitol est fermenté, si non les colonies sont de couleur blanche. Les
colonies sont arrondies à bords régulier de 1 à 2 mm de diamètre après 48h d’incubation à
37°C. (Voire figure 04)

Figure 04: aspect macroscopique des colonies de Staphylococcus spp sur Gélose Chapman
(Originale)
II. Evaluation de la formation de biofilm :

Plusieurs chercheurs ont étudié les stratégies employées par les micro-organismes pour
produire des biofilms. Ils ont montré que les bactéries productrices de biofilm sécrètent
certaines substances chimiques qui les protègent contre les désinfectants, les agents
antimicrobiens et des systèmes immunitaires de l'hôte (Saitou, 2009).

23
 Partie expérimentale

Des méthodes classiques de la détection de la production de biofilm in vitro ont été

établies, telles que la méthode qualitative de tube TM (Christensen et al., 1982). et la
méthode du Rouge Congo (Mathur et al., 2006).
II.1-. Technique Rouge Congo Agar :

Les 19 souches de Staphylococcus spp isolées ont été testées pour mettre en évidence
leur capacité à former le biofilm par techniques de Rouge Congo Agar (RCA).

La recherche de la production de Slime sur milieu rouge Congo a révélé que 04

souches sur 19 isolées d’industrie laitière sont productrices de Slime (21.05%), 08 souches
sont intermédiaire (42.10%) et 07 souches non productrice du Slime (36.84%) (Voire figure
n° 05).

Figure n°05: Production de Slime chez les souches Staphylococcus spp sur milieu Rouge
Congo Agar.( Originale )
24
 Partie expérimentale

21%
42%
forte
modéré
37% negative

Figure n°06: Répartition des souches Staphylocoques spp isolées d’industrie laitière en
fonction de production de Slime bactérien.

Le Slime est définie comme la substance polymérique extracellulaire, également connu

sous le nom de exo-polysaccharid
polysaccharides (EPS), qui est principalement formé par PIA chez S.
Costerton et al., 1995)
epidermidis et S. aureus, (Costerton

La production des exo-polysaccharides

exo polysaccharides joue un rôle important dans les infections
causées par différents microorganismes (Alcaraz et al., 2003), et est considérée comme un
facteur de virulence important pour certains microorganismes tels que Staphylococcus aureus.
aureus

Les EPS (exo-polysaccharides)

polysaccharides) sont généralement des matériaux polysaccharidiques,
qui sont impliqués dans la protection des cellules microbiennes.
microbiennes. En plus, les microorganismes
qui produisent ces exo-polysaccharides
polysaccharides sont plus résistants à la dessiccation, à la prédation et
aux produits chimiques (Ophir et al., 1994). Cependant, ces molécules sont également
importantes dans la formation de biofilms sur les surfaces puis qu’elles sont impliquées dans
les premières étapes de la formation de biofilms.
biofilms

25
 Partie expérimentale

Krukowski et al. (2008) ont indiqué que, sur les 59 isolats de S. aureus isolées de la
sécrétion inflammatoire des glandes mammaires des vaches, 42,37 % produire de Slime et
57.68% non produire du Slime.

Gundogan et al. (2006) ont constaté que 58 (52,7 %) des 110 souches de S. aureus
isolé à partir de lait cru, lait pasteurisé et les glaces des échantillons ont été productrice du
Slime.

Ciftci et al. (2009) ont constaté que seulement 22 des 59 souches (37,2 %) de S. aureus
isolées des échantillons de lait ont été productrices de Slime.

Le résultat obtenu par Vasudevan et al. (2003) 32 souches (91,4 %) sur 35 souches de
S. aureus isolées de mammites bovines à été productrice de Slime Ces valeurs sont plus élevé
par rapport à notre résultats.

Plusieurs auteurs signalent que la méthode de Rouge Congo Agar semble être moins
efficace pour détecter la formation du biofilm in vitro.

II-2- La technique TM :

Selon la technique TM et sur l’ensemble de 19 souches, 5 souches ont été fortement

formatrices du biofilm (26,31%), 09 souches étaient modérément (47,36%) et 05 souches ont
été non formatrices du biofilm (26,31%).

