Cours : Biotechnologie Végétale
Chapitre I : Multiplication végétative in vitro
Rappel de la multiplication végétative (asexuée) classique : Définition, exemples (bouturage,
marcottage, greffage), avantages et inconvénients.
Introduction à la multiplication végétative in vitro : Définition et concept fondamental de la
culture de tissus végétaux pour la propagation.
Importance et applications de la multiplication in vitro : Production à grande échelle, obtention
de matériel sain, conservation d'espèces rares, multiplication de génotypes élites, etc.
2. Définitions
Culture in vitro : Culture de cellules, tissus ou organes végétaux sur un milieu nutritif stérile
dans des conditions de laboratoire contrôlées.
Multiplication végétative in vitro (Micro propagation) : Ensemble des techniques de culture in
vitro visant à produire un grand nombre de copies génétiquement identiques d'une plante mère.
Explant : Fragment de tissu végétal (bourgeon, feuille, tige, racine, méristème, etc.) utilisé
pour initier la culture in vitro.
Cal : Masse de cellules parenchymateuses indifférenciées résultant de la dédifférenciation des
cellules de l'explant.
Organogenèse : Processus de formation de nouveaux organes (pousses, racines) à partir d'un
cal ou directement de l'explant.
Embryogenèse somatique : Processus de formation d'embryons bipolaires à partir de cellules
somatiques (non reproductrices).
Milieu de culture : Mélange nutritif stérile contenant des macro-éléments, des micro-éléments,
des vitamines, des sucres, des hormones de croissance et d'autres additifs nécessaires à la
croissance et au développement des tissus végétaux in vitro.
Acclimatation (Endurcissement) : Adaptation progressive des plantules issues de la culture
in vitro aux conditions environnementales ex vitro (serre, plein champ).
Totipotence des cellules végétales : Capacité d'une cellule végétale différenciée à se
dédifférencier et à régénérer une plante entière sous des conditions appropriées.
Plasticité du développement végétal : Flexibilité des cellules et des tissus végétaux à modifier
leur programme de développement en réponse à des signaux environnementaux et hormonaux.
Rôle des hormones de croissance (régulateurs de croissance des plantes) :
Auxines : Impliquées dans la division cellulaire, l'élongation cellulaire, la formation des
racines, la dominance apicale et la formation de la cal.
Cytokinines : Impliquées dans la division cellulaire, la croissance des bourgeons, la levée de
la dominance apicale et le retardement de la sénescence.
Interactions hormonales : Le rapport entre les concentrations d'auxines et de cytokinines dans
le milieu de culture est crucial pour déterminer la voie de développement (callogenèse,
organogenèse, embryogenèse).
I. Techniques de la culture in vitro
1. Conditions de culture in vitro :
Asepsie (Stérilité) : Importance cruciale pour éviter la contamination par des micro-
organismes (bactéries, champignons) qui peuvent nuire ou détruire les cultures.
Stérilisation du matériel : Autoclavage (chaleur humide sous pression), stérilisation à chaleur
sèche, filtration.
Stérilisation du milieu de culture : Autoclavage.
Désinfection de l'explant : Utilisation d'agents chimiques (hypochlorite de sodium, éthanol,
peroxyde d'hydrogène) suivie de rinçages stériles.
Travail sous flux laminaire : Maintien d'un environnement de travail stérile.
Milieu de culture : Composition et rôle des différents composants.
Macroéléments : Azote (N), Phosphore (P), Potassium (K), Calcium (Ca), Magnésium (Mg),
Soufre (S) - nécessaires en grandes quantités pour la croissance.
Microéléments : Fer (Fe), Manganèse (Mn), Zinc (Zn), Bore (B), Cuivre (Cu), Molybdène
(Mo), Iode (I) - nécessaires en petites quantités comme cofacteurs enzymatiques.
Vitamines : Thiamine (B1), Nicotinamide (B3), Pyridoxine (B6), Acide pantothénique (B5),
Biotine (B7), Acide folique (B9), Myo-inositol - jouent un rôle dans le métabolisme cellulaire.
