Université Alassane Ouattara

GENETIQUE
COURS MAGISTRAUX: ETUDE
FONDAMENTALE DE génétique

LICENCE 2

TOURE MAHAMA, Maître de Conférences

Email: [email protected]
Tél: +225 01 40 37 67 81
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Chapitre 1. Génétique et organisme

Pourquoi s'intéresser a la génétique ?

Deux raisons :
 La première est qu’elle est devenue une plaque tournante de la biologie et
comprendre la génétique est capital pour tous ceux qui désirent se spécialiser
dans l’étude de la vie des plantes, des animaux et des microorganismes. Elle
unifie les sciences biologiques et humaines).
 La deuxième raison est qu’elle occupe une position centrale dans divers secteurs
des activités humaines (Figure 1).

Médecine

Agriculture
Droit

Ecologie Génétique
Sociologie

Philosophie
Botanique

Figure 1. Les découvertes de la génétique ont de l'impact sur de nombreux domaines

de l'activité humaine.

Ce chapitre présente un panorama de la science génétique et montre comment elle

est arrivée à occuper cette position essentielle.

1. Définitions
1.1. Génétique
La génétique est l’ensemble des principes et des méthodes analytiques qui
permettent d‘étudier les phénomènes héréditaires ; l'hérédité étant la similarité
biologique entre des parents et leur descendance.
Cette science a débuté en 1860 avec le moine GREGOR MENDEL, premier
chercheur à avoir utilisé de véritables techniques de génétiques. En effet, à partir
d’une série d’expériences mettant en évidence des éléments biologiques qu’il a appelé
facteurs ; il a proposé la «théorie particulaire de l’hérédité » pleinement confirmée par
la démonstration récente selon laquelle l’information génétique est codée d’une façon
discontinue en gènes dans la molécule d’ADN.
La génétique peut aussi être définie comme l’étude des gènes à travers leurs
variations transmissibles de génération en génération. Il y a trois concepts
 2

fondamentaux dans génétique : la génétique formelle ou génétique de la transmission,

la génétique de la population et la génétique moléculaire (Tableau 1).
L'étude des modes de transmission des gènes de génération en génération est
appelée la génétique de la transmission ou génétique formelle. La génétique
formelle s'intéresse aux caractères, définit les gènes responsables et propose leur
déterminisme génétique. La génétique formelle part du phénotype pour aboutir au
génotype. Les différents croisements réalisés sont contrôlés.
L'étude du comportement des gènes dans les populations est appelée génétique
des populations. Ici également, le généticien part du phénotype pour proposer le
génotype. Cependant, les croisements sont libres; donc les parents ne sont pas connus.
La génétique quantitative s’intéresse aux caractères quantitatifs, il s’agit de
caractères mesurables pour lesquels il existe un continuum parmi les génotypes
possibles. Exemple : taille, poids. La génétique quantitative s’intéresse à leur variation,
quantifie les facteurs responsables des variations et détermine l’héritabilité. Les
croisements réalisés peuvent être contrôlés ou non.
Une branche très récente résultant de l'approfondissement de la connaissance
sur le support de l'hérédité (ADN) est la génétique moléculaire. Elle étude la structure
et de la fonction des gènes. La génétique moléculaire part d'une structure (ADN) pour
expliquer comment un gène contrôle une fonction. Elle part donc du génotype au
phénotype. Elle est scindée aujourd’hui en deux branches :
- le génie génétique : l'ensemble des techniques qui visent à manipuler l'ADN.
Pratiquement, le génie génétique s'occupe de transférer de l'ADN d'une espèce dans
une autre pour le multiplier ou pour améliorer l'hérédité de certains individus, ou de
certaines populations chez les plantes.
- la génomique : crée en 1986 par Thomas Roderick c’est la branche de la biologie
moléculaire qui est centrée sur la cartographie des génomes et le séquençage de
l’ADN. Elle s’étend sur trois domaines :
1. la génomique structurale qui va de l’analyse physique d’un génome jusqu’à son
séquençage complet ;
2. la génomique comparative : elle utilise l’outil informatique pour comparer les
génomes d’organismes différents ;
3. la génomique fonctionnelle : son objectif est de déterminer les fonctions des
gènes.

Intérêt de la génomique :

1. connaître l’agencement particulier des gènes ;

2. localiser et identifier les gènes dont le dysfonctionnement est responsable des
maladies génétiques.
 3

Tableau1. Les principaux concepts de la génétique, les problématiques abordées et les

démarches.
Concepts Problématiques abordées Démarches adoptées
Génétique formelle 1 Etablit les effets phénotypiques Analyse les phénotypes
des gènes et les règles de pour conclure sur les
l’hérédité génotypes
2 Localise les gènes sur les
chromosomes
Génétique Détermine l’héritabilité * Analyse la variation des
quantitative caractères
* quantifie les facteurs
responsables des variations
Génétique des Etablit les facteurs qui Analyse les phénotypes
populations déterminent la composition pour conclure sur les
génétique des populations et les génotypes
changements de cette
composition dans le temps et
l’espace
Génétique 1 Détermine la nature du support Elle part d’une structure
moléculaire de l’hérédité (ADN) pour expliquer
2 Détermine la structure de l’ADN comment les gènes
3 Détermine comment contrôlent une fonction
l’information génétique est
stockée dans l’ADN et sa
manifestation au niveau de
l’organisme

1.2. Génome, chromosome, gène

Les cellules de tous les organismes, des bactéries à l'homme, contiennent un ou
plusieurs jeux d'un complément de DNA qui est particulier à chaque espèce. Ce
complément de DNA est appelé un génome. Le génome est subdivisé en
chromosomes; chaque chromosome est constitué d'une seule molécule, continue et
très longue de DNA. A son tour, un chromosome peut être partagé dans sa longueur en
de milliers de régions fonctionnelles appelées gènes, mais aussi en d'autres régions
dont les fonctions sont moins bien comprises. Le gène est donc l'unité structurale et
fonctionnelle de l'hérédité, porteuse de l'information d'une génération à l'autre; c'est un
segment du DNA comportant une région transcrite et une séquence rendant le contrôle
de la transcription possible.

Ainsi défini, un gène peut être considéré comme une unité fonctionnelle de
l’hérédité. Il porte l’information biologique nécessaire à la mise en place de
caractères (traits) héréditaires : forme, fonction, couleur, etc. Chaque caractère peut se
manifester sous plusieurs variantes. Ces variations stables et transmissibles
constituent la matière première de toute analyse génétique (Figure 2). L’étude de ces
variations se fait sur la base de principes et d’analyses statistiques.
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(A)

(B)

(C)

(D)
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(E)

(F)
Figure 2. Quelques variations stables et transmissibles constituant la matière première
de l'analyse génétique. (A) Les fruits de deux formes différentes de Plectritis
congesta. (B)Deux morphotypes de crocodiles (C) Fleurs de la digitale. (D) Les
caractéristiques de la croissance de tomates dites indéterminées (Sp) et déterminées
(sp). La plante déterminée porte de moins en moins de feuilles entre le inflorescences
au fur et à mesure que l'on se rapproche du sommet de la tige et chaque tige se termine
par une inflorescence.. (E) Quelques-uns de nombreux phénotypes de tomates
produits par les pépiniéristes. (F) Différents phénotypes de grains de maïs.

1.3. Locus génétique, allèle, génotype et phénotype

Le locus génétique est l'emplacement d'un gène donné sur un chromosome. Un
allèle est un des multiples états possibles d'un locus génétique. Le génotype est la
composition allélique d'une cellule particulière; fait référence le plus souvent à un gène
ou un ensemble de gènes. Le phénotype est la manifestation externe d'un génotype
spécifique.
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1.4. L’acide désoxyribonucléique (ADN)

L'ADN constitue la structure de base du chromosome. C’est le matériel
héréditaire qui est transmis d’une génération à l’autre et qui détermine les propriétés
intrinsèques des espèces. Chaque molécule d’ADN est une structure extrêmement
longue et filiforme qui s’associe à des protéines et des ARN pour former le
chromosome.
La génétique s'efforce de comprendre les propriétés du matériel génétique : les
acides désoxyribonucléique et ribonucléique mieux connus par leurs abréviations:
ADN et ARN. Les généticiens étudient les propriétés du DNA à divers niveaux, depuis
les cellules jusqu'aux populations.

2. Génétique et activités humaines

La génétique a fortement influencé les activités humaines (Figure 1). La
majorité des aliments et vêtements provient d’organismes améliorés génétiquement.
Les possibilités d’amélioration sont encore accrues par l’ingénierie génétique. En
effet, en tant qu’ensemble de principes de techniques et de méthodes, elle permet de :
* acquérir de nombreuses connaissances sur les êtres vivants dans leur genèse, leur
fonctionnement et leur évolution ;
* faire des améliorations intensives aboutissant à des productions agricoles
maximales ;
* faire des biosynthèses de protéines indispensables dans les domaines de la santé, de
l’alimentation, et de l’environnement grâce à la technologie de l’ADN recombinant
ou génie génétique

2.1. La portée de la génétique classique

Un aspect important de cette génétique a été orienté dans l’amélioration des
plantes et des animaux. On procède par croisements et tries parmi les descendants pour
obtenir les génotypes recherchés. Ici le gène responsable du caractère d’intérêt n’est
connu (composition en bases).
2.1.1. Amélioration génétique du caféier
Les programmes d’amélioration génétique des caféiers visent à mettre au point
des variétés qui allient les qualités (goût, arôme teneur en caféine) de l’arabica et les
capacités de résistance aux parasites du robusta.
C. arabica est très sensible aux attaques des champions, bactéries, nématodes et
insectes. Les graines ne supportent ni le froid ni la déshydratation. L’arabica totalise
68 % de la production, donne un café moins amer, plus aromatique et au taux de
caféine deux à trois fois moindre.
C. canephora pousse dans les plaines forestières, plus chaudes et plus humides
(Afrique de l’Ouest et centrale, Indonésie et Vietnam). Ces 2 espèces sont les seules à
être cultivées parmi les 80 répertoriées dans le monde.
La souche de café Coffea arabusta est obtenue par croisement entre les espèces
C. canephora et C. arabica allie l'essentiel des caractéristiques génétiques de ses deux
parents : résistance et productivité.
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2.1.2. Amélioration génétique du riz et du coton

Un autre exemple dans ce domaine est la création, par l’ADRAO, de nouvelles
variétés de riz naturellement parfumées et résistantes aux maladies, chacune étant
adaptée à une agro écologie précise.
Il y a aussi le cas du cotonnier "glandless" issu de croisements entre plusieurs
espèces de Gossypium.
2.2. La portée de la génétique moléculaire (biologie moléculaire)
Contrairement à la génétique classique, ici l’ADN est extrait et découpé. Par
ailleurs, le gène responsable du caractère d’intérêt est connu. Les domaines
d’intervention de la génétique moléculaire concernent l’agriculture, la médecine et le
droit.
2.2.1. Agriculture
Les découvertes dans cette branche de la génétique permettent aujourd’hui
d’introduire chez des animaux et des plantes, des gènes provenant d’autres espèces, et
de produire des animaux et des plantes génétiquement modifiés appelés OGM
(Organismes Génétiquement Modifiés) ou encore organismes transgéniques.
2.2.1.1. Animaux transgéniques
L’intérêt de produire ces animaux réside soit dans l’amélioration des
productions animales, soit dans la mise au point de modèles d’animaux de maladies
humaines, soit dans l’étude de la fonction d’un gène.
Deux méthodes sont utilisées pour l’obtention d’animaux transgéniques : la
micro-injection d’ADN étranger (gène d’intérêt) dans des œufs justes fécondés et
l’injection d’ADN dans les cellules embryonnaires (cellules ES, Embryonic Stem
cells).
La première méthode est la plus utilisée. Un gène d’origine étrangère est
introduit par micro-injection dans un œuf qui vient juste d’être fécondé. Ce gène
s’insère dans l’un des deux pronuclei avant qu’ils ne fusionnent. L’œuf ainsi
génétiquement modifié est réimplanté dans l’oviducte ou l’utérus d’une femelle
porteuse. Une proportion de 10 à 30% des œufs manipulés survivent et se développent
jusqu'à terme. Les organismes obtenus sont dits transgéniques et l'ADN introduit est
appelé transgène. Les transgènes sont transmis d'une génération à l'autre comme les
gènes naturels.
C’est par cette méthode qu’à la fin de l'année 1982, deux groupes de chercheurs
américains avaient obtenu des souris "géantes" par injection du gène de l'hormone de
croissance de rat dans les œufs tout juste fécondés. Ces souris dites transgéniques car
ayant intégré dans leur patrimoine génétique un gène provenant d'une autre espèce
avaient une taille double de celle des souris normales et transmettaient à leur
descendance le gène en question.
En dehors de la souris, d’autres espèces d’animaux transgéniques ont été
produites non seulement chez les mammifères (lapin, porc, mouton, chèvre, vache)
mais aussi chez le poisson et certains invertébrés.
L’inconvénient de cette technique est que le gène s’insère au hasard et donc pas
obligatoirement dans un site qui permettra son expression. La possibilité existe
également qu’il s’insère dans une région essentielle du génome avec les risques de
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destruction d’un gène important, ou près d’un oncogène avec risque d’activation de cet
oncogène.
La deuxième méthode est plus complexe. Elle n’est en ce moment utilisée que
chez la souris. Le transgène est d’abord inséré dans un plasmide (fragment d’ADN
circulaire), qui est à son tour introduit dans des cellules prélevées sur des embryons à
un stade précoce de leur développement (blastocyste, stade à 64 cellules). Ces cellules
embryonnaires (cellules ES) transformées sont réinjectées dans un blastocyste et le
tout est implanté dans l’utérus d’une souris porteuse. Les descendants ayant le
transgène sont triés et croisés entre eux pour produire des transgéniques homozygotes.