La méthode TM semble facile à réaliser mais la lecture des résultats peut-être difficile,
car plusieurs auteurs stipulent que la formation du biofilm est considérée comme positive
quand un film visible recouvre le mur et le bas du tube alors que d’autres considère que la
formation d’un anneau à l’interface liquide n’est pas indicative de la formation du biofilm
(Mathur et al., 2006).

26
 Partie expérimentale

Figure n°07 : Evaluation de la production de biofilm par la méthode TM.(Originale)

TM.

Les résultats de TM sont présentés dans la figure suivante :

26% 26%

forte

modédré

abcence
48%

Figure n°08 : Répartition des souches Staphylocoques spp isolées d’industrie laitière en
fonction de la production de biofilm.

27
 Partie expérimentale

Krukowski et al. (2008) ont indiqué que, sur les 59 isolats de S. aureus isolées de la
sécrétion inflammatoire des glandes mammaires des vaches, 47,45 % produit Slime utilisé
par la méthode MT.

La comparaison de nos résultats aves Krukowski et al. (2008) montrent que nous
avons trouvés uniquement 28% des souches ont été fortement formatrices du biofilm.

Afreenish et al.( 2011) ont constatés que 49 % des souches de S. aureus isolé à
partir de lait sont considérées comme productrices de biofilm et 51 % comme des non-
productrices de biofilm.

Fox et al. (2005) démontré que 41,4 % des souches de S. aureus retrouvés dans le lait
de vache ont formé le biofilm.

D’après les résultats obtenus on peut dire qu’il y a une corrélation entre la production de
Slime et la formation de biofilm sur verre (Voire tableau n° 01).

Tableau n°01 : La comparaison des résultats de la technique RCA et la méthode TM.

Nombre des souches Staphylococcus spp

Technique
Fort Modéré Absence

RCA 04 08 07

TM 05 09 05

Les résultats de nos expériences ont montré que la TM était la plus efficace et la mieux
indiquée pour une évaluation qualitative de l’adhésion bactérienne sur une surface.

Dans une autre étude, Ruzicka et al.(2004) a noté que sur 147 souches de S.
epidermidis, TM a détecté la formation de biofilm chez 79 (53,7 %) et RCA a détecté
uniquement 64 (43,5 %).

Ils ont montré que la méthode TM est la meilleure pour la détection du biofilm que la
méthode RCA.

28
 Partie expérimentale

II.3-La technique MATH :

L’hydrophobicité de la surface bactérienne des souches de Staphylococcus spp est

connue pour être associée à sa pathogénicité, à son adhésion bactérienne et à sa capacité à
former le biofilm (Costa et al., 2006 ; Pour et al., 2011). Dans ce travail, l'hydrophobicité des
souches Staphylococcus spp a été évaluée par la méthode MATH en utilisant l’héxadécane
comme solvant.
Les résultats obtenus par la méthode MATH indiquent qu’à partir des valeurs obtenues,
les isolats peuvent être classés en trois groupes :

Groupe 1: très hydrophobe comprennent 9 souches (47.36% des isolats).

Groupe 2: les souches moyennement hydrophobes comprennent 8 souches (42.10% du total
des isolats).
Groupe 3: les souches hydrophiles comprennent 02 souches soit 10.52%du total des isolats.

50
Pourcentage d'affinité à l'exadécane

45
40
35
30
25
20
15
10
5
0

Souches Staphylococcus spp

Figure n°09: Pourcentage d’affinité des souches Staphylococcus spp à l’héxadecane.

29
 Partie expérimentale

Certains auteurs considèrent que l’hydrophobicité de la surface bactérienne est le

paramètre clé qui gouverne l’adhésion bactérienne aux supports inertes (Jana et al., 2000 ;
Cappello et al., 2006). L’hydrophobicité chez les bactéries à Gram positive est du à la partie
de lipide d'acide lipotéichoïques qui se prolonge à l'extérieur de la cellule, ayant pour résultat
une surface hydrophobe (Frank, 2001).

Nos résultats montrent que la majorité des souches de Staphylococcus spp isolées
d’industrie laitier sont hydrophobes 9 (47.36%), les souches moyennement hydrophobe sont
8(42.10%) et enfin 2(10.52%) souches sont hydrophile.

