TERAPIA FOTODINÂMICA COM AZUL DE METILENO SOBRE CEPA DE

Staphylococcus aureus RESISTENTE À METICILINA

Freitas MAA, Pereira AHS, Fontana LC, Ferreira-Strixino, J

Universidade do Vale do Paraíba – UNIVAP, Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) – Av
Shishima Hifumi, 2911 – São José dos Campos, SP, 12244-000.
E-mail: [email protected]

Resumo- S. aureus é o agente etiológico de maior importância associado às infecções adquiridas

tanto em âmbito comunitário ou hospitalar, devido a sua capacidade de desenvolver resistência às
terapias convencionais. A Terapia Fotodinâmica (TFD) surge como alternativa a ser utilizada no
controle de cepas resistentes aos antibioticos. O objetivo do presente estudo é avaliar os efeitos da
TFD com Azul de Metileno (AM) sobre cepas de S. aureus resistente à meticilina (MRSA). As
amostras foram diluídas em PBS estéril de acordo com a escala 0,5 de MacFarland. Os grupos foram
compostos com diferentes concentrações de AM, incubados no escuro durante 15 minutos e
irradiados por LED Biopdi/Irrad-Led5 em 660nm com fluência de 10 J/cm². Posteriormente, foram
semeadas e incubadas à 37ºC por 24 horas. A contagem de Unidades Formadoras de Colônias
(UFCs) demonstrou que a TFD foi eficaz na menor concentração testada de AM sobre cepas de
MRSA.

Palavras-chave: Staphylococcus aureus, Terapia Fotodinâmica, Azul de Metileno

Área do Conhecimento: Biomedicina

Introdução

O gênero Staphylococcus são cocos Gram positivos, comumente encontrados na região do trato
respiratório e pele. Geralmente as infecções se caracterizam por serem superficiais e leves na
maioria dos pacientes, mas podem tornar-se graves em pacientes imunocomprometidos. O S. aureus
é o agente etiológico de maior importância associado às infecções adquiridas tanto em âmbito
comunitário ou hospitalar, devido a sua capacidade de desenvolver resistência às terapias
medicamentosas convencionais (CATAO et al., 2013; FU, X.J; FANG, Y; YAO, M., 2013). Embora o
S. aureus seja suscetíveis à Meticilina (MSSA), alguns mecanismos relacionados à mutação ou
transdução levam ao desenvolvimento de cepas resistentes à Meticilina (MRSA) que podem ser
resistentes também a outros fármacos, tais como Clindamicina, Eritromicina e Tetraciclina (BASTOS
et al., 2013; CATAO et al., 2013; PINTO, 2013).
Em determinadas circunstâncias o S.aureus pode provocar infecções oportunistas brandas, como
as folicutes simples, impetigo e furúnculos ou podem ocasionar infecções sistêmicas graves
potencialmente fatais. Em alguns casos a infecção pode ser causada por bactérias do próprio
paciente, de outros doentes ou de indivíduos sadios e a sua transmissão ocorre por contato direto ou
indireto. O uso prolongado da terapia antimicrobiana pode facilitar o surgimento de cepas
multirresistentes que ocorre por meio de mutações e aquisição de plasmídeos. Os MRSA são
resistentes à ação das beta-lactamases o que implica em um sério problema para o inicio da terapia
antimicrobiana, uma vez que as opções terapêuticas são escassas e o tempo de tratamento é
prolongado, resultando em infecções severas (RATTI, R.P; SOUSA, C.P., 2009). Tendo em vista o
potencial elevado dos MRSA produzirem infecções invasivas, terapias alternativas, como a Terapia
fotodinâmica, têm sido utilizadas para sua erradicação.
A terapia fotodinâmica (TFD) é uma terapia minimamente invasiva, devido ao seu amplo espectro
de ação, inativação de cepas resistentes aos antibióticos, baixo potencial mutagênico e a falta de
cepas microbianas resistentes à TFD (PINTO, 2013; TIM, 2015). Envolve três componentes: Luz,
fotossensibilizador (FS) e oxigênio molecular. Quando o FS é irradiado com luz de comprimento de
onda especifico, o mesmo passa de um estado de baixa energia para um estado excitado chamado
de singleto O oxigênio no estado singleto pode decair para o estado fundamental com emissão de
fluorescência ou passar para um estado tripleto excitado. No estado tripleto, esta espécie poderá
passar por dois mecanismos de reação, do tipo I ou II. Na reação de tipo I, há transferência direta de