2.2.1.2. Plantes transgéniques

Ces plantes sont obtenues après l’introduction dans leur patrimoine génétique
des gènes d’autres plantes et même des gènes d’animaux et de bactéries. Les objectifs
recherchés sont d’augmenter la productivité, de conférer une résistance à des
herbicides, à des insectes, à des pathogènes et à divers stress. L’application de la
transgénèse (ajout d’un gène à un organisme) est facilitée par la possibilité de
régénérer une plante entière à partir de quelques cellules végétales (embryogenèse
somatique).
L’introduction de gènes est effectuée par le biais d’une bactérie du sol,
Agrobacterium tumefaciens. Cette bactérie transforme naturellement les cellules
végétales grâce à son ADN circulaire appelé Plasmide Ti (tumor inducing). Après
infection d’une plante, une partie du plasmide Ti, appelée ADN-T intègre le
chromosome des cellules du tissu infecté, ce qui permet l’expression des gènes qu’il
porte (formation de tumeurs et synthèse de protéines).
Cette propriété d’A. tumefaciens est exploitée pour introduire des gènes
étrangers dans une plante. A cet effet, on construit un petit plasmide (vecteur
intermédiaire) dans lequel on insère le gène d’intérêt [par exemple le gène de la
résistance au glyphosate (herbicide)] et des gènes marqueurs de sélection [par exemple
un gène de résistance à la spectinomycine sélectionnable chez les bactéries et un gène
de résistance à la kanamycine, sélectionnable chez les végétaux]. Ce plasmide est
intégré dans la région ADN-T d’A. tumefaciens, auparavant délètée des gènes
responsables de la formation de tumeurs et de synthèse de protéiques (on dit que le
plasmide Ti est atténué ou désarmé). Les bactéries ayant effectivement incorporé le
vecteur (bactéries transformées) sont sélectionnées par culture sur un milieu
contenant le marqueur de sélection bactérien (spectinomycine). Les bactéries
transformées sont ensuite utilisées pour inoculer des petits fragments de tissu végétal
(petits morceaux de feuilles). Si l’infection par la bactérie réussit, son ADN-T sera
transféré aux cellules végétales et les gènes qu’il porte s’intégreront dans un de leurs
chromosomes. Si ces fragments végétaux sont cultivés dans un milieu contenant la
kanamycine, seules les cellules qui ont reçu l’ADN-T (et par conséquent le gène de la
résistance à l’herbicide) pourront se multiplier. La croissance de ces cellules aboutit à
la formation de petits amas de cellules appelés cals. Les cals peuvent ensuite être
traités de manière à produire des plantes entières, appelées plantes transgéniques.
L'utilisation de Agrobacterium tumefaciens a ainsi permis de produire des plantes
résistantes à des herbicides (Soja, Maïs), virus et insectes (Coton).
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2.2.2. Médecine
A partir de la structure moléculaire d’un gène il est possible d’étudier le défaut
physiologique qui provoque la maladie. Une fois que la nature de la maladie sera
connue, il sera possible de développer de nouvelles approches thérapeutiques. La
génétique humaine occupe incontestablement une place importante dans les activités
de l’homme. En effet cette discipline permettra à plus long terme de résoudre de
nombreux problèmes de santé mais surtout de connaître le plan d’ensemble de la
structure humaine.
Les applications du génie génétique en médecine sont nombreuses :
 détection des anomalies héréditaires par amniocentèse (analyse du liquide
placentaire)
 le diagnostic par sonde d'ADN
 la thérapie génique qui se propose d'apporter un nouveau gène pour pallier
l'insuffisance qualitative ou quantitative d'un gène résident altéré, de
moduler, en plus ou en moins, l'expression génétique endogène, cellulaire
ou éventuellement virale, ou encore de corriger exactement l'anomalie
structurale d'un gène muté.

2.2.3. Droit
Les empreintes génétiques utilisées comme outil pour l'étude des pedigrees et
l'identification des individus sont largement utilisées aussi bien dans le domaines
social (identification de vrai parents) que juridique (identification de criminels ou
victimes).
Les empruntes génétiques sont réalisées en sept étapes :
1. Le processus commence par l’extraction de l’ADN ;
2. L’ADN extrait est coupé en fragments de différentes longueurs à l’aide
d’enzymes spécifiques (endonucléases appelées enzymes de restriction) ;
3. Les fragments sont ensuite séparés selon leur longueur par électrophorèse sur
gel d’agarose ;
4. dénaturation de l’ADN (séparation des 2 brins de la double hélice) ;
5. Les fragments sont transférés sur une membrane en nylon de sorte que leurs
positions relatives sont conservées ;
6. La membrane en nylon est plongée dans une solution contenant des fragments
d’ADN radioactifs (sondes). Les sondes vont s’hybrider à des fragments
spécifiques d’ADN lié au nylon. L’excès des sondes est éliminé par lavage de
sorte que seules les fragments d’ADN liés aux sondes restent liés au nylon ;
7. L’ADN hybridé et lavé est transfert sur un film photographique et le profil
électrophorétique (électrophorégramme) pour être visualisé au rayon X.
Dans la recherche de parenté, on s’intéresse aux bandes qui sont présentes chez
l’enfant et absentes chez la mère. Le présumé père avec lequel le taux de bandes
spécifiques est élevé est le véritable père. Ce raisonnement est basé sur le fait qu’en
vertu des lois de la reproduction sexuée, tout gène de l’enfant est hérité du père ou de
la mère. Ainsi, dès qu’une bande présente chez l’enfant est absente chez la mère, on
doit le retrouver systématiquement chez le père.
Exemple:
 Le procès de OJ SIMPSON
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 RANDALL Jones en Floride USA.

3. Problèmes inhérents à l'application des résultats de la génétique

 Le problème éthique vis à vis des OGM
 Le dilemme Monsanto pour la vente du roundup et de la betterave résistante à
cet herbicide
 Le contrat des agriculteurs américains pour l'acquisition de la semence du maïs
résistant aux herbicides.
 La semence au gène terminator
 Faut-il faire comme WILMUT (clonage de Dolly, Figure 3) et cloner des
millionnaires, des joueurs de foot, des entrepreneurs médicaux, les belles
créatures, etc ?
 Déjà une équipe coréenne affirme avoir cloné des cellules humaines et qu'ils
auraient bloqué leur expérience avant que les cellules ne soient matures.

4. Génétique et biologie
Jadis la biologie était scindée en disciplines distinctes dont chacune étudiait la
vie à différents niveaux. Les découvertes de la génétique ont fourni des thèmes
unificateurs à toute la biologie de telle sorte qu’aujourd’hui un réseau conceptuel
unique rassemble toutes les ces disciplines. Le principal lien thématique est en réalité
la molécule d’ADN. Sa structure rend compte de 2 caractéristiques majeures de la
vie : la réplication et la genèse de la forme.
Le processus de réplication de l’ADN permet d’effectuer des copies des cellules
et des organismes et de les perpétuer L’ADN peut donc être considéré comme le fil qui
nous rattache à nos ancêtres dans l’évolution En outre, l’ADN contient les instructions
nécessaires à l’élaboration d’un organisme c’est à dire à la mise en place de la forme et
de ses traits spécifiques
La génétique a également conduit à des méthodes analytiques de pointe qui sont
actuellement utilisées dans toutes les disciplines biologiques :
 la dissection génétique qui permet d’identifier les gènes qui influencent les
structures et les processus ;
 l’utilisation de gènes spécifiques comme marqueurs pour identifier certains
animaux ou certaines plantes ;
 l’utilisation de l’ingénierie génétique en recherche fondamentale grâce à la
possibilité de transférer des gènes d’un organisme à un autre. Exemple : c’est la
création de plante brillante parce qu’elle exprime le gène phosphorescent de la
luciole. Création de chromosomes entièrement artificiels mais fonctionnels ;
 l’analyse génétique utilisée non seulement dans l’étude de l’hérédité mais aussi
dans tous les autres domaines de la biologie.

Le plus grand succès de la biologie est peut être celui d’avoir montré
exactement comment se fait le flux de l’information de l’ADN vers l’ARN et ensuite
vers les protéines.
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Chapitre 2. Support de l'information génétique

1. Manipulation des micro-organismes pour l'analyse génétique

Les micro-organismes considérés ici sont essentiellement des champignons et
des bactéries qui sont haploïdes. Les champignons sont des eucaryotes (leurs
chromosomes sont entourés d'une enveloppe nucléaire dans un noyau) alors que les
bactéries sont des procaryotes (leur chromosome n'est pas dans un compartiment
particulier). L'analyse génétique des micro-organismes haploïdes, en particulier les
bactéries et les virus a livré des informations capitales quant à la nature et la structure
du matériel génétique. Elle a également permis de déchiffrer le code génétique et de
comprendre la nature des mutations.

1.1. La culture des micro-organismes

On peut cultiver les micro-organismes unicellulaires en milieu liquide ou sur
une surface solide tel un gel d'agar, à condition de leurs fournir des éléments nutritifs
de base. Le milieu de culture est dit "milieu minimum" (MM) lorsqu'il ne contient
que des sels inorganiques, une source de carbone et de l'eau.
En milieu liquide, les bactéries se divisent par fission binaire : elles se
multiplient géométriquement jusqu'à ce que les produits nutritifs soient épuisés ou que
des produits toxiques (déchets) s'accumulent jusqu'à atteindre une concentration qui
provoque l'arrêt de la croissance. Si l'on prélève au moyen d'une pipette un échantillon
d'une culture liquide et qu'on le répartit régulièrement, avec un étaloir stérilisé, sur la
surface d'une boîte de Pétri contenant un milieu gélosé, les cellules vont s'y reproduire
par fission. Comme elles sont immobilisées sur le gel d'agar, toutes les cellules filles
vont rester groupées et constituer un amas. Quand cet amas dépasse 107 cellules, il
devient visible à l'œil nu sous forme de colonie. La manipulation qui vient d'être
décrite est appelée étalement (Figure 1). Si l'échantillon étalé ne contient qu'un petit
nombre de cellules, chaque colonie isolée sur la boîte sera issue d'une seule cellule
originelle. Les individus au sein d'une colonie descendant tous d'un ancêtre génétique
commun sont appelés clones.
Des champignons tels que les levures suivent exactement le même schéma de
croissance. La situation diffère légèrement chez les champignons à mycélium où les
cellules filles restent attachées en longues chaînes appelées hyphes ; la culture en
milieu liquide se transforme rapidement en une sorte de bouillon, contenant de petites
boules d'hyphes en suspension, chacune descendant d'une spore.
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Suspension de cellules Mise en culture de la suspension

bactériennes sur un milieu solide constitué d’agar

1 à 2 jours
d ’incubation

Boîte de Pétri
avec un gel d’agar

Colonies visibles (chaque colonie est un

Cellules individuelles
clone au départ d'une cellule isolée)
(non visibles à l'œil nu)

Figure 1. Culture de cellules bactériennes en laboratoire. Un petit nombre de cellules

bactériennes qui ont été cultivées dans un milieu liquide contenant des substances
nutritives appropriées sont étalées sur un milieu solide contenant les mêmes
nutriments. Chacune de ces cellules va se diviser par fission binaire et de nombreuses
divisions successives vont donner naissance à une colonie. Toutes les cellules d'une
colonie sont issues d'une seule cellule originale et ont donc le même génotype.

1.2. Le comptage des micro-organismes mis en culture

1.2.1. Le comptage au microscope
La suspension de bactéries est introduite dans une cellule de profondeur connue
gravée d'une grille de dimensions connues. Cet outil s'appelle un hématimètre (utilisé
à l'origine pour compter les globules sanguins, d'où son nom). On le place sous le
microscope ce qui permet de compter directement les cellules dans la suspension.

1.2.2. La turbidité
Les bactéries étant souvent trop petites pour être dénombrées au microscope, on
peut aussi obtenir leur nombre par des mesures densitométriques. On mesure
l'intensité lumineuse passant au travers d'une suspension de densité connue ; ces
mesures sont alors utilisées pour tracer une courbe. Une suspension de densité
inconnue peut alors être mesurée par rapport à cette courbe de calibrage.

1.2.3. L'unité de formation de colonies

Des volumes connus d'une suspension cellulaires, à des dilutions appropriées,
sont étalés sur la surface d'un milieu nutritif solidifié par l'adjonction d'agar. Chaque
cellule formera une colonie et les colonies pourront être dénombrées à l'œil nu.

1.2.4. Le compteur électronique

La figure 2 présente quelques exemples de techniques de culture et de

comptage des micro-organismes.
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Culture stock Cellules en Cellules étalée sur Grille de comptage

en gélose profonde suspension milieu solide

Comptage

Comptage

Colonies
(A)

Culture stock Spores en suspension Spore étalée sur Grille de comptage

en gélose profonde dans l’eau milieu solide

Comptage

Comptage

Colonies

(B)

Figure 2. Exemples de techniques de culture et de comptage des micro-organismes.

(A) Cellules individuelles. (B) Type mycélien.

1.3. Les caractères et phénotypes observés chez les micro-organismes

Il est possible d'analyser de nombreux traits (caractères) directement par
inspection visuelle des colonies ou par quelques tests biochimiques simples. Les
phénotypes exprimés par un caractère donné peuvent être attribués à la cellule
originelle du clone et les fréquences des différents phénotypes dans l'échantillon pipeté
peuvent être établies. Quatre principaux caractères, liés à la nature de la mutation qui
les engendre sont d'habitude analysés :
 Les caractères morphologiques résultant des mutations qui altèrent la
couleur, la forme ou la taille des colonies. Chez les micro-organismes
unicellulaires tels que les bactéries, les caractères morphologiques sont peu
pratiques. Ils nécessitent l'observation individuelle de chaque cellule au
microscope, ce qui limite considérablement le nombre de cellules observées.
Ainsi, les mutations morphologiques sont utiles mais le choix est limité.
 L'aptitude à synthétiser un facteur de croissance (acide aminé ou vitamine).
On parle de mutation auxotrophe quand les bactéries sont incapables de
croître en absence d'un facteur de croissance. Dans le cas contraire, les
cellules sont dites prototrophes.
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 La capacité des cellules à utiliser un sucre particulier comme source

d'énergie (fructose, saccharose, etc.). On parle de mutation catabolique.
 Le comportement des cellules en présence d'un inhibiteur particulier de la
croissance (streptomycine, ampicilline, etc.).
Quelques exemples de phénotypes et les symboles des génotypes
correspondants sont présentés dans le tableau 1.

