Técnicas para análise da expressão gênica

Para analisar a expressão gênica primeiro É muito utilizada para comparar os níveis
deve-se categorizar a sua especificidade, qual relativos de um dado mRNA em diferentes
é seu objetivo. tecidos, estágios e tratamentos do organismo,
pois a quantidade de hibridização será
Para análise: relacionada à quantidade de mRNA presente
-​ Individual. na amostra, além de permitir analisar todos os
-​ De mRNA. mRNA produzidos de um gene.
-​ Quantitativa (mede a quantidade da
expressão).
-​ Estática (não mede a expressão
com o decorrer de um tempo).

Northern Blot

Mede a expressão relativa dos níveis de um

determinado mRNA.
Parecido com o Southern Blot, mas é para
identificar um mRNA específico em uma
população de RNAs.
Não é necessário enzima para digerir, pois o
mRNA já é curto.
Os mRNAs são separados por eletroforese
(após o isolamento e purificação) e
transferidos para uma membrana
positivamente carregada e incubados com
DNA radioativo ou não. Os híbridos advém do
pareamento entre o DNA e o mRNA.
Nesse exemplo foi testado a presença de
GLUT4 em vários tecidos. Na imagem acima
uma eletroforese do RNA de vários tecidos.
Abaixo uma membrana marcada
(gene-especifica) com sonda para GLUT4.
Pode-se observar que no coração é onde há
mais presença de GLUT4, enquanto no baço
é onde menos tem.
Pode ser usado para determinar a quantidade Vamos supor que você tem um vírus e
de um mRNA específico numa amostra, em gostaria de saber quais genes são mais
vez de seu tamanho (que ocorre no Southern expressos por esse vírus. Para isso, basta
blot). Isso revela o nível da expressão do aplicar a técnica do Northern Blot.
gene que codifica o mRNA em questão.
Os genes rec e “1.5 kb” são os mais Os primers:
transcritos, pois apresentam uma maior Oligo(dT) - se liga à cauda poli-A.
quantidade de mRNA. Random's - são aleatórios e podem se ligar a
qualquer região (correspondente) no mRNA.
Um ponto importante no Northern Blot é que a
quantificação não é absoluta. O nível de Assim como o Northern blot, a quantificação é
expressão de um gene é determinado em relativa.
relação a um outro gene, mas de expressão Vantagens:
constitutiva (que sempre é expresso). ●​ Requer quantidades pequenas de
O cálculo Fol Change (FC), que diz se um mRNA em comparação com o
gene é mais ou menos expresso em relação a Northern .
outro, é um dos que podem ser aplicados. ●​ É capaz de detectar níveis baixos de
FC = tratado/controle. expressão.
Depois faz o log desse resultado e esse sim é ●​ Produto pode ser usado para
quantas vezes um gene é mais expresso que clonagem.
outro.
As desvantagens: Desvantagens:
●​ Requer uma grande quantidade de ●​ Os níveis da expressão gênica podem
RNA estar mascarados pela fase não linear
●​ RNA raros ou rapidamente do PCR.
degradados não são detectados ●​ Não é automatizado.
através do Northern Blot
●​ Utilização de materiais tóxicos PCR em tempo real
(formamida, EtBr, acrilamida,
formaldeído) A principal diferença em relação ao
convencional é a constante detecção e
monitoramento de fluorescência produzida
RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR) durante a amplificação, dada em um gráfico.
Há o uso de sonda marcada com
É útil para revelar as diferentes isoformas de fluorescência, que fica inibida por um
um transcrito, mede a expressão relativa dos quencher até que a Taq polimerase desloque
níveis de um determinado mRNA (em tratado a sonda e libere os dois.
e normal, por exemplo). Os fluoróforos podem ser:
SYBR Green (mais usado, pois é mais barato)
Primeiro há o isolamento e purificação do Se liga à dupla fita de DNA à medida que a
mRNA, depois a produção de um cDNA a Taq polimerase a sintetiza, e emite
partir de um RNA (transcrição reversa) fluorescência.
utilizando-se primers que podem ser
oligo(dT), random's ou de um gene específico.
Depois do PCR completo, há a eletroforese
em gel padrão, que fraciona o cDNA por
tamanho, os produtos separados se ligam a
EtBr e são revelados sob radiação UV.
O gráfico mostrando a detecção de ●​ Confirmação da amplificação
fluorescência: específica .
●​ MAIS ESPECÍFICO, SENSÍVEL e
REPRODUZÍVEL.
●​ A reação não é muito mais cara que a
PCR convencional (exceção: preço do
equipamento).
Desvantagens
●​ Utilização requer alta habilidade
técnica e suporte.
●​ Alto custo do equipamento.