Sucres : Généralement du saccharose - source de carbone et d'énergie.
Hormones de croissance (Régulateurs de croissance des plantes) : Auxines et cytokinines
(et parfois gibbérellines, acide abscissique).
Autres additifs : Acides aminés, extraits naturels (extrait de levure, hydrolysat de caséine),
agents gélifiants (agar-agar, gellan gum), charbon actif, etc.
Différents types de milieux de culture : Milieux de base (MS, Gamborg B5, White), milieux
spécifiques adaptés aux espèces et aux étapes de culture.
Conditions environnementales : Contrôle précis des facteurs physiques.
Température : Généralement entre 22-28°C, optimale pour la plupart des espèces.
Lumière : Intensité, photopériode (durée du jour/de la nuit), qualité spectrale - influencent la
croissance et la morphogenèse.
Humidité relative : Contrôlée dans les récipients de culture.
Aération : Échanges gazeux limités dans les récipients, importance de la composition de
l'atmosphère.
2. Les besoins des plantes in vitro
Besoins nutritionnels : Détail des rôles des macro-éléments, micro-éléments et vitamines pour
le métabolisme et la croissance des tissus végétaux in vitro.
Besoins hormonaux : Importance de l'équilibre hormonal (auxines/cytokinines) pour induire
la dédifférenciation, la division cellulaire, la formation du cal, l'organogenèse et
l'embryogenèse. Exemples concrets de concentrations hormonales utilisées pour différentes
étapes.
Besoins en eau et en nutriments : Absorption des nutriments à partir du milieu de culture
gélifié ou liquide.
Besoins en support : Rôle de l'agent gélifiant pour fournir un support physique et faciliter
l'absorption des nutriments.
Besoins en environnement contrôlé : Importance de la température, de la lumière et de
l'asepsie pour une croissance optimale et la prévention des stress.
3. Les techniques de multiplication
Introduction aux différentes approches de multiplication in vitro : Présentation des principales
techniques basées sur différents explants et voies de développement.
3.1. Micro propagation
Définition : Multiplication rapide et à grande échelle de plantes génétiquement identiques à
partir de petits explants (bourgeons axillaires ou apicaux).
Étapes de la micropropagation (Schéma illustratif) :
Étape 0 : Sélection et préparation de la plante mère.
Étape I : Initiation de la culture : Isolement et désinfection de l'explant, mise en culture sur un
milieu d'initiation.
Étape II : Multiplication (Prolifération) : Induction de la formation de pousses multiples à
partir de l'explant initial sur un milieu enrichi en cytokinines.
Étape III : Enracinement : Transfert des pousses sur un milieu favorisant la formation des
racines (riche en auxines).
Étape IV : Acclimatation : Transfert progressif des plantules enracinées vers des conditions
ex vitro.
Avantages de la micropropagation :
Multiplication rapide, production de matériel sain, uniformité génétique, possibilité de
multiplier des espèces difficiles à propager par voie conventionnelle.
Inconvénients de la micro propagation :
Coût élevé, risque de variations soma clonales, nécessité de personnel qualifié, sensibilité aux
contaminations.
Applications de la micro propagation :
Horticulture ornementale, agriculture (plants de pomme de terre, bananier, fraise), foresterie,
conservation d'espèces menacées.
3.2. Culture de méristèmes :
Définition : Culture in vitro de méristèmes apicaux ou axillaires (zones de cellules
indifférenciées à l'extrémité des tiges et dans les bourgeons).
Objectif principal : Obtention de plantes exemptes de virus et autres agents pathogènes
systémiques, car les méristèmes sont souvent épargnés par ces agents.
Taille de l'explant méristématique : Importance de la taille (quelques cellules
méristématiques avec un ou deux primordia foliaires).
Étapes de la culture de méristèmes : Isolement du méristème, culture sur un milieu favorisant
la croissance et le développement de la pousse, enracinement de la pousse obtenue.