Tableau 1. Symbole de phénotypes bactériens

Symbol Caractères ou phénotypes correspondant au symbole

e
Bio- Exigent l'addition de la biotine au milieu minimum pour leur croissance
(cellules auxotrophes pour la biotine)
Bio+ N'exigent pas l'addition de la biotine au milieu minimum pour leur
croissance (cellules prototrophes pour la biotine)
Lac- Incapables d'utiliser le lactose comme source de carbone
Lac+ Capables d'utiliser le lactose comme source de carbone
Strr Résistantes à l'antibiotique streptomycine
Strs Sensibles à l'antibiotique streptomycine

Remarque
Chez les eucaryotes végétaux on utilise les termes hétérotrophe et autotrophe
pour qualifier la dépendance (hétérotrophe) ou la non-dépendance (autotrophe) d'un
génotype par rapport au carbone inorganique.

1.4. La sélection de mutants

La mutation est un processus (changement) aléatoire qui a lieu au niveau du
patrimoine génétique et qui se produit n'importe quand dans n'importe quelle cellule.

1.4.1. La réversion de mutants auxotrophes

La réversion est la production d'un gène sauvage à partir d'un gène muté, les
individus ainsi mutés étant appelés reversant (ou révertants). Pour détecter la
réversion d'un mutant auxotrophe vers la prototrophie, il existe un système direct de
sélection. Un mutant auxotrophe pour l'adénine par exemple est mis en culture dans
un milieu contenant l'adénine. La suspension est ensuite étalée sur un milieu solide ne
contenant pas l'adénine. Les seules cellules qui pourront proliférer sur ce milieu sont
celles qui sont apparues à la suite d'une mutation reverse ayant eu lieu dans la culture
de départ et qui n'ont plus besoin d'adénine pour pousser (Figure 3).
 15

Suspension de cellules Apparition de réversants Prolifération de cellules

auxotrophes prototrophes prototrophes

Cellulesauxotrophes
Culture sur milieu
Incubation solide

Cellules prototrophes

MILIEU AVEC ADENINE MILIEU AVEC ADENINE MILIEU SANS ADENINE

Figure 3. Sélection de reversant prototrophes de mutants auxotrophes

1.4.2. L'enrichissement par filtration

Cette méthode est utilisée pour sélectionner des mutants auxotrophes de
champignons à mycélium. Une suspension de spores prototrophes est cultivée dans un
milieu minimum liquide. Tout mutant auxotrophes qui apparaît ne pourra croître dans
ce milieu, contrairement aux cellules prototrophes. On pourra dès lors récupérer les
mutants dans un filtrat de suspension passé au travers d'un filtre en fibre de verre. Les
mutants auxotrophes seront de types variés. Les uns auront besoin d'un produit A pour
pousser, les autres d'un produit B.
Si l'on veut récupérer uniquement les mutants auxotrophes pour l'adénine, il
suffira d'étaler ensuite le filtrat sur un milieu contenant de l'adénine (Figure 4). Seuls
les mutants désirés pousseront.

Rétention des prototrophes

par le filtre

Passage des auxtrophes

à travers le filtre
Type sauvage de
prototrophe

Murant nutritionnel
(auxotrophe)

MILIEU MINIMUM Mise en culture

MILIEU MINIMUM
+ ADENINE

Figure 4. Méthode de l'enrichissement par filtration destinée à sélectionner des

mutants auxotrophes chez les organismes filamenteux. Cet exemple fait appel à des
mutations menant à l'exigence de l'adénine.
 16

1.4.3. L'enrichissement à la pénicilline

Il existe une technique analogue à la précédente pour la sélection de mutants
auxotrophes de bactéries. La plupart des bactéries sont très sensibles à la pénicilline,
mais seulement lorsqu'elles sont en croissance. Si l'on ajoute cet antibiotique à une
suspension de bactéries en croissance, les cellules prototrophes sont tuées parce
qu'elles prolifèrent, mais les auxotrophes survivent. On peut enlever la pénicilline en
lavant les cellules récupérées sur un filtre. En étalant les bactéries lavées sur un milieu
solide contenant le ou les additifs appropriés, on autorisera la croissance des seuls
mutants que l'on désire récupérer.

1.4.4. La technique de la réplique sur velours pour la sélection de mutants

Cette technique permet de faire pousser des bactéries en milieu non sélectif et
d'en faire ensuite une copie sur un milieu sélectif (minimum ou riche additionné d'un
antibiotique ou tout autre facteur environnemental). La technique de la réplique sur
velours a été mise au point par JOSHUA et LEDERBERG en 1952. Un morceau de
velours stérile est tendu sur un tampon cylindrique. Une boîte de Pétri, sur laquelle se
sont développées des colonies bactériennes, est délicatement mise en contact avec la
surface du velours qui retient une partie des bactéries de chaque colonie. Le tampon
sert ensuite de matrice pour imprimer une nouvelle boîte contenant un milieu stérile.
Des colonies se développeront dans la deuxième boîte exactement au même endroit
que la première. Des cellules de certaines colonies de la boîte mère ne forment pas de
colonies lorsqu'elles sont transférées sur un milieu sélectif. Il s'agit des cellules
mutantes.
La réplique de velours est devenue une technique classique de la génétique
microbienne. En général, elle permet de garder des bactéries sur la boîte mère tout en
les soumettant à une série de tests par réplique sur différents milieux (Figure 5).
Poignée

Velours stérilisé

(A)

Transfert Incubation

Impression du velours sur la Impression de la réplique Apparition de colonies

boîte matrice sur un milieu frais aux mêmes endroits

(B)
 17

Transfert

Réplique Réplique Réplique

Culture mère
(milieu non sélectif) (milieu sélectif) (milieu sélectif)
(Milieu non sélectif)

INCUBATION

(C)

Figure 5. Méthode de la réplique par tampon de velours. (A) Tampon de velours.

(B) Processus de transfert. Le tampon couvert de velours stérile est pressé sur la boîte
matrice dans le but de transférer des cellules des colonies sur un second milieu. (C)
Réplication sur différents milieux. Pour détecter des mutants, des cellules sont
transférées sur deux types de milieux : un type de milieu dit non sélectif permettant la
prolifération des cellules issues de toutes les colonies de la boîte matrice ; un type de
milieu dit sélectif qui ne permet que la prolifération d'un certain type de cellules.

Remarque
La résistance à des agents de l'environnement (antibiotique, phage, etc.), qui ne
sont normalement pas tolérés par des micro-organismes est une variante de mutation.
Deux théories opposées expliquent l'origine des cellules résistantes : l'adaptation
physiologique et le changement génétique aléatoire.
Comment peut-on distinguer ces deux possibilités ?
Si les cellules résistantes résultent d'un changement génétique aléatoire, celui-ci
peut se produire n'importe quand au cours de la croissance de la culture des micro-
organismes. Si l'on prend un grand nombre de culture, le nombre de mutants variera
très fortement d'une culture à l'autre puisqu'il dépendra du moment auquel le
changement se sera produit. Par contre, si pour chaque individu la probabilité de
devenir résistant est la même et dépend d'une adaptation physiologique, chaque culture
contiendra plus ou moins le même nombre de mutants (Figure 6).
Il faut néanmoins noter que l'adaptation physiologique peut aussi se manifester
dans certains cas particuliers. Mais le point important à ce niveau est que les
mutations, elles, ne se produisent pas par adaptation physiologique.
 18

Culture 1 Culture 2 Culture 3 Culture 4

(A)
Culture 1 Culture 2 Culture 3 Culture 4

(B)

Figure 6. Pedigree cellulaire illustrant les prédictions de deux théories opposées sur
l'origine des cellules résistantes. (A) Adaptation physiologique. (B) Changement
génétique aléatoire.

2. Découverte du support de l'information génétique

Les chapitres précédents nous ont appris qu'au cours de la reproduction
conforme, le matériel génétique est divisé en de nombreux gènes et que chacun de ces
gènes assure une double fonction : il se reproduit strictement identique à lui-même à
chaque division cellulaire et il détermine un caractère spécifique. Pour comprendre
comment ces fonctions s'effectuent au niveau moléculaire, il est indispensable de
savoir d'abord quelle est la nature de la substance chimique qui constitue les gènes.

2.1. Nature du matériel génétique chez les bactéries

Rappelons que les bactéries sont des organismes procaryotes mais qui possèdent
tous les types de macromolécules caractéristiques de la matière vivante : protéines,
lipides, polysaccharides, et les deux acides nucléiques ADN et ARN. C'est chez ces
organismes que le problème de la nature du matériel génétique a été résolu le premier,
et de manière très claire, grâce aux expériences de transformation bactérienne chez le
pneumocoque, Streptococcus pneumoniae.

2.1.1. Expérience de GRIFFITH (1928)

La conversion d'un génotype en un autre par l'introduction de matériel
génétique exogène est appelée transformation. Ce phénomène qui a été découvert
chez Streptococcus pneumoniae par GRIFFITH en 1928 constitue la première étape de
la connaissance de la nature du support de l'information génétique. Streptococcus
pneumoniae, qui provoque la pneumonie chez les humains, est normalement létale
 19

pour les souris. Toutefois, il existe des souches de cette espèce qui diffèrent des
bactéries sauvages par l'absence de virulence (aptitude à causer la maladie ou la mort).
Dans ses expériences, GRIFFITH a utilisé deux souches discernables par l'aspect des
colonies qu'elles forment lorsqu'elles sont cultivées en laboratoire. La première
souche est virulente et ses cellules sont entourées d'une enveloppe polysaccharidique
qui donne aux colonies une apparence lisse ; cette souche est appelée S (pour smooth).
Chez l'autre souche de GRIFFITH, un mutant non virulent qui se développe chez la
souris mais n'est pas létale, la capsule polysaccharidique est absente et les colonies ont
un aspect rugueux ; cette souche est appelée R (pour rough).
GRIFFITH tua des cellules virulentes par chauffage et inocula ces cellules mortes
à des souris. Celles-ci ont survécu, montrant donc que les cellules tuées ne causent pas
la mort des souris. En revanche, les souris inoculées avec un mélange de cellules
virulentes tuées par la chaleur et de cellules non virulentes vivantes meurent. En outre,
des cellules vivantes virulentes pouvaient être réisolées à partir de souris mortes. La
seule explication convenable est qu'il y a eu transfert du caractère de virulence de la
souche de bactéries tuées par la chaleur (S) à l'autre souche (R). Ainsi, d'une manière
ou l'autre, les débris des cellules S chauffées avaient converti les cellules R vivantes en
cellules S. L'expérience de GRIFFITH est résumée dans la figure 7.

Figure 7. Schéma de l'expérience de transformation de GRIFFITH (1928)

 20

2.1.2. Expérience de ALLOWAY (1933)

L'expérience de ALLOWAY (1933) schématisée par la figure 8 est la version in
vitro de l'expérience de GRIFFITH. Un mélange d'extrait de cellules S tuées par la
chaleur et de cellules R est mis en culture. Après incubation, plusieurs colonies de
cellules R et quelques colonies de cellules S apparaissent sur le milieu de culture. La
conclusion qui peut être tirée est que le principe transformant est extractible.

Figure 8. Schéma de l'expérience de transformation de ALLOWAY (1933)

2.1.3. Expérience d'AVERY, MACLEOD et McCARTHY (1944)

La même technique de base a été utilisée pour déterminer la nature du principe
transformant c'est-à-dire l'agent des débris cellulaires qui est spécifiquement
responsable de la transformation. AVERY et al. ont séparé les différentes classes de
molécules présentes dans les débris des cellules S mortes et ont testé l'aptitude de
chacune d'elles à induire la transformation. Ces tests ont montré d'abord que les
polysaccharides eux-mêmes n'ont aucune activité transformante. Dès lors, la capsule
polysaccharidique, tout en étant impliquée dans l'action pathogène, n'apparaissait que
comme l'expression phénotypique de la virulence. Par l'examen des différentes classes
de molécules, AVERY et al. ont établi que seul l'ADN était capable d'induire la
transformation des cellules R (Figure 9). Ils en déduisent que l'ADN est l'agent qui
détermine la présence du polysaccharide et, par conséquent, le caractère pathogène.
La démonstration que l'ADN est le principe transformant constitue la première preuve
que les gènes sont composés d'ADN.
 21

En fait, une partie des gènes des cellules de la souche S tuées intègre le
patrimoine génétique (l'ADN) des cellules de la souche R et dirige la synthèse des
polysaccharides formant la capsule. Dans ces conditions, il est évident que la chaleur
ne fait que dénaturer l'ADN des cellules S.
Il faut souligner que les enzymes DNAse et RNAse pouvaient être utilisées en
lieu et place de la chaleur pour détruire, respectivement, l'ADN et l'ARN.
S

Polysaccharides Lipides RNA Protéines DNA

CELLULES R VIVANTES

R R R R S

Figure 9. Démonstration que l'ADN est l'agent transformant. L'ADN est le seul agent
qui produit des colonies lisses (S) lorsqu'il est ajouté à des cellules rugueuses (R)
vivantes.

2.2. Nature du matériel génétique chez les virus

2.2.1. Reproduction des virus
Contrairement aux bactéries, les virus ne sont pas des cellules. En effet, ils sont
dépourvus de membrane, cytoplasme et noyau qui constituent les élémentaires
permettant de définir les cellules. Les virus représentent donc une catégorie
exceptionnelle d'organismes définie par leur nature acellulaire. Ceci a pour
conséquence, un parasitisme cellulaire obligatoire.
On peut opposer deux phases dans le cycle de vie d'un virus. L'une correspond
à un état intracellulaire actif. L'information génétique du virus détourne le
métabolisme de la cellule hôte à son profit ; elle utilise les molécules organiques et les
organites de la cellule hôte pour réaliser la synthèse de nouvelles particules virales. Le
virus se multiplie de cette manière au dépend de la cellule dont il est hôte. Ceci
explique les propriétés pathogènes des virus car la cellule hôte ne survit généralement
pas à l'infection. L'autre phase correspond à l'état extracellulaire. Après sa libération,
la particule virale qu'on appelle virion n'est qu'un assemblage inerte de molécules
organiques.
 22

Exemple : Cas du bactériophage (phage)

Il existe deux types de phages : les phages "virulents" (T2 et T4) qui
provoquent toujours la lyse bactérienne et la libération de virions quand ils infectent la
bactérie hôte. Leur cycle est qualifié de cycle lytique. Le deuxième type appelé phage
tempéré ne provoque pas toujours la lyse bactérienne. Parfois, leur DNA est intégré
dans le chromosome bactérien et répliqué avec celui-ci lors de la division cellulaire. Le
cycle est qualifié de lysogénique. Le phage intégré dans le chromosome bactérien est
nommé prophage. La bactérie renfermant un prophage est dite bactérie lysogénique.
A tout moment (mais rare), le prophage peut entrer dans le cycle lytique et libérer des
particules phagiques (Figure 10).

