Réaction antigène-anticorps appliquée en techniques immunologiques
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Le document traite des réactions antigène-anticorps (Ag-Ac) et de leurs bases moléculaires, détaillant les aspects liés à l'affinité et à l'avidité des interactions. Il présente également plusieurs techniques immunologiques telles que l'immunoagglutination, l'immunoprécipitation et l'immunoenzymologie, ainsi que leurs applications en biotechnologie. Enfin, il aborde des méthodes spécifiques, comme l'ELISA et le Western blot, utilisées pour la détection et l'analyse des protéines.
Réaction antigène-anticorps appliquée en techniques immunologiques
- 1. LGUENSAT Asmae SAYAH Kaoutar ABBAD Anass S5 Génie biologique Mme Elouaii
- 2. Plan: I. La réaction Ag-Ac 1)les bases moléculaires de la réaction 2) Aspect de la réaction a) Forces attractives intramoléculaires b) Affinité c) Avidité 3) Caractéristiques de la réaction II. Techniques immunologiques 1-immunoagglutination 2-immunoprecipitation 3-immunofluorescence 4-immunoenzymologie III. Applications des techniques immunologiques en biotechnologie
- 3. I-Réaction Ac-Ag 1-Les bases moléculaires de la réaction a- l ’antigène • Considérée comme étrangère de l’organisme, C’est une molécule qui contient des épitopes dont la structure est particulièrement définie,et reconnus par les sites de liaisons des anticorps. • L’antigène peut porter plusieurs épitopes ce qui détermine sa valence. b- l’anticorps • Les anticorps sont caractérisés par la présence des paratopes qui varient selon l’anticorps reconnaissant ainsi un antigène.
- 4. Groupement glucidique Ponts disulfures Chaînes lourdes (H) Site de fixation à l’antigène ou PARATOPE Chaîne légère (L) Partie variable Partie constante
- 5. C- le complexe immun • Le complexe immun est une combinaison de l’Ac avec l’Ag Ag Ag Epitope de l’antigène Le paratope a une structure tridimensionnelle complémentaire à celle de l’épitope La structure du paratope est variable. Elle dépend de la structure tridimensionnelle de l’épitope Le paratope se fixe sur l’épitope à l’image du clef/ serrure
- 6. • L’interaction entre épitope et paratope est considérer comme la clé du complexe Ac-Ag. • La complémentarité entre épitope et paratope induit la formation du complexe immunitaire: • Si l’épitope correspond au paratope alors il y a présence d’une force d’attraction ,si non on a une force de répulsion. • La réaction entre Ac-Ag est une combinaison spécifique et réversible des Ac et Ag correspondant. Antigène Déterminants antigéniques Ou épitopes Anticorps Paratope
- 7. 2- Aspects de la réaction a- Forces attractives intramoléculaires • Il s’agit d’un ensemble de forces qui fusionnent les Ac aux Ag correspondants. • Il existe 4 types de forces non covalentes; dépendantes de la complémentarité entre les sites d’ Ac et les déterminant des Ag. Forces non- covalentes Application Schématisation Liaisons hydrogène Deux atomes électronégatifs partagent un atome d’hydrogène Liaison hydrophobes L’interaction est difficile entre les groupes hydrophobes et l’eau qui se réuni pour exclure l’eau Forces de Van Der Waal: Résultent de la fluctuation des nuages électroniques de charge opposé autour des molécules. Forces électrostatiques ou ioniques attraction entre atomes de charges opposées
- 8. b- l’affinité • C’est la somme des forces d’attractions et de répulsions entre un épitope et un paratope. • Définie par la réaction : Ag+Ac Ag-Ac c- l’avidité • c’est la force de fusion d’un anticorps possédant multiples paratopes avec un antigènes contenant plusieurs épitopes. • Ainsi l’avidité est supérieur à la somme des affinités. • Donc l’avidité est influencé par la valence, tout comme la T , le pH et la force ionique.
- 9. 3) Caractéristiques de la réaction La formation d’une liaison Ac/Ag libérant de l’énergie, ce qui influence la température et donc un bon déroulement de la réaction. Les liaisons qui s’effectuent entre l'Ac et l’Ag sont des liaisons faibles, facilement rompues Ag +Ac Ag – Ac + chaleur Si ↘ pH, ↗ force ionique → dissolution du complexe Ag-Ac La spécificité de la réaction Ag –Ac dépend de la complémentarité spatiale entre le paratope et l’épitope, elle est très étroite. Cette spécificité n’est pas absolue, il existe des réactions croisées Exothermique Réversible Spécifique Réaction Ac/Ag Exothermique Réversible SpécifiqueRéversible
- 10. II. Techniques immunologiques CI visible à l’œil nu CI non visible à l’œil nu Immunoagglutination Immunoprécipitation immunofluorescence Immunoenzymologie Détection de réaction Ac/Ag
- 11. 1-Immunoagglutination a- Principe: • C’est le produit d’une réaction des Ac dirigés vers des Ag formant ainsi des ponts spécifiques entre les particules, constituant un réseau sous forme d’amas. • On trouve deux sortes d’agglutination; active et passive.
