01/12/2022
CURSO DE APERFEIÇOAMENTO
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS E PROCESSOS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
PFGE, RFLP, RAPD,
AFLP
Lorena Carnielli, PhD
[email protected] MUTAÇÕES
MUTAÇÕES MUTAÇÕES
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48 kb
PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis)
Utiliza campos elétricos Eletroforese convencional
oscilantes orientados em
várias direções 0,5% 1,2% 3% 25 bp
Agarose Agarose Agarose
~ 6Mb
Possibilita separação de
moléculas grandes de
DNA – resolução PFGE
Schwartz et al. (1982)
1% 1% 1,5 kb
Agarose Agarose
Sharma-Kuinkel et al. (2016) https://international.neb.com; www.bio-rad.com
PFGE: FATORES ENVOLVIDOS NA RESOLUÇÃO
[agarose] - influencia tempo de corrida
Solução tamponante: Se a concentração for
aumentada, a resolução da corrida também
será alterada, dificultando a separação dos
fragmentos maiores, aumentando a corrente
elétrica e a geração de calor.
Tensão da corrente elétrica (voltagem): maior
o fragmento, menor deverá ser a tensão (altas
diminuem resolução).
Tempo de pulso: determinação da faixa de
tamanho de fragmentos (Longo - moléculas
grandes).
www.cdc.com https://ses.sp.bvs.br/local/File/1033.pdf
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PFGE
Concordância com Tempo
dados Cuidados na escolha
Canaletas 1 e 2 são DNA cromossômicos (crDNA) epidemiológicos das enzimas
com padrões indistinguíveis e consideradas
linhagens epidêmicas; canaleta 3, uma das bandas
recebeu uma inserção e aumentou de tamanho;
Subtipagem de Variações entre
canaleta 4, uma das bandas sofreu uma deleção e diversas bactérias manipuladores
diminuiu de tamanho; canaleta 5, uma mutação
criou um sítio de restrição, aumentando o número
de bandas; canaleta 6, uma mutação alterou um
Reprodutível
sítio de restrição e dois fragmentos foram
perdidos, surgindo um de maior tamanho;
canaleta 7, crDNA com padrão diferente, não
relacionado ao surto.
www.cdc.com; Neoh et al. (2019) https://ses.sp.bvs.br/local/File/1033.pdf
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
10.3389/fmicb.2019.02025
Técnica em que organismos podem ser diferenciados pela análise
de padrões derivados da clivagem do DNA
Indivíduos diferentes possuem sequencias de nucleotídeos diferentes
ao longo da fita de DNA
MAPEAMENTO DO GENOMA
PATERNIDADE
CIÊNCIA FORENSE
DOENÇAS GENÉTICAS
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RFLP: METODOLOGIA RFLP: METODOLOGIA
1. EXTRAÇÃO DO DNA 3. ELETROFORESE
2. ADIÇÃO DE ENZIMA DE RESTRIÇÃO
Irá reconhecer sítios específicos do DNA e cortá-lo em fragmentos
Palindrômicas
RFLP: METODOLOGIA
https://pt.slideshare.net/EduardoCardoso11/rflp-10531827
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1. FGSC
2. TEF 1-α
3. Produto da PCR (BsaHI)
4. Se duas bandas dos tamanhos esperados fossem obtidas, então, o isolado seria
identificado como F. graminearum.