Cellule bactérienne Bactériophage T2 ou T4

Adsorption du phage

Injection du DNA du phage

Incorporation du DNA du phage Multiplication du DNA et synthèse

au chromosome bactérien des protéines phagiques

Assemblage de nouveaux
phages

Multiplication bactérienne Lyse cellulaire et libération

de nouveaux phages

Cycle lysogénique Cycle lytique

Figure 10. Les cycles lysogénique et lytique d'un bactériophage

 23

2.2.2. Expérience de HERSHEY et CHASE (1952)

L'argument de AVERY et al. a été confirmé par les résultats de l'expérience de
Alfred HERSHEY et Martha CHASE (1952) qui ont utilisé le phage T2 qui est un virus à
DNA. Ils estimèrent que l'infection par le phage devait comporter l'introduction dans
la bactérie d'une information spécifique capable d'imposer à celle-ci la multiplication
virale.
L'expérience de ces auteurs est basée sur le fait qu'on ne trouve pas de
phosphore dans les protéines alors que le soufre en est un constituant important.
Inversement, le soufre qui est présent dans les protéines n'est jamais présent dans
l'ADN. Cette expérience comporte quatre étapes (Figure 11) :
1. Des bactéries sont mises en croissance dans deux milieux dont l’un contient le
précurseur radioactif 35S marquant les protéines (milieu 1) et le précurseur 32P
marquant l'ADN (milieu 2).
2. Après intégration des précurseurs par les bactéries, elles sont infectées par les
phages.
3. On obtient des phages marqués. Chaque lot est ensuite mis en présence de
bactéries non marquées.
4. Après adsorption des phages, les dépouilles phagiques sont détachées des parois
bactériennes par agitation mécanique au mixeur. Puis une centrifugation est
réalisée afin de séparer les bactéries des dépouilles phagiques. En fait les
enveloppes virales (fantômes ou ghosts), légères restent dans le surnageant alors
que les bactéries, relativement lourdes forment le culot. En mesurant la
radioactivité dans les deux fractions on décèlera la radioactivité soit dans le
surnageant (milieu 1) soit dans le culot (milieu 2).
La conclusion de ces observations était que l'ADN est le matériel héréditaire
tandis que les protéines de phage ne sont qu'un emballage qui est écarté une fois que
l'ADN est injecté dans la cellule bactérienne.
 24

1 2

A Bactérie
Milieu nutritif N N
X X N
X X 35
S 32
P N N
X X N N

X N Bactériophage
B X
X X Bactéries N
N
X marquées N

X
X
X
Bactériophage N
X X
C X
X N
XX N
Protéines ADN
X
X marquées marqués N
X

AGITATION VIOLENTE
CENTRIFUGATION

X
XX
X XX X Surnageant
XX XX
D XX X
X

N N
Culot N N

Figure 11. Expérience de HERSHEY et CHASE (1952). (A) Des bactéries sont mises en
croissance dans un milieu contenant le précurseur radioactif : 35S pour les protéines
(1), 32P pour l'ADN (2). (B) Les bactéries, après intégration des précurseurs, sont
infectées par les phages. (C) On obtient des phages marqués ; chaque lot est mis en
présence de bactéries non marquées. (D) Après adsorption des phages, les dépouilles
phagiques sont détachées des parois bactériennes par agitation mécanique au mixeur ;
après centrifugation, on décèle la radioactivité soit dans le surnageant (1) soit dans le
culot (2).

2.2.3. Les expériences de CONTRAT, WILLIAMS et SCHRAMM

Leurs expériences intéressent notamment le virus de la mosaïque du tabac
(VMT) qui est un virus à RNA. Ce virus pénètre dans les cellules des feuilles de tabac
et perturbe leur métabolisme. Les cellules infectées perdent leur chlorophylle. Les
zones contaminées présentent des taches jaunâtres.
L'enveloppe protéique des bâtonnets de VMT est constituée de plus de 2000
molécules protéiques identiques qui présentent un arrangement hélicoïdal autour de la
molécule d'ARN centrale (Figure 12).
Il est possible in vitro de séparer l'ARN des protéines. Dans les conditions
propices, lorsqu'on remet en présence l'ARN et les protéines, celles-ci vont
spontanément s'assembler autour de la molécule d'acide nucléique de manière à
reconstituer un virion complet. Ces propriétés ont permis à CONTRAT et al. :
 25

1. de tester le pouvoir infectieux de chacun des constituants isolément ;

2. de fabriquer in vitro des virions mixtes constitués d'un ARN et de protéines
issus de souches différentes de VMT.
Il a ainsi été établi que l'ARN pur est capable d'infecter les plantes de tabac
(avec un rendement faible), alors que les protéines pures en sont incapables. A partir
des taches apparues sur les feuilles de tabac infectées par l'ARN pur, on retrouve des
virions complets (Figure 13).
L'ARN du VMT contient donc l'information nécessaire au processus d'infection
et à la synthèse des protéines du virion.

Figure 12. Morphologie du virus de la mosaïque du tabac.

Infection

Protéines pures
Infection

VMT
Infection

ARN pur

Figure 13. L'expérience de CONRAT, WILLIAMS et SCHRAMM montrant le pouvoir

infectieux de l'ARN du virus de la mosaïque de tabac (VMT).
 26

La possibilité de reconstituer in vitro des virions complets à partir des deux

constituants moléculaires du VMT a suggéré une expérience qui a confirmé la
conclusion précédente. Elle démontre que si deux virus diffèrent pour un caractère
particulier héréditaire, ce caractère est transmis par l'ARN.
En fait il existe chez VMT des mutants qui produisent des taches dont la taille,
la forme ou l'intensité de coloration est différente. A partir de deux souches de virus
qui provoquent des taches d'aspects différents, on constitue des virus mixtes : l'ARN de
chaque souche est réassocié avec les protéines de l'autre. Lorsqu'on infecte des plantes
de tabac avec chacun de ces deux types de virus mixtes, on constate que les taches
correspondent toujours à celles qui auraient été obtenues en infectant par le virus qui a
fourni l'ARN (Figure 14).
La spécificité est donc fournie par l'acide nucléique et non par la protéine.
Virus A Virus B

ARN A Protéine A Protéine B ARN B

Infection de type A Infection de type B

Figure 14. Spécificité de la fonction de l'ARN dans les virions mixtes de la mosaïque
du tabac.

Ainsi, chez les virus le support de l'information génétique peut être l'ADN
(Phage T2) ou l'ARN (VMT). Les protéines virales ont essentiellement un rôle de
protection de l'acide nucléique durant son séjour hors de la cellule hôte. Elles peuvent
également faciliter la pénétration de cet acide nucléique dans la cellule hôte (Phage
T2).

2.3. Nature du matériel génétique chez les eucaryotes

Plusieurs arguments indiquent de manière certaine que l'ADN correspond au
matériel génétique des eucaryotes :
 L'ADN est localisé dans les chromosomes. Or, les observations cytologiques et
génétiques prouvent conjointement que les chromosomes sont les supports de
l'hérédité (théorie chromosomique de l'hérédité).
 Les lois de la reproduction conforme ne s'expliquent que si le matériel génétique
est en quantité constante dans un même clone cellulaire, ou à l'intérieur des cellules
composant les organismes d'une même espèce. Si chaque gène est très exactement
reproduit d'une génération cellulaire à la suivante, alors, la quantité de la substance
 27

chimique qui correspond au matériel génétique est elle-même constante. Ceci est
précisément vérifié pour l'ADN, mais nullement pour les autres types de molécules.
 L'ADN est remarquablement stable. Le dédoublement d'ADN qui précède chaque
division cellulaire correspond à la synthèse d'une quantité d'ADN équivalente à celle
qui existait. En dehors de cela, les rares synthèses ou dégradations qui sont
observées sont de très faible amplitude et s'expliquent par l'existence de processus
de réparation destinés à remplacer certaines portions qui auraient pu être lésées.
Cette stabilité métabolique est celle qu'on attend du matériel génétique et ne
s'applique pas aux autres types moléculaires qui sont constamment renouvelés.
 Des arguments directs ont été obtenus grâce à la possibilité de transférer des
fragments d'ADN d'organismes donneurs eucaryotes variés à des cellules receveuses
différentes correspondant soit à des bactéries, soit à des cellules eucaryotes (génie
génétique ou technologie de l'ADN récombinant). Ces fragments d'ADN sont
capables de conférer à la cellule receveuse de nouvelles propriétés : un phénotype.
Une relation (causale) peut être établie entre le maintien ou la perte du fragment
d'ADN dans les cellules descendantes et le maintien ou la perte de ces nouvelles
propriétés.

3. Structure et fonctionnement du support de l'information génétique

Une fois que le rôle de l'ADN dans l'hérédité devint évident, les chercheurs
entreprirent des travaux en vue de déterminer sa structure exacte. Comment une
molécule contenant un nombre aussi limité de constituants différents pouvait-elle
stocker l'énorme quantité d'informations nécessaires pour décrire la structure primaire
de toutes les protéines des organismes vivants ?

3.1. Les acides nucléiques

Les acides nucléiques sont des chaînes polynucléotidiques. Ils sont constitués
d'un sucre à 5 atomes de carbone (pentose), d'un groupe phosphate et de bases azotées.
Les bases azotées, cinq au total sont de deux types. Elles peuvent être une purine
(bases à deux hétérocycles azotés) : adénine (A) et guanine (G) ou une pyrimidine
(bases à un seul hétérocycle azoté) : cytosine (C), thymine (T) ou uracile (U).
Le pentose est le -D-ribose dans le cas de l'ARN et le -D-désoxyribose dans le cas de
l'ADN. Les atomes de carbone et l'azote des bases ainsi que les atomes de carbone du
sucre sont numérotés conventionnellement de façon à faciliter leur identification. Les
atomes des bases portent les chiffres 1 à 6 pour les pyrimidines et 1 à 9 pour les
purines. Les atomes du sucre portent les chiffres 1' à 5' (Figure 15). Le prime ajouté
à ces derniers les distingue de ceux des bases.
 28

(A)

(B)

-D-ribose (ARN) -D-désoxyribose (ADN)

(C)

OH

HO P O

OH

(D)
Figure 15. Les composants des acides nucléiques ADN et ARN. (A) et (B) Structures
chimiques des bases puriques et pyrimidiques composant les acides nucléiques ADN et
ARN. Les purines (adénine et guanine) sont formées de deux hétérocycles azotés alors
que les pyrimidines (cytosine, thymine et uracile) n'en renferment qu'un. Seules les
bases adénine (A), guanine (G), cytosine (C) et thymine (T) sont présents dans l'ADN ;
dans l'ARN, l'uracile (U) remplace la thymine. (C) Les deux pentoses qui composent
les acides nucléiques. Les atomes de carbone des pentoses sont par convention
numérotés par un chiffre affecté du signe prime pour les distinguer des chiffres
habituellement utilisés pour les carbones des purines et pyrimidines. La différence,
entre les deux pentoses, porte sur le groupement lié au carbone 2' du ribose (OH) ou du
désoxyribose (H). Le -D-ribose est un constituant de l'ARN alors que le -D-
désoxyribose est un constituant de l'ADN.
 29

La structure des acides nucléiques montre trois unités de formation : les

nucléosides, les nucléotides et les polynucléotides.

3.1.1. Les nucléosides

C'est une molécule composée du pentose et d'une des bases azotées. Les
nucléosides sont des unités fondamentales des acides nucléiques (Figure 16). Ils
résultent de la formation d'une liaison N-glycoside entre le carbone 1' du pentose et
l'azote 1 des pyrimidines ou l'azote 9 des purines.

A, G, C ou U A, G, T ou C
HOCH 2 HOCH2
O Bases O Bases

H H
H H
H
H H
H
OH OH
OH H
Sucre
Sucre

Acide ribonucléique Acide désoxyribonucléique

Figure 16. Structures typiques des nucléosides.

3.1.2. Les nucléotides

On obtient un nucléotide quand un groupe phosphate se lie par estérification au
carbone 5' de l'ose du nucléoside (Figure 17). En fait, avec son carbone 5', l'ose du
nucléoside s'associe au phosphate  par une liaison ester. Le même phosphate peut
former des liaisons anhydrides d'acide avec d'autres groupes phosphate  et  ou ester
avec un groupe hydroxyle du carbone 3' de l'ose (Figure 18).

OH OH
A, G, C ou U A, G, T ou C
HO P O CH 2 HO P O CH2
O Bases O Bases
O O
H H H H
Phosphate H Phosphate H
H H
OH OH H
OH
Sucre
Sucre

Acide ribonucléique Acide désoxyribonucléique

Figure 17. Structures typiques des nucléotides.

 30

NH2

N
N
H A
O- O- O- H H
N N
  
O P O P O P O5’C H O

O O O H H
H
3’
OH H
Base (A)

désoxyribonucléoside (dN)

désoxyribonucléoside 5’monophosphate(dNMP)

désoxyribonucléoside 5’diphosphate (dNDP)

désoxyribonucléoside 5’trihosphate (dNTP)

Figure 18. Structure détaillée d'un désoxyribonucléoside triphosphate précurseur de

l'ADN.

3.1.3. Les polynucléotides

Les polynucléotides sont formés par la liaison de plusieurs nucléotides. Dans
les polynucléotides, le groupe phosphate attaché au carbone 5' d'un sucre est lié au
groupe hydroxyle 3' du carbone du sucre suivant (Figure 19). La liaison chimique par
laquelle les sucres des nucléotides adjacents sont liés par l'intermédiaire du groupe
phosphate est appelée liaison phosphodiester.

