Fundamentos de Engenharia Genética

2Fundamentos de engenharia genética

Índice
Introdução...................................................................................................................................................7
Enzimas de Restrição: As tesouras moleculares .........................................................................................8
DNA Recombinante....................................................................................................................................9
DNA Complementar.................................................................................................................................11
Reações de Polimerização em Cadeia (PCR).............................................................................................12
Eletroforese em Gel..................................................................................................................................14
Conclusão..................................................................................................................................................16
Bibliografia................................................................................................................................................17
Webgrafia .................................................................................................................................................17

“There are as many atoms in each molecule of
your DNA as there are stars in the typical
galaxy. This is true for dogs, and bears, and
every living thing. We are, each of us, a little
universe.”
Neil deGrasse Tyson,
astrofísico americano

Introdução
Durante 25 anos, desde a sintetização num modelo único e coerente da estrutura do DNA,
em 1953, até a conferência de 1975 que permitia aos engenheiros genéticos levar as pesquisas
ao limite, a molécula de DNA foi considerada “intocável”. A partir da década de 70 ocorreu uma
verdadeira revolução biotecnológica.
Foi possível abrir a molécula de DNA, extrair genes
e transplantá-los para outra células, multiplicar alguns
desses genes milhões e milhões de vezes e transformar
organismos noutros que não surgiram como resultado de
milhões de anos de evolução. É a engenharia genética
que, através da junção de DNA a um novo
organismo cria novas caraterísticas que não eram
encontradas naquele organismos, permitindo assim
conhecer melhor algumas doenças humanas, oferecer
produtos apelativos à indústria e libertar a agricultura das
suas dependências em relação aos adubos e pesticidas.
Parece não haver limites.
Este avanço avassalador da engenharia genética
pelo nosso quotidiano exige que se conheçam algumas
das suas sofisticadas e surpreendentes técnicas.
Se considerarmos, por exemplo, o genoma
humano com os seus 3 mil milhões de pares de bases que
constituem os cromossomas, tendo cada hélice dupla
dezenas de milhão de pares de bases, podem levantar-se
algumas questões:
Como encontrar um determinado gene?
Como separá-lo dos restantes genes?
E como juntá-lo novamente a uma nova cadeia de DNA?
Fig. 1: Molécula de DNA

Enzimas de Restrição: As tesouras moleculares
A partir da década de 1970, ficou mais fácil analisar a molécula de DNA com o isolamento
de enzimas de restrição. Estas enzimas foram dos contributos mais importantes para esta
revolução biotecnológica. Estas enzimas são endonucleases, ou seja, encontram-se no interior
das moléculas de DNA cortando-as em locais bem definidos.
As enzimas de restrição são produzidas normalmente por bactérias que possuem a
propriedade de se defender de vírus invasores (bacteriófagos). Estas substâncias “perfuram” a
molécula de DNA sempre em determinados pontos, chamados de zonas de restrição específicos
de cada enzima, levando a produção de fragmentos contendo pontas adesivas, que se podem
ligar a outras pontas de moléculas de DNA que tenham sido cortadas com a mesma enzima. As
enzimas de restrição reconhecem e atuam sobre sequências específicas de DNA, destruindo a
ligação fosfodiéster entre dois nucleótidos consecutivos ligados a determinadas bases. Os
nucleótidos entre os quais a enzima corta, ou seja, entre os quais promove a hidrólise,
encontram-se no interior das sequências de reconhecimento.
Por exemplo, a enzima Eco
RI reconhece a porção de DNA
5’GAATTC3’. Esta enzima só
cortará a molécula de DNA se
encontrar esta sequência de bases
nas duas hélices da cadeia, sempre
lidas no sentido 5’ para 3’, fazendo
um corte entre o nucleótido de
guanina e o nucleótido de adenina
em cada uma das cadeias. Cada
molécula de DNA pode ser
composta de várias repetições da
sequência 5’GAATTC3’ ao longo de
toda sua extensão, fazendo com
que a fita de DNA possa ser
fragmentada em diversos lugares,
gerando assim fragmentos de
diferentes tamanhos.
Estes fragmentos deixados como resultado da atuação das enzimas de restrição podem
ligar-se por complementaridade a outro DNA cortado pela mesma enzima. É neste processo que
atuam outras enzimas, as ligases de DNA que catalisam o processo de ligação de dois fragmentos
de DNA. Mas para transferir genes da molécula de DNA do qual foi retirado até à molécula de
DNA que os vai receber, é necessário um vetor. Existem inúmeros tipos de vetores entre os quais
os plasmídeos das bactérias, pequenas moléculas de DNA circulares que muitas bactérias
possuem, para além da molécula de DNA principal. O DNA destes plasmídeos, geralmente,
contêm genes não essenciais para a sobrevivência da bactéria, podendo assim ser retirados sem
a prejudicar e podem se reproduzir na bactéria independentemente do DNA principal.
Fig. 2: Funcionamento da enzima Eco RI

