Poster 40 biochimie
- 1. Adaptation du dosage sérique du méthotrexate sur Unicel DxC600 ® Saada S ., Olichet B., Bronzini T., Berrafato S. Unité de Biochimie Institut Curie, Paris. 2011 Biochimie Biochemistry Poster 40
- 2. INTRODUCTION Le traitement par méthotrexate haute dose nécessite un suivi pharmacologique pour adapter la posologie d ’ acide folinique et l ’ hyperhydratation alcaline afin de limiter les effets secondaires. Le méthotrexate se comporte comme un inhibiteur compétitif de l ’ enzyme dihydrofolate-réductase qui réduit l ’ acide dihydrofolique en différents acides tétrahydrofoliques entrainant une inhibition de la synthèse d ’ ADN, d ’ ARN et de protéines. Il est utilisé dans le traitement de nombreux cancers. Le traitement à haute dose est indiqué dans les leucémies lymphoblastiques de l ’ enfant, les ostéosarcomes et les lymphomes malins non hodgkiniens. L ’ étude réalisée a été menée dans le but de valider l ’ adaptation du réactif méthotrexate EMIT® de Siemens sur l ’ Unicel DxC 600® (Beckman). Adaptation du dosage sérique du méthotrexate sur Unicel DxC600® Saada S. , Olichet B., Bronzini T., Berrafato S. Laboratoire de Biochimie Institut Curie, Paris
- 3. MATÉRIELS ET MÉTHODES : Les dosages ont été réalisés sur l ’ automate UNICEL DXC600® (Beckman) par une technique immuno-enzymatique en phase homogène avec la trousse EMIT Méthotrexate® (Siemens). Le dosage est basé sur la compétition entre le médicament présent dans l ’ échantillon et celui marqué à l ’ enzyme G6PDH pour les sites de liaison des anticorps anti-méthotrexate. L ’ activité enzymatique, qui diminue lors de la liaison à l ’ anticorps, est mesurée par l ’ absorbance à 340 nm du NADH produit lors de l ’ oxydation du glucose-6-phosphate. Adaptation du dosage sérique du méthotrexate sur Unicel DxC600® Saada S. , Olichet B., Bronzini T., Berrafato S. Laboratoire de Biochimie Institut Curie, Paris
- 4. MATÉRIELS ET MÉTHODES : La validation de méthode a été effectuée selon les recommandations du Guide de validation des méthodes du COFRAC et des documents établis par le groupe de travail « Validation de techniques » de la Société Française de Biologie Clinique. Nous avons défini le domaine d ’ analyse (linéarité, limites de détection et de quantification), étudié la fidélité et la justesse, et réalisé la corrélation avec la méthode par polarisation de fluorescence (TDX® Abbott) . Nous avons également évalué l ’ incertitude de mesure pour la concentration 1 µmol/L correspondant au seuil pour l ’ adaptation du traitement de sauvegarde 48 heures après le début du traitement dans certains protocoles. Adaptation du dosage sérique du méthotrexate sur Unicel DxC600® Saada S. , Olichet B., Bronzini T., Berrafato S. Laboratoire de Biochimie Institut Curie, Paris
- 5. RÉSULTATS Linéarité, limites de détection, limites de quantification Objectif : obtenir une limite basse du domaine de mesure ≤ 0,1 µmol/L 2 méthodes ont du être mises au point à partir de la trousse méthotrexate EMIT® (Siemens) Méthode METB (méthode dite basse) Méthode MET (méthode dite haute) Linéarité : 0,05-0,25 µmol/L Limite de quantification : 0,05 µmol/L (CV de 8,9%) Limite de détection : 0 µmol/L Linéarité : 0,25-1 µmol/L Limite de quantification : 0,25 µmol/L (CV de 4,1%) Adaptation du dosage sérique du méthotrexate sur Unicel DxC600® Saada S. , Olichet B., Bronzini T., Berrafato S. Laboratoire de Biochimie Institut Curie, Paris
