Biologia molecular
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O documento descreve várias técnicas de biologia molecular, incluindo gel de agarose para visualização de DNA, Southern blotting para detecção de DNA específico, enzimas de restrição para corte de DNA em sequências específicas, vetores para transporte de DNA recombinante, reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificação de DNA, e sequenciamento de DNA.
Biologia molecular
- 1. 01/06/2016 1 Técnicas de Biologia molecular Natalia Bernardi Videira [email protected] BG515 – Prof. Gonçalo TÉCNICAS PARA ESTUDO DO DNA E RNA
- 2. 01/06/2016 2 Gel de Agarose • Objetivo: visualização da presença ou ausência do DNA • Princípio: Após aplicação de uma corrente elétrica, o DNA (carga negativa) migra para o polo positivo. • Através da comparação com um marcador de peso molecular conhecido é possível comparar o tamanho do DNA da amostra Gel de Agarose • Material: – Gel de agarose (0,8 a 2%) – Tampão TAE (tris-acetato-EDTA) ou TBE (tris-borato-EDTA) – Intercalante de DNA para visualização (brometo de etídeo, gel red) – Marcador de peso molecular (DNA ladder) – Amostra de DNA • Aplicações: – Visualização do tamanho do DNA – Qualidade do DNA (x degradação) – Permite extração do DNA após purificação do gel
- 3. 01/06/2016 3 Southern Blotting • Objetivo: detectar um DNA específico em uma mistura • Princípio: uso de sondas marcadas (de DNA ou RNA, complementar a sequencia de interesse) que hibridizam com o DNA de interesse • Técnica desenvolvida por Edwin Southern. Southern Blotting 1) DNA é fragmentado E aplicado em gel de eletroforese 2)DNA é desnaturado 3,4,5,6) DNA é transferido do gel para membrana 7)A membrana Northern Blotting: Localização de RNA através de sondas Western Blotting: Localização de proteínas através de anticorpos
- 4. 01/06/2016 4 Enzimas de Restrição Histórico: • Werner Abner: descobriu a enzima de restrição (“tesouras moleculares”) Estudo com bacteriófagos → bactérias digeriam o DNA viral • Hamilton Smith: Descreve mecanismo de ação das enzimas de restrição O corte gera um par de extremidades coesivas idênticas e as enzimas clivam as mesmas sequências em qualquer DNA • Daniel Nathans: primeiro a mostrar a aplicação tecnológica Enzimas de restrição : são produzidas naturalmente por bactérias como mecanismo de defesa à infecção de DNA viral Enzimas de Restrição • Objetivo: clivagem de uma região específica do DNA. • Princípio: Reconhecem e fazem cortes bifilamentares na ligação açúcar-fosfato das moléculas de DNA em sequencias específicas. • Sítio de restrição: 4 a 6pb – regiões palindrômicas
- 5. 01/06/2016 5 Enzimas de Restrição • Extremidades coesivas (Sticky-ends) ex: EcoRI, HindIII, BamHI • Extremidades cegas (Blunt-ends) Ex: NsbI, HaeIII, AluI. http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1982-56762009000200006 Vetores Vetores: molécula de DNA usada como veículo para transportar artificialmente um material genético exógeno para outra célula, onde ele pode ser replicado e/ou expresso. Um vetor contendo o inserto de DNA exógeno é chamado DNA recombinante. Um vetor contém: - sítio múltiplo de Clonagem (com sítios para várias enzimas de restrição), - marcador de seleção - origem de replicação adequada ao hospedeiro (célula que recebe o vetor)
- 6. 01/06/2016 6 Exemplo de tipo de Vetor Plasmídeos: Encontrados naturalmente em bactérias Pequena molécula de DNA circular dentro da célula Se replica de forma independente. Fisicamente separada do DNA cromossomal Na natureza, os plasmídeos frequentemente carregam informação adicional que pode beneficiar a sobrevivência do organismo, por exemplo genes de resistência a antibióticos. Plasmídeos artificiais são usados na biologia molecular como vetores, transportando sequências de DNA recombinante em organismos hospedeiros Clonagem de DNA Inserção de um fragmento de DNA em um vetor.