- 12. b- les différents types d’agglutination ACTIVE PASSIVE c’est une agglutination bien visible à l’œil nu lorsque les Ac et les Ag forment un amas. On utilise Ag particulaire et un Ac agglutinant. c’est une agglutination artificielle résultante d’une faible quantité d’Ac et d’Ag. Entre autre, utilise un Ag particulaire et un Ac non agglutinant c’est la fixation d’un Ac soluble sur une surface inerte indépendante de la réaction Ac-Ag. C’est-à- dire la particule ne possède pas naturellement l’Ag donc on l’introduit manuellement L’agglutination des particules sur lesquelles l’Ag est fixé détermine la présence de l’Ac Directe Indirect
- 13. Ac agglutinant Ag particulaire SAB SAB SAB SAB SAB Ac non agglutinant SAB Ag particulaire Agglutination Directe Agglutination Indirecte
- 15. Immunoprécipitation: 1)Principe Les réactions de précipitation ont lieu entre un anticorps et un antigène soluble :soit en milieu liquide ou gelifié Chaque molécule d‘Ag multivalent peut fixer plusieurs molécules d‘Ac et chaque molécule d‘Ac est liée à plus d'une molécule d'antigène. Ce qui influence la taille des agrégats formés qui deviennent importante et leur solubilité diminue: Si la masse des agrégats dépasse les forces qui les maintiennent en solution, ils peuvent devenir insolubles et se précipiter.
- 16. 1-L’immunoprécipitation en milieu liquide a)Test de l’anneau: Techniques qualitative est un peu quantitatif : Basé sur la diffusion des Ac et des Ag solubles (non mélangé) , qui aboutissent lorsqu’ il y a autant de paratope que d'épitopes (a l'équivalence) au formation d’un anneau de précipitation Rq:plus il y a d'antigène, plus l'anneau est bas.
- 17. 2) technique de Heidelberg et Kendall • On mélange dans des tubes une quantité constante d‘Ac , et une quantité croissante d'Ag ,on centrifuge les tubes, et on compare la quantité de précipité en fonction de la concentration.
- 18. 2-L’immunoprécipitation en milieu gelifié A-immunodiffusion : Simple radial simple double diffusion technique Oudin technique Mancini technique d’Ouchterlony un seul des deux éléments diffuse; la précipitation a lieu à l'endroit où les concentrations en Ag et Ac correspondent à la zone d'équivalence. Consiste à introduit des Ac spécifique dans le gélose, et de remplit des puits avec un antigène de concentrations différentes, Après la diffusion On observe des cercle de précipitation dont le diamètre est proportionnel à la concentration d'antigène C'est une méthode qualitative et semi quantitative Les 2 éléments Ac et Ag diffusent selon leur taille
- 19. B-immunoelectrophorèse: • C’est une méthode qui sert à differencier plusieurs systèmes précipitants • Elle est effectuée en 2 temps : - séparation des protéines - révelation des proteines fixées
- 20. C- Immunofixation : c’est une technique de précipitation en milieu gélifié résultante d’une électrophorèse d’une solution antigénique qu’on lui ajoute des Ac spécifiques . Ainsi elle induit la pénétration et la précipitation des Ac en présence des Ag correspondant
- 21. L’immunoflurescence 1-Principe • C’est une technique qui sert à marquer différentes molécules grâce aux anticorps rendus fluorescents. • Elle utilise plusieurs types de molécules fluorescentes : Fluorescein isothiocyanate :, son spectre d’émission : 520 nm, couleur verte. Rhodamine : utilisé en général pour le double marquage, donne une fluorescence rouge- orangée . Anticorps primaires: Ce sont des anticorps dirigés spécifiquement vers l’antigène Anticorps secondaires: Ce sont des anticorps dirigés vers les anticorps primaires; ce sont eux qui portent généralement la molécule fluorescente Elle met en jeux deux types d’anticorps
- 22. 2-Types d’immunoflurescence : • Il existe deux : Immunofluorescence directe Immunofluorescence indirecte - l’anticorps primaire couplé au molécule fluorescente. - Lorsque l’anticorps secondaire, porteur de molécule fluorescente se lie spécifiquement à l’anticorps primaire.
- 23. A – l’immunofluresence directe : • • Méthode rapide, en un temps • Révélation de l’Ag cherché directement par l’Ac porteur du molécule fluorescente (flueorechrome) • Pour observer le résultat, on utilise un microscope à épiflurescence.
