Ecole Supérieure des Sciences et Technique de la Santé de TunisTP de Chimie Analytique Et Instrumentale 1ère année Biologie-Hygiène

Méthodes d’analyse chimique et techniques de séparation

Introduction :

La chimie analytique est une science proche de la chimie physique. Elle se rapporte à
l’étude du comportement chimique et physique des composés purs ou en solution soumis à
diverses conditions. Elle est souvent perçue sous son aspect appliqué, ayant pour but
l’identification, la caractérisation et la quantification des substances chimiques ainsi que le
développement des méthodes nécessaires à cette analyse.

Il existe deux catégories de méthodes d’analyse en chimie :

- Méthodes chimiques entraînant une spécificité réactive de l’analyte (le composé qui
fait l’objet du dosage) avec des molécules réactives.
- Méthodes physiques utilisant les propriétés physico-chimiques du composé à
analyser. Ces dernières utilisent des instruments très performants dont leur principe de
base repose sur la mesure d’une grandeur physique et à apporter une relation entre
cette grandeur (réponse de l’appareil) et la composition de l’échantillon à quantifier.

L’analyse chimique comprend plusieurs étapes et pas juste l’utilisation d’un instrument. Il
y a l’échantillonnage et stockage des échantillons, leurs préparations, puis la séparation des
analytes et enfin la caractérisation et quantification.

But de la manipulation :

L’objectif de la manipulation est d’acquérir les techniques de base pour la

maintenance des instruments du laboratoire et la mise en œuvre de certaines méthodes
utilisées pour l’obtention d’une substance pure.

A/ Méthode potentiométrique : Mesure du pH

Le terme de « pH » est l’abréviation de « pondus hydrogenii » le poids de l’hydrogène.

Ce terme a été proposé par un scientifique danois S.P.L. Sorensen, pour exprimer la
concentration d’ions H3O+ (appelé ion hydronium) présents en solution. Par définition, le pH
est égal au cologarithme de l’activité des protons.

pH= - log [H3O+]

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I.Mesure du pH :

I.1. Méthode pH-métrique :

I.2. Description du pH mètre

Un pH-mètre comporte une sonde de mesure formée de deux électrodes : Une

électrode de référence, dont le potentiel est constant et une électrode de mesure en verre
extrêmement fragile (épaisseur de verre de la partie basse qui ne dépasse pas quelques
microns). Les électrodes sont reliées par de simples fils à un voltmètre spécial, directement
gradué en unités de pH. Ces deux électrodes peuvent être sous la même enveloppe: on parle
alors d’électrode combinée. La valeur de pH est obtenue par la différence de potentiel entre
ces deux électrodes et sera indiquée sur le pH-mètre.

2,3 RT
E=E0 + log ¿ ¿
F

Avec : E0 : potentiel standard du couple H+/H2

R : constante des gaz parfait (8.31 J. K-1)

T : température absolue (K)

F : Faraday= 96500 C

Figure 1 : schéma d’un pH-mètre

I.3. Description des électrodes

 Electrode de verre :
 Electrode de référence : présentée sur la figure 1 est une électrode Ag/AgCl
argent/chlorure d’argent - où les deux composants ainsi que le KCl sont encapsulés

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dans un tube rouge lequel est plongé dans une solution de KCl saturé. Le tube en verre
rouge assure une protection contre la lumière. La jonction liquide, c'est-à-dire
l’élément en contact avec la solution à mesurer, est un poreux. Le potentiel qui
apparaît est déterminé par le produit de solubilité du chlorure d’argent et de la solution
de KCl. Ce potentiel doit rester constant.

NB. Comme il est beaucoup plus facile de manipuler avec une seule électrode plutôt que
deux, l’électrode combinée est très largement utilisée dans les laboratoires. Ce type
d’électrode combine en une seule entité une électrode de verre et une électrode de référence.
Un deuxième avantage est que cela aide à s’assurer que les deux électrodes sont bien à la
même température pendant le déroulement des mesures.

Figure 2 : schéma des différentes électrodes

I.4. Entretien des électrodes :

Un entretien régulier des électrodes est indispensable pour l’obtention de résultats fiables
et afin d’assurer une durée de vie plus longue à l’électrode.

- Il faut tout d’abord vérifier la propreté de la membrane. Pour cela un rinçage à l’eau
déminéralisée est indispensable au moins une fois par semaine, pour le nettoyage de
l’électrode.
- Il ne faut jamais laisser l’électrode à l’air libre. Entre les mesures, conserver
l’électrode dans l’eau déminéralisée ou dans une solution tampon légèrement acide.
- Les électrodes combinées peuvent être conservées dans leur solution de remplissage.
En cas de non utilisation pendant une longue période, un stockage à sec est alors
recommandé sachant mais il faudra la réhydrater avant une nouvelle utilisation.