DNA Recombinante
Cada fragmento de DNA, que foi clivado e separado do resto do material genético, contém
um ou mais genes. Como cada gene codifica a formação de uma proteína, o que vai estar em
estudo é a proteína que este origina e não o gene em si.
Para estudar o gene, ou mais propriamente a proteína que este codifica, devemos
introduzi-lo no material genético de um hospedeiro para que ocorra a transcrição do gene, em
mRNA, e a sua tradução em proteína.
O hospedeiro é um organismo que se multiplica rapidamente, como por exemplo, as
bactérias. Quando as bactérias se reproduzem por bipartição, elas transmitem aos seus
descendentes o seu material genético, portanto se neste material conter o fragmento de DNA de
estudo, em pouco tempo teremos milhões de seres com o gene. Isto não acontecia se o
hospedeiro fosse um organismo que se reproduz por reprodução sexuada, já que se assim fosse
os descendentes apenas teriam 50% de possibilidade de ter o gene em estudo.
Exemplificando, um grupo de pesquisadores querem estudar um gene humano para o
qual não sabem qual a proteína que produz e quais as suas funções. Estes pesquisadores,
utilizando enzimas de restrição, dissociam, do DNA humano, o gene de interesse.
Esse fragmento de DNA que contém o gene, é multiplicado por PCR
(método de multiplicação de um determinado gene) para obtermos várias cópias do mesmo
fragmento, ou seja, da mesma informação.
A mesma
enzima que clivou o
gene do DNA humano
é utilizada para clivar o
plasmídeo bacteriano.
Como referido
anteriormente, o
fragmento de DNA, ao
ser clivado, gera
pontas adesivas que
são complementares
ao plasmídeo se este
for clivado com a
mesma enzima.
Depois do plasmídeo ser clivado, este é associado com os fragmentos de DNA (contendo
o gene) e uma enzima chamada ligase de DNA, que vai agregar os fragmentos humanos ao
plasmídeo, produzindo o chamado DNA recombinante (ou rDNA).
De seguida, o DNA recombinante é introduzido numa bactéria hospedeira. Como o
plasmídeo sofre o mesmo processo do DNA principal de transcrição e tradução, produzindo assim
Fig. 3: Representação do corte de DNA por uma enzima de restrição

proteínas, e este também se multiplica aquando da divisão celular, passa assim uma perfeita
cópia do seu DNA para cada descendente.
A bactéria hospedeira é colocada num meio nutritivo seletivo. Após muitas gerações de
bactérias, o produto da expressão dos genes, as proteínas humanas, são purificadas das bactérias
(são separadas das proteínas das bactérias).
Caso já seja conhecida a proteína produzida por um determinado gene e o objetivo é a
sua produção externa ao corpo humano, utiliza-se o mesmo processo. Mas no final, após a
purificação da proteína, esta é armazenada para depois ser usada para o seu objetivo. O rDNA é
utilizado no mundo atual na indústria alimentar, indústria farmacêutica e em muitas outras áreas.
Um dos exemplos do uso de rDNA na indústria alimentar é no fabrico de queijo. O
processo para fabricar o queijo confia geralmente numa enzima chamada coalho, que contém a
quimosina (protease). Tradicionalmente, esta substância é formada no estômago de vacas
alimentadas a leite (vacas recém-nascidas) ou extraída a partir de algumas plantas. Contudo, o
DNA recombinante da quimosina está em uso desde 1990. É geneticamente e estruturalmente
idêntico à enzima original, logo pode ser produzido em quantidades maiores e de forma mais
rentável.
Outro uso de rDNA na indústria
alimentícia é na alteração de arroz.
Existe uma variedade específica de
arroz. O arroz dourado é
geneticamente modificado com DNA
recombinante para expressar as
enzimas que promovem a biossíntese
do B-Caroteno (esta que é uma das
formas de obter, indiretamente,
vitamina A). Na atualidade isto está
ainda em processo de regulamentação
mas tem o potencial de reduzir no
mundo inteiro a deficiência desta
vitamina tão importante para a saúde
humana, já que ajuda na saúde ocular,
saúde óssea, entre outros benefícios.
Fig. 4: Arroz dourado e arroz branco

DNA Complementar
O DNA complementar ou cDNA (do inglês complementary DNA) é outro processo através
do qual se podem conseguir cópias de genes e é utilizado muitas vezes como um auxiliar da
técnica do DNA recombinante. Este é sintetizado a partir de um molde de mRNA maduro (RNA
mensageiro que já sofreu processamento, assim só contém os exões) numa reação catalisada por
duas enzimas, a transcriptase reversa e a polimerase.
O cDNA é utilizado para clonar genes de eucariontes para procariontes, isto porque os
procariontes não têm maturação do RNA logo fariam a redução de todo o DNA, o que não era o
pretendido. Por exemplo, para expressar uma determinada proteína de uma célula eucarionte
numa célula procarionte, onde geralmente não é expressa (expressão heteróloga), transfere-se
cDNA que codifica a proteína para a célula alvo, porque, caso se utilize uma porção de DNA sem
este ter sofrido processamento, a célula procarionte também iria realizar a transcrição dos
intrões naquele fragmento DNA, formando assim proteínas diferentes das pretendidas. O cDNA
também pode ser produzido por retrovírus, que o utilizam como mecanismo de infeção.
Síntese de cDNA numa célula eucariótica:
Em primeiro lugar, o DNA é transcrito em RNA pré-mensageiro pela célula. De seguida
sofre maturação onde são removidos os intrões formando assim mRNA maduro. Posteriormente,
esta molécula é colocada em
contacto com a enzima
transcriptase reversa e vários
nucleótidos. Esta enzima vai
catalisar a formação de uma
cadeia simples de DNA a
partir do mRNA formando
assim uma molécula híbrida
de mRNA e de DNA. Quando
a síntese da cadeia de DNA
se completa, o mRNA é
degradado permitindo assim
a replicação do DNA através
da enzima DNA-polimerase.
Esta técnica, conjuntamente com o DNA recombinante, permitem que se produzam
proteínas humanas em seres procariontes, estes que muitas das vezes se reproduzem através de
mitose, tendo a sua descendência o mesmo DNA que o seu. Um dos exemplos muito conhecidos
é a produção da insulina humana por bactérias onde os avanços da engenharia genética revelou-
se muito útil no prolongamento do tempo de vida e da qualidade de vida da população humana.
Outra vantagem da técnica de DNA complementar é a identificação dos intrões e dos exões no
genoma humano e a facilidade de manuseamento de DNA