Figure 19. Formation d'un brin d'ADN par polymérasation des nucléotides. Un
désoxyribonucléotide triphosphate (dNTP) peut s'associer avec un dinucléotide
possédant l'extrémité 3' hydroxyle libre. La polymérisation implique une liaison ester
entre le phosphate  en 5' du dNTP et l'hydroxyle en 3' du brin receveur. Un
pyrophosphate est également libéré.
 31

3.2. L'acide désoxyribonucléique (ADN)

3.2.1. La structure primaire de l'ADN
La structure primaire de l'ADN fait ressortir la polarité du polynucléotide.
L'orientation 5'-3'-5'-3' des liaisons continue à travers la chaîne dont le nombre de
monomères peut être de l'ordre de plusieurs millions. Tout acide nucléique se trouve
ainsi orienté avec une extrémité 5' phosphate (5'-P) libre (appelée queue) et une autre
extrémité 3' hydroxyle (3'-OH) libre (appelée tête) comme indiqué par la Figure 20.
L'asymétrie des extrémités des brins d'ADN constitue la base chimique de sa polarité.
Extrémité 5’ avec le
groupe phosphate
NH2
-O
N
N
-O P O H A

O N H Extrémité 5’
N
5’CH2 O
P A
H H
H
3’ O

O H H
N
N
-O P O H G P G
O N NH2
N
5’CH2 O

H
H H
P C
3’
O NH2
H
-O P O H
N
O C HO
H N O
5’ CH2 O

H H
H
3’
Extrémité 3’
OH H

Extrémité 3’ avec
l ’hydroxyle (-OH)

Figure 20. Trois nucléotides de l'extrémité 5' d'un polynucléotide et leur

schématisation montrant la polarité.

3.2.2. La structure secondaire de l'ADN

La structure secondaire de l'ADN fait ressortir qu'il s'agit d'une molécule
bicaténaire à deux brins antiparallèles : la double hélice. La mise en évidence de cette
structure est l'œuvre de WATSON et CRICK (1953). Le modèle de la double hélice
suggéré par James D. WATSON1 et Francis CRICK2 s'appuyait sur des découvertes faites
par d'autres chercheurs. On peut regrouper celles-ci en deux catégories (chimie et
physique)

Découvertes en chimie
1. On savait que le DNA était composé de bases azotées, de sucre et de groupements
phosphates.
2. Erwin CHARGAFF3, en analysant les nucléotides libérés par hydrolyse chimique du
DNA extrait de divers organismes, a montré que les quatre bases n'étaient pas
présentes en concentrations égales, celles-ci variant selon les organismes. Par
contre, dans tous les organismes examinés, la quantité total de purines était
toujours égale à la quantité totale de pyrimidines. Plus précisément, A = T et G =
1 Américain, biologiste, intéressé par la découverte de la structure du DNA mais travaillant sur les myoglobines et les RNA.
2 Anglais, né en 1916-, chauve, physicien, travaillant dans le cadre de son PhD en recherche médicale, sur la structure des
protéines en utilisant la diffraction des rayons X à l'Université de Cambridge (UK). Aucun des deux chercheurs ne travaillait
donc directement sur le DNA. CRICK affirmait d'ailleurs après leur découverte : "La chance favorise l'esprit préparé".
3 Columbia University
 32

C. On peut donc écrire que A + G = C + T, d'où A + G / C + T = 1. Cette relation

est appelée règle de CHARGAFF. A l'opposé, A + T / G + C  1 dans la plupart des
cas. Ce rapport, appelé rapport de bases (bases ratio) et habituellement exprimé
en pourcentage de GC varie largement en fonction des organismes.

Découvertes en physique
Les données de la physique concernent le spectre de diffraction aux rayons X
des fibres de DNA. Les premiers spectres de bonne qualité ont été obtenus par
Rosalind FRANKLIN sur du DNA fourni par M.H.E. WILKINS. Quand un faisceau de
rayon X émis rencontre un groupe d'atomes disposés régulièrement, sa trajectoire est
déviée (ou diffractée), créant ainsi un dessin typique dont l'image peut être captée sur
un film radiographique. Les profils obtenus indiquaient que le DNA est formé de deux
chaînes enroulées l'une autour de l'autre, formant ainsi une hélice.
Pour corréler les données chimiques et physiques, WATSON et CRICK ont
proposé une structure symétrique compatible avec les faits expérimentaux et qui
possède les propriétés qu'on attend du matériel génétique. Dans le modèle de WATSON
et CRICK, les deux chaînes polynucléotidiques ont des directions opposées : l'une étant
orientée 5'3' et l'autre, 3'5'. Elles sont dites antiparallèles. Dans les chaînes, les
bases sont empilées, disposées face à face et liées par des liaisons hydrogènes. A et T
sont liées par deux liaisons hydrogènes tandis qu'il existe 3 liaisons hydrogènes entre
G et C.

Extrémité 3’
HO
Extrémité 5’

P
T A P

P
G C P

P
A T P

P
C G P

HO Extrémité 5’

Extrémité 3’

Figure 21. La double hélice de l'ADN déroulée pour montrer les squelettes des chaînes
désoxyribose-phosphate et les barreaux formés par l'appariement des paires de bases.
Les directions de ces chaînes sont opposées et leurs extrémités sont nommées 5' et 3'
d'après l'orientation des atomes de carbone 5' et 3' des noyaux de sucre. Chaque paire
de bases comporte une base purique, adénine (A) ou guanine (G), et une base
pyrimidique, thymine, (T) ou cytosine (C), unies par des liens hydrogènes (pointillés).

Pyrimidine + pyrimidine : ADN trop étroit

 33

Purine + purine : ADN trop large

Purine + pyrimidine : largeur compatible
avec les données des
rayons X

Figure 22. L'appariement des purines avec les pyrimidines rend compte du diamètre
exact de la double hélice déterminé par diffraction des rayons X.

3.2.3. La structure tertiaire de l'ADN : l'hélicoïde

Les bases de l'ADN s'empilent les unes sur les autres pour former la structure en
torsade de la double hélice. Cet empilement des bases au sein de la double hélice fait
que les deux brins ménagent deux sillons hélicoïdaux de largeurs différentes. Ils sont
appelés grand et petit sillon (Figure 23). Dans l'hélicoïde, on dénombre 10 paires de
bases par pas d'hélice. Comme la distance entre deux paires de bases adjacentes est de
0,34 nm, on en déduit que le pas d'hélice mesure 3,4 nm.

Grand
sillon

Petit
sillon

Figure 23. Modèle tridimensionnel de la double hélice de l'ADN.

3.3. Biosynthèse de l'ADN : la réplication

Pour que deux cellules héritent par division du même patrimoine génétique,
l'ADN, support de l'information génétique doit être au préalable dupliqué fidèlement.
Dans ce paragraphe nous décrirons les étapes principales de la duplication ou
réplication de l'ADN, ainsi que la machinerie enzymatique indispensable à ce processus
fondamental de la vie d'une cellule.
 34

3.3.1. Les modèles hypothétiques de la réplication

Trois modèles hypothétiques ont été envisagés en ce qui concerne la relation qui
s'établit entre la molécule parentale et la molécule fille lors de la réplication (Figure
24). Ces modèles hypothétiques sont appelés "semi-conservatif" ou modèle de
WATSON et CRICK, conservatif et dispersif. Dans la réplication semi-conservative,
chaque double hélice fille contient une fibre parentale et une fibre nouvelle. Au
contraire, dans la réplication conservative, la double hélice parentale est conservée,
mais deux fibres nouvelles sont générées. La réplication dispersive aboutit à des
doubles hélices qui comportent à la fois des segments des ADN parentaux et des ADN
nouvellement synthétisés (Figure 24).
15 15 15 14 14 15 15 14 14 14 14 14 14 15
N N N N N N N N N N N N N N

(A) : Modèle Semi-conservatif

15 15 15 15 14 14 15 15 14 14 14 14 14 14
N N N N N N N N N N N N N N

(B) : Modèle conservatif

15
N 15
N  15N--- 14N Intermédiaire entre 15N- 14N et 14N- 14N

(C) : Modèle Dispersif

Figure 24. Trois profils de réplication de l'ADN.

3.3.2. Preuve du caractère semi-conservatif de la réplication de l'ADN

La figure 25 schématise le mécanisme de réplication de l'ADN proposé par
WATSON et CRICK. Ici, les squelettes sucre-phosphate des chaînes polynucléotidiques
sont représentés par des lignes et l'ordre des paires de bases est aléatoire. Imaginons
que la double hélice ressemble à une fermeture éclair qui s'ouvre à partir d'une
extrémité. Dans ces conditions, la séparation des deux fibres aboutira à exposer les
 35

bases. Comme les contraintes d'appariement imposées par la structure de l'ADN sont
strictes, chaque base exposée va s'apparier avec la base complémentaire. En raison de
cette complémentarité, chaque fibre séparée va jouer le rôle de matrice ou de moule,
et va permettre la formation d'une nouvelle double hélice identique à celle qui existait
au départ.
Ce sont les expériences de MESELSON et STAHL (1958) qui ont démontré ce
mode de réplication. Ils ont cultivé des cellules d'E. coli dans un milieu contenant
l'isotope lourd d'azote (15N) au lieu de la forme légère normale (14N). Cet isotope a été
incorporé dans les bases azotées et ensuite dans les nouvelles fibres d'ADN
synthétisées. Après un grand nombre de divisions cellulaires en présence de 15N, tout
l'ADN de ces cellules était marqué par l'isotope lourd. Les cellules ont ensuite été
séparées du milieu au 15N et transférées dans le milieu au 14N ; et des échantillons ont
été prélevés après une et deux divisions cellulaires. L'ADN a été extrait des cellules de
chacun des échantillons, dissout dans une solution de chlorure de césium (CsCl) et
soumis à une ultracentrifugation.
Lorsque le chlorure de césium est centrifugé à très haute vitesse (50000 tpm)
pendant plusieurs heures, les ions césium et chlorure migrent vers le fond du tube sous
l'action de la force centrifuge. Finalement un gradient d'ions Cs+ et Cl- s'établit dans le
tube, avec la concentration la plus élevée dans le fond. Déposées à la surface du
gradient de césium ainsi obtenu et soumis à une ultracentrifugation, les molécules
d'ADN de la solution sont également poussées par la force centrifuge. Pendant leur
trajet vers le fond, elles s'arrêtent à l'endroit du gradient où la force centrifuge
compense exactement sa densité de flottaison. La tendance de flotter de l'ADN dépend
de sa densité qui, à son tour reflète le rapport G-C et A-T. La présence de l'isotope
lourd de l'azote modifie la densité de flottaison de l'ADN.
MESELSON et STAHL ont observé qu'une génération après le transfert des
molécules lourdes dans le milieu au 14N, l'ADN formait une seule bande dont la densité
est intermédiaire entre les densités témoins lourd et léger. Après deux générations
dans le milieu au 14N, l'ADN formait deux bandes, l'une située à une position
intermédiaire, l'autre à la position de la bande légère (Figure 26). Ce résultat était
celui prédit par le modèle de réplication semi-conservative.
 36

Ancienne

Nouvelle

Figure 25. Le modèle de réplication de l'ADN proposé par WATSON et CRICK. Les
deux fibres de la double hélice parentale se déroulent et chacune spécifie une nouvelle
fibre selon les règles d'appariement.
 37

EXPERIMENTATIO
RESULTATS INTERPRETATION
N

Culture sur milieu

lourd

(Isotope 15N)

Culture sur milieu

léger

(Isotope 14N)

Une génération après

transfert sur milieu
léger (Isotope 14N)

Deux générations
après transfert sur
milieu léger (Isotope
14
N)

Figure 26. Expérience de MESELSON et STAHL (1958) montrant le caractère semi-

conservatif de la réplication de l'ADN. Sous l'action de la force centrifuge, le CsCl
distribué de façon homogène au temps zéro se répartit dans les tubes, en formant
progressivement un gradient de concentration (et de densité). Mélangées au CsCl, les
molécules d'ADN migrent sous l'effet de la force centrifuge pour former une bande
dans la région du gradient de CsCl où les densités relatives de l'ADN et du CsCl sont
égales.
 38

3.3.3. Mécanisme de la réplication

Dans la molécule d'ADN, la position au niveau de laquelle la réplication est
amorcée est appelée origine de réplication. La région au niveau de laquelle les brins
parentaux se séparent afin que la synthèse de nouveaux brins ne commence est appelée
fourche de réplication.
La formation d'un brin d'ADN complémentaire s'opère par additions successives
de désoxyribonucléotides à un oligonucléotide en élongation. Les enzymes
responsables de ce processus sont les ADN polymérases. Les ADN polymérases sont
incapables de réaliser une synthèse d'ADN en l'absence d'un ADN parental. Par contre,
elles sont tout à fait capables de synthétiser le brin complémentaire d'un brin parental
servant de matrice. Elles catalysent la formation de liaison ester entre le groupement
5' phosphate () d'un dNTP libre et le groupement 3' hydroxyle libre d'un brin d'ADN
en formation (Figure 27). L'allongement du brin en formation s'opère par conséquent
dans le sens 5'3'. La loi de complémentarité entre les deux brins d'ADN implique que
le dNTP additionné à un moment donné soit choisi en fonction du nucléotide qui sert
de matrice sur le brin parental.
Direction de l’élongation
P
C

P
A HO

P Pont H
T C
P
P P P
P
Libération de 2 P
P
G HO

Pont O-P

P
G C
P

P
A T
Brin matrice P Brin en formation

P
G C
P

P
C G
P

HO

Figure 27. Addition d'un nucléotide à l'extrémité 3'-OH d'un brin en élongation.
L'étape de la reconnaissance des bases complémentaires est montrée par la formation
du pont hydrogène entre C et G. La réaction chimique a lieu entre l'hydroxyle OH de
l'extrémité 3' de la fibre en élongation et le groupement phosphate  du nucléoside
triphosphate devant être incorporé dans la chaîne.