Ciccio et al. (2014) ont démontré que : parmi les 67 souches de Staphylococcus spp
testées à 37°C (64,1 %) sont des souches hautement hydrophobe, (31,3 %) des souches
modérément hydrophobes et (4.4 %) sont des souches hydrophiles.

Mamo et al. (1987) ont trouvés 33% souches de S. aureus isolées de mastite bovine
sont hydrophobe ,28 % étaient modérément hydrophobe et 26 % étaient hydrophile.

Les résultats obtenus dans cette étude sur l’affinité pour l’hexadécane des souches de
Staphylococcus spp montrent que nos isolats présentent des valeurs similaires ou légèrement
plus faibles que celles citées dans des travaux antérieurs.

La comparaison des résultats de la technique RCA, la technique TM et la technique

MATH permet d’observer que :

*02 souches sont productrices du Slime , formatrice de biofilm sont hydrophobes , 02

souches productrice du Slime, bonne formatrices de biofilm sont hydrophiles et une (01)
souche formatrice de biofilm par la technique TM hydrophobe.

*09 souches avec une production intermédiaire de biofilm par la méthode TM sont
hydrophobes Parmi les 09 souches 08 avec une production intermédiaire de Slime.

*07 souches non productrices du Slime sont hydrophobes. Parmi les 07 souches il y a
05 non formateurs de biofilm par méthode TM.

30
 Partie expérimentale

D’après ces résultats on n’a trouvé qu’il ya une relation entre la technique RCA et la
technique MATH et entre la technique RCA et la technique TM, mais il n’y a pas relation
entre la technique MATH et la technique TM.

II.4.Evaluation de formation de biofilm sur l’acier inoxydable :

Les résultats montrant l'intensité de l'adhésion des cellules de Staphylococcus spp sur
l’acier inoxydable (Voire figure N°10). Le nombre maximum d'adhésion des cellules viables
a été de l'ordre de 5,80x106 UFC/cm2 et un nombre minimum de 1,2x105 UFC/cm2.

70
Nombre des souches adérées x 105 UFC/cm2

60

50

40

30

20

10

Souches Staphylococcus spp

Figure n°10: Evaluation de la formation de biofilm par les souches Staphylococcus spp sur
l’acier inoxydable.

31
 Partie expérimentale

La comparaison des résultats de la technique RCA, la technique TM et la technique

d’adhésion sur acier inoxydable permet d’observer que :

*02 souches sont productrices du Slime , hydrophobes ,formatrice de biofilm par la

technique TM et une forte formation de biofilm sur l’acier inoxydable , 02 souches
productrice du Slime, bonne formatrices de biofilm, hydrophile avec une faible formation
de biofilm sur acier inoxydable et une (01) souche formatrice de biofilm par la technique
TM, hydrophobe et bonne formatrice du biofilm sur l’acier inoxydable.

*09 souches avec une production intermédiaire de biofilm par la méthode TM,
hydrophobes et bonne formatrices de biofilm sur l’acier inoxydable. Parmi les 09 souches 08
avec une production intermédiaire de Slime.

*07 souches non productrices du Slime, hydrophobes avec une bonne formation de
biofilm sur l’acier inoxydable. Parmi les 07 souches il y a 05 non formateurs de biofilm par
méthode TM.

D’après les résultats obtenus on peut dire qu’il y a une relation entre la production de
Slime, l’hydrophobicité et la formation de biofilm soit sur le verre ou sur l’acier inoxydable.

Heloísa et al. (2012) ont montré que la formation de biofilm sur l’acier inoxydable par
S. aureus isolé des usines de transformation des aliments avec un taux de 108 CFU/cm2.

D’après Oliveira. (2014) 42 % des 31 souches de S. aureus isolées d'environnements

de traite étaient productrices de biofilm sur l'acier inoxydable.

Il a été constaté que la cause d'une importante crise au Japon en 2000, qui a touché plus
de 13 000 personnes, a été la production d'une toxine thermorésistants par la bactérie S.
aureus survivre dans les canalisations d’une usine laitière (Asao et al., 2003).

