Poster 3 biochimie
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Ce document présente une validation analytique du dosage de l'homocystéine par spectrométrie de masse en tandem, soulignant son importance dans le diagnostic des hyperhomocystéinémies. La méthode développée est rapide, sensible, et spécifique, avec des résultats comparables à ceux de la chromatographie liquide haute performance. Les tests confirment une excellente transférabilité des résultats entre les deux méthodes.
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- 1. VALIDATION ANALYTIQUE DUDOSAGE DE L’HOMOCYSTEINE PAR SPECTROMETRIE DE MASSE EN TANDEM Mathilde Louis 1 , C. Tse 1 , N. Jacob 1 , C. Jardel 1 , A. Sprault 2 , F. Lamari 1 1 – Laboratoire de Biochimie, Hopital Pitié Salpétrière 2 – Laboratoire de Biochimie, Hopital Kremlin Bicêtre 2011 Biochimie Biochemistry Poster 3
- 2. Introduction L’Homocystéine plasmatique(Hcy) est un acide aminé soufré ayant un rôle majeur dans le cycle de la méthionine. Le dosage de l’Hcy totale sert au diagnostic et au suivi des hyperhomocystéinémies d’origine génétique, ou carentielles L’hyperhomocystéinémie est associée à un risque accru de thromboses artérielles et veineuses. C’est aussi un facteur de risque athérogène de classe IIb Objectif Nous avons mis au point un dosage de l’Hcy par spectrométrie de masse, triple quadripolaire, couplée à une chromatographie liquide, avec dilution isotopique (LC-MS) Les résultats sont comparés à ceux obtenus par chromatographie liquide haute performance avec détection fluorimétrique (CLHP-FD)
- 3. Matériel : - TQD : Source Electrospray + UPLC :Colonne HSST3, 60 °C Phase mobile : 95% A1 : eau + 0,1 % acide formique 5% B1 : méthanol Débit : 0,4 mL/min Méthode : Dilution isotopique Standard interne : D8-homocystine Matériel : - TQD : Source Electrospray + UPLC :Colonne HSST3, 60 °C Phase mobile : 95% A1 : eau + 0,1 % acide formique 5% B1 : méthanol Débit : 0,4 mL/min Méthode : Dilution isotopique Standard interne : D8-homocystine Validation des résultats selon le guide de validation technique d’une portée flexible B de la COFRAC
- 4. Méthode spécifique : 1 transition de quantification m/Z = 136 > 90 1 transition de qualification m/Z = 136 > 56 1 temps de rétention Méthode sensible : n = 19 blancs Limite de détection (LOD) = 3 x σ (blanc) = 0.1 µmol/L Limite de quantification (LOQ) = 10 x σ (blanc) = 0.5 µmol/L
- 5. Réalisée sur lescontrôles de qualités externes européens ERENDIM Biais < 13% - 8 mesures pour chaque point de gamme - Linéarité jusqu’à 211 µmol/L Comparaison de gamme dans l’eau, l’albumine et le plasma Effet matrice nigligeable Résultats justesse Concentration (µmol/L) Biais (%) E 111 117 12.4 E 112 48 2.8 E 109 13.1 -5.2
- 6. Réalisé sur lescontrôles qualités internes BIORAD CV < 5 % => Conforme Recherche d’une contamination inter échantillon : - alternance de 3 mesures d’un plasma avec une homocystéinémie élevée (48 µmol/L) suivi de 3 mesures d’un plasma ayant une homocystéinémie basse (8.4 µmol/L) - Contamination inter-échantillons = 0,05 % 30, 2 dosages par jour 30, 2 dosages par jour 30, même série 30, même série Nombre 2,48 3,21 3,9 2,9 Coefficient de variation 0,70 0,34 1,1 0,30 Ecart-type 28 10,4 28 10,4 Moyenne (µmol/L) CQ2 CQ1 CQ2 CQ1 Reproductibilité Répétabilité
- 7. Transférabilité des résultatsentre LCMS et CLHP 74 échantillons analysés en double sur la LC-MS et CLHP - Graphique des différences : < 20 % - Graphiques des rapports : > 70 %
- 8. Conclusion La méthodemise au point est simple, rapide, sensible et spécifique. La comparaison de méthode avec la CLHP-FD montre une parfaite transférabilité des résultats