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elétrons de um FS excitado para um substrato, formando diferentes tipos de radicais livres, como
peroxido de hidrogênio e hidroxila. Estas Espécies Reativas de Oxigênio (ERO'S) são capazes de
oxidar uma variedade de biomoléculas, provocando danos biológicos no microrganismo. Na reação
de tipo II o FS excitado transfere energia ao oxigênio molecular e gera oxigênio singleto altamente
reativo que irá oxidar biomoléculas, levando a lise da membrana celular. Reações do tipo I e II podem
ocorrer simultaneamente (PINTO, 2013; NASCIMENTO, 2013; TIM, 2015).
A escolha do FS apropriado é necessária para obter uma eficácia antimicrobiana e oferecer baixa
toxicidade, para isso é necessário cumprir alguns requisitos, como alto rendimento quântico de
oxigênio, ser fotoestável, apresentar amplo espectro de ação antimicrobiana (bactéria, fungo e
parasitas), ter baixa afinidade e toxicidade pelas células do paciente, baixo potencial mutagênico e
ausência de toxicidade no escuro (TIM, 2015). O Azul de Metileno pertence à classe dos
fenotiazínicos com absorção entre 600-660 nm, região do espectro eletromagnético, comumente
utilizado por se encontrar dentro da janela terapêutica, devido a capacidade de penetração da luz no
tecido (BUCK, 2009). Tendo em vista a necessidade de novas terapias eficazes, menos invasivas e
que não ofereçam resistência antimicrobiana, o objetivo do presente estudo é avaliar os efeitos da
Terapia Fotodinâmica com Azul de metileno sobre cepas de S. aureus MRSA.

Metodologia

As cepas de S. aureus MRSA foram cedidas pelo Laboratório Oswaldo Cruz de São José dos
Campos, que mantêm convênio com o Laboratório de Terapia Fotodinâmica da Universidade do Vale
do Paraíba. São provenientes de material clínico já submetido aos procedimentos de identificação.
As cepas foram cultivadas em caldo BHI durante 24 horas em estufa bacteriológica à 37ºC,
aliquotadas em eppendorfs com 5% de glicerol e, posteriormente acondionadas em freezer à -4ºC.
Para os ensaios as cepas foram descongeladas em caldo BHI e incubadas à 37ºC por 24 horas e,
posteriormente semeadas em Ágar Manitol. Inicialmente as amostras foram diluídas em PBS estéril
de acordo com a escala 0,5 de MacFarland, correspondente a 1,5 x 108 células/ml.
Os grupos amostrais foram divididos de acordo com as concentrações testadas de Azul de
Metileno, descritos na tabela 1. Depois de adicionado o FS, as amostras foram incubadas no escuro
durante 15 minutos e suspensas em caldo BHI estéril. Os grupos tratados foram irradiados pelo
dispositivo LED’s Biopdi/Irrad-Led5 660, com comprimento de onda de 660nm, irradiância de
25mW/cm², potência de 70mW/cm² e fluência de 10J/cm². Posteriormente, alíquotas foram semeadas
por espalhamento em ágar BHI e incubadas à 37ºC por 24 horas. A análise dos efeitos da TFD foi
realizada, após o período de incubação, por meio da contagem de Unidades Formadoras de Colônias
(UFC/ml).

Tabela 1 – Grupos Amostrais

Grupo Concentração FS (μM) Fluência

Controle Escuro s/ AM s/ irradiação
AM 0,1 0,1 mg/mL s/ irradiação
AM 0,3 0,3 mg/mL s/ irradiação
AM 0,5 0,5 mg/mL s/ irradiação
Controle Claro s/ AM Irradiado 10J/cm²
TFD 0,1 0,1 mg/mL Irradiado 10J/cm²
TFD 0,3 0,3 mg/mL Irradiado 10J/cm²
TFD 0,5 0,5 mg/mL Irradiado 10J/cm²

Os mesmos ensaios foram realizados com a cepa ATCC 25923 de S. aureus, a fim de
comparar os resultados com a cepa clínica e para garantir a fidelidade dos experimentos. Todos os
experimentos foram realizados em triplicatas.
Os resultados foram apresentados em forma de tabelas e gráficos contendo a média da
contagem do número de unidades formadoras de colônia em Log10 e percentual de redução em
relação aos controles. Nos gráficos também foram inseridas barras de erro considerando o desvio
padrão obtido para cada um dos grupos experimentais.

