Como desenhar um primer

Notas do Editor

• #2: No site do NCBI (National Center for Biotechnology Information), na database “Nucleotide” (1.), pesquisa-se a sequência de mRNA desejada (2.).
• #3: Você vai encontrar assim, o registro relacionado à sua pesquisa. Clicando no botão “FASTA” (3.), você obtém a sequência completa de gene. Além disso, clicando em CDS, você obtém o a sequência de domínio conservado dentro da sequência completa.
• #4: Assim, de acordo com a sequência obtida em CDS, torna-se possível localizar o códon de início (verde) e o códon de parada (vermelho).
• #5: No site da ThermoFisher você pode localizar a ferramenta OligoPerfect™ Designer a partir da qual é possível desenhar seu primer através de quatro passos iniciais simples: a) Dar um nome para a sua sequência, b) selecionar a aplicação “PCR: detection”, c) Identificar o pesquisador e d) Colar, sem espaços, a sequência obtida no CDS, desde o códon de início até o de parada.
• #6: O passo seguinte é configurar os primes que serão desenhados às condições da sua reação. Alguns parâmetros podem ser ajustados: um primer ideal não pode ser muito longo e nem muito curto; logo, escolhe-se um primer com aproximadamente 20 pares de bases. Outra característica importante, que poderia ser classificada até como principal, é a Tm - temperatura de melting (ou anelamento), de forma que, você padroniza a Tm do primer desenhado às condições padrão da sua reação. Além disso, o percentual de Guanina-citosina (%GC) irá determinar a ligação das bases complementares o seu primer, uma vez que GC fazem três pontes de hidrogênio enquanto que AT fazem apenas duas. Em “Region of Analysis” é possível determinar se o primer desejado será desenhado em qualquer local das sequências de pares de bases ou em uma sequência específica. O tamanho de produto de PCR obtido também pode ser configurado, de forma a não serem desenhados primers para produtos muito pequenos, levando a um certo grau de inespecificidade na reação e nem a uma sequência muito grande, gerando uma reação demorada e dispendiosa. Outras condições podem ser ajustadas, como a concentração de sal assim como do oligonucleotídeos no produto fornecido pela Termofisher e também você pode determinar quantas sequências de pares de primers vocês deseja que a ferramenta desenhe (obviamente, respeitando as condições probabilísticas dentro da sequência fornecida as software).
• #7: Sendo assim, o software vai elencar os pares de primers que, segundo a matemática do sistema, são adequados para aquela sequência de mRNA. Clicando em “Highlight Target Sequence”, torna-se possível observar na sequência original, onde localiza-se o primer sense (amarelo) e onde o primer anti-sense é complementar invertido (laranja)
• #8: Uma ferramenta, bem simples e útil é a “reverse complement”, onde você apenas fornece as bases do seu primer anti-sense e obtém o complementar invertido (seta) a fim de localizar na sua sequência “FASTA” onde seu primer é complementar invertido.
• #9: Sendo assim, você obtém o seu produto de PCR na sequência FASTA (sublinhado), desde o primer sense (amarelo) até o complementar invertido do anti-sense (cor-de-rosa).
• #10: Adicionalmente, no site do NCBI, é possível utilizar a ferramenta “BLAST” (seta vermelha), a partir da qual se verifica o índice de homologia dos primers obtidos com a sequência desejada. O BLAST é uma ferramenta que verifica a probabilidade de alinhamento em sequências específicas. Aqui, você pode verificar BLAST de proteínas ou de Nucleotídeos; evidentemente, você deve escolher a opção Nucleotídeo (seta verde).
• #11: Sendo assim, ao se colar a sequência de pares de bases e selecionar as opções “Nucleotide Collection” e “Others”, é possível pesquisar a homologia da sequência fornecida com outras sequências de nucleotídeos de quaisquer espécies no banco de dados do NCBI. Ao se preencher as informações requeridas, clicar em ‘BLAST’ (seta vermelha).
• #12: Logo, se obtém no banco de dados do NCBI quais sequências registradas podem gerar alinhamento significativo com a sequência de pares de bases fornecida. Dentre os resultados obtidos, encontram-se sequências de mRNA, como o RNA pretendido o qual está ressaltado em vermelho, além de cDNA, etc... O que se pode observar, de acordo com os dados obtidos é que a sequência fornecida, além de relacionada ao produto desejado, é espécie-específica; ou seja, relacionada apenas a nucleotídeos da espécie Mus musculus.