- 6. Tableau 1. Résultats des calculs de biais aux taux 0,07 µmol/L, 0,40 µmol/L, 0,80 µmol/L et 1 µmol/L RÉSULTATS Justesse L ’ étude de la justesse est réalisée à partir des contrôles qualité Abbott L (0,07 µmol/L), M (0,40 µmol/L), H (0,80 µmol/L) et X (5 µmol/L) dilué au 1/5 (concentration moyenne de 4 dosages = 1,01 µmol/L). Les résultats ne mettent pas en évidence de biais. Adaptation du dosage sérique du méthotrexate sur Unicel DxC600® Saada S. , Olichet B., Bronzini T., Berrafato S. Laboratoire de Biochimie Institut Curie, Paris Fidélité Pour chaque méthode, les études de fidélité sont satisfaisantes avec des coefficients de variation de répétabilité et reproductibilité inférieurs à 6%. Seuil supérieur d ’acceptabilité du CV de reproductibilité Seuil supérieur d ’acceptabilité du CV de répétabilité
- 7. Tableau 1. Résultats des calculs de biais aux taux 0,07 µmol/L, 0,40 µmol/L, 0,80 µmol/L et 1 µmol/L RÉSULTATS Corrélation La corrélation avec la méthode par polarisation de fluorescence (TDX® Abbott) est correcte. L ’ analyse des résultats est effectuée par la méthode de comparaison par l ’ allométrie. Les paramètres de la droite des moindres rectangle sont calculés et pour chaque niveau de décision défini par la SFBC, l ’ inexactitude observée est comparée à l ’ inexactitude tolérée. Adaptation du dosage sérique du méthotrexate sur Unicel DxC600® Saada S. , Olichet B., Bronzini T., Berrafato S. Laboratoire de Biochimie Institut Curie, Paris
- 8. Tableau 1. Résultats des calculs de biais aux taux 0,07 µmol/L, 0,40 µmol/L, 0,80 µmol/L et 1 µmol/L RÉSULTATS Estimation de l ’incertitude : 20% pour la concentration 1 µmol/L, concentration seuil pour l ’adaptation du traitement de sauvegarde 48 heures après le début du traitement dans certains protocoles. L ’incertitude de mesure est constituée de 2 composantes : l’incertitude due à la fidélité (approché par l’écart type de reproductibilité) et de l’incertitude due à la justesse (estimée à partir du biais de l’évaluation externe de la qualité). L’incertitude totale peut être estimée par le double de la composante des deux. Adaptation du dosage sérique du méthotrexate sur Unicel DxC600® Saada S. , Olichet B., Bronzini T., Berrafato S. Laboratoire de Biochimie Institut Curie, Paris Évaluation externe de la qualité : Le laboratoire effectue une évaluation externe de la qualité en participant à des contrôles interlaboratoires ponctuels (Pro Bio Qual). Les résultats obtenus sont satisfaisants.
- 9. CONCLUSIONS Cette étude montre que les adaptations de la méthode EMIT sur l ’Unicel DxC 600® Beckman sont satisfaisantes puisque les différents critères étudiés répondent aux exigences de la validation des techniques. D’autre part, la corrélation de ces adaptations avec la méthode FPIA du TDX® Abbott est correcte. Cependant pour 66% des échantillons reçus au laboratoire au moins 2 dosages sont nécessaires et 30% doivent être dilués manuellement tant les gammes de linéarité des méthodes sont restreintes. La gestion quotidienne des réactifs et des dosages des échantillons reste acceptable même si la mise en place d ’ une seule méthode est préférable. Cependant aucun autre réactif disponible sur le marché ne permet d ’ obtenir un domaine de mesure répondant à nos besoins. Adaptation du dosage sérique du méthotrexate sur Unicel DxC600® Saada S. , Olichet B., Bronzini T., Berrafato S. Laboratoire de Biochimie Institut Curie, Paris