Aula de Engenharia Genética sobre PCR
- 1. Profª. Drª. Priscila Mello Elaborado por: Profa. Dra. Marta Bastos
- 2. Seqüência alvo ✓ Reação que permite a amplificação de um fragmento específico de DNA, aumentando a possibilidade de visualização. ✓ “XEROX MOLECULAR”
- 3. ✓ 1952 - Watson & Crick: Modelo da molécula de DNA ✓ 1971 - Gobind Khorana: replicação de um pedaço de DNA 2 primers.
- 5. ✓ Separação da dupla fita de DNA - Helicase X Aumento da temperatura
- 6. ✓ 1985 - Kary B. Mullis- Amplificação de sequências de DNA.
- 7. Limitações: -Síntese de primers - Purificação de DNA polimerase ✓ Limitações: - Síntese de primers - Purificação de DNA polimerase
- 8. ✓ 1976 - Thomas D. Brock - DNA polimerase termoestável de Thermus aquaticus .
- 9. ✓ Desnaturação ✓ Anelamento ✓ Elongação
- 10. ✓ Termociclador
- 11. ✓ amostra de DNA (template- molde) - DNA genômico - cDNA
- 12. ✓ primers (iniciadores) ✓ dNTPs ✓ DNA polimerase ✓ MgCl2 ✓ Solução Tampão e água destilada
- 15. ✓ primers (iniciadores) ✓ dNTPs ✓ DNA polimerase ✓ MgCl2 ✓ Solução Tampão e água destilada DNA
- 16. Esta reação permite a amplificação de qualquer sequência de DNA coletada de amostras de materiais biológicos como sangue, urina, outros fluidos corporais, cabelo e fragmentos teciduais. Amostras de microorganismos, células vegetais ou animais mesmo que com milhares de anos, também podem ser detectadas pela PCR.
- 17. * Aplicável em organismos mortos. Uma vez que a amplificação ocorre in vitro, e depende apenas da amostra genética coletada, não do complexo enzimático do organismo. VANTAGENS
- 18. * Facilidade de contaminação: Devido a sua alta sensibilidade, os fragmentos de amostras anteriormente trabalhadas (amplicons na forma de aerossóis) podem vir a serem amplificados no processo. Para reduzir o risco de contaminações são fundamentais os seguintes cuidados: DESVANTAGENS
- 19. • A separação física em dois laboratórios “pré-PCR” e “pós-PCR”, de modo que cada um tenha o máximo de independência possível • Descarte de ponteiras e tubos utilizados. • Controle do fluxo de pessoas, também de visitantes externos, mas principalmente do pessoal que pode transitar de um laboratório para o outro. O maior risco de contaminação é através dos amplicons (fragmentos de DNA) produzidos no laboratório pós “PCR” e transportados pelos experimentadores ate o laboratório de “pre-PCR”. DESVANTAGENS
- 20. ✓ Composta por ciclos ✓Desnaturação das cadeias ✓Anelamento dos Primers ou iniciadores ✓ Polimerização das novas cadeias complementares pela ação da enzima Taq DNA polimerase.
- 22. ✓ Temperatura de 94 a 96ºC (3 a 5 minutos )
- 23. ✓ Temperatura de 94 a 96ºC (30 segundos)
- 24. ✓ Temperatura varia de acordo com os primers ✓Tempo
- 25. ✓ Temperatura de 72ºC, tempo varia de acordo com tamanho do amplicon
- 26. Desnaturação Anelamento Extensão Final do ciclo ✓ Nº de ciclos variável: 25 a 30
- 29. 1 ciclo = 2 Amplicons 2 ciclos = 4 Amplicons 3 ciclos = 8 Amplicons 4 ciclos = 16 Amplicons 5 ciclos = 32 Amplicons 6 ciclos = 64 Amplicons 7 ciclos = 128 Amplicons No. No. Amplicons Ciclos Copias do DNA alvo 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1.048.576 30 1.073.741.824
- 30. ✓ Eletroforese em gel de agarose
- 31. ✓ Real time PCR ou PCR em tempo real ou PCR quantitativo
- 32. Intensa padronização Contaminação Não automatizado Necessidade de pós-processamento do produto da PCR Resultados não são expressos em números
- 39. ✓ Real time PCR- PCR quantitativo
- 41. Diagnósticos de doenças infecciosas: O diagnóstico de doenças infecciosas tem como principio a detecção do patógêno ou de sua ação..
- 42. Atualmente, o PCR é utilizado em laboratórios de investigação médica e biológica objetivando diferentes tarefas, como a identificação de doenças hereditárias, a construção de árvores filogenéticas, a clonagem de genes, teste de paternidade, detecção de organismos causadores de infecções, concepção de organismos transgênicos, entre outras.
- 43. ✓ Diagnósticos moleculares Identificação de doenças hereditárias Testes de paternidade
- 44. ✓ Teste de paternidade
- 45. ✓ Teste de paternidade -Baseado em seqüências repetitivas encontradas no DNA -Microssatélites (SNP- single nucleotide polimorphism): classe de DNA repetitivo de poucas bases - STR ou VNTRs : regiões com número variável de repetições
- 46. ✓ Microsatélites (SNPs) ✓ Marcador molecular de doença
- 47. ✓ Teste de paternidade (STRs ouVNTRs)
- 48. ✓ Teste de paternidade
- 49. ✓ Teste de paternidade PM M F P1 P2
- 50. ✓ Identificação de indivíduos
- 51. DNA controle Acusado Vítima Amostra ✓ Análise Forense
- 53. ✓ Análise da expressão de genes (RT-PCR) - Extração de RNAm - Preparo do cDNA - gene de referência (gene constitutivo)
- 54. ✓ RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA – DNA polimórfico randomicamente amplificado)- DNA fingerprinting – PCR utilizando-se iniciadores aleatórios em baixa estringência (especificidade no produto de DNA a ser amplificado) – Não é necessário um conhecimento prévio do genoma – Uniformidade no padrão de bandas para espécies relacionadas
- 56. ✓ RAPD