L'activité de polymérisation nécessite en outre, la présence d'un court fragment

d'acide nucléique appelé amorce ou primer. Dans les cellules vivantes, il s'agit d'une
séquence d'ARN comportant 2 à 5 nucléotides (chez les procaryotes) ou de 5 à 8
nucléotides (chez les eucaryotes). Le primer ARN est synthétisé par une ARN
polymérase, encore appelée primase. L'ARN polymérase qui produit le primer
nécessaire à la synthèse de l'ADN fonctionne en association avec 15 à 20 polypeptides
avec lesquels elle forme un complexe protéique appelé primosome. Lorsque la
 39

réplication est réalisée en dehors de la cellule (in vitro), le primer peut être de l'ARN ou
l'ADN.
Dans le modèle de réplication proposé par WATSON et CRICK, l'élongation de
chaque fibre fille était supposée se faire de façon continue. Mais aucune des ADN
polymérases connues à ce jour ne travail de cette manière. En fait, comme les deux
brins d'ADN sont antiparallèles, un des brins en formation, le brin avancé ou principal,
s'allongera de façon continue dans le sens 5'3', sens de déplacement de la fourche de
réplication. L'autre brin, dit retardé ou secondaire, se forme de façon discontinue par
de petits fragments d'ADN dont la synthèse est à chaque fois amorcée dans le sens
5'3', c'est-à-dire en sens inverse du déplacement de la fourche de réplication (Figure
28). Ces différents morceaux, appelés fragments D'OKAZAKI, ont une taille comprise
entre 100 et 200 nucléotides chez les mammifères et entre 1000 et 2000 chez les
procaryotes. Ainsi, pour une même origine de réplication, le brin principal n'est
amorcé qu'une seule fois tandis que le brin retardé est amorcée plusieurs fois (au début
de chaque fragment D'OKAZAKI).
A mesure que la fourche de réplication avance, le primosome se déplace et
forme dans le sens 5'3', au contact du brin retardé, de petits oligonucléotides d'ARN
qui sont ensuite allongés par une ADN polymérase (l'ADN polymérase III chez E. coli)
en petites séquences d'ADN. Quand cette ADN polymérase (Pol III) arrive à l'extrémité
5' de l'amorce précédente, elle est remplacée par une autre ADN polymérase (ADN
polymérase I chez E. coli) qui agit d'abord comme une exonucléase en dégradant
l'ARN dans le sens 5'3', puis comme une polymérase (endonucléase) en remplaçant
l'amorce ARN par l'ADN. Les différents fragments du brin d'ADN retardataire sont
ensuite réunis par l'enzyme ADN ligase. Cette enzyme va établir une liaison
phosphodiester entre une extrémité 5' monophosphate d'un brin et l'extrémité 3'
hydroxyle d'un autre brin (Figure 29 et 30).

Figure 28. Déplacement de la fourche de réplication. A mesure que la fourche de

réplication avance, un des brins matrice est répliqué de façon continue dans le sens 5'
 3' (brin avancé). L'autre brin (brin retardé) est répliqué également dans le sens 5'
 3', c'est-à-dire en sens inverse du déplacement de la fourche de réplication. La
synthèse de l'ADN s'effectue dans le sens 5'  3' au contact d'une matrice elle-même
orientée 3'  5'.
 40

Direction de l’élongation

OH
P C

P A….…..T P

Nouveau ADN
P T….…..A P

P G…...…C P
OH

P G……...C
P
OH
Brin matrice

P
A……..U P
OH

Amorce ARN
P C……..G P
OH

P G….…..C P
P
P

HO

Figure 29. Amorçage de la synthèse de l'ADN à partir d'un fragment d'ARN. Le

segment d'ARN qui a été synthétisé par une ARN polymérase (primase) comporte un U
à la place de T et des hydroxyles en position 2' sur le sucre. Dans un premier temps
l'ADN polymérase ajoute un désoxyribonucléotide à l'extrémité 3' du primer. Puis des
désoxyribonucléotides sont successivement additionnés à l'extrémité 3' de la chaîne en
élongation.
ADN polymérase

Brin d’ADN ADN ajouté

en élongation Primer ARN au primer ARN

OH

Paire de bases

HO
Brin matrice d’ADN

(A)
Nucléotide ADN
Nucléotide ARN clivé et éjecté
à incorporer

OH

HO
Brin matrice d’ADN

(B)
 41

Nucléotides ARN éjectés

OH

HO
Brin matrice d’ADN

(C)

Nucléotides du primer
ARN libéré
L’ADN nouvellement synthétisé
remplace le primer ARN
Dernier pont O-P mis en place

OH

HO
Brin matrice d’ADN

(D)

Figure 30. Séquence des événements lors de la jonction des fragments d'OKAZAKI.
(A) L'ADN polymérase du fragment situé en amont rencontre le primer ARN du
fragment se trouvant en aval. (B) Le nucléotide ARN immédiatement adjacent est
excisé et remplacé par un nucléotide ADN. (C) Les autres nucléotides ARN sont clivés
et remplacés successivement. (D) Quand tous les nucléotides ARN sont remplacés, les
extrémités adjacentes des brins d'ADN nouvellement synthétisés sont liées.

3.3.4. Les protéines accessoires de la réplication

L'initiation de la réplication requiert également la participation de nombreuses
protéines dont l'ensemble forme le réplisome (Figure 31). Chez E. coli par exemple,
il y a la protéine Dna qui, au moment de l'initiation se fixe à une séquence
nucléotidique. Elle induit la séparation localisée des deux brins d'ADN et définit ainsi
l'origine de réplication. Se fixent ensuite à l'ADN des protéines spécifiques appelées
hélicases (DnaG, PriA) qui déroulent progressivement l'ADN en présence d'ATP.
La séparation des deux brins s'effectue dans les deux sens. Il en résulte des
tensions provoquant des surenroulements de la double hélice encore non répliquée. Le
surenroulement est amoindri par des protéines spécifiques, les topoisomérases encore
appelées gyrases. Ce sont des enzymes qui changent (isomérisent) la topologie de
l'ADN en modifiant le nombre d'entrecroisements des deux brins d'ADN.
Le déroulement des deux brins pour préparer la réplication crée des régions
monocaténaires dans la molécule d'ADN mère. Ces régions sont très rapidement
recouvertes par des protéines spécifiques SSB (Single-Strand Binding Protein) qui
n'ont pas d'activité enzymatique connue. Elles permettent de maintenir les deux brins
 42

d'ADN sous forme monocaténaire indispensable à leur fonction de matrice. Elles

protègent également l'ADN monocaténaire contre des dégradations par des nucléases.

Figure 31. Le rôle de quelques protéines accessoires de la réplication

Remarque
Les grands principes de la réplication sont les mêmes chez les procaryotes et
eucaryotes. Néanmoins, chez les eucaryotes, la réplication est bidirectionnelle et
s'effectue généralement à partir de plusieurs origines. Par contre, chez les procaryotes,
la réplication débute à une origine fixe (unique) et procède aussi de façon
bidirectionnelle.
 43

Chapitre 3. Flux intracellulaire de l'information

génétique

1. Introduction

L'information génétique contenue dans l'ADN peut être soit copiée pour produire
davantage d'ADN au cours de la réplication (savoir faire direct), soit être traduite en
protéine (savoir faire indirect). Tels sont les processus de transfert d'information
génétique qui constituent les fonctions de l'ADN.
Les premiers chercheurs qui se sont intéressés au transfert de l'information
avaient de bonnes raisons de croire qu'elle n'était pas transmise directement de l'ADN
aux protéines. C'est que l'ADN se trouve dans le noyau (d'une cellule eucaryote) alors
que les protéines sont synthétisées dans le cytoplasme. Un autre acide nucléique
(ARN) joue en effet le rôle d'intermédiaire.

1.1. Mise en évidence de l'intervention de l'ARN dans le transfert de l'information

Lorsque des cellules sont cultivées en présence de précurseurs radioactifs
d'ARN, la radioactivité apparaît tout d'abord dans le noyau, ce qui indique que c'est là
que se déroule la synthèse de cet ARN. Dans une expérience de marquage avec chasse,
un court marquage (pulse) est suivi d'une période de chasse (chase) en présence de
précurseur non marqué de l'ARN. Dans les échantillons prélevés après la chasse, l'ARN
marqué est localisé dans le cytoplasme (Figure 1). Il semble donc que l'ARN soit
synthétisé dans le noyau et migre ensuite vers le cytoplasme. C'est donc un bon
candidat pour jouer le rôle d'un intermédiaire qui transmet l'information de l'ADN aux
protéines.

Figure 1. Synthèse de l'ARN en présence de précurseurs radioactifs. Les cellules en

croissance sont soumises à un marquage court par des précurseurs radioactifs de l'ARN,
suivi d'une chasse par des précurseurs non radioactifs. Dans une autoradiographie,
l'ARN marqué apparaît sous forme de grains noirs. Apparemment, l'ARN est synthétisé
dans le noyau et migre ensuite vers le cytoplasme.
 44

En 1957, VOLKIN et ASTRACHAN ont fait une observation importante. Ils ont
constaté qu'un des événements moléculaires les plus significatifs qui suivent l'infection
d'E. coli par le bactériophage T2 est une augmentation importante de la synthèse
d'ARN. Les bactéries infectées sont d'abord marquées à l'uracile radioactif (un
précurseur spécifique de l'ARN radioactif), puis soumises à une chasse en présence de
l'uracile froid. L'ARN isolé peu après le marquage est radioactif mais celui que l'on
récupère un peu plus tard, après la chasse, n'est pas marqué, ce qui montre que l'ARN a
un temps de demi-vie court. Enfin, lorsqu'on compare les contenus en nucléotides des
ADN d'E. coli et du phage T2 avec celui de l'ARN induit, on constate que le contenu de
ce dernier est très proche de celui de l'ADN de phage.
La conclusion provisoire de cette expérience était que l'ARN jouait un rôle
d'intermédiaire entre l'ADN des gènes et les protéines correspondantes. Cet ARN devait
devenir le messager ou la matrice qui fixe l'ordre des acides aminés dans les protéines.

1.2. Les propriétés de l'ARN

Bien que l'ARN soit un acide nucléique à longue chaîne comme l'ADN, il possède
des propriétés très différentes :
 L'ARN n'a qu'une seule fibre, ce n'est pas une double hélice.
 L'ARN comporte du ribose plutôt que du désoxyribose dans ses nucléotides,
d'où son nom d'acide ribonucléique.
 L'ARN contient une autre base pyrimidique, l'uracile (U) au lieu de la
thymine. Néanmoins, l'uracile forme des liens hydrogène avec l'adénine
exactement comme la thymine.
On distingue trois étapes dans le transfert de l'information génétique (Figure 2)
: la réplication (la synthèse de l'ADN), la transcription (la synthèse d'une copie d'ARN à
partir d'une partie d'ADN) et la traduction (la synthèse d'un polypeptide dictée par la
séquence de l'ARN).

ADN Transcription Traduction

ARN ARN Protéine

Réplication Noyau Cytoplasme

Figure 2. Les trois étapes du transfert de l'information génétique : la réplication, la

transcription et la traduction

2. La transcription ou la synthèse de l'ARN

On ne sait pas exactement pourquoi l'ARN contient de l'uracile au lieu de
thymine ou du ribose au lieu du désoxyribose. La particularité principale de l'ARN est
de ne comporter qu'une seule fibre mais pour le reste sa structure est très proche de
celle de l'ADN. Ceci indique que la transcription est fondée sur la complémentarité des
bases, qui est aussi la clé de la réplication de l'ADN. Une enzyme de transcription,
l'ARN polymérase, effectue la transcription d'une manière qui ressemble beaucoup à la
réplication (Figure 3).
 45

Figure 3. Synthèse de l'ARN sur une matrice d'ADN simple brin à partir de nucléotides
libres. Le processus est catalysé par l'ARN polymérase. L'uracile (U) s'apparie avec
l'adénine (A).
Comment l'ARN polymérase détermine quel brin d'ADN sera transcrit ?
Comment l'enzyme reconnaît l'endroit où la transcription du brin matrice pourrait
commencer ? Comment l'enzyme reconnaît l'endroit où la transcription s'arrêtera ?
Telles sont les questions critiques dans la régulation de la synthèse de l'ARN.
D'une façon générale, on peut considérer que la transcription est effectuée en
quatre ou cinq étapes distinctes, selon le système biologique (eucaryote ou procaryote)
:
1. La reconnaissance du promoteur
2. L'initiation de la transcription
3. L'élongation de la chaîne d'ARN
4. La terminaison de la transcription
5. La maturation de l'ARN

2.1. La reconnaissance du promoteur

L'ARN polymérase se lie à l'ADN au niveau d'une séquence particulière : le
promoteur. Une sous-unité de l'ARN polymérase, le facteur sigma (), permet à
celle-ci de reconnaître et de se lier fermement aux promoteurs. Les promoteurs sont
les régions de l'ADN qui signalent le début de la transcription. Ils se présentent sous la
forme d'une séquence de 20 à 200 bases. Il y a une variation dans la séquence de bases
des promoteurs et cette variation se répercute sur la fermeté de la liaison formée avec
l'ARN polymérase. Cependant, la plupart des promoteurs présente une séquence en
commun appelée séquence consensus. Une séquence consensus est une séquence
d'environ 6 nucléotides et est déterminée par deux règles :
 Pour un ensemble de promoteurs, chaque base dans la séquence consensus
est une base le plus souvent observée à une position bien précise.
 Aucune séquence particulière observée dans le promoteur ne peut
ressembler à la séquence consensus.
Les séquences consensus des promoteurs d'E. coli sont TATAAT, située
approximativement à –10 c'est-à-dire 10 nucléotides en amont du premier nucléotide à
être transcrit, désigné conventionnellement nucléotide +1 et la séquence TTGACA,
située à –35 (Figure 4). La première séquence consensus, appelée la boîte TATA est
similaire à celle qui est observée dans la plupart des promoteurs des organismes
eucaryotes.
La position des séquences consensus détermine où et à partir de quel brin d'ADN
l'ARN polymérase amorcera la synthèse. Les promoteurs forts, capables de
 46

déclencher plusieurs transcriptions successives, sont des promoteurs possédant des

séquences –10 et –35 proches des séquences consensus d'E. coli alors que les
promoteurs faibles possèdent des séquences plus éloignées.
Séquences consensus Début de la transcription

Gène TTGACA TATAA T

Figure 4. La séquence des bases dans les promoteurs de quelques gènes d'E. coli. Les
promoteurs comportent des régions similaires comme indiquées par les cadres. Le ou
les gènes sont indiqués à gauche. La numérotation correspond au nombre de bases en
amont (-) ou en aval (+) du site d'initiation de la synthèse de l'ARN.