3.3. Méristème apical caulinaire:
Spécificité de la culture du méristème situé à l'extrémité de la tige principale.
Applications de la culture de méristèmes : Production de matériel de base sain pour la
micropropagation, assainissement de variétés infectées par des virus.
3.3. Callogenèse :
Définition : Induction de la formation d’une cal (masse de cellules indifférenciées) à partir
d'un explant sur un milieu de culture approprié (riche en auxines).
Facteurs influençant la callogenèse : Type d'explant, composition du milieu de culture
(notamment le rapport auxines/cytokinines), conditions environnementales.
Utilisations du cal : Source de matériel pour l'organogenèse ou l'embryogenèse somatique,
étude du métabolisme secondaire, induction de variations somaclonales.
3.4. Embryogenèse somatique :
Définition : Formation d'embryons bipolaires (avec un pôle caulinaire et un pôle racinaire) à
partir de cellules somatiques (non reproductrices) in vitro.
Types d'embryogenèse somatique :
Embryogenèse somatique directe : Formation d'embryons directement à partir des cellules
de l'explant, sans passer par la phase de cal.
Embryogenèse somatique indirecte : Formation d'embryons à partir d'un cal préalablement
induit.
Étapes de l'embryogenèse somatique : Induction, développement des embryons (globulaire,
cœur, torpille, cotylédonaire), germination des embryons somatiques en plantules.
Facteurs influençant l'embryogenèse somatique : Type d'explant, composition du milieu de
culture (équilibre hormonal, présence d'agents stressants), génotype de la plante.
Avantages de l'embryogenèse somatique : Potentiel de multiplication à très grande échelle
(utilisation de bioréacteurs), possibilité de cryoconservation des embryons somatiques.
Applications de l'embryogenèse somatique : Production massive de plants, amélioration des
plantes (sélection d'embryons résistants), production de graines artificielles.
3.5. Les variations somaclonales et leurs applications
Définition : Apparition de variations génétiques ou épigénétiques chez les plantes régénérées
in vitro à partir de cellules somatiques.
Origines des variations somaclonales : Mutations génétiques, réarrangements
chromosomiques, changements épigénétiques induits par le stress de la culture in vitro.
Détection des variations somaclonales : Analyse morphologique, cytologique, biochimique
et moléculaire (ADN, protéines).
Applications des variations somaclonales : Création de nouvelle variabilité génétique pour
l'amélioration des plantes (sélection de mutants présentant des caractères intéressants :
résistance aux maladies, tolérance aux stress, etc.).
Inconvénients des variations somaclonales : Perte d'uniformité génétique, apparition de
caractères indésirables.
Stratégies pour minimiser les variations somaclonales : Utilisation d'explants
méristématiques, réduction du temps de culture, optimisation des milieux de culture.
Le schéma montre les étapes de la multiplication végétative in vitro, une technique qui utilise
des morceaux de plante (explants : racines, tiges, feuilles...) cultivés dans un milieu stérile. Ces
explants peuvent suivre deux voies :
1. Morphogenèse directe :
Formation directe de bourgeons (caulogenèse) ou d’embryons somatiques sans passer par un
callus.
2. Morphogenèse indirecte :
les cellules forment d’abord un callus, puis ce callus peut donner :
des bourgeons (caulogenèse),des embryons somatiques, ou des suspensions cellulaires.
Ensuite, on obtient une tige feuillée, puis un enracinement, ce qui donne une plantule complète.
Ces plantules peuvent être transformées en semences artificielles.
Cette technique permet de produire beaucoup de plantes identiques, rapidement et
en toute sécurité.
Chapitre II : Amélioration des plantes par des méthodes de
biotechnologie
Introduction du Chapitre II
Rappel des méthodes conventionnelles d'amélioration des plantes : Sélection massale,
croisement, hybridation. Leurs limites (temps, compatibilité sexuelle, introduction de
caractères liés).