Para análise:
Pode haver quantificação: -​ Individual.
Relativa -​ mRNA.
●​ É necessária um controle endógeno -​ Qualitativa e quantitativa.
(curva padrão não é usada) -​ Estática.
●​ Normalização é feita para a
quantidade de amostra adicionada. Hibridização in situ

Analisa a localização em uma célula, tecido

ou cromossomo do mRNA de interesse,
através de uma sonda de DNA ou RNA
marcada.
As sondas podem ou não (ex: FISH) ser
radioativas.
A técnica é por meio de uma desparafinização
do espécime/amostra e aplicação da sonda
diretamente na lâmina, que vai hibridizar e
CtB é menor que CtA, o que significa que há
mostrar o local do mRNA de interesse.
mais IFN-gama na amostra B (pq foi preciso
As amostras hibridizadas precisam passar por
menos ciclos pra chegar no limiar) do que na
uma solução de afinidade e depois serem
A.
lidas em um microscópio.
Absoluta
●​ Necessita um padrão cuja
concentração é conhecida .
●​ Quantidade idêntica da amostra
precisa ser testada.

Vantagens
●​ Amplificação pode ser monitorada em
tempo real sem utilizar eletroforese.
●​ Ciclos mais rápidos.
●​ Requer 1000x menos DNA que demais
ensaios (3 picogramas = 1 genoma).
Vantagens:
●​ Mostra o padrão de expressão
diretamente do tecido
●​ Não requer o isolamento do RNA
●​ Não requer uma estimativa sobre o
padrão de expressão
Desvantagens:
●​ Não pode ser realizada em todos
organismos

Para análise:
-​ Global.
-​ mRNA.
-​ Qualitativa.
-​ Estática. São incorporados ligantes/adaptadores às
extremidades do cDNA. Eles possuem
Bibliotecas de cDNA sequências de enzimas de restrição que
cortam o DNA em locais específicos. Quando
São constituídas de clones de regiões este cDNA é cortado pelas enzimas de
codificantes de proteínas do genoma de uma restrição correspondentes, as extremidades
determinada célula de onde o mRNA foi resultantes são compatíveis com as
extraído. extremidades cortadas do vetor de clonagem,
É formada de amostras de mRNA de tecidos, facilitando a inserção desse no vetor de
estágios e cultivados em condições clonagem em plasmídeos.
ambientais diferentes.
Um exemplo:
A fita de cDNA é sintetizada pela transcriptase
Imagine que você tenha um cDNA que deseja
reversa a partir de um mRNA. O híbrido
clonar em um vetor plasmídico para
desses dois é tratado com RNase H, que
expressá-lo em células bacterianas:
degrada a fita de RNA, e os fragmentos que
sobrarem servirão como primer para DNA 1.​ Preparação do cDNA: Você primeiro
polimerase sintetizar uma segunda fita de sintetiza o cDNA a partir de mRNA
DNA. usando a enzima transcriptase
reversa.
2.​ Ligação de Adaptadores:
Adaptadores contendo locais de
restrição, digamos EcoRI e HindIII, são
ligados às extremidades do cDNA.
3.​ Digestão com Enzimas de
Restrição: Tanto o cDNA com
adaptadores quanto o vetor plasmídico
são digeridos com EcoRI e HindIII,
 gerando extremidades coesas tratamentos e investigar como a expressão
compatíveis. gênica muda durante o desenvolvimento ou a
4.​ Ligação ao Vetor: O cDNA digerido é diferenciação celular são exemplos de
misturado com o vetor plasmídico aplicação dessa técnica de análise.
digerido na presença de uma enzima
ligase, que sela as extremidades,
inserindo o cDNA no vetor.
5.​ Transformação: O vetor recombinante
é então introduzido em células
bacterianas para propagação ou
expressão.

A construção da biblioteca advém de várias

bactérias com plasmídeos que possuem
sequências de cDNA de um mRNA que foi
Consegue dizer quais genes estão sendo
coletado e isolado.
expressos em apenas um ou nos dois casos.
O plasmídeo, depois, pode ser isolado e ter
Cada amostra de cDNA é marcada com um
seu DNA purificado para gerar uma sequência
fluoróforo e emitem uma cor. A mistura das
de bases.
duas cores reflete que o gene naquele spot é
expresso em ambas as amostras.
Para análise:

-​ Global.
-​ de mRNA.
-​ Quantitativa.
-​ Estática.

