![1. BIOCHIMIE
Courbe de La calibration
Glucose [g/L] = A Échantillon x Conc. Cal. [g/L] / A Cal ASAT [U/L] =ΔA/min. Échantillon x Conc. Cal [U/L] / ΔA/min. Cal
Créatinine [mg/dL] = ΔA Échantillon x Conc. Cal. [mg/dL] / ΔA Cal.](https://image.slidesharecdn.com/lestechniquesetmethodesenbiologiemdicale-240512011618-f94b709e/85/LES-TECHNIQUES-ET-METHODES-EN-BIOLOGIE-MEDICALE-pdf-15-320.jpg)
LES TECHNIQUES ET METHODES EN BIOLOGIE MÉDICALE.pdf
- 1. DR DIEDHIOU IDEX SANTE TECHNIQUE DE LABORATOIRE L1 TC TECHNIQUES ET METHODES EN BIOLOGIE MEDICALE
- 2. • GENERALITES • LES HÔPITAUX, CENTRE DE SANTE, LES CENTRES DE RECHERCHE ET DE NOMBREUSES ENTREPRISES POSSÈDENT DES LABORATOIRES AFIN D'EFFECTUER LES ANALYSES DONT ILS ONT BESOIN POUR FONCTIONNER. • CES ANALYSES SONT RÉALISÉES GRÂCE À DES TECHNIQUES DE LABORATOIRE QUI TIRENT LEURS PRINCIPES DE LA BIOLOGIE, DE LA CHIMIE.
- 3. Images de quelques analyseurs
- 4. Chapitre I: La méthode analytique
- 5. 1. La méthode analytique : de quoi s’agit-il? ⚫ La méthode analytique est une technique qui se consacre à l’analyse des substances chimiques. Elle permet d’identifier la composition chimique des échantillons et de mesurer leur quantité. ⚫ Différentes méthodes sont utilisées pour analyser les substances, dont la spectrométrie de masse, la chromatographie, la spectroscopie infrarouge et l’analyse thermique. Les résultats obtenus sont précieux pour diverses disciplines comme la médecine, l’industrie pharmaceutique, l’agriculture ainsi que pour la recherche scientifique.
- 6. 1. Le principe de la méthode: de quoi s’agit-il? La méthode doit être décrite et doit inclure les éléments ci-dessous : Analyte/mesurande détecté Principe analytique évalué Type d’échantillon/matrice Référence du réactif Référence de l’équipement Référence des contrôles d’étalonnage
- 7. 2. Les principe de méthodes ⚫ Les principes biologiques, chimiques et physico-chimiques ⚫ Les réactions chimiques, biochimiques, enzymatiques. ⚫ Principe des analyses physico-chimiques, microscopie électronique. ⚫ Éléments de biologie cellulaire, bactériologie, virologie, hématologie, immunologie. ⚫ Intérêt clinique des analyses, intégration du laboratoire dans le système de santé.
- 8. 3 Technologie des équipements et méthodes d'analyses Vue d'ensemble des techniques et équipements des laboratoires d'analyses médicales. Biochimie: Techniques et méthodes d'analyses en biochimie: Spectrophotomètres, photomètres d'émission, photomètres d'absorption, fluorimétrie, spectrofluorimétrie, techniques enzymatiques, etc... Principes et caractéristiques des appareillages et des automates d'analyses. Principe des électrodes sélectives et à gaz (Ph, Po2, Pco2). Pharmacologie: Appareils et méthodes. Microbiologie: Bactériologie, virologie, sérologie. Automatisation. Hématologie: Hémostase, Groupage sanguin, Numération Formule sanguine. Trieurs de cellules, Cytométrie en flux Immunoanalyse: Techniques et méthodes en immunologie (Immuno-enzymologie, immunochimie, Immuno-spectrofluorimétrie, radio-immunologie,). Automatisation et perspectives en immunoanalyse. Biologie moléculaire: Principes et automatisation en Biologie Moléculaire. Intérêts cliniques, équipements.
- 9. Les différente technique utilise en laboratoire d’analyses médicales
- 10. SOMMAIRE 1. BIOCHIMIE 2. IMMUNOLOGIE 3. BACTERIOLOGIE 4. HEMATOLOGIE 5. HEMOSTASE
- 11. 1. BIOCHIMIE ⚫ NEPHELEMETRIE ⚫ Correspond à la mesure de la lumière diffusée par une suspension , d'une valeur sous un angle de : 70° par rapport à la direction du faisceau incident.