Introduction aux biotechnologies pour l'amélioration des plantes : Définition et aperçu des
différentes techniques (culture in vitro, modification génomique).
Objectifs de l'amélioration des plantes par biotechnologie : Augmentation du rendement,
amélioration de la qualité nutritionnelle, résistance aux stress biotiques et abiotiques,
production de molécules d'intérêt.
Présentation des deux grandes sections de ce chapitre : Haplodiploïdisation et Culture et
fusion des protoplastes.
I. Haplodiploïdisation
Introduction à l'haplodiploïdisation : Définition et principe général de l'obtention de plantes
haploïdes (n) et de leur diploïdisation pour obtenir des plantes homozygotes (2n).
1. Culture d’haplotides
Principe : Utilisation de cellules reproductrices haploïdes (gamètes) pour régénérer des
plantes.
Méthodes :
Androgénèse (anthères/microspores) : Développement d'embryons ou de cals haploïdes à partir
de cellules mâles immatures (microspores) isolées des anthères.
Gynogenèse (ovaires/ovules) : Développement d'embryons ou de cals haploïdes à partir de
cellules femelles non fécondées (ovules) isolées des ovaires.
Dédoublement chromosomique : Induction de la diploïdisation des plantes haploïdes pour
obtenir des plantes homozygotes diploïdes (haploïdes doublés - HD).
Agents chimiques : Colchicine (inhibe la formation du fuseau mitotique), Oryzaline (agit sur
la polymérisation de la tubuline). Mécanismes d'action.
Méthodes physiques : Choc thermique, centrifugation (moins courantes).
Intérêts :
Obtention de plantes homozygotes : Atteinte de l'homozygotie en une seule génération (au
lieu de plusieurs cycles de rétrocroisement). Importance pour la fixation des caractères et la
création de lignées pures.
Gain de temps pour la création variétale : Réduction significative de la durée du processus
de sélection et de création de nouvelles variétés.
Applications en génomique et transformation génétique : Facilite l'étude des gènes récessifs
et l'intégration de transgènes dans un fond génétique stable.
Outils pour :
Marqueurs de sélection : Association directe des marqueurs génétiques avec les phénotypes
d'intérêt en l'absence d'hétérozygotie.
QTL mapping (Cartographie des loci de caractères quantitatifs) : Simplification de
l'identification des régions génomiques responsables de caractères complexes.
Ingénierie génétique et cartes génétiques : Utilisation de plantes haploïdes doublées pour des
études fondamentales et appliquées en génomique.
Expression des gènes récessifs : Les gènes récessifs s'expriment directement chez les
haploïdes, facilitant leur identification et leur étude.
2. Haplotides et haplotides doublés (HD)
Définitions :
Haplotides (n) : Plantes possédant un seul jeu de chromosomes (nombre haploïde).
Généralement de petite taille et souvent stériles.
Haplotides doublés (HD) (2n homozygotes) : Plantes diploïdes obtenues par le doublement
du nombre de chromosomes des haplotides. Elles sont homozygotes pour tous leurs gènes.
Caractéristiques :
Petite taille et vigueur réduite (haplotides) : Due à la présence d'un seul jeu de chromosomes.
Stérilité (haplotides) : Difficulté ou incapacité à produire des gamètes fonctionnels en raison
d'anomalies méiotiques.
Nécessité de doublement chromosomique : Étape cruciale pour obtenir des plantes fertiles et
homozygotes (HD) utilisables en sélection.
3. Production de plantes haplotides
Spontanée : Apparition naturelle de plantes haploïdes à une faible fréquence.
Parthénogenèse : Développement d'un embryon à partir d'un ovule non fécondé.
Apomixie : Reproduction asexuée par graine, où l'embryon se développe sans fécondation.
Peut parfois produire des haploïdes.
Méthodes induites : Techniques expérimentales pour augmenter la fréquence d'obtention de
plantes haploïdes.
Androgénèse (anthères/microspores) : (Développé plus en détail ultérieurement).