DNA Microarrays

Basicamente é a habilidade de cDNA se

hibridizar em uma solução com alta
especificidade.
Uma coleção microscópica de spots de DNA
(chamados de sondas) ficam sobre uma
superfície sólida, e milhares dessas sondas Fornecem uma quantificação relativa da
podem ser colocadas em um único slide/chip. abundância dos mRNA presentes em cada
Geralmente são organizadas para comparar amostra.
duas ou mais amostras relacionadas que
diferem informacionalmente. RNA-Seq
Comparar a expressão gênica entre diferentes
condições, como células normais versus Método de sequenciamento massivo para
células cancerosas, estudar como as células analisar o transcriptoma mais usado
respondem a medicamentos ou outros atualmente.
Faz uma análise global de RNA (ou seja, – Sítios de processamento.
todos os genes) em uma célula ou organismo. – Padrões de processamento.
Basicamente é o sequenciamento do cDNA, ●​ Para quantificar a mudança nos níveis
em sequências curtas. de expressão de cada transcrito
Essas sequências são alinhadas a um durante o desenvolvimento e sob
genoma usado como referência e o mapa é diferentes condições.
montado. Não requer conhecimento da sequência
Esses são os passos: genômica (como o microarray).
●​ Isolar todo mRNA (fragmentar).
●​ Síntese do cDNA. Para análise:
●​ Ligar adaptadores.
●​ Usar primers complementares ao -​ Individual.
adaptador para sequenciar cDNA por -​ De proteínas.
meio de sequenciamento de nova -​ Qualitativa e quantitativa.
geração (NGS). -​ Estática.
●​ Mapear as sequências no genoma.
Western Blot (imunobloting)

Usado para identificar proteínas específicas

em um extrato celular.
Etapas:
●​ Isolar extrato protéico da célula, tecido
ou organismo através de uma lise
celular.
●​ Separar as proteínas presentes no
extrato através da eletroforese.
●​ Transferir as proteínas para uma
membrana (blotting).
●​ Hibridização com anticorpo específico.
Anticorpo primário específico para proteína de
interesse.
As sequências obtidas são analisadas com Anticorpo secundário específico para porção
ferramentas bioinformáticas para Fc do anticorpo com algum tipo de marcação
quantificação da expressão gênica, (enzimática ou fluorescente). A marcação
identificação de novos transcritos, variantes enzimática é a mais comum, requer apenas
de splicing e fusões gênicas. uma enzima ligada ao anticorpo secundário
Após ser sequenciado, haverá a leitura dos que quando entra em contato com seu
fragmentos e conclusão da quantidade dos substrato emite luminescência.
genes.
Tem então como objetivo:
●​ Quantificar a abundância do mRNA.
●​ Determinar a estrutura transcricional
dos genes:
– Códons de iniciação.
 A enzima ligada ao anticorpo secundário é
uma peroxidase ou fosfatase alcalina e
quando ela reage com o substrato, produz um
Anticorpos primários específicos já marcados
produto de coloração marrom.
são muito caros, por isso há os secundários.

Imunofluorescência
Na eletroforese passa primeiro por uma
desnaturação para eliminar estruturas
O produto do marcador é um sinal
secundárias, terciárias e quaternárias e
fluorescente que pode ser visto em
depois por um SDS (tipo de sabão), que
microscópio de fluorescência e combinado a
recobre cadeias polipeptídicas e confere
outras marcações quando houver uma
carga negativa.
sobreposição de imagens.
A quantificação da intensidade da banda do
resultado da hibridização pode ser feita
usando análise de imagens e softwares.

Para análise:
-​ Individual.
-​ De proteína.
-​ Quantitativa.
-​ Estática.
Para análise:
-​ Individual.
Imuno-histoquímica​
-​ De proteína.
-​ Quantitativa.
Método para analisar a expressão de uma
-​ Dinâmica.
proteína específica em uma amostra fixada de
um tecido ou organismo.
Gene repórter
Essa proteína é
identificada através
Monitoramento da expressão de proteínas
de um anticorpo
sem a utilização de anticorpos, mas sim com
específico marcado
proteínas que são naturalmente fluorescentes
(modo direto) ou
acopladas à proteína de interesse (age como
um anticorpo
marcador).
específico e um
Permite localizar, medir e identificar o gene de
segundo anticorpo
interesse.
marcado, que se
O gene repórter mais utilizado é o da proteína
liga ao anterior
GFP (proteína fluorescente verde).
(modo indireto).
 Para análise:
-​ Global.
-​ De proteína.
-​ Quantitativa e qualitativa.
-​ Estática.

Proteômica

Análise de todo o conjunto de proteínas

existentes em uma célula, tecido ou órgão.
Confirma a presenã da proteína e fornece
uma medida da quantidade dela presente.
Essa GFP é proveniente das medusas, que Estuda as proteínas expressas em diferentes
emitem cor azul quando o cálcio se liga à estágios da doença, condições ambientais,
proteína aequorin. tratamentos…
Essa cor azul é captada pela GFP. A cromatografia líquida de alta performance e
a espectrometria de massa são exemplos
O gene da GFP é introduzido a jusante do para analisar a expressão proteômica.
promotor ou elemento regulatório de interesse Tem como objetivo final definir redes proteicas
em um plasmídeo, que é introduzido em que irão ajudar a compreender como as
células, que são selecionadas. células funcionam.
A expressão do gene repórter é regulada pelo
promotor ou elemento regulatório clonado no
plasmídeo. A atividade desse promotor
determina o nível de expressão do gene
repórter.
E a proteína repórter é expressa e
acumula-se nas células, produzindo um sinal
detectável.

Nesse experimento o GFP foi introduzido a

jusante de um gene que quando o organismo
é levado a condições de estresse, tem sua
expressão aumentada.