Marques et al. (2007) ont étudié la formation de biofilm par S. aureus isolées de
services alimentaires sur les surfaces en verre et en acier. Le nombre des bactéries était de
l’ordre de 107 et 108 UFC/cm2, respectivement, après 15 jours d'incubation.

Evandro et al. (2014) on montré que la formation de biofilm sur l’acier inoxydable par
S. aureus isolé de services alimentaires était avec un taux de 107 UFC/cm2.

Tsuneda et al.( 2003) indiqué que Le nombre de S. aureus ont adhéré sur la surfaces
d’acier inoxydable plus de 72 h d'incubation à 7 et 28 °C avec un taux de 105 à 106 UFC/cm2.
32
 Partie expérimentale

Azelmad et al.( 2015) montré que le nombre des souches des S.aureus isolées d’usines
laitière adhéraient sur l’acier inoxydable avec une charge de 3,02.107 UFC/cm2 .

Certaines études ont constaté que la formation de biofilm sur des surfaces hydrophobes
est produite dans une plus grande mesure que sur des surfaces hydrophile (Cerca et al.,
2005 ; Pagedar et al., 2010).

les bactéries à caractère hydrophobe préfèrent adhérer aux surfaces hydrophobes et que
les bactéries à caractère hydrophile préfèrent adhérer aux surfaces hydrophiles
(Katsikogianni et Missirlis, 2004 ; Costa et al., 2006; Hamadi et al., 2009 ; Treter et
Macedo, 2011).

Ils on trouvé qu’il y a une corrélation positive entre l'hydrophobicité et l'adhérence

bactérienne (Hamadi et al., 2005; Henriques et al.,2004 ; Hamadi et al., 2008; Sliva et al.,
2008). Nos résultats sont également en accord avec cette étude.

D'autres chercheurs n'ont pas été établit une relation entre l'adhérence bactérienne et
propriétés physico-chimiques (hydrophobicité) (Flit et al., 1997; Oliveira et al.,
2006 ;Teixeira et al., 2007)

Ils ont constatées que l'adhésion bactérienne est inhibée ou réduit par le pré
conditionnement avec du lait entier ou composants du lait (protéines) (Helke et al., 1993 ;
Almakhlafi et al., 1995 ; Wong, 1998 ; Barnes et al., 1999 ; Flit et al., 2001 ; Pakar et al.,
2001 ; Rubio et al., 2002).

Toutefois, en présence de protéines de lactosérum, il y a une augmentation de

l'attachement de plusieurs micro-organismes de lait sur l'acier inoxydable, caoutchouc et
surfaces en verre a été observés par Speers et Gilmour, (1985).

33
Conclusion
 Conclusion

Conclusion
La capacité d’une souche à former du biofilm est reconnue comme étant un important
facteur de virulence chez de nombreuses espèces bactériennes, dont Staphylococcus spp.
La formation de biofilms sur les surfaces en contact avec les aliments constitue un
risque accru de contamination du produit, puisque les bactéries au sein du biofilm sont plus
résistantes aux désinfectants et à d’autres stress environnementaux, et cela peut conduire à des
problèmes d’hygiène alimentaire.

Dan cette étude, la capacité des souches de Staphylococcus spp a formé du biofilm à été
évalué par les méthodes suivantes : Rouges Congo Agar (RCA), méthode en tube (TM), la
technique MATH et l’étude d’adhésion des souches a l’acier inoxydable.

La production de Slime sur milieu rouge Congo Agar a révélé que 04 souches sont
productrices de Slime, 08 souches avec une production intermédiaire et 07 souches non
productrice du Slime. Selon la technique TM, 5 souches ont été fortement formatrices du
biofilm, 09 souches étaient modérément et 05 souches ont été non formatrices du biofilm
Pour la technique MATH, 09 souches sont hydrophobes, 08 moyennement
hydrophobes et 02 souches hydrophiles. L’étude d’adhésion sur l’acier inoxydable le
nombre maximum des cellules viables a été de l'ordre de 5,80x106 UFC/cm2 et un nombre
minimum de 1,2x105 UFC/cm2.