Gynogenèse (ovules/ovaires) : (Moins courante que l'androgénèse dans de nombreuses
espèces). Culture in vitro d'ovaires ou d'ovules non fécondés pour induire le développement
haploïde.
Croisements interspécifiques : Utilisation de croisements entre espèces ou genres différents,
suivis de l'élimination sélective des chromosomes d'un des parents lors du développement
embryonnaire. Exemple : Hordeum bulbosum x Hordeum vulgare.
4. Facteurs influençant l’induction
Génotype : Forte influence de l'espèce et de la variété sur la capacité à produire des haploïdes
in vitro. Certaines espèces et génotypes sont plus réceptifs que d'autres.
Conditions physiologiques de la plante donneuse : Âge de la plante mère, stade de
développement des organes reproducteurs, conditions de croissance (nutrition, stress).
Stress (thermique/hydrique) : Application de stress modérés (choc thermique, stress
hydrique) aux organes reproducteurs peut parfois stimuler l'induction d'haploïdes.
Milieux de culture :
Carence : Utilisation de milieux de culture avec des concentrations réduites en certains
nutriments.
Osmolarité : Ajustement de la pression osmotique du milieu (ajout de mannitol, sorbitol) peut
influencer la réponse des cellules haploïdes.
Hormones : Équilibre et concentration des régulateurs de croissance (auxines, cytokinines)
jouent un rôle crucial.
5. Androgénèse
Définition : Culture in vitro de microspores (cellules haploïdes issues de la méiose dans les
anthères) ou de pollen (microspores matures) pour induire leur développement en embryons ou
cals haploïdes.
Historique : Mention de la découverte de la production d'haploïdes par culture d'anthères par
Guha et Maheshwari en 1964 chez Datura innoxia.
Techniques :
Directe (embryogenèse) : Les microspores se développent directement en embryons haploïdes
sans passer par une phase de cal.
Indirecte (via cals) : Les microspores forment d'abord un cal indifférencié, qui est ensuite
induit à régénérer des pousses haploïdes.
Gamétogenèse mâle : Rappel des étapes de la formation des microspores et du pollen (méiose,
mitose pollinique, formation de la cellule végétative et de la cellule générative). La division
asymétrique de la microspore est une étape clé.
Rendement : Mesure de l'efficacité de l'androgénèse (nombre de plantes haploïdes obtenues
par rapport au nombre d'anthères ou de microspores cultivés). Exemples de rendements chez
le tabac et le riz, soulignant la variabilité interspécifique et variétale.
Facteurs génétiques :
Familles prédisposées : Certaines familles de plantes (Solanacées, Graminées) présentent une
plus grande aptitude à l'androgénèse.
Variabilité intra-espèces : Différences significatives dans la capacité d'androgénèse entre les
variétés au sein d'une même espèce (exemples du blé et de la tomate).
Facteurs physiologiques :
Environnement : Importance de la température (chocs thermiques), de la lumière (obscurité
initiale) et de l'humidité pendant la culture des anthères ou des microspores.
Procédure (cas du rosier) : Exemple concret des étapes de l'androgénèse, illustrant les
techniques utilisées.
Stress thermique/mécanique : Application de traitements de stress pour favoriser la
réorientation du développement des microspores.
Désinfection et digestion enzymatique (isolement des microspores) : Étapes pour obtenir
une suspension de microspores pures.
Milieu de carence ("starvation") : Utilisation de milieux de culture spécifiques pour induire
l'embryogenèse des microspores.
II. Culture et fusion des protoplastes
Introduction à la culture et à la fusion des protoplastes : Définition des protoplastes et aperçu
de leur utilisation pour l'amélioration des plantes.
1. Définition des protoplastes :
Cellules végétales dont la paroi cellulaire a été complètement ou partiellement éliminée par des
méthodes enzymatiques et/ou mécaniques.