- 24. B- L’immunoflurecence indirecte : Dans ce cas, le marquage passe par deux étape ; lors de la première étape, des ac primaires spécifiques à l’ag ont été lancés, En deuxième temps, d’autres Ac anti Ac fluorescent et ayant une forte affinité pour les Ac primaires ont été lancés Le tous frome un complexe détectable par le microscope épiflurescent
- 25. Immunoenzymologie : 1-Principe • Dans cette technique , l’antigène ou l’anticorps est marqué avec une enzyme, qui permet de transformer un substrat incolore en produit coloré. • Principe de la réaction : La reaction mise en jeux • Ag + Ac * substrat molécule signale (détectable) • * : le marquage par une enzyme ne touche qu’une molécule , soit l’ag, soit l'Ac et ne consiste pas les deux à la fois • L’immunoenzymologie met en œuvre deux types de réactions: Réactions qualitatives : qui consistent soit à : - La détection de protéines après électrophorèse : Western-blot - Détection de protéines sur une coupe histologique Réactions quantitatives: Dosage d’antigènes Dosage d’anticorps ELISA (direct, compétitif…)
- 26. • La réaction peut s’effectuer soit en: • phase homogène; en milieu liquide contenant tous les acteurs et où se fera la détection. • En phase hétérogène: • fixation d’un des composés sur un support (puits, lame, bille, tissu, …) • nécessité de lavages pour éliminer les composants non fixés Molécule détectée Phase Technique Antigène Hétérogène Western blot, immunohistochimie ELISA compétition Immunométrique (ELISA sandwich) Homogène EMIT (Enzymes Multiplied Immunoassay Technique Anticorps Hétérogène Immunométrique de type ELISA
- 27. • A- ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent Assay) : • c’est un dosage immunenzymatique sur support solide. • Principe général : • Mise en évidence d’anticorps présents dans un sérum par la visualisation d’une réaction colorée.
- 28. Les types d’ELISA : ELISA PAR COMPETITION ELISA INDIRECT ELISA SANDWICH Repose sur la compétition entre l’antigène à doser avec un ag marqué vis-à-vis d’un même ligand spécifique Cherche des ag de petite taille Elle est le plus souvent utilisée pour déterminer la concentration en anticorps. C’est une variante moins commune de cette technique, utilisée afin de détecter un échantillon d'antigène dans le sérum ou tout autre échantillon.
- 29. B- Le western-blot : • est une méthode de protéomique, ayant recours à la biologie moléculaire, la biochimie et l'immunogénétique, pour détecter une protéine spécifique dans un échantillon donné d'extrait ou d'homogénat tissulaire. • But : Analyse et identification des Ac Se rassurer du résultat d’ELISA en cas de test positif. • Principe : Cette technique associe 3 grands principes :
- 30. Séparation des protéines Transfert des protéines Révélation immunologique Cette séparation est en fonction de leurs poids moléculaires par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et mercaptoéthanol Sur une feuille de nitrocellulose ou de nylon -S’effectue par des Ac marqués (l’ajout des ac spécifiques de la protéine d’intérêt). Puis, on ajoute des ac porteurs d’enzyme.
- 31. III- Application en biotechnologie Immunoflrescence -immunocapteur -observation de la division cellulaire -activation cellulaire -hybridation moléculaire Immunoprécipitation -immunoprécipitation d’une protéines - Immunoprécipitation d’ARN - Immunoprécipitation de chromatine Immunoagglutination -……………………….. immunoenzymologie -western blot -elisa
- 32. les biocapteurs dans l’industrie agroalimentaire • Biocapteur = élément de reconnaissance moléculaire (anticorps par exemple) +transducteur
- 33. • Immunocapteur: C’est un biocapteur qui utilise des anticorps comme élément de reconnaissance moléculaire(ligand) . • Les transducteurs les plus couramment utilisés sont de type optique ou électrochimique. Réactions mises en jeu : Mesure de l’absorbance Mesure de la fluorescence
- 34. Application dans le domaine agroalimentaire : Immunocapteur portable pour E-coli O157 : H7
- 35. Immunoprécipitation de chromatine • L’immunoprécipitation du chromatine est une procédure utilisée pour déterminer si la protéine a analysée est localisée sur une séquence d’ADN spécifique ou non . Les DNA-binding proteines sont liées à la molécule de DNA avec formaldéhyde in vivo. - Isoler la chromatine. -Cliver le DNA avec les bound proteines en fragments. -couplage des anticorps specifiques avec le DNA-binding proteine -Pour isoler le complexe, on a recours à l’immunoprecipitation. Reverse the cross-linking to release the DNA and digest the proteins. Utiliser le PCR pour amplifier la sequence du DNA pour savoir si elle se sont précipité avec les anticorps