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- Vérifier qu’aucune bulle d’air ne se trouve piégée à l’électrode. Si tel est le cas, il est
possible de les chasser en tapotant légèrement l’extrémité de l’électrode, soit en la
secouant

1.5. Étalonnage du pH-mètre :

Avant son utilisation, le pH-mètre doit être impérativement étalonné. Pour cela deux
solutions tampons de pH connu sont utilisées. Les étapes d’étalonnages sont comme suit :

1) Prenez la sonde et enlevé le bouchon.

2) Rincer l’électrode à l’eau distillée puis l’essuyer à l’aide du papier Joseph.
3) Immerger l’électrode dans une solution tampon de pH =7, attendre la stabilisation de
la valeur.
4) Rincer à nouveau l’électrode à l’eau distillée puis l’essuyer à l’aide du papier Joseph.
5) Immerger l’électrode de verre dans une seconde solution tampon de pH=4, attendre la
stabilisation de la valeur
6) Rincer à nouveau l’électrode et la plonger dans l’eau distillée. Le pH-mètre est prêt à
être utilisé.

Attention il faut toujours agiter lors d’une mesure de pH. Et en passant d’une mesure à
une autre il faut toujours rincer l’électrode de verre à l’eau distillée.

I.6. Mesure:

1) Immerger l’électrode de verre dans un volume suffisant d’eau à analyser (Vérifier

que l’électrode est bien plongée dans la solution.

2) Attendre la stabilisation de la valeur indiquée sur le pH-mètre, lire ensuite la valeur

affichée et la noter.

II. Méthode calorimétrique :

II.1. Les indicateurs de pH :

On peut déterminer visuellement le pH approximatif d’une solution aqueuse au moyen

d’un indicateur. Les indicateurs de pH sont des acides ou des bases faibles dont les formes
conjuguées bases ou acides sont de couleurs différentes. Le changement de couleur ou
« virage »survient lorsque le pH dépasse une certaine valeur ou « domaine » spécifique pour
chaque indicateur (Tableau 1). Le changement de couleur indique donc que le pH a atteint une

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certaine valeur. Cette méthode est largement utilisée pour déterminer le point final des
réactions de titrage acide-base.

Tableau 1: Tableau des indicateurs colorés et leur pH

Indicateurs Couleur pH (zone de virage)

Forme acide Forme basique
Bleu de bromophénol Jaune Bleu 3,1-4,5
Héliantine (ou méthyl-orange) Rouge Jaune 3,2-4,4
Vert de bromocrésol Jaune-rosé Bleu 3,8-5,4
rhodamine
Bleu de bromothymol Jaune Bleu 6-7,6
Rouge de méthyle Jaune Rouge 4,8-6
phénolphtaléine Incolore Rose 8,2-10

II.2. Papiers indicateurs de pH :

Les papiers indicateurs de pH commerciaux, dits universels, sont imprégnés de plusieurs

indicateurs. Ils permettent, selon le type de papier utilisé, la mesure du pH de solutions
aqueuses avec une précision de ± 0,01 unité de pH. La mesure s’effectue en comparant la
couleur du papier indicateur, imbibé au préalable, du liquide à étudier avec une échelle de
comparaison imprimée sur le coffret d’emballage du papier.

Les papiers indicateurs de pH doivent être stockés à l’abri des vapeurs et de la lumière.

Figure 3 : Papiers indicateurs de Ph

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III. Manipulation :

But : On se propose de titrer une solution d’acide chlorhydrique (HCl : acide fort) par une
solution d’hydroxyde de sodium (NaOH : base forte) de concentration connue 0,2 mol. L -1 par
pH-métrie.

Matériels:

pH-mètre, agitateur magnétique, barreau aimanté, burette graduée, bécher et une pipette
jaugée.

Protocole expérimental :

- Remplir la burette avec NaOH 0,2 mol.L-1

- Prélever à la pipette 20 mL de la solution d’acide chlorhydrique de concentration
inconnue et la transvaser dans un bécher
- Ajouter le NaOH goutte à goutte en agitant.

Exploitation des résultats :

1) Tracer la courbe de titrage.

2) Déterminer la concentration inconnue de HCl.

