METODOLOGIAS PARA AVALIAÇÃO
DA RESPOSTA IMUNE CELULAR
Salvador – BA
Julho - 2013
Reconhecimento de Antígenos pelos
Linfócitos B e T
Linf B Linf TCD4+ Linf TCD8+
(Linf. TH) (Linf. TC)
Métodos para Detecção e
Quantificação de Linfócitos
• Citometria de Fluxo: baseada em anticorpos
monoclonais específicos para cada tipo de
marcador celular
• Kits específicos para CD3, CD4 e CD8
• Análise espécie-específica
• Quantitativo total / relativo
• CD4/CD8
METODOLOGIA
Detector de dispersão de
luz frontal
Tamanho celular
FSC (Forward Scatter)
Fonte de Luz Incidente: Laser
de Argon a 488 nm
Detector de dispersão de
luz em ângulo de 90º
Complexidade celular
SSC (Side Scatter)
METODOLOGIA
ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)
LASER
CÉLULA ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)
METODOLOGIA
4)Filtro
1)Suspensão de células
6) Análise
de dados
5)A luz refletida passa
através de filtros e é
detectada por tubos
fotomultiplicadores que
convertem o sinal luminoso
em sinal eletrônico
3)Dispersão lateral
de luz
Laser
2) Anticorpos monoclonais associados a 3)Dispersão de luz
fluorocromos e ligados à superfície de uma para a frente
célula
METODOLOGIA
Anticorpos monoclonais marcados
Linfócito TCD4 Linfócito TCD8
Citometria de fluxo
Luz fluorescente
Laser
Contagem das
células
METODOLOGIA
Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal)
Cada ponto significa uma célula identificada pelo citômetro.
Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente
E também pela dispersão lateral (side) - granulação e complexidade – verticalmente
Os círculos indica células que pertencem a um grupo de tamanho e complexidade próximos
METODOLOGIA
Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência)
Neste quadrante estão as Neste quadrante estão as
células CD4+ e CD3- células CD4+ e CD3+
(linfócitos Th)
Neste quadrante estão as Neste quadrante estão as
células CD4- e CD3- células CD4- e CD3+
(células que não linfócitos) (outros linfócitos que não Th)
Metodologia para quantificação de
linfócitos - Citometria
Bismarck et al. 2012. Canine CD4+CD8+ double positive T cells in peripheral blood have
features of activated T cells. Veterinary Immunology and Immunopathology
Metodologia para quantificação de
linfócitos - Citometria
Bismarck et al. 2012. Canine CD4+CD8+ double positive T cells in peripheral blood have
features of activated T cells. Veterinary Immunology and Immunopathology
Vias de
Transdução
do Sinal -
Linf. T
Métodos para Avaliação
de Transdução de Sinal
• Western Blot – anticorpos específicos para
cada molécula participante de cada cadeia de
transdução de sinal
• Anticorpos específicos para mediadores
fosforilados e não fosforilados
• Tempo dependentes e dose dependentes
• Controles internos e externos importante
Métodos para Avaliação
de Transdução de Sinal
Andrade et al. 2004. The vaccinia virus-stimulated mitogen-activated protein kinase (MAPK)
pathway is required for virus multiplication. Biochemistry Journal
Métodos para Avaliação
de Transdução de Sinal
Campos et al. 2004. Impaired production of proinflammatory cytokines and host resistance to
acute infection with Trypanosoma cruzi in mice lacking functional myeloid differentiation factor 88.
Journal of Immunology.
L-selectinas e
adressinas
dirigem os linfócitos
para os tecidos
linfoides
Integrinas são
importantes na adesão
leucocitária
Métodos para avaliação de
Moléculas de Adesão
• Imunohistoquímica, Imunofluorescência
Indireta – avaliação qualitativa e semi-
quantitativa da expressão de moléculas de
adesão em diferentes órgãos
• Avaliação in vivo, ex-vivo, biópsias, cortes
histológicos
• Citometria de Fluxo – avaliação in vitro, células
cultivadas, ex-vivo – marcadores específicos
Métodos para avaliação de
Moléculas de Adesão
Subranamian et al. 2012. Signaling through L-selectin mediates enhanced chemotaxis of
lymphocyte subsets to secondary lymphoid tissue chemokine. Journal of Immunology.
Métodos para avaliação de
Moléculas de Adesão
Shetty et al. 2012. Recruitment mechanisms of primary and malignant B cells to the human liver.
Hepatology.
Métodos para avaliação de
Moléculas de Adesão
Shetty et al. 2012. Recruitment mechanisms of primary and malignant B cells to the human liver.