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Resultados

Foram testadas as concentrações de 0,1; 0,3 e 0,5mg/mL de Azul de Metileno para os

experimentos no claro (irradiado) e no escuro (não irradiado). Na cepa clínica MRSA, pode-se
observar que na ausência de luz, houve baixa citotoxicidade em todas as concentrações, obtendo
redução de 1 log no AM 0,1mg/mL. O mesmo ocorreu nas concentrações de 0,3 mg/mL e 0,5 mg/mL
com redução de 2 logs quando comparado ao controle. Conforme demonstrado na tabela 2, nos
grupos irradiados com 10J/cm² nas três concentrações testadas houve redução de 4 logs comparado
ao controle. O gráfico 1 apresenta a contagem de UFC/mL (log) da TFD aplicada nas cepas de
MRSA.

Tabela 2 – Terapia Fotodinâmica com Azul de Metileno em MRSA

Escuro – MRSA Claro 10 J/cm² - MRSA

Grupo UFC/mL Desvio % Grupo UFC/mL Desvio %
(log) Padrão Redução (log) Padrão Redução
Controle 9,67 0,06 0 Controle 9,9 0,17 0
AM 0,1  8 0,25 17,3 TFD 0,1 5,9 0,07 40,4
AM 0,3 7,6 0,11 21,4 TFD 0,3 5,32 0,15 46,3
AM 0,5 5,15 0,21 46,7 TFD 0,5 5,3 0,09 46,5

Na cepa ATCC foi observado redução, na ausência de luz, de 2 logs no grupo AM 0,1 mg/mL e
redução de 3 logs nos grupos AM 0,3 e AM 0,5, conforme apresentado na tabela 3. Analisando os
grupos irradiados, pode-se observar redução de 6 logs no grupo TFD 0,1mg/mL, porém nos grupos
com 0,3 e 0,5 mg/mL de AM foi observado redução de 4 logs, tendo menor redução quando
comparado à menor concentração de AM (Gráfico 2).

Tabela 3 – Terapia Fotodinâmica com Azul de Metileno em S. aureus ATCC

Escuro – ATCC Claro 10 J/cm² - ATCC

Grupo UFC/mL Desvio % Grupo UFC/mL Desvio %
(log) Padrão Redução (log) Padrão Redução
Controle 10,62 0,4 0 Controle 10,56 0,34 0
AM 0,1  8,16 0,59 23,2 TFD 0,1 4,76 0,15 54,9
AM 0,3 7,89 0,29 25,7 TFD 0,3 6,44 0,03 39,0
AM 0,5 7,38 0,3 30,5 TFD 0,5 6,61 0,02 37,4

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Gráfico 1 – Terapia Fotodinâmica utilizando Azul de Metileno aplicada em MRSA

Gráfico 2 – Terapia Fotodinâmica utilizando Azul de Metlieno aplicada em S.aureus ATCC

Discussão

O aumento de bactérias resistentes aos antimicrobianos tem incentivado o estudo de métodos

alternativos para combater as infecções ocasionadas por esses microrganismos (SILVA et al., 2013).
Tendo em vista a necessidade do emprego de novos métodos terapêuticos, o presente trabalho
buscou avaliar o efeito da TFD sobre cepas resistentes de S. aureus (MRSA) isolados de material
clinico, avaliando o efeito citotóxico do AM e do LED isoladamente e a associação de ambos.
No presente estudo, nas cepas de MRSA, foi observado redução de 40,4% quando irradiado a
10J/cm² na concentração de 0,1mg/mL de AM, nas concentrações de 0,3 e 0,5mg/mL testadas houve
redução de 46,3 e 46,5% respectivamente. Analisando a cepa ATCC foi observado 55% de redução