2.2. Initiation de la chaîne

Après l'étape de reconnaissance et de liaison, l'ARN polymérase initie la
transcription tout près du point de départ de la transcription (+1). Le premier
nucléotide triphosphate est placé au site +1 ; puis le suivant est lié au carbone 3' du
ribose, et ainsi de suite. Seul un brin de l'ADN sert de matrice. Du fait que l'ARN est
synthétisé dans le sens 5'  3', le brin matrice est parcouru dans le sens 3'  5'.
Ainsi, en considérant l'orientation des promoteurs de la figure 4, le brin d'ADN matrice
est le brin complémentaire de celui qui est représenté. Par conséquent, la séquence de
l'ARN transcrit est la même que celle de l'ADN illustré excepté que l'ARN comportera
des U là où nous avons des T.
Une fois l'ARN polymérase fixée à la région –35, les deux brins d'ADN se
séparent temporairement autour de la région –10, autorisant le début de la
transcription. La distance entre ces deux séquences s'avère importante et serait
optimale pour dix nucléotides.
Le premier nucléotide utilisé par l'ARN polymérase est souvent une purine. En
effet, la comparaison de nombreuses molécules naissantes montre que 51% d'entre
elles commencent par A, 42% par G, 5% par C et seulement 2% par U.

2.3. L'élongation de la chaîne

Après l'étape d'initiation au niveau du nucléotide +1, l'ARN polymérase se
déplace le long du brin matrice de l'ADN en ajoutant successivement des nucléotides à
l'ARN en élongation. Après l'allongement des 90 premiers nucléotides, le facteur  se
détache de l'ARN polymérase pour aller assurer un nouveau démarrage de la
transcription. Chaque nouveau nucléotide est lié à l'extrémité 3' de la chaîne, si bien
que l'ARN s'allonge dans le sens 5'  3' tout comme l'ADN. L'ARN en cours de
formation reste lié à l'ADN sur une longueur d'environ 17 nucléotides (Figure5). A
mesure que l'ARN polymérase avance, la molécule d'ARN se détache de l'ADN,
permettant ainsi à la double hélice d'ADN de se reconstituer.
 47

HO
3’
5’

P
C G
P

Chaîne d’ARN en
élongation
P
U A
P Brin d’ADN
matrice

P
A T
P

P
G C
P

HO 3’
P A
P
P
5’
P
U
Prochain
nucléotide
HO

(A)
HO
3’

5’
P
C G
P

P
U A
P

P
A T
P

P
G C
P

P U A
P
5’

3’
HO
P P

(B)

(C)

Figure 5. La synthèse de l'ARN. (A) L'étape de polymérisation dans la synthèse de

l'ARN. Le nucléotide incorporant la chaîne forme un pont hydrogène avec la base
complémentaire de l'ADN. (B) Le groupe –OH de la chaîne en élongation réagit avec
le groupe  P du nucléotide entrant en ligne. (C) Topologie de la synthèse de l'ARN.
L'ARN est copié à partir d'un seul brin d'un segment de la molécule d'ADN dans cet
exemple, le brin Bsans la présence d'une amorce. Dans cette région de l'ADN, l'ARN
 48

n'est pas copié à partir du brin A. Cependant, dans une région différente (par exemple
au niveau d'un autre gène) le brin A pourrait être transcrit plutôt que le brin B.

2.4. La terminaison
L'arrêt ou la terminaison de la synthèse de l'ARN peut s'accomplir de deux
manières différentes.
1. Par la reconnaissance d'une séquence d'ADN appelée terminateur. Il s'agit
d'une séquence palindromique riche en bases G-C suivie d'une région riche
en A. Les palindromes sont des mots ou des phrases qui peuvent lus
d'une manière identique dans les deux sens (Radar – Laval – ici – élu par
cette crapule).
Dans le DNA, les palindromes se présentent sous forme de séquences répétées
et inversées où la même séquence se trouve inversée si on passe d'un brin à son
complémentaire à partir d'un centre de symétrie (Figure 6). Quand cette
séquence est transcrite, l'ARN forme un appariement intrabrin en épingle à
cheveux qui contribue à détacher l'ARN polymérase en libérant la molécule
d'ARN aussi appelée transcrit primaire (Figure 6).

C G
C G
(A) GCATCC GGATGC Appariement intrabrin après U A
A U
(B) CGTAGG CCTACG transcription du brin A C G
G C

Centre de symétrie
Figure 6. Séquences palindromiques et appariement intrabrin induisant la fin de
la transcription

2. Un autre mécanisme d'arrêt de la transcription complémentaire du premier

est parfois assuré par une protéine spécifique, le facteur Rhô () qui interagit
avec l'hybride ADN/ARN et le dissocie en consommant de l'ATP.

2.5. La maturation de l'ARN transcrit (transcrit primaire)

Quoique le processus de la transcription soit similaire entre organismes
eucaryotes et procaryotes, il existe une différence majeure au niveau du devenir
immédiat du produit de la transcription. En effet, chez les procaryotes, le produit
immédiat de la transcription, appelé transcrit primaire est l'ARN messager (ARNm).
Par contre, chez les eucaryotes, le transcrit primaire doit subir une modification. En
effet, les ARN–Poly-A extraits du noyau de cellules eucaryotes sont instables et très
hétérogènes en taille. Au contraire dans le cytoplasme les ARN sont plus stables,
homogènes et de taille nettement plus faible bien que possédant la coiffe et la queue
Poly-A. En fait le transcrit primaire des eucaryotes doit être converti en ARNm. Cette
conversion appelée maturation, est constituée de trois événements qui peuvent être
facilement mis en évidence par des expériences d'hybridation de l'ARNm avec l'ADN
dénaturé. L'observation au microscope électronique de l'hybride ADN/ARNm mature
 49

(extrait du cytoplasme) fait apparaître des boucles d'ADN correspondant à des régions
non conservées dans l'ARNm final qui participera à la traduction.
La première étape de la maturation est l'adjonction à l'extrémité 5', dans un sens
inhabituel 5'  5' (au lieu de 3'5') d'une coiffe constituée d'un résidu de 7-
méthylguanosine triphosphate (MeG**). La coiffe MeG** est lié à l'extrémité 5' du
transcrit au court de la réplication.
Ensuite, s'opère un clivage spécifique à l'aplomb d'une séquence signale
particulière appelée site de polyadénylation. Ce clivage élimine une partie de
l'extrémité 3' du transcrit et une enzyme, la poly-A polymérase, y ajoute une séquence
polyadénylique, de 20 à 200 nucléotides, appelée séquence ou queue poly-A.
Enfin, des séquences sont successivement excisées du transcrit sans toucher aux
extrémités. Les séquences éliminées, par conséquent non traduites, sont appelées
introns. Les parties conservées, ou exons sont reliées entre elles pour former l'ARNm
final. Cette opération est appelée épissage ; elle consiste en des excisions des introns
et des raboutages des exons (Figure 7).
Ce processus, désigné aussi maturation post-transcriptionnelle, peut éliminer
jusqu'à 90% des séquences du transcrit primaire (introns) et nécessite plusieurs
enzymes différentes. L'exemple le plus décrit est celui du gène de l'ovalbumine dont
le gène comporte sept exons et sept introns comptant pour 75% de la séquence du
gène.
 50

ADN

transcrit primaire Sens de la transcription Brin d’ADN

transcrit

Coiffe Libération du Clivage 20 bases après

Me G** transcrit primaire la séquence AAUAAA

AAUAAA

Exon Intron
Ajout d’une queue
poly-A en 3’

AAUAAA AAAAA

Excision d’introns

AAUAAA AAAAA

Transcrit mature
Figure 7. Maturation du transcrit primaire des eucaryotes par adjonction de la coiffe
MeG** et la queue poly-A respectivement aux extrémités 5' et 3', et l'épissage
(l'excisions des introns et le raboutage des exons).

3. La traduction
La synthèse de toute molécule de protéine dans une cellule est dirigée par
l'ARNm qui intervient comme une copie de l'ADN du noyau envoyée dans le
cytoplasme. La production des protéines comprend deux types de processus :
1. Un processus de transfert d'information dans lequel la séquence de base de l'ARNm
détermine la séquence d'acides aminés de la protéine.
2. Un processus chimique dans lequel les acides aminés sont liés entre eux.
Le terme traduction désigne l'ensemble de ces processus c'est-à-dire, l'ensemble
des mécanismes qui transforment l'information de la séquence de l'ARN en protéine.
Néanmoins, si on mélange l'ARNm et les 20 acides aminés dans un tube à essai
en espérant obtenir une protéine, on sera tout simplement déçu. En effet, d'autres
constituants sont nécessaires ; la découverte de la nature ce ces composés a été la clé
de la compréhension du mécanisme de la traduction.
 51

3.1. Les composantes de la traduction

3.1.1. La technique de centrifugation en gradient de saccharose
Le gradient de saccharose est un gradient de sédimentation préparé en déposant
successivement des couches de solutions de saccharose de moins en moins concentrées
les unes au dessus des autres dans un tube à centrifuger. L'échantillon à examiner est
déposé délicatement à la surface du gradient. En centrifugeant la solution à très
grande vitesse dans un appareil qui permet aux tubes d'osciller librement, les
matériaux en cours de sédimentation migrent dans le gradient à des vitesses différentes
qui dépendent de la taille et la forme des molécules. Les grandes molécules migrent
plus loin en un temps donné que les petites. Les molécules séparées de cette manière
peuvent ensuite être recueillies individuellement en récoltant les unes après les autres
les gouttes qui s'échappent par une petite ouverture à la base des tubes (Figure 8). La
distance qui sépare une fraction du fond du tube indique sa position et son coefficient
de sédimentation (S) qui est lui-même une mesure de la taille des molécules de cette
fraction.

Figure 8. La technique de centrifugation en gradient de saccharose (sucrose). (A) Un

gradient de densité de sucrose est préparé dans un tube à centrifuger en déposant
successivement des couches de densités décroissantes. (B) L'échantillon à tester est
placé au sommet du gradient. (C). La centrifugation provoque la sédimentation
différentielle des différents constituants (fractions) de l'échantillon. (D) Les différentes
fractions se présentent comme des bandes dans le gradient centrifugé. (E) Les
différentes bandes sont récoltées séparément en recueillant à intervalles fixes les
échantillons qui s'échappent goutte à goutte du tube troué à la base. La valeur S d'une
fraction est basée sur sa position dans le gradient, qui est elle-même déterminée par le
moment où elle s'échappe à la base du tube.

3.1.2. Les composantes de la traduction

En utilisant le pouvoir séparateur de la technique de centrifugation en gradient
de sucrose, il est possible d'identifier diverses molécules et agrégats de molécules
présents dans un système de synthèse des protéines. Les principaux constituants en
sont les ARN de transfert (ARNt), les ribosomes et les ARNm.
 Les ARN de transfert ou ARNt  Les acides aminés n'ont pas d'affinité
spécifique pour l'ARNm. Ils s'attachent aux matrices d'ARNm par l'intermédiaire
de molécules adaptatrices, les ARNt. Chaque ARNt est attaché à un acide aminé
 52

particulier. Les ARNt sont de petites molécules d'environ 75 bases. Toutes

présentent une alternance de régions en forme d'hélices stabilisées par des liens
hydrogènes et des régions monocaténaires et prennent une structure secondaire
en forme de feuille de trèfle (Figure 9). L'extrémité 5' de l'ARNt est toujours
occupée par une G alors que l'extrémité 3' se termine par la séquence CCA. La
fonction 3'OH de l'adénosine est estérifiée par le groupement COOH de
l'acide aminé.
 Les ribosomes  Les ribosomes sont des organites cellulaires résultant d'un
mélange complexe de diverses protéines ribosomiques avec des ARN
ribosomiques (ARNr). Au microscope électronique, le ribosome apparaît
comme une goutte de liquide. Cette masse ronde peut, par traitement chimique,
être scindée en deux sous-unités : une grande (de 50 S chez E. coli) et une petite
(30 S chez E. coli). Les deux sous-unités s'associent au niveau de l'ARNm pour
former le ribosome mature. Ces composantes sont des particules sur lesquelles
la synthèse protéique a lieu. Le ribosome se déplace le long de la molécule
d'ARNm et assure des mises en contact successives entre l'ARNm et l'ARNt.
Chaque ribosome comporte, au niveau de la petite sous-unité, un site de liaison
avec l'ARNm et au niveau de la grande sous-unité, deux sites de liaison avec
l'ARNt ; en outre une enzyme la peptidyl transférase est encastrée dans la
grande sous-unité du ribosome (Figure 10).
Outre les composantes pouvant être révélées par la technique de la
centrifugation en gradient de sucrose, plusieurs dizaines de protéines et autres
molécules différentes interviennent dans la traduction. Les plus importantes sont :
 Les aminoacyl ARNt transférases  C'est un ensemble d'enzymes dont chaque
espèce catalyse l'attachement d'un acide aminé particulier à la molécule d'ARNt.
Un ARNt porteur d'un acide aminé est appelé ARNt aminoacylé ou aminoacyl-
ARNt ou ARNt chargé.
 Les facteurs d'initiation, d'élongation et de terminaison  La synthèse des
polypeptides peut être divisée en trois étapes dont chacune requiert une molécule
protéique spécialisée. Il s'agit des protéines d'initiation (IF pour Initiation
Factor), d'élongation (EF pour Elongation Factor) et de terminaison (RF pour
Release Factor).

Régions en forme d’hélices stabilisées

par des liens hydrogène Régions monocaténaires

Figure 9. La structure en feuille de trèfle de l'ARNt

 53

Peptidyl transférase

Grande sous-unité Sites de liaison des ARNt

Petite sous-unité Sites de liaison de l’ARNm

Figure 10. La représentation simplifiée à deux sous-unités et des régions importantes

du ribosome d'E. coli. La petite sous-unité comporte 21 protéines et une molécule
d'ARN. La grande sous-unité comporte 34 protéines et deux molécules d'ARN.

3.2. Le code génétique et ses caractéristiques

3.2.1. Elucidation du code génétique

Le transfert de l'information génétique de la séquence nucléotidique à la

séquence protéique est réalisé grâce à un système de code entre les deux types de
séquences : le code génétique. Le code génétique gère la correspondance entre la
séquence nucléotidique d'un ARNm et la séquence en acides aminés d'une protéine.
Les séquences nucléotidiques sont lues séquentiellement par triplet. Chaque
triplet est appelé codon et aucun chevauchement dans la lecture des codons successifs
ne se produit (Figure 11). Ainsi le premier codon est très important puisqu'il définit le
cadre de lecture pour le reste de la séquence. Puisqu'il n'y a pas de chevauchement, il
n'existe que trois cadres de lecture possibles (Figure 12).

