Aula sobre Diagnóstico Virológico para Saúde
0 gostou43 visualizações
Aula sobre Diagnóstico Virológico para diferentes áreas de Saúde
Aula sobre Diagnóstico Virológico para Saúde
- 3. Importância do Diagnóstico Laboratorial • Diferenciação de agentes que causam a mesma síndrome clínica • Identificação de patógenos novos • Diferenciação de fases de doença • Triagem e avaliação de tecidos e órgãos • Imunidade pós vacinal • Vigilância epidemiológica • Estudo epidemiológico • Iniciar tratamento específico
- 4. Tipos de métodos diagnósticos Métodos Direitos Pesquisam elementos da partícula viral (antígenos, genoma, partícula inteira) Métodos Indireitos Pesquisam RESPOSTA do hospedeiro (Anticorpos)
- 5. Tipos de métodos diagnósticos Métodos Clássicos Isolamento viral em sistema hospedeiro Métodos Rápidos Imonológicos Biologia Molecular Microscopia eletrônica
- 8. Métodos clássicos: Isolamento viral
- 9. Métodos clássicos: Isolamento viral Cada tipo de vírus vai exigir uma cultura celular diferente!
- 10. Cultivo Celular Cultura Primária Cultura Diplóide Cultura imortal Efeito Citopático (ECP): alterações que a replicação viral causa à célula hospedeira
- 15. Diagnóstico Imunológico IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA Detecção de ANTÍGENOS virais no interior das células IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA Detecção de ANTICORPOS
- 17. Diagnóstico Imunológico ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO DIRETO Detecção de ANTÍGENOS virais em fluidos (ex. sangue)
- 18. Diagnóstico Imunológico ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO INDIRETO Detecção de ANTICORPOS
- 24. Diagnóstico rápido Hemaglutinação: - Capacidade de alguns vírus em aglutinar hemácias - Rápida, fácil execução - Não identifica exatamente um vírus; restrito
- 25. Diagnóstico rápido Inibição da Hemaglutinação: - Capacidade de alguns vírus em aglutinar hemácias é bloqueada por anticorpos específicos contra determinado vírus quantificação! - Rápida, fácil execução, identifica exatamente um vírus; - Restrito
- 27. Informação codificada para vida!
- 28. Reação em cadeia da polimerase - PCR Ampliar o número de determinada sequência de DNA Mimetizando a duplicação in vivo!
- 29. • Aquecimento – Resfriamento cíclico • Temperatura máxima ~100°C • Temperatura de desnaturação ~95°C • Temperatura ótima Taqpolimerase ~72°C • Anelamento: variável In vitro http://biologiateista.blogspot.com.br/2010/09/complexidade-da-vida-parte-i-dna.html Reação em cadeia da polimerase - PCR
- 30. • Primers (iniciadores) DNA: • Senso e Anti-senso • Complementariedade à sequência alvo do gene: desenhados! • Permitem a ação da Taq In vitro http://www.pcrstation.com/pcr-primer/ Reação em cadeia da polimerase - PCR
- 31. In vitro ttp://www.norgenbiotek.com/display-product-pcr-dntp.php?ID=237 http://www.ocf.berkeley.edu/~edy/genome/sequencing.html Reação em cadeia da polimerase - PCR
- 32. PC . In vitro Água autoclavada e deionizada: completa o volume final da reação Tampão 10X concentrado: 10 mM Tris-HCl pH 8,0 , 50mM KCl mantém o pH ótimo para a reação Cloreto de Magnésio (MgCl2): otimiza a atividade da Taq polimerase. Concentração: 0,5 a 2,5 mM dNTP mix 10x buffer MgCl2 Taq pol Reação em cadeia da polimerase - PCR
- 33. PC DNA polimerase Reagentes do PCR Primer Sense Primer Antisense Reação em cadeia da polimerase - PCR
- 34. PC Ciclagem (30 – 40x) Desnaturação do DNA (95°C – 30’’ a 1’) Temperatura de anelamento variável Extensão 72°C (30’’ a 1’) Desnaturação Inicial 95° 10’ Extensão Final 72°C 7’ Temperatura de anelamento ~5°C abaixo da Tm (melting Temperature) do primer; Para calcular Tm de um primer : 2 (A + T) + 4 (G + C) Reação em cadeia da polimerase - PCR
- 35. PC Reação em cadeia da polimerase - PCR
- 36. PC • 35 a 100 nuc/seg • 1 minuto = 1,2kbp Reação em cadeia da polimerase - PCR
- 37. PC DNA?? CADÊ??? Reação em cadeia da polimerase - PCR
- 38. Eletroforese • Agarose ou Poliacrilamida A separação é feita por peso molecular de casa amostra que migra no gel devido a corrente elétrica
- 39. Eletroforese - visualização O Brometo de Etídio -intercalante de DNA- fluoresce em UV
- 40. Variações do PCR: Nested Nested PCR pode ser uma alternativa para melhorar a especificidade e a sensibilidade da PCR 1o PCR: primers externos Produto do 1o PCR : template para o 2º PCR 2o PCR: primers internos Produto do 2º PCR
- 41. - Para vírus de genoma RNA, pesquisa de RNAm -Realização da reação de transcrição reversa -> Transcriptase Reversa -Cuidados a tomar durante o preparo do c-DNA Variações do PCR: RT-PCR
- 42. Ensaio quantitativo, rápido, dispensa realização do gel Variações do PCR: PCR em tempo real Baseado na emissão de fluorescência e detecção por Laser • TaqMan • Syber Green • Molecular beacon
- 43. PCR em Tempo Real Novaes et al 2004
- 44. TAqMan Novaes et al 2004
- 45. Sybr Green® Novaes et al 2004 http://www.gene-quantification.de/chemistry.html
- 46. Quantificação: Curva de calibração a partir de concentrações conhecidas de DNA Representação de um plot da amplificação em tempo real: 3 fases linha basal: não houve clivagem suficente do corante-repórter para que se possa detectar a fluorescência fase log: a quantidade de amplicon dobra a cada ciclo fase platô: não há mais aumento no número de ampliconsxx PCR em Tempo Real