APLICAÇÕES 5. FHB em cereais (F. graminearum), o uso desta abordagem pouparia
• tempo e recursos poupados
10.1016/j.fm.2017.08.020
RAPD (Randon Amplified Polimorphic DNA)
Técnica baseada na reação de PCR
Duas características distintas:
Primer de sequências arbitrárias com 10 nucleotídeos (único ao invés de um par)
Sequência alvo desconhecida
• Os produtos de PCR das
amostras examinadas com Se ligam em diferentes lugares do DNA
432 pb Por serem pequenos, é grande a possibilidade de encontrem diversas regiões do
genoma para se ligarem, fazendo com que diversos fragmentos de tamanhos
• Produtos da digestão do diferentes resultem de uma reação
fragmento de PCR
• 1: G. duodenalis genótipo AI Para acontecer:
• 2-4: G. duodenalis genótipo E Orientação correta
Distância razoável
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RAPD: METODOLOGIA
1. Extração de DNA
2. PCR
3. Eletroforese
4. Análise dos resultado
• A distância percorrida pelo
fragmento é comparada com a
do peso molecular
• É atribuído score (1 ou 0) para
presença e ausência de bandas
RAPD: METODOLOGIA RAPD: METODOLOGIA
• Alterações, deleções ou inserções no sítio de ligação do primer
podem inviabilizar o anelamento
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1. Não necessita de informação
sobre a sequência de DNA
2. Sem uso de hibridização
1. Marcadores são dominantes
(Homo=Hetero)
2. Condições da PCR
APLICAÇÕES
3. Rápido, simples e baixo custo influenciam
4. Baixas quantidades de amostra 3. Dificuldade com a
reprodutibilidade
5. Grande quantidade de
fragmentos gerados
Isolados de C. parapsilosis das amostras de RTT
foram geneticamente não relacionados aos de HC
10.1186/s12876-018-0785-z
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AFLP (amplified fragment length polymorphism)
RFLP + RAPD
Utilizada para definição de marcadores moleculares e detecção de
polimorfismos
Revela variabilidade a nível de DNA
• Entender a variabilidade genética de espécies de amoreiras coletadas Amplificação seletiva por PCR de um subconjunto de fragmentos derivados
de diferentes cultivares da Coréia do Sul: da digestão total do DNA por combinação de enzimas que clivam a
• Alta semelhança genética entre a maioria das cultivares, quatro grupos molécula em sítios específicos.
distintos puderam ser identificados Corte raro reconhece 6 a 8 pb
• A segregação das cultivares ajudará no melhoramento de plantas para a Corte frequente reconhece 4 pb
produção de variedades com maior qualidade de folhas e frutos. O polimorfismo detectado decorre principalmente da presença ou ausência
do sítio de restrição para a enzima de corte frequente
AFLP: METODOLOGIA AFLP: METODOLOGIA
A técnica envolve 3 etapas: • Combinação de enzimas = garantir completa digestão da molécula de
DNA
1. Digestão do DNA pelas enzimas de restrição e ligação de
adaptadores
2. Amplificação
- Pré • DNA = alta pureza
- Seletiva
3. Análise do gel
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AFLP: METODOLOGIA AFLP: METODOLOGIA
Primers + 1 pb
Amplificação
pré- seletiva
Primers + 3 pb
EcoR I *
Amplificação
seletiva
Gel
APLICAÇÕES
Não precisa conhecer o genoma do m-o Envolve maior nº de etapas
fragmentos gerados DNA qualidade
poder de detecção da variabilidade
genética DNA desnaturado (seq.
fragmentadas)
Possibilidade de combinar #s primers (3
bases arbitrárias)
Digestão completa
Possibilidade de combinar #s enzimas de
restrição Incompleta ausência de
banda
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Diversidade genética significativa entre os isolados de S. globosa na Para este estudo, foram utilizados 69 isolados de F. poae disponíveis e a
China. análise de AFLP foi realizada para avaliar sua diversidade genética.
Os perfis de AFLP dos isolados estão associados às suas
origens geográficas, mas não a outras propriedades fenotípicas dos
• Um total de 247 marcadores foram pontuados, dos quais 201 eram polimórficos.
isolados (idade, gênero e resistência) • Os isolados mostram > 75% de similaridade, sugerindo que eles são parte de uma
Ferramenta potencialmente útil para o estudo da única linhagem monofilética
epidemiologia da S. globosa
• Nenhuma ligação óbvia foi encontrada entre a geografia e os resultados de AFLP
No total, 271 bandas de AFLP foram observadas usando as sete
combinações de primers selecionadas. O grau de polimorfismo dos
isolados de A. solani variou de 36,2 a 98,4%.
As comparações entre as duas regiões suecas revelaram que a região de
Kalmar apresentava um nível de diversidade mais elevado do que a área de
Kristianstad.
A análise de agrupamento separou claramente as duas espécies em dois
grupos principais.
O primeiro subgrupo consistia em 44 isolados de todos os cinco locais.
O subgrupo 2.2 compreendia oito isolados de A. solani, incluindo sete isolados de
Kalmar-local A e um isolado de Kristianstad-local C. O Kalmar-local A era o único
campo onde os isolados eram altamente separados geneticamente.
A análise do marcador AFLP indica que a diversidade genética entre os isolados estudados é
relativamente alta e que os isolados mostraram uma diferenciação genética significativa.
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