Hepatology.
Caracteristic
as
gerais
Métodos de dosagem de citocinas
• ELISA Sanduíche – a partir de sobrenadante de
células em cultivo após diferentes estímulos –
citocinas secretadas
• Citometria de Fluxo – beads contendo
anticorpos específicos contra citocinas
• Citometria de Fluxo – citocinas
intracitoplasmáticas, contagem do número de
células produtoras – efeito celular
Métodos de dosagem de citocinas
• ELISPOT – metodologia que permite
acompanhar a cinética de células estimuladas
quanto à sua produção de citocinas específicas
em cultivo
• Através de visualização em microscópio,
conta-se o número de células marcadas.
ELISPOT
ELISPOT
Métodos de dosagem de citocinas
Arrode-Brusés et al. 2012. Immunogenicity of a lentiviral-based DNA vaccine driven by
the 5'LTR of the naturally attenuated caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) in mice
and macaques. Vaccine
Métodos de dosagem de citocinas
Arrode-Brusés et al. 2012. Immunogenicity of a lentiviral-based DNA vaccine driven by
the 5'LTR of the naturally attenuated caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) in mice
and macaques. Vaccine
Métodos de dosagem de citocinas
Arrode-Brusés et al. 2012. Immunogenicity of a lentiviral-based DNA vaccine driven by
the 5'LTR of the naturally attenuated caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) in mice
and macaques. Vaccine
Detecção da Hipersensibilidade
Tipo I
• O teste aspecto de uma reação aspecto de uma reação
cutâneo após 5 horas logo após injeção
determina a
capacidade
de diferentes
alérgenos de
produzirem
uma reação
de pápula e alérgeno diluído
de 1:10 até 1:1000
eritema .
Teste Radioalergoadsorvente(RAST)
Mede o nível sérico de anticorpos IgE específicos contra determinado
componente alergênico ao paciente.
discos com
componente
alergênico
suspeito
soro do paciente contendo
lavagem
anti-alérgeno IgE
adição de anti IgE humana
marcada
lavagem detecção
IMUNOFLUORESCÊNCIA DE REAÇÕES DE
HIPERSENSIBILIDADE TIPOS II E III
Os cortes de rim comparam o
padrão de imunofluorescência de
um paciente com Lupus Eritematoso
Sistêmico (predomínio de
hipersensibilidade tipo III) e um
paciente com Síndrome de
Goodpasture (predomínio de
hipersensibilidade tipo II). No LES,
os imunocomplexos formados no
sangue são depositados no tecido
renal, dando aspecto granular. No
segundo caso, os anticorpos se
depositam de forma linear sobre a
membrana basal glomerular. TIPO III TIPO II
Detecção da Hipersensibilidade
Tipo IV
Testes cutâneos
No teste epicutâneo - aplica-se uma baixa dose do antígeno suspeito numa área da
pele do paciente .
Pode haver desenvolvimento de eczema dentro de 48 a 72 h.
Antígeno
EPIDERME
DERME
GORDURA
SUBCUTÂNEA
•Teste tuberculínico – o derivado protéico purificado de Mycobacterium
tuberculosis, PPD, é injetado por via intradérmica.
Nesse teste analisa-se o surgimento de vermelhidão e enduração no local da
injeção, que podem surgir depois de 24 a 72h em indivíduos pré-sensibilizados.
EPIDERME
DERME
GORDURA
SUBCUTÂNEA
APRESENTAÇÃO CLÍNICA E HISTOLÓGICA DO
TESTE TUBERCULÍNICO
Resposta ao teste:
1. nenhuma reação:
normal
2. 5 a 10mm: repetir o
exame
3. > 10mm: positivo para
tuberculose
4. Paciente HIV +, >5mm:
positivo para
tuberculose
Avaliação da produção de IFN-
(por exemplo, em paciente suspeito de infeccão por Mybacterium tuberculosis)
Suspeito 24 h
Cultura Coleta ELISA
sangue de do detecção
sangue total sobrenadante de IFN-
Controles
negativo
e positivo
Leitura
Sangue de
+ densidade
PPD óptica
Avaliação dos resultados
Métodos de Avaliação da
Resposta Imune Celular
ELISA SANDWICH PARA DOSAGEM DE CITOCINAS
ELISA SANDWICH PARA DOSAGEM DE CITOCINAS
ELISA SANDWICH PARA DOSAGEM DE CITOCINAS
Lim et al 2009.The Effects of Heat-Killed Wild-Type Lactobacillus casei Shirota on Allergic Immune
Responses in an Allergy Mouse Model. International Archives of Allergy and Immunology,