B/ Méthodes de séparation :

La séparation des mélanges consiste en un tri des particules afin d’obtenir des corps
purs. On utilise divers procédés de séparation qui sont des techniques permettant de
transformer un mélange de substances en plusieurs composants distincts et qui peuvent être
par la suite analysables. Les buts de séparation sont principalement la purification des
impuretés, la concentration d’une solution (exemple : élimination d’une partie de l’eau dans
un parfum) ou le fractionnement du mélange (exemple : distillation de fruits pour obtenir de
l’alcool).

Les principaux procédés de séparation qui seront investigués lors de cette manipulation sont :

 La filtration
 La centrifugation
 La décantation

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 La distillation
 La chromatographie

I.1 La filtration :

La filtration est une opération qui consiste à séparer notamment un solide d’un liquide à
l’aide d’un filtre constitué par une matière plus ou moins poreuse. Au laboratoire, on utilise
généralement des papiers filtres. Le solide que l’on recueille sur le filtre est appelé précipité
et le liquide recueilli après filtration est le filtrat.

La trompe à vide (filtration sur entonnoir de Büchner sous pression réduite) est un moyen
très efficace pour filtrer rapidement une grande quantité de liquide. Le dispositif comporte :

- Une trompe à eau, permettant de faire le vide.

- Un entonnoir Büchner, monté sur un flacon à filtration forcée, sur lequel on dépose un
filtre rond de même dimension que les dimensions intérieures de l’entonnoir.

Il est possible aussi de procéder par filtration sur plaque en verre fritté sous pression
réduite. La méthode est identique à la précédente sauf que dans ce cas l’entonnoir Büchner est
remplacé par des plaques de verre fritté de différentes porosités (allant de 1 à 5
habituellement). L’avantage de ce procédé c’est qu’il permet d’éviter la contamination du
solide par les fibres détachées du papier filtre. Les verres frittés de porosité 1 conviennent
pour séparer des gros cristaux et ceux de porosité 4 pour les précipités fins.

Figure 4 : Montage d’une filtration sous vide

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Procédé :

On verse dans l’entonnoir la solution contenant le solide ; on aspire alors le liquide à

l’aide d’une trompe à eau jusqu’à élimination complète de l’eau mère. On déconnecte la
trompe pour laisser entrer l’air et empêcher le retour d’eau dans le flacon de filtration.
Enfin, on déconnecte l’entonnoir de la fiole à vide et on récupère le précipité.

Manipulation :

1. Matériels :
o Trompe à eau,
o Fiole de filtration sous vide,
o pipette graduée de 10 mL,
o Erlenmeyer de 200 mL,
o Filtre en verre fritté,
o Büchner et papier filtre circulaire de même diamètre.
2. Réactifs
o Solution de glucose à 50 g. L-1.
o Liqueur de Fehling A.
o Liqueur de Fehling B
3. Protocole expérimental :
Verse successivement dans l’erlenmeyer : 10 mL de solution de glucose ; 10 mL de
liqueur de Felhing A et 10 mL de liqueur de Fehling B.Porter à ébullition et maintenir
celle-ci pendant 1 min. Refroidir sous courant d’eau et séparer le précipité de CuO obtenu
en utilisant :

- la trompe à eau et un filtre de verre fritté (porosité 3 ou 4).

- La trompe à eau et un papier filtre circulaire adapté à un Büchner.

I.2. La centrifugation :

La centrifugation est une technique qui permet de séparer des constituants de taille et
de masse très variables contenus dans un liquide. Tous les constituants contenus dans un
échantillon sont soumis à la gravité (force qui d’exerce du haut vers le bas) et à la poussée

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d’Archimède (force qui s’exerce du bas vers le haut) Donc, on pourrait s’attendre qu’avec le
temps tous les constituants finissent par tomber au fond du récipient dans lequel il se trouve
(sédimentation) ou remontent à la surface. En faisant tourner l’échantillon, une nouvelle
source apparaît, la force centrifuge. Cette dernière permet d’accélérer la séparation du solide
de la phase liquide. Généralement après centrifugation le solide est recueilli sous forme d’un
culot (culot de centrifugation) recouvert par le liquide.

La force centrifuge, notée g, est fonction de la vitesse angulaire de rotation et de la

distance à l’axe de rotation. Elle est donnée par la formule suivante :

g= ω2r= 1,119 × 10-5× r × n2

Avec, ω= vitesse angulaire (rad/s), r= distance à l’axe de rotation et n= nombre de rotations

par minute (rpm).