- 12. 1. BIOCHIMIE ⚫ TURBIDIMETRIE C’est des techniques d’immunoprécipitation quantitatives en milieu liquide. Les complexes antigènes anticorps dans cette technique restent en solution et ne précipitent pas, pour cela on travaille en zone d’excès d’anticorps si on veut doser des antigènes. La réaction se fait dans des cuves de mesure traversée par une lumière.
- 13. 1. BIOCHIMIE ⚫ La spectrophotométrie
- 14. 1. BIOCHIMIE ⚫ La spectrophotométrie permet de mesurer l’absorbance (appelée aussi densité optique) d’une substance en solution. Pour mesurer cette absorbance, on utilise un spectrophotomètre. ⚫ Le spectrophotomètre comprend tout d’abord une source de lumière. Celle-ci va ensuite passer dans un monochromateur (réseau diffractant la lumière de la source) qui va sélectionner une longueur d’onde. ⚫ La lumière d'intensité I0 va ensuite traverser une cuve qui contient la solution a analyser. ⚫ La lumière transmise I est ensuite analysée. (En passant par une cellule photoélectrique et un amplificateur).
- 15. 1. BIOCHIMIE Courbe de La calibration Glucose [g/L] = A Échantillon x Conc. Cal. [g/L] / A Cal ASAT [U/L] =ΔA/min. Échantillon x Conc. Cal [U/L] / ΔA/min. Cal Créatinine [mg/dL] = ΔA Échantillon x Conc. Cal. [mg/dL] / ΔA Cal.
- 16. solution colorée) EXERCICE ⚫ On cherche à déterminer la concentration Cx d'une solution. Le dosage par étalonnage va s'appuyer sur une caractéristique physique de cette solution : par exemple sa conductivité pour une solution ionique ou son absorbance pour une solution colorée. On réalise alors plusieurs solutions de même nature que la solution à doser. Ces solutions serviront d'étalons : on les réalisera de façon à ce que leur concentration soit connue avec la meilleure précision possible. On obtient ainsi une « gamme étalon » dans le cas d'une
- 17. 1. BIOCHIMIE ⚫ Chromatographie en phase gazeuse (CPG)
- 18. 1. BIOCHIMIE ⚫ Chromatographie en phase gazeuse (CPG) ⚫ Principe La chromatographie en phase gazeuse (CPG) s’adresse à la séparation des constituants volatils ou volatilisables. Le mélange gazeux ou liquide est introduit dans le système d’injection, volatilisé s’il y a lieu puis entraîné par un gaz vecteur (phase mobile)
- 19. 1. BIOCHIMIE ⚫ Électrophorèse ⚫ Définition L’électrophorèse est une méthode de séparation de constituants en solution. Elle est basée sur la différence de migration de particules chargées électriquement, sous l’effet d’un champ électrique. Elle s’applique aux ions métalliques, aux molécules chargées quelle que soit leur taille.
- 20. 1. BIOCHIMIE
- 21. 1. BIOCHIMIE ⚫ Réflectance - spectrophotomètre ⚫ Pour mesurer la couleur en mode réflexion, un spectrophotomètre projette toutes les longueurs d’ondes de la lumière (de 360 à 750) à travers le flash, puis mesure la lumière réfléchie pour créer un graphique quantifié de la couleur. Les longueurs d’ondes dominantes réfléchies désignent la couleur. Les tons violets, indigo et bleus ont une plage de longueurs d’ondes réduite, comprise entre 400 et 550. Les verts se situent au centre, avec une longueur d’ondes entre 550 et 600. Les nuances de jaune, d’orange et de rouge possèdent les plus grandes longueurs d’ondes visibles. Les azurants optiques et les agents fluorescents, les extrêmes, culminent à plus de 100 %.
- 22. 1. BIOCHIMIE ⚫ la réfractométrie ⚫ Utilisation des principes optiques pour analyser les substances ⚫ La réfractométrie est une technique de mesure quantitative et non destructive basée sur des principes optiques évidents dans la nature : Par exemple, lorsque la lumière traverse l’eau, le faisceau lumineux est réfléchi – et les objets sous l’eau semblent avoir des proportions différentes de celles observées au-dessus de l’eau. Ce phénomène est appelé réflexion et réfraction.
- 23. 1. BIOCHIMIE ⚫ la réfractométrie
- 24. 2. Immunologie ELISA, (= Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Le test ELISA (acronyme de Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) est destiné à détecter et/ou doser une protéine dans le sang. Cette protéine appelée "enzyme", va se fixer à certains constituants spécifiques de la maladie dans le sang, et par repérage et quantification de cette enzyme, la maladie pourra être affirmée.