2. Intérêts:
Hybridation somatique : Fusion de protoplastes de deux plantes différentes pour créer des
hybrides somatiques, contournant les barrières d'incompatibilité sexuelle.
Transformation génétique directe : Introduction d'ADN étranger directement dans le
cytoplasme des protoplastes.
3. Procédure
Isolement : Obtention des protoplastes à partir de tissus végétaux.
Purification : Séparation des protoplastes viables et intacts des débris cellulaires.
Culture : Maintien et régénération de la paroi cellulaire des protoplastes en milieu in vitro.
Fusion : Induction de la fusion de deux ou plusieurs protoplastes.
4. Isolement des protoplastes
Plasmolyse : Immersion des tissus végétaux dans une solution hypertonique (contenant du
mannitol ou du sorbitol) pour provoquer la plasmolyse et faciliter l'action des enzymes sur la
paroi.
Traitement mécanique : Méthodes physiques pour libérer les protoplastes (moins courantes
pour l'isolement à grande échelle).
Digestion enzymatique : Utilisation d'enzymes spécifiques pour dégrader les composants de
la paroi cellulaire.
Cellulase : Hydrolyse les liaisons β-1,4 glycosidiques de la cellulose.
Pectinase : Dégrade les pectines, les principaux composants de la lamelle moyenne et de la
paroi primaire.
Hémicellulase : Dégrade les hémicelluloses.
Filtration et purification : Utilisation de filtres de différentes tailles pour éliminer les débris
cellulaires et les cellules non digérées. Centrifugation pour concentrer les protoplastes.
5. Purification :
Centrifugation : Séparation des protoplastes en fonction de leur densité.
Tests de viabilité : Utilisation de colorants fluorescents (ex : Fluorescein Diacetate - FDA)
pour évaluer l'intégrité de la membrane plasmique et la viabilité des protoplastes.
6. Culture
Milieux : Utilisation de milieux de culture adaptés (MS, B5 modifiés) avec des concentrations
spécifiques en nutriments et hormones pour favoriser la régénération de la paroi cellulaire et la
division cellulaire.
Conditions : Culture en obscurité initiale pour favoriser la régénération de la paroi, suivie d'un
passage à la lumière pour la croissance et la différenciation.
8. Fusion et hybridation somatique :
Méthodes :
Chimique : Utilisation d'agents chimiques comme le Polyéthylène Glycol (PEG) à haute
concentration pour induire l'agrégation et la fusion des membranes plasmiques.
Électrique (électrofusion) : Application de champs électriques pulsés pour aligner les
protoplastes et induire leur fusion.
Types d’hybrides :
Intraspécifiques : Fusion de protoplastes provenant de différentes variétés de la même espèce.
Interspécifiques (somatiques) : Fusion de protoplastes provenant d'espèces différentes,
surmontant les barrières d'incompatibilité sexuelle.
Diversité des produits :
Hybrides symétriques : Hybrides somatiques contenant le matériel génétique complet des
deux parents dans le noyau.
Hybrides asymétriques : Hybrides somatiques ayant perdu une partie du matériel génétique
d'un des parents lors de la fusion ou des divisions cellulaires suivantes. Utilisés pour transférer
des caractères spécifiques.
Cybrides (hybrides cytoplasmiques) : Plantes possédant le noyau d'un parent et le cytoplasme
(mitochondries et chloroplastes) de l'autre parent. Utiles pour étudier l'hérédité cytoplasmique
et transférer des organites.
Répartition des génomes : Analyse du matériel génétique des hybrides somatiques et des
cybrides (ADN nucléaire, ADN mitochondrial, ADN chloroplastique) pour déterminer la
contribution de chaque parent.
Gamétogenèse mâle (chez les plantes)
C’est la formation des gamètes mâles à partir des microspores.
Elle commence par une division asymétrique du noyau de la microspore : la première division
pollinique.
Cette division donne deux cellules différentes :
Cellule végétative : forme le tube pollinique.
Cellule générative : fait une mitose et donne deux spermatozoïdes