Il existe deux catégories principales de centrifugeuses :

- Les centrifugeuses à axe vertical, communément appelées séparateurs centrifuges ou

clarificateurs (avec un bol à assiettes ou à chambres qui tourne sur un axe vertical).
Ils sont souvent utilisés pour séparer une phase solide d’une phase liquide.
- Les centrifugeuses à axe horizontal, communément appelées décanteurs centrifuges
(avec un bol cylindro-conique qui tourne sur un axe horizontal et une vis disposée à
l’intérieur du bol permettant l’évacuation des sédiments). Ils sont essentiellement
utilisés pour clarifier des mélanges liquides à forte teneur en sédiments.

Figure 5: Centrifugeuse à axe horizontal

Manipulation :

1. Matériels et appareillages :
o Centrifugeuse I pour centrifugation horizontale,

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o Centrifugeuse II pour centrifugation oblique,

o Tubes de centrifugation droits,
o Tubes de centrifugation cylindro-conique
o Pipette graduée de 10 mL.
2. Réactifs :
o Solution d’AgNO3 (0,1 N)
o Solution de HCl (0,1 N)
o Solution de KI (0,1 N)
o Solution de Pb(COOH)2 (0,1 N).
3. Protocole expérimental :
1/ Dans 2 tubes de centrifugation cylindro-conique, verser 2 mL de AgNO3 et 2 mL
de HCl. Séparer le précipité de chlorure d’argent obtenu, par centrifugation
horizontale dans le centrifugeur I à 1200 t/mn en 2 mn.
2/ Dans 2 tubes de centrifugation droits, verser 2 mL de solution d’acétate de plomb et
2 mL de la solution KI. Séparer le précipité d’iodure de plomb obtenu par
centrifugation oblique dans le centrifugeur II à 600 t/mn en 3 mn.

I.3. La décantation :

La décantation est un procédé permettant la séparation de deux phases liquides non

miscibles de densités différentes : l’une des phases est aqueuse, l’autre organique. Leur
séparation s’effectue sous l’action de la pesanteur, en les laissant reposer.

Au laboratoire, la décantation est le plus souvent réalisée dans une ampoule à décanter.
Diverses formes d’ampoules à décanter sont représentées à la figure suivante.

Figure 6 : Différentes formes d’ampoule à décanter

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Les deux phases dont disposées l’une sur l’autre en fonction de leur densité. La
phasela moins dense constitue la phase supérieure et la plus dense la phase inférieure.

Protocole d’extraction

Manipulation :

1. Matériel :
o Ampoule à décanter
2. Réactifs :
o Huile de Soja
3. Protocole expérimental :

Verser dans une ampoule à décanter 100 mL d’eau puis 20 mL d’huile. Agiter
énergétiquement : une émulsion d’huile dans l’eau se forme. Attendre la rupture de
l’émulsion.

Séparer les deux phases en les recueillant successivement par le robinet de vidange de
l’ampoule.

I.4. La distillation :

Pour séparer des liquides, on se base sur le fait qu’ils n’ont pas la même température
d’ébullition. La distillation est réalisée en chauffant le mélange. La substance la plus volatile
s’échappe et est récupérée dans un condensateur qui refroidit la vapeur la liquéfie. Elle se
résume en deux actions :

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- Chauffer un liquide impur ou un mélange de liquide pour lestransformer en vapeurs

par ébullition.
- Condenser ensuite les vapeurs par refroidissement et isoler les liquides purs.

Manipulation

La distillation simple : (sans colonne)

1. Principe :

Le liquide et la vapeur sont au contact de l’air. La méthode est surtout appliquée à la

purification des solvants volatils ou des composés ayant des températures d’ébullition très
différentes.

2. Montage :

Le montage se fait en partant du support élévateur puis du ballon de réaction et en

déposant successivement la tête de distillation, le réfrigérant, l’allonge puis le récipient.
Quant au démontage, il se fera dans l’ordre inverse.

Figure 7 : Schéma d’une distillation simple

3. Matériels :
- 1 ballon en pyrex à fond plat ou fond rond de 1000 mL dans lequel on déposera 2 ou 3
billes de verre de 2 mm de diamètre.
- Un réfrigérant à serpentin de 75 cm de longueur utile.
- Canes de verre, tubulure en caoutchouc ou en polyéthylène, bouchon à 1 trou,
bouchon à 2 trous.

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- Chauffe ballon électrique.

- Erlenmeyer de 200 mL.
- Burette graduée, pipette jaugée de 10 mL, pipette jaugée de 20 mL et erlenmeyer de
100 mL.
4. Réactifs :
o Solution d’acide acétique
o Solution de NaOH (0,1 N)
o Indicateur de pH : phénolphtaléine.
5. Protocole expérimental :

1/ Doser une prise d’essai de 10 mL de la solution d’acide acétique à analyser avec une
solution de NaOH (0,1 N) en présence de phénolphtaléine.

- Déterminer la molarité et le titre pondéral (exprimé en g/L) de cette solution.

- Calculer la quantité en g d’acide acétique contenu dans un volume de 20 mL de cette
solution.

2/ Réaliser le montage d’un dispositif de distillation simple par la suite introduire

rapidement et successivement 100 mL d’eau distillée puis 20 mL de la solution
d’acétique.

3/ Placer à la sortie du système un erlenmeyer de 200 mL contenant 50 mL d’eau distillée.

4/ Distiller sous bonne réfrigération jusqu’à recueillir 60-70 mL environ de distillat.

5/ Doser le distillat au moyen de NaOH (0,1 N) en présence de phénolphtaléine.

- Calculer la quantité d’acide acétique présente dans le distillat.

I.5. La chromatographie: aspects généraux:

La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différences
d'affinités des substances à analyser à l'égard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe,
l'autre mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des
composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur
désorption successive sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque
phase.

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Nature des phases:

Phase fixe:
La phase fixe peut être solide ou liquide. Les solides, silice ou alumine traitées,
permettent la séparation des composants des mélanges grâce à leurs propriétés adsorbantes. Ils
peuvent être employés comme remplissage d'une colonne (chromatographie par gravité et
chromatographie à haute performance ou HPLC) ou étalés en couche mince sur une plaque de
verre, d'aluminium  ou sur une feuille de matière plastique (chromatographie sur couche
mince ou CCM)
La phase fixe peut aussi être constituée par un liquide imprégnant un support solide ou
encore par une chaîne carbonée fixée sur un support (phase greffée). Ainsi en
chromatographie sur papier, la phase fixe est formée par l'eau que les molécules de cellulose
du papier adsorbent, alors qu'en chromatographie en phase gazeuse, elle est constituée d'un
liquide peu volatil et thermiquement stable imprégnant un granulé poreux.
Phase mobile:
La phase mobile est:
- Soit un gaz (ex: chromatographie en phase gazeuse): la phase mobile est appelée gaz
vecteur ou gaz porteur.
- Soit un liquide (ex: chromatographie sur papier, couche mince ou colonne): la phase
mobile est appelée éluant.

Manipulation :

Chromatographie sur papier:

1. Principe

La chromatographie sur papier est fondée sur la différence de solubilité des substances
à séparer vis à vis de deux phases parfaitement miscibles, la phase stationnaire constituée
par le système cellulose du papier-eau et la phase mobile (solution aqueuse eau salée-
éthanol par exemple).La chromatographie sur papier est employée principalement pour
l'analyse de composés très polaires, tels les acides aminés, les sucres et les composés
polyfonctionnels.

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L’échantillon, mis en solution, est déposé en un point repère du papier et le solvant,

qui se déplace par capillarité, fait migrer les composants de l'échantillon à des vitesses
variables selon leur solubilité. Généralement, les composés les plus solubles dans l'eau ou
ceux qui forment facilement des associations par liaisons hydrogène sont fortement retenus
par la phase stationnaire et migrent donc lentement.

2. Papier:

On peut utiliser du papier filtre ordinaire, mais il est préférable de se procurer du

papier conçu pour cet usage, ayant un faible taux d'impuretés et dont les caractéristiques sont
uniformes. Les marques principales sont Whatman, Schleicher et Schüll, Durieux, Arches.
3. Matériel  et Réactifs
a. Matériel
o un bécher ou une cuve à chromatographie,
o une pince de bureau,
o un petit bâton,
o une bande de papier filtre ou papierWhatman.
b. Réactifs :
o Solvant : solution de chlorure de sodium (NaCl) à 10g. L-1.
o Plusieurs stylos feutres de couleurs différentes.
4. Protocole expérimental :
o Verser la solution de NaCl dans la cuve sur une hauteur de 1 cm.
o A l’aide d’un crayon à papier, tracer un trait à 1,5 cm du bas de la feuille de
papier filtre/ Whatman dans le sens de la largeur.
o Faire 4 croix espacées régulièrement et déposer sur le papier quatre tâches
avec des feutres de couleurs différentes
o tremper la feuille dans le bécher en veillant à ce que les tâches ne trempent
pas dans l’eau salée.
o Laisser évoluer et observer.
o Lorsque le front du solvant est arrivé à environ 1 cm du bord supérieur,
sortir le papier et noter (au crayon à papier) le front du solvant.
5. Exploitation des résultats :
- Faire un schéma de l’expérience (bien préciser la position et la nature de la phase
stationnaire et de la phase mobile).

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- - Quel est le colorant le plus soluble dans l’éluant (justifier).

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