A U G U C G U C G C U C
1 2 3 4 Lecture sans
chevauchement
A U G U C G U C G C U C
1 4 7 10

2 5 8 Lecture avec
chevauchement
3 6 9

Figure 11. Lecture de l'ARNm au moment de la traduction. La lecture d'un ARNm se

fait par triplets. Si elle était chevauchante, la lecture d'un ARNm de 12 nucléotides
aboutirait à un peptide de 10 acides aminés. En réalité, il n'y a pas de chevauchement
dans la lecture et la traduction conduit à la formation d'un tripeptide.

Cadre de Séquence Protéine

lecture
U U G U U G U U G U U G
1er cadre Poly Leu
2ème cadre U U G U U G U U G U U G
Poly Cys
 54

3ème cadre U U G U U G U U G U U G
Poly Val

Figure 12. Cadre de lecture d'ARNm en cours de traduction. Un polynucléotide

synthétique (UUG)n traduit fournit trois polypeptides différents selon le cadre de
lecture employé.

L'établissement du code génétique complet (c'est-à-dire la correspondance entre

les triplets et les acides aminés) est basé sur l'utilisation de systèmes de synthèse de
protéines in vitro. En fait, en mélangeant dans un tube à essai, un extrait d'E coli
contenant de l'ATP, des ribosomes, des tRNA, du mRNA, l'aminoacyl-tRNA
transférase, et des acides aminés, Marshal NIRENBERG et Heinrich MATHAEI ont pu
réaliser une synthèse protéique. Une fois que le mRNA initial est épuisé, on peut
redémarrer la synthèse protéique en ajoutant dans le tube, des molécules de mRNA
artificielles synthétisées enzymatiquement in vitro selon la réaction suivante :
ARN  Pi (phosphate inorganiqu e)       XDP (ribonucléoside diphosphate)
polynucléotide phosphorylase

En présence de fortes concentrations de nucléosides diphosphates, la réaction

peur se dérouler dans le sens inverse pour ainsi aboutir à la synthèse du mRNA.
Dans une première série d'expériences, les auteurs ont constitué une série de
milieux réactionnels contenant chacun des vingt acides aminés dont un seul est marqué
radioactivement. Chaque milieu contient tous les autres composés nécessaires à la
synthèse protéique sauf le mRNA. Dans ces conditions, la synthèse protéique est
déclenchée par l'ajout du mRNA dans le milieu réactionnel. Dans ces expériences,
une modification de la force ionique du milieu induit le démarrage de la
traduction au hasard en absence de tout codon initiateur. Les auteurs recueillent
les protéines synthétisées par précipitation à l'acide trichloracétique (TCA), puis ils y
mesurent la radioactivité afin de détecter la nature de l'acide aminé incorporé. Ils ont
ainsi montré qu'en présence de poly(U) jouant le rôle du mRNA, la phénylalanine
marquée était incorporée dans la protéine précipitée. On en conclue que le codon UUU
spécifie la phénylalanine. Des expériences similaires ont montré que AAA est un
codon de la lysine tandis que CCC spécifie la proline.
Les autres codons ont été élucidés par la traduction de polyribonucléotides à
séquences dinucléotidiques ou trinucléotidiques alternées. Un polyAC par exemple
porte deux codons possibles quel que soit le cadre de lecture adopté : ACA et CAC.
Sa traduction fournie un mélange équimolaire d'histidine et de thréonine.
L'identification des codons de ces acides aminés est donnée par une autre expérience.
Il s'agit de synthétiser un polymère de A et de C dans des rapports molaires de 5 : 1.
Dans ce polymère le codon AAA sera statistiquement le plus représenté et le codon
CCC le moins représenté. Les codons mixtes (A)2C c'est-à-dire AAC, ACA et CAA
seront plus fréquents que les codons A(C2) c'est-à-dire CCA, CAC et ACC. L'analyse
de la composition en acides aminés des produits de la traduction indique que seule
l'histidine peut avoir A(C2). Il en résulte que CAC code l'histidine et donc ACA est le
codon de la thréonine (Tableau 1).
 55

Tableau 1. Le code génétique

Seconde lettre

Troisième lettre
Première lettre

3.2.2. Caractéristiques du code génétique

1. Le code génétique n'a pas de ponctuation et il est non chevauchant, c'est à

dire que le message est lu sans interruption par blocs de trois bases jusqu'à la
rencontre d'un codon d'arrêt.
2. Le code génétique est universel, c'est-à-dire que tous les organismes utilisent le
même langage. Le message provenant d'une cellule animale produira la même
protéine, quelle que soit le type de cellule qui assure la traduction.
3. Le code génétique est dégénéré ou redondant, c'est-à-dire qu'à deux
exceptions près (AUG et UGG), il y a plus d'un codon correspondant à un acide
aminé donné.
4. Le code génétique possède un codon de départ (AUG) dit codon d'initiation et
des codons d'arrêt (UAA, UAG et UGA) dits codons non sens ou codons stop.

3.2.3. La théorie de la base flottante (wobble)

L’analyse séquentielle des tRNA montre aussi que certaines espèces de tRNA
peuvent apporter leurs acides aminés spécifiques en réponse à plusieurs codons et non
à un seul. Pour ces tRNA, la base en position 5’ de l’anticodon, c’est à dire la base
complémentaire à la 3ème base du codon n’est pas aussi stériquement contrainte que les
deux autres. Ce type d’appariement, qualifié d’appariement lâche est appelé
flottement ou wobble (Figure 13). Néanmoins, seuls certains appariements flottants
sont possibles car une molécule de tRNA particulière ne peut pas s’apparier avec plus
de trois codons différents (Tableau 2). La règle qui détermine cette flexibilité
d’appariement (fixation) est appelée théorie de la base flottante (wobble).
 56

Figure 13. Appariement des bases selon la théorie de la base flottante

Tableau 2. Appariements codon – anticodon permis par la théorie de la base flottante

(Wobble)

Extrémité 5’ de l’anticodon Extrémité 3’ du codon

G U ou C
C G seulement
A U seulement
U A ou G
I U, C ou A

Exemple
Exemple 1. L’anticodon 5’-UAA-3’ de l’ARNtLeu peut s’apparier avec deux codons :
le codon 5’-UUA-3’ avec lequel il forme un appariement normal et le codon 5’-UUG-
3’ avec lequel il forme un appariement flottant ;
Exemple 2. L’anticodon 5’-GGA-3’ de l’ARNtSer peut s’apparier avec deux codons :
le codon 5’-UCC-3’ avec lequel il forme un appariement normal et le codon 5’-UCU -
3’ avec lequel il forme un appariement flottant. (Figure 14).
Ser Ser

3’ 3’

5’ 5’

tRNASer

A G G A G G
Normal Flottant
U C C U C U
5’ 3’ 5’ 3’
Ser Ser

CODON 1 (UCC) CODON 2 (UCU)

 57

Leu Leu

3’ 3’

5’ 5’

tRNALeu

A A U A A U
Normal Flottant
U U A U U G
5’ 3’ 5’ 3’
Leu Leu

CODON 1 (UUA) CODON 2 (UUG)

Figure 14. Illustrations de la théorie de la base flottante

4. La biosynthèse des protéines

La traduction de l'ARNm en protéines s'accomplit toujours dans le sens 5'  3'.
Chez les procaryotes, la traduction commence avant même que la transcription ne
prenne fin. Chez les eucaryotes, la transcription s'opère dans le noyau alors que la
traduction a lieu dans le cytoplasme. Les ARNm sont donc transcrits puis maturés dans
le noyau. Ils migrent dans le cytoplasme pour y être traduits en protéine (Figure 15).
La traduction peut être subdivisée en trois étapes essentielles : l'initiation ou le
démarrage, l'élongation ou l'allongement et la terminaison ou l'arrêt.

Figure 15. L'expression des gènes chez les eucaryotes. L'ARNm subit une maturation
avant son transfert dans le cytoplasme.

4.1. L'initiation ou le démarrage

L'étape d'initiation correspond à la liaison du ribosome à un ARNm, à la
recherche du codon d'initiation et à la fixation du premier aminoacyl-ARNt.
Chez les bactéries, le démarrage de la synthèse protéique commence par la
formation d'un complexe entre la petite sous-unité 30S, le premier ARNt chargé et une
 58

molécule d'ARNm. Au cours de la synthèse de tous les polypeptides bactériens, le

premier acide aminé incorporé est la N-formyl-méthionine (fMet) c'est-à-dire une
méthionine modifiée par la présence d'un groupement formyl fixé sur son radical
aminé terminal. Le codon principal de cet acide aminé est AUG, parfois GUG. Du
fait que le groupement amine de fMet est bloqué, un tel acide aminé ne peut être inséré
qu'en début de la chaîne.
Des facteurs dits d'initiation (IF) sont nécessaires. Ce sont les protéines IF1,
IF2 et IF3. Chez les eucaryotes, il en existe 5. Un GTP est lié à IF2. Ces facteurs se
fixent à la sous-unité 30S lors de la première étape d'initiation. Le GTP lié à IF2 serait
l'élément stabilisateur de cette fixation. A ce stade, le facteur IF3 empêcherait
l'association des sous-unités 30 S et 50S. La seconde étape est l'association de
l'ARNtmet et de l'ARNm à l'ensemble IF-30S-GTP.
IF3 est ensuite libéré, permettant l'association entre les deux sous-unités,
l'hydrolyse du GTP ainsi que la libération des deux autres facteurs d'initiation. Le
complexe ainsi obtenu est appelé complexe d'initiation 70S.
Chez les eucaryotes, les ribosomes reconnaissent la coiffe méthylée grâce à des
facteurs appelés protéines fixatrices de la coiffe (Cap Binding Proteins). Ils glissent
ensuite le long de l'ARNm à partir de l'extrémité 5' jusqu'à la rencontre du premier
codon AUG initiateur.

4.2. Elongation ou allongement

L'élongation implique la formation de la liaison peptidique entre aminoacides et
le déplacement du ribosome le long de l'ARNm. Chaque ribosome possède deux sites
de fixation pour les ARNt. Ce sont les sites P (Peptidyl) et A (Aminoacyl). La
fixation du ribosome à l'ARNm s'opère de telle manière que l'ARNtfMet soit positionnée
dans le site P pour s'apparier au codon AUG de l'ARNm. Le site A disponible peut
alors recevoir l'aminoacyl-ARNt dont l'anticodon correspond au second codon de
l'ARNm. Une liaison peptidique est établie entre le groupement COOH du premier
acide aminé (occupant le site P) et le groupe NH2 du second acide aminé (occupant le
site A) grâce à l'enzyme peptidyl tranférase encastrée dans la grande sous-unité du
ribosome. A la suite de cette liaison, l'ARNtfMet déchargé quitte le site P et le dipeptide
se trouve alors lié à l'ARNt portant le deuxième acide aminé et placé au site A. Le
point de fixation de la chaîne en croissance est ainsi déplacé du site P au site A. Ainsi,
la chaîne peptidique est synthétisée à partir de son extrémité NH2 vers son extrémité
COOH qui est toujours terminée par une molécule d'ARNt. Une fois que le site P est
libéré, l'acide aminé subit une translocation qui lui permet de passer au site P. Le site
A peut de nouveau recevoir un nouvel aminoacyl-ARNt. Dès que ce dernier reçoit un
autre acide aminé, une liaison peptidique l'associe à celui qui le précédait dans le site P
et le cycle recommence, engendrant ainsi l'élongation du polypeptide.
L'allongement de la chaîne polypeptidique requiert deux molécules de GTP qui
sont hydrolysées pour chaque acide aminé ajouté. Des facteurs d'élongation (EF)
sont également indispensables. Le déplacement du peptidyl-ARNt du site A au site P
est sous la dépendance d'une enzyme appelé translocase.
Les mécanismes d'élongation de la chaîne peptidique chez les procaryotes
s'avèrent similaires à ceux des eucaryotes avec également la contribution des facteurs
d'élongation.
 59

4.3. Arrêt ou terminaison

La terminaison comprend le repérage du codon d'arrêt ou codon stop, la
rupture de la liaison ester entre le dernier ARNt et la chaîne polypeptidique et la
libération de cette dernière. Elle nécessite deux conditions :
 la présence d'un codon qui spécifie l'arrêt de l'élongation
 l'intervention d'un facteur de dissociation (RF) capable de reconnaître le
signal de terminaison de la chaîne et de favoriser la rupture de la liaison
avec l'ARNt et la libération de la chaîne (Figure 18).
Remarque
Le segment d'ADN contenant l'ensemble des triplets codant une chaîne
polypeptidique ainsi que les signaux d'initiation et de d'arrêt s'appelle cistron. Les
ARNm procaryotes sont dits polycistroniques car ils codent généralement plus d'une
chaîne polypeptidique.
Chez les procaryotes également, le gène et la protéine qu'il code sont
colinéaires, c'est-à-dire que la quasi totalité des séquences nucléotidiques sont
informatives et traduites en protéines.
Chez les eucaryotes, il n'y a pas d'ARNm polycistronique mais il existe des
systèmes dont les résultats sont semblables. C'est le cas des protéines synthétisées
sous la forme d'une polyprotéine qui sera clivée par la suite pour libérer des protéines
individualisées. Dans la séquence du gène de la polyprotéine il n'existe pas plusieurs
codons d'initiation et de terminaison ; c'est la position de certains acides aminés qui
fait office de limite de chaque protéine. Ces acides aminés sont repérés par des
protéases spécifiques qui coupent la polyprotéine.
Ainsi chez les eucaryotes, n'y a pas de réinitiation de la synthèse protéique après
la rencontre d'un codon stop.
Quand la taille d'une chaîne polypeptidique atteint 25 acides aminés, le codon
d'initiation AUG de l'ARNm est complètement libre et un nouveau démarrage peut
commencer. Le phénomène se reproduit plusieurs fois jusqu'à ce que l'ARNm soit
couvert de ribosomes espacés d'environ 80 nucléotides. Cette grande unité de
traduction, appelée polyribosome ou polysome, permet à la cellule de produire
plusieurs copies de la protéine en question à partir de la molécule d'ARNm.