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quando utilizado o AM a 0,1mg/mL. Porém, na concentração de 0,3mg/mL houve 39% de redução e
0,5mg/mL 37%.
No trabalho de Pereira em 2009, a TFD foi aplicada em biofilmes de C. albicans, S.aureus e S.
mutans utilizando o Azul de Metileno na concentração de 0,1mg/mL e irradiado por Laser (660nm)
durante 98 segundos. Foi possível observar redução de 40,22%, 55,91% e 47,35% para C.albicans,
S.aureus e S. mutans respectivamente.
Para um fotossensibilizador ser considerado eficiente, é necessário que ele tenha baixa toxicidade
na ausência de luz e baixa agregação em soluções (OLIVEIRA, et al., 2015). Os ensaios realizados
no escuro com a cepa ATCC demonstrou baixo efeito citotóxico do AM em todas as concentrações.
Outro ponto relevante foi nos ensaios realizados com a aplicação da luz, onde o grupo TFD 0,1mg/mL
teve redução de 6 logs e nos grupos TFD 0,3 e TFD 0,5mg/mL a redução foi menor (4logs), tal
comportamento pode sugerir que o AM se agregou em concentrações maiores e não interagiu de
forma eficiente com bactéria ou com a luz.
Nos ensaios com a cepa clinica MRSA, no escuro, foi observado efeito citotóxico do AM em todas
as concentrações testadas. Na concentração 0,1mg/mL de AM houve redução de 1log demonstrando
baixa toxicidade, essa redução se manteve na concentração de 0,3mg/mL. Na concentração de
0,5mg/mL a redução foi de 4logs comparado ao controle escuro, conforme demonstrado nas tabelas
1 e 2, sugerindo o efeito citotóxico considerável do AM. Entretanto, quando irradiado os grupos com
10J/cm² foi observado redução de log UFC/mL na concentração de 0,1 e 0,3mg/mL, salientando a
eficiência da associação da luz com o fotossensibilizador. A concentração de 0,5mg/mL de AM
demonstrou-se citotóxica, uma vez que seu percentual de redução, no escuro, foi maior comparado
ao mesmo grupo quando irradiado por LED.
Carvalho e colaboradores em 2014, avaliaram a ação da TFD in vitro na inativação de
microrganismos em feridas infectadas, utilizando AM e Photodithazine (PDZ) a 0,1mg/mL e LED-
based 660nm com dose de energia de 50 J/cm². Nas diferentes cepas analisadas, quando irradiadas,
foi observada redução de UFCs comparadas ao controle sem tratamento em ambos os
fotossensibilizadores. O mesmo foi observado no trabalho de Peloi (2008), o qual testaram a TFD
com AM, em diferentes concentrações, sobre cepas de S. aureus, E. coli, e C.albicans. Observou-se
que utilizando comprimento de onda de 663nm e fluência de 4J/cm² foi possível a redução de 93,05%
para S. aureus na concentração de 42,2µM, 93,7% redução de E. coli na concentração de 35µM e
93,33% de redução para C.albicans, após 20 minutos de exposição.
Nos ensaios de Almeida em 2011, realizados in vivo, foi analisado a efetividade da TFD sobre
feridas cutâneas infectadas por S. aureus, utilizando LED com fluência de 10J/cm² e AM a 0,1mg/mL.
Foi observado durante o período experimental, que a aplicação da TFD após 72horas de incubação
obteve 93,4% de redução e após análises realizadas em 7,14 e 21 dias de incubação obteve-se
100% de redução de UFC/mL de S. aureus nas feridas cutâneas. No presente trabalho a
concentração de 0,1mg/mL de AM e fluência de 10J/cm² foi eficaz sobre cepas MRSA e ATCC,
apresentando 40,4% e 54,9% de redução respectivamente.

Conclusão

Pode-se concluir que a TFD com azul de metileno levou a redução de UFCs de cepa clínica
MRSA, apresentando baixo efeito citotóxico na menor concentração de fotossensibilizador utilizado,
demonstrando ser uma promissora terapia alternativa para o tratamento de infecções ocasionadas
por cepas resistentes de S. aureus.

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