Analise de hibridização

Análise de Hibridização
Caio Fagundes
João Moreira

Breve histórico
• A idéia de imobilizar e hibridizar moléculas em
um suporte sólido foi primeiro proposta por
Denhardt (1966), conduzindo ao desenvolvimento
de metodologias de identificação de seqüências no
DNA genômico e de clonagem.
• O passo seguinte foi dado por Southern (1975),
quando demonstrou como poderia ser feita a
transferência de DNA do gel para membranas;

• Segundo Dyson (1991), desde as descobertas de
Denhardt e Southern as técnicas de hibridização
em membranas tornaram-se gradativamente
sofisticadas, principalmente devido a melhor
compreensão acerca dos fatores que influenciam a
taxa de hibridização e estabilidade dos híbridos.

Hibridização de ácidos nucléicos
• É o pareamento complementar de bases entre os
ácidos nucléicos de fita simples, gerando um
produto dupla fita.
• Pode ser:
– DNA/DNA
– RNA/RNA
– DNA/RNA

Hibridização de ácidos nucléicos
Como se mantem unidas as fitas?
• Pontes de hidrogênio entre as
bases;
• Interações hidrofóbicas entre as
bases adjacentes de uma mesma
fita.

Fatores que afetam a estabilidade dos
híbridos
•
•
•
•
•
•

Número de pares GC v/s pares AT;
Grau de complementariedade;
Tamanho das fitas (número de pares de bases) ;
Concentração de sal na solução;
Temperatura;
Concentração de formamida (para híbridos de RNA).

híbridos
• Número de pares GC v/s pares AT:
– Maior número de ligações de H
entre as fitas → maior
estabilidade dos híbridos.
• 3 ligações de H entre G e C
• 2 ligações de H entre A e T

híbridos
• Grau de complementariedade:
– Menor complementariedade de bases:
→ menos ligações de H formadas;
→ menor estabilidade.

híbridos
• Tamanho das fitas:
– Maior tamanho (cDNAs >200pb):
→ mais ligações de H;
→ maior estabilidade do híbrido.
– Menor tamanho (oligos <50pb):
→ Maior especificidade;
→ Menor probalidade de hibridização cruzada.

híbridos
• Concentração de sal na solução:
∀ ↑ [sal] → ↑ estabilidade do híbrido
– Cátions monovalentes (Na+) ou
divalentes (Mg++)
– As cargas negativas dos grupos fosfato
repelem umas às outras.
– Os íons positivos da solução reduzem a
repulsão eletrostática entre as fitas.

híbridos
• Temperatura:
– Maior T → aumenta a energia cinética das
fitas e desestabiliza a estructura dos ácidos
nucléicos.
→ as fitas se separan.

híbridos
• pH:
↑ [OH- ]
↑ ionização dos grupos fosfato, favorecendo
a repulsão eletrostática entre as fitas.
• Concentração de formamida:
– Provavelmente forma ligações de H com os
ácidos nucléicos;
– Desestabiliza a formação de híbridos.

O efeito combinado destes fatores pode
ser expresso em uma equação para o
cálculo da Tm
• O que é Tm?
Tm = temperatura de melting ou temperatura de
separação das fitas.
A Tm é uma medida de estabilidade dos híbridos,
definida como a temperatura na qual 50% dos híbridos
se encontram formados e 50% permanecen dissociados.
50%
5’ - - - - - - - - - - -3’
3’ - - - - - - - - - - 5’

5’ - ----5’
----3’ - -50%
-3’

Para DNA:DNA
Tm = 81,5 ºC + 16,6log[Na] + 41(%G+C) - 0,63(%formamida) - (500/L)

Para DNA:RNA
Tm = 79,8 ºC + 18,5log[Na] + 58,4(%G+C) + 11,8(%G+C)2 - 0,5(%formamida) - (820/L)

Para oligonucleotidos em 1 M Na+
Tm (oC) = 4 (G+C) + 2 (A+T)

Dot/Slot Blot
• Desenvolvido primeiramente por Kafatos et al em
1979.
• Usado na determinação da abundância relativa de
uma seqüência alvo em uma série de amostras de
DNA
• Aplicada em análise genômica de espécies
relacionadas
• Zoo Blot: blots contendo DNA de uma variedade
de espécies relacionadas.