La comparaison des résultats de la technique RCA, la technique TM et la technique

d’adhésion sur acier inoxydable permet d’observer que :

*02 souches sont productrices du Slime , hydrophobe ,formatrice de biofilm par la

technique TM et une forte formation de biofilm sur l’acier inoxydable , 02 souches
productrice du Slime, bonne formatrices de biofilm, hydrophile avec une faible formation
de biofilm sur acier inoxydable et une (01) souche formatrice de biofilm par la technique
TM, hydrophobe et bonne formatrice du biofilm sur l’acier inoxydable.

*09 souches avec une production intermédiaire de biofilm par la méthode TM,
hydrophobes et bonne formatrices de biofilm sur l’acier inoxydable. Parmi les 09 souches 08
avec une production intermédiaire de Slime.

34
 Conclusion

*07 souches non productrices du Slime, hydrophobes avec une bonne formation de
biofilm sur l’acier inoxydable. Parmi les 07 souches il y a 05 non formatrices de biofilm par
méthode TM.

D’après les résultats obtenus on peut dire qu’il y a une relation entre la production de
Slime, l’hydrophobicité et la formation de biofilm soit sur le verre soit sur l’acier inoxydable.

Afin de minimiser le risque de formation de biofilm et d’intoxication alimentaire du à la

présence des bactéries qui ont été présent au niveau du biofilm et devient présent au niveau de
l’aliment, il serait intéressant d‘explorer des techniques qui permet d’inhiber l’adhésion
bactériens sur la surface qui ont en contact avec les aliments serait également une voie à
prospecter.

35
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ANNEXES
 Annexe

Milieux de culture
1-Milieu de Chapman :
Composition:
La formule théorique de ce milieu de culture en g/L d’eau purifiée est :
Extrait de viande (bovin ou porcin)…………………………………………………………..1g
Peptone de caséine et de viande (bovin et porcin)…………………………………………..10g
Chlorure de sodium……………………………….…………………………………………75g
Mannitol……………………………………………………………………………………..10g
Agar……………………………………………………………………..………...…………15g
Rouge de phénol…………………………………………………..………………...……0,025g
pH=7,6
Préparation : 111g par litre d’eau distillée. stérilisation à l’autoclave : 15 minutes à 120°C.

2. Bouillon cœur-cervelle (BHIB) :

Composition :
Infusion de cervelle de veau……………………………...…………………………….….12.5g
Infusion de cœur de bœuf……………………..………………………………………….....5.0g
Peptone……………………………………………………..……………….………...…...10.0g
Glucose…………………………………………………………..…………….……............2.0g
Chlorure de sodium………………………………………………………………………....2.0g
Phosphate disidique………………………………………………………………..….…….5.0g
Eau distillé………………………………………………………………………………..…..1L
pH= 7.4
Préparation : 37g par litre d’eau distillée. Stérilisation à l’autoclave à 120°C, 20min.

3. Bouillon nutritif
Composition :
Peptone .............................................................................................................................. 15,0 g
Extrait de levure .................................................................................................................. 3,0 g
Chlorure de sodium ............................................................................................................. 6,0 g
D(-) glucose…………………………………………………………………………………1,0g
Eau distillée ..................................................................................................................... 1000ml
pH = 7,2 ± 0,2.

4. Rouge Congo Agar :

Composition :

Saccharose…………………………………………………...………………………………50g

B HIB………………………………….……………………………………….……………37g

Rouge Congo…………………………………………………………...............................0.8g

Agar …………………………………………………………………………………………10g

Eaux distillée……………………………………….……………………………………1000ml

5. Bouillon TSE (tryptone sel eau) :

Composition :
Tween…………………………………………………………………….…………………0.2g
Tryptone ................................................................................................................................. 1 g
Chlorure de sodium ............................................................................................................. 8.5 g
Eau distillée ..................................................................................................................... 1000ml

6. Le tampon PBS ( Phosphate Buffered Saline ) à 0,1M, pH= 7,2± 2 :

Composition :
KH2PO4 …………………………………………………………………..………………0, 29 g
K2HPO4 ………………………………………………...………………………… . …....1, 19 g
NaCl …………………………………………………..………………………………….4, 93 g
Dans un litre d’eau distillée. Eau distillée (qsp) 1 L
7. Cristal Violet :

Composition :

Cristal violet…………………………………………………………………………………. 2g
Eau distillée……………………………………………………………………………… 100ml