- 25. 2. Immunologie
- 26. 2. Immunologie ⚫ Enzyme-Linked fluorescence Assay (ELFA)
- 27. 2. Immunologie ⚫ Enzyme-Linked fluorescence Assay (ELFA) ⚫ Son principe repose sur la technique ELFA (méthode ELISA avec une lecture finale en fluorescence) et permet l’obtention de résultats QUANTITATIFS
- 28. 2. Immunologie ⚫ Electrochimiluminescence (ECLIA) ⚫ L'Electrochimiluminescence (abréviation ECL) ou encore chimiluminescence électro générée est un phénomène de luminescence qui est initié par une étape de transfert d'électron à la surface d'une électrode. ⚫ ECLIA s'appuie sur l'interaction entre les anticorps et les antigènes du corps, déclenchant une réaction qui émet de la lumière. La quantité de lumière produite est proportionnelle à la concentration de la molécule cible. ⚫ De plus, l’intensité ECL est proportionnelle à la quantité de luminophore et de Co-réactif engagée, ce qui permet d’acquérir un signal dépendant de la concentration sur plusieurs ordres de grandeur. Ainsi, l’ECL est très utilisée dans le diagnostic médical, notamment pour détecter la présence d’anticorps spécifiques même sous forme de traces dans des échantillons de sang ou d’urine. Dans ce contexte.
- 29. 2. Immunologie ⚫ Immunoblotting (Immuno-dot) Les techniques d'immun transfert utilisent des anticorps (ou d'autres ligands spécifiques dans des techniques apparentées) pour identifier des protéines cibles parmi un certain nombre d'espèces protéiques non apparentées. Ils impliquent l’identification d’une cible protéique via des réactions spécifiques antigène-anticorps (ou protéine-ligand). Les protéines sont généralement séparées par électrophorèse et transférées sur des membranes (généralement de la nitrocellulose). La membrane est recouverte d'un anticorps primaire destiné à une cible spécifique, puis d'un anticorps secondaire marqué, par exemple, avec des enzymes ou des radio-isotopes. Lorsque le ligand n’est pas un anticorps, la réaction peut être visualisée à l’aide d’un ligand directement marqué. Le dot blot est une procédure simplifiée dans laquelle les échantillons de protéines ne sont pas séparés par électrophorèse mais sont déposés directement sur la membrane. L'immun transfert est désormais largement utilisé en conjonction avec l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel de Polyacrylamide, non seulement à des fins traditionnelles, telles que l'identification par immun affinité des protéines et l'analyse des réponses immunitaires.
- 30. 3. Bactériologie ⚫ Technique d’ensemencement (mise en culture)
- 31. 3. Bactériologie ⚫ Identification bactérienne ⚫ L’identification exacte d’un micro-organisme permet d’utiliser les caractéristiques connues d’un groupe taxonomique pour en évaluer les risques. Les renseignements sur ce groupe taxonomique peuvent également contribuer à identifier des organismes « étroitement apparentés » (au niveau de l’espèce ou des souches), lesquels peuvent servir à fournir des renseignements complémentaires permettant de déterminer le danger lié à un micro-organisme déclaré et de faire la distinction entre celui-ci et de possibles pathogènes d’importance clinique ou environnementale. En outre, les renseignements sur des organismes étroitement apparentés pourraient servir à fournir des données de substitution pour d’autres éléments d’information du règlement.
- 32. 3. Bactériologie ⚫ Identification bactérienne
- 33. 3. Bactériologie ⚫ Identification bactérienne
- 34. 3. Bactériologie ⚫ Antibiogramme ⚫ L’antibiogramme est un examen de laboratoire visant à déterminer la sensibilité d’une bactérie à différents antibiotiques. En effet, de nombreuses bactéries sont devenues, avec le temps, résistantes aux antibiotiques. Il n’est donc pas toujours évident de trouver l’antibiotique qui sera efficace pour traiter une souche bactérienne donnée. ⚫ En mettant en contact des bactéries (prélevées chez un malade) avec plusieurs antibiotiques, l’antibiogramme permet de voir quels sont les produits qui inhibent la croissance bactérienne et qui seront efficaces pour traiter l’infection.
- 36. 3. Bactériologie
- 37. 3. Bactériologie ⚫Cytologie ⚫ L’examen à l’état frais L'analyse d'un prélèvement effectué dans un but diagnostique est en règle générale une analyse à la fois cytologique et bactériologique. Ainsi, l'examen microscopique est une étape clé dans la démarche diagnostique des infections bactériennes.
- 38. 3. Bactériologie
- 39. 3. Bactériologie ⚫ L’examen après coloration - Les techniques les plus communément utilisées au laboratoire de bactériologie médicale font appel à descolorations. - La préparation est fixée sur une lame puis colorée. ⚫
- 40. 3. Bactériologie ⚫ Coloration de Gram ⚫ les bactéries à GRAM négatif tacheront le rose / rouge ⚫ les bactéries à Gram positif tacheront le bleu / violet.
- 41. 3. Bactériologie ⚫ Coloration de Ziehl-Neelsen ❖ La méthode de choix pour la bacilloscopie des frottis d’expectoration est la coloration de Ziehl-Neelsen (ZN) car elle est la seule à fournir régulièrement de bons résultats sansnécessiter un équipement spécial.
- 42. 3. Bactériologie ⚫ Microscopie optique à fluorescence
- 43. 4. HEMATOLOGIE
- 44. 4. HEMATOLOGIE ⚫ Les différents systèmes d’analyse des cellules étudient de nombreux paramètres cellulaires. Exemples : la taille et le volume des cellules la taille et l’aspect du noyau (segmentation, densité chromatinienne) le contenu granulaire intracytoplasmique l’activité peroxydasique du cytoplasme. la concentration en hémoglobine
- 45. 4. HEMATOLOGIE 2principes sont utilisés : détection électrique détection optique
- 46. 4. HEMATOLOGIE ⚫ Principe de la détection électrique - Détection volumétrique par différence de conductivité (variation d’impédance) Ce principe est basé sur la différence de conductivité entre les cellules mauvaises conductrices et le milieu salin, électro-conducteur dans lequel baignent les cellules.
- 47. 4. HEMATOLOGIE ⚫ Principe des détections généralement optique après focalisation hydrodynamique Ce principe associe les principes de bases de la Cytométrie en Flux (1977): • Focalisation hydrodynamique: les cellules passent en file indienne devant un système de détection ou chambre de mesure. • Détection des signaux optiques ou physiques émis par les cellules natives ou ayant subi un traitement préalable et coupant le faisceaux d'un laser ou d'une lampe à mercure Les signaux mesurés sont essentiellement relatifs : - aux propriétés optique par étude de la diffusion lumineuse liés à la taille de la cellule, à sa structure interne (estimation de la granulométrie du cytoplasme, de la forme du noyau ...) - aux propriétés des enzymes cytoplasmique (ex: recherche d'activité peroxydasique) - aux propriétés du noyau (densité) par mesure de la conductivité à l'aide d'un courant haute fréquence. • Ces signaux séparés par des filtres optiques sont collectés par des photomultiplicateurs, amplifiés, numérisés, traités et stockés par un ordinateur.
- 48. 4. HEMATOLOGIE
- 49. 4. HEMATOLOGIE ⚫ - Détection optique Étude de la diffusion de la lumière La diffusion de la lumière est la résultante de plusieurs phénomènes : diffraction, réflexion, réfraction et absorption. Lorsqu’une cellule traverse un faisceau lumineux (laser ou lampe) excitateur, le faisceau lumineux incident va subir une diffusion dépendant des propriétés physiques de la cellule (diamètre, forme du noyau, contenu cytoplasmique). La lumière laser (monochromatique, unidirectionnelle) diffusée par une cellule est détectable par un photodétecteur sous des angles différents.
- 50. 5. Hémostase ⚫ L'Hémostase est souvent comparée à une balance ⚫ En effet, la fluidité du sang (homéostasie) est maintenue grâce à un judicieux équilibre entre activateurs et inhibiteurs (antithrombine, Protéine C, Protéine S). Toute rupture de cet équilibre fera pencher la balance vers un processus pathologique : • La thrombose : formation de caillot pouvant provenir d'un déficit en inhibiteur • L'hémorragie : saignement pouvant être dû à un déficit en facteur de la coagulation
- 51. 5. Hémostase ⚫ En première intention, l'exploration de la coagulation repose sur la réalisation du temps de Quick (taux de prothrombine) et du temps de céphaline + activateur (TCA). ⚫ PRINCIPE ⚫ grâce au système de détection viscosimétrie (mécanique) unique de Stago présent sur tous nos systèmes, la fiabilité des résultats est garantie, les mesures n'étant pas affectées par les interférences optiques. De plus, ce système de détection affiche une sensibilité maximale pour la détection des caillots faibles.