Dot/Slot Blot
• Técnica de imobilização
de DNA não fracionado
em uma membrana de
nitrocelulose ou de
nylon. Posteriormente a
análise de hibridização
pode ser feita.
• Dot ou Slot: Diferenças
na geometria do blot

Dot/Slot Blot
• Dot/Slot blotting de DNA em membranas não
carregadas de nitrocelulose e nylon:
– Aprelho de sucção e um manifold
– Materiais:
•
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•
•
•
•
•
•

SSC 6x e 20x
DNA a ser analizado
Solução de desnaturação: 1.5M NaCl/0.5M NaOH
Solução de neutralização: 1M NaCl/0.5M tris.Cl pH 7,0
Membrana
Folhas de papel de filtro
Manifold
Plástico transparente a luz UV
Fonte UV

Dot/Slot Blot
• Embeber a membrana e o filtro de papel em SSC 6x
por 10 min.
• Posicionar a membrana sobre o filtro no manifold.
Observar se há bolhas de ar.
• Diluir DNA com água e SSC 20x p/ um volume de
400ul. Desnaturar o DNA em banho de água a 100 ºC
por 10 min.
• Ligar o aparelho de sucção ao manifold, adicionar
500ul de SSC 20x e permitir filtragem (5 min).
• Centrifugar amostras de DNA e aplicar aos poços.
• Filtrar.

Dot/Slot Blot
• Após filtragem, colocar membrana sobre um papel
de filtro embebido em solução de desnaturação
por 10 minutos.
• Levar membrana a um papel embebido em solução
de neutralização por 5 minutos.
• Embrulhar a membrana no plástico transperente a
UV e posicioná-la com o DNA voltado para baixo
na fonte de UV pelo tempo indicado.
• Secar a membrana.

• DNA de fita simples e RNA de sequencias
definidas podem parear com um segundo DNA ou
RNA com uma seqüência complementar, com a
estabilidade do híbrido dependendo do grau de
pareamento de bases.
• Experimentalmente usa-se uma sonda marcada e
um DNA alvo imobilizado em uma membrana. É
um método bastante sensível.


•
•
•
•
•

Imobilização;
Adição das sondas na solução de hibridização;
Lavagem: grau de complementaridade;
Sondas: 100 a 1000 bp marcados radioativamente;
Diversos protocolos: Southern e Dot

Análise de hibridização de DNA
com sonda de DNA marcada
•
•
•
•

Bloqueio de sítios não específicos
Incubação com a sonda.
Lavagem.
Materiais:
– Sonda
– Solução de pre-hibridização/hibridização
– 2x SSC/0,1% SDS, 0,2x SSC/0,1% SDS, 0,1x
SSC/0,1% SDS, 2x e 6x SSC
– Incubadora
– Tubo de hibridização
– Reagentes para marcação de DNA e autoradiografia

com sonda de DNA marcada
• Marcação da sonda de DNA (nick translation ou
random priming) a atividade especifica de 1x108
dpm/ug;
• Molhar a membrana com o DNA em 6x SSC;
• Incubar membrana no tubo de hibridização com
APH (1ml para 10cm2) por 3 hr a 68 ºC;
• Desnaturar sonda a 100 ºC por 10 min;
• Repor a APH contendo a sonda no tubo e incubar
overnight a 68 ºC;
• Lavar a membrana (SSC/SDS - ciclos de 10 min);
• Fazer autoradiografia.

com sonda de RNA marcada
• Construção de sondas de RNA (RNA pol:SP6, T3
ou T7) para o DNA template;
Para marcação radioativa adicionar NTPs radioativos.

• Molhar a membrana com o DNA em 6x SSC;
• Incubar membrana no tubo de hibridização com
FPH (1ml para 10cm2) por 3 hr a 42 ºC;
• Trocar o FPH, adicionar a sonda no tubo e incubar
overnight a 42 ºC, sob agitação;
• Lavar a membrana (SSC/SDS - ciclos de 10 min).

• Repor a solução de lavagem e adicionar igual
volume de 2x SSC (25µg/ml RNase A + 10U/ml
RNase T1) e incubar 30 min;
• Realizar a autoradiografia.
• Para remover as sondas da membrana hibridizada
basta realizar um tratamento com 0,4 M de NaOH
à 45 ºC, ou com 0,1% de SDS. Assim a membrana
poderá ser novamente hibridizada.

Random priming:

Nick translation:
ds DNA

DESNATURACION
ALINEAMIENTO DE PARTIDORES

DNase I quebra
o DNA
DNA POLIMERASA +
dNTPs + dNTP-P

DNA pol I
agrega NTPs

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