TP. 1.
DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DE L’AMIDON TOTAL,
L’AMYLOSE ET L’AMYLOPECTINE
Principe
l’amidon (polysaccharides de réserve chez les végétaux) est une macromolécule constituée de deux
polymères de D-glucose : Amylose et amylopectine (Figure 1). L’amylose est constitué essentiellement
d’unités de D-glucoses unies entre elles par des liaisons de type
(14). L’amylopectine consiste essentiellement en unités (14)-D-glucosidiques linéaires mais
branchée, par des liaisons de type (16)-D-glucosidiques à tous les 24-30 unités de glucose.
L’amylopectine contient plus de 10 6 résidus de D-glucose , la rendant ainsi la macromolécule
biologique la plus volumineuse qui existe. La structure primaire de l’amylopectine est semblable
à celle du glycogène (polysaccharide de réserve chez les animaux) mais le nombre de résidus de D-
glucose dans les ramifications est de l’ordre de 8 à 12 dans le glycogène. En d’autres termes le
glycogène est plus ramifié que l’amylopectine.
L’iode (I2) interagit avec l’amylose et l’amylopectine pour donner une coloration
respectivement bleue et brune. Les spectres des complexes I2-amylose et I2-amylopectine sont
différents. De ce fait ces complexes ont des longueurs d’ondes maximales pour l’amylose (max
= 630 nm) et l’amylopectine (max = 548 nm) qui sont différentes. En plus l’amylose absorbe dans
le proche visible tan disque l’amylopectine n’y absorbe pas (Figure 2). On peut donc utiliser
cette différence spectrale pour doser simultanément l’amidon total, l’amylose et l’amylopectine dans
un matériel biologique. Dans cette manipulation on considérera que l’absorbance à 580 nm est liée à
la fois à l’amylose et à l’amylopectine, par contre l’absorbance à 720 nm est liée essentiellement à
l’amylose.
Matériels et réactifs
- Bain –marie
- Spectrophotomètre UV-visible
- Tubes à essais
- Plaques chauffantes
- Réactif de (I2 / KI) (iode/iodure de potassium).
- Amidon
- Cuvettes pour le spectrophotomètre.
- Pipettes graduées.
- Tubes à essai ou béchers.
- Cuvettes de mesure.
Mode opératoire
Conditions expérimentales
Longueur d'onde : 580 nm (ou celle correspondant au maximum d'absorbance de l’amidon).
Volume total pour chaque tube : 5 ml.
- a. Courbe d’étalonnage de l’amidon standard
Pesez 0,5 g d'amidon avec la balance analytique.
Mettez l'amidon pesé dans un bécher de 100 mL.
Ajoutez une petite quantité d'eau distillée (environ 10-20 mL).
Chauffez légèrement le mélange tout en remuant constamment avec une baguette de verre. L'amidon
se dissout mieux dans l'eau chaude (mais pas bouillante),
Continuez à remuer jusqu'à ce que l'amidon soit complètement dispersé dans l'eau. La solution peut
être légèrement trouble
Complétez avec de l'eau distillée jusqu'à atteindre exactement 100 mL.
Transférez la solution dans un flacon propre et étiqueté.
Préparer les solutions standard :
Préparez une série de solutions d'amidon ou d'amylopectine de concentrations connues (ex: 0, 0.01,
0.02, 0.03, ...0.10 mg/mL) en diluant une solution stock de concentration élevée.
Ajoutez une quantité fixe du réactif (comme I2_22/KI) à chaque solution standard.
Mélangez bien et laissez reposer un peu pour que la couleur se développe complètement.
Mesurer l'absorbance :
Pour chaque solution standard, mesurez l'absorbance à une longueur d'onde spécifique, souvent
autour de 580 nm pour l'amidon avec le réactif I2_22/KI.
Notez les valeurs d'absorbance correspondantes à chaque concentration.
racer la courbe d'étalonnage :
Sur un graphique, placez les concentrations d'amidon ou d'amylopectine en abscisse (axe x) et les
absorbances en ordonnée (axe y).
Tracez une droite de régression linéaire si la relation est linéaire (ce qui est souvent le cas pour les
faibles concentrations).
Remarques
Assurez-vous que les conditions expérimentales (quantité de réactif, temps de réaction, température,
etc.) sont identiques pour toutes les solutions.
La courbe d’étalonnage devrait être linéaire pour des concentrations faibles à moyennes. À des
concentrations élevées, la relation peut devenir non linéaire en raison de la saturation
Réactif /tube T=0 T=1 T=2 T=3 T=4 T=5 T=6 T=7 T=8 T=9 T=10
(Blanc)
La concentration 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
Des tubes (mg/ml)
Volume 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4 .5 5
correspondant
H2O (ml) 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0
Réactif I2/KI 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
(ml)
Durée 10 min avant les lectures des DOs
d’incubation
DO1 (580 nm)
DO2 (720 nm)