- 7. 01/06/2016 7 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) • Objetivo: amplificação do número de cópias do DNA em bilhões de vezes • Princípio: reação enzimática de polimerizaçãodo DNA in vitro – utiliza DNA polimerase • Material: – Amostra de DNA – DNA polymerase – Primer Forward e Reverse – Tampão da enzima – MgCl2 – dNTP Tempo Temp (C) Desnaturação 95°- 30s Anelamento 55°- 1min Extensão 72°- 1min *Repete ciclo 35 vezes Ciclo PCR Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
- 8. 01/06/2016 8 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) • Aplicações: – Diagnóstico de patógenos e doenças hereditárias – Identificação de anormalidades cromossomais – Identificação de mutações – Mutagênese – Clonagem de genes – Sequenciamento – Genotipagem Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
- 9. 01/06/2016 9 • Limitações: – Baixa sensibilidade – Colorações não quantitativas – Pobre discriminação entre o tamanho dos produtos de PCR – Resultados não são expressos em número Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) PCR Real Time • Objetivo: método quantificativo baseado no PCR • Princípio: análise da fase exponencial do PCR
- 10. 01/06/2016 10 PCR Real Time • Uso de sondas fluorescentes para quantificar o número de cópias PCR Real Time • Aplicações – Análise da expressão gênica – Identificação de polimorfismos e mutações – Quantificação da carga viral ou outras infecções – Identificação de translocações genéticas (ex em leucemia mielóide crônica)
- 11. 01/06/2016 11 Produção de cDNA Objetivo: Como o RNA é muito instável, é interessante produzir cDNA (DNA complementar) a partir do mRNA Princípio: Utiliza a enzima Transcriptase Reversa que é capaz de realizar a síntese de DNA a partir de um molde de RNA Transcriptase Reversa: enzima encontrada nos vírus de RNA (retrovírus). Quando o vírus infecta seu hospedeiro ele utiliza a Transcriptase Reversa para produzir cDNA a partir do seu material genético de RNA, para depois integrar o cDNA no genoma do hospedeiro Funciona como se fosse uma reação de PCR no qual ocorre o anelamento do primer oligo-dT (TTTTT) com o RNA e síntese do cDNA com a Transcriptase Reversa, e depois a síntese da segunda fita do DNA com a DNA polimerase Sequenciamento de DNA Objetivo: Obter a sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA Princípio: Síntese de cópia do DNA de interesse utilizando-se nucleotídeos modificados
- 12. 01/06/2016 12 Sequenciamento de Sanger Desenvolvido na década de 1980 Utiliza ddNTP (trifosfato de didesoxinucleotideo) Nucleotídeo modificado com capacidade de bloquear a síntese contínua do DNA Não possui o grupo 3’-hidroxila, portanto a DNA polimerase não consegue adicionar outro nucleotídeo após o ddNTP A reação de síntese da fita de DNA é interrompida quando a polimerase adiciona o ddNTP São criadas fitas de DNA com diferentes tamanhos dependendo de quando o ddNTP foi incorporado Essas fitas de DNA são aplicadas num gel de acrilamida e “correm” de acordo com seu tamanho (da menor para a maior) O equipamento lê a fluorescência dos diferentes ddNTP e indica a ordem em que eles foram incorporados Sequenciamento de Sanger Método inicial era manual A reação era realizada em quatro tubos separados, um para cada tipo de ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP) O resultado era visto numa eletroforese em gel GATC
- 13. 01/06/2016 13 Sequenciamento de Sanger automatizado Sequenciamento de nova geração Também conhecido como: Next-generation sequencing (NGS), high-throughput sequencing. Termo usado para descrever diferentes novas tecnologias de sequenciamento: Illumina (Solexa) sequencing Roche 454 sequencing Ion torrent: Proton / PGM sequencing SOLiD sequencing Essas técnicas novas permitem sequenciar DNA e RNA de maneira muito mais rápida e barata, e revolucionaram o estudo de genômica e biologia molecular. RNA – seq : sequenciamento de todo o mRNA transcrito na célula naquele momento.
- 14. 01/06/2016 14 Illumina https://youtu.be/HMyCqWhwB8E 1) o DNA é fragmentado 2) o DNA é ligado a adaptadores 3) Através do adaptador, o DNA se liga na placa 4) Através de um PCR de ponte, o número de cópias do DNA de interesse é aumentado 5) Ocorre o sequenciamento do DNA de interesse. A polimerização da fita é contínua e o equipamento consegue ler a fluorescência de cada base que é adicionada http://www.illumina.com/content/dam/illumina- marketing/documents/products/illumina_sequencing_introduction.pdf Exemplo Produção de insulina humana em bactéria Região Codante Região não-codante Extração RNA Células beta Do pâncreas Síntese de cDNA de Todo mRNA PCR do cDNA Da insulina Clonagem no vetor Sequenciamento do vetor recombinante Inserção do vetor (transformação) da bactéria Expansão do número de bactérias Produção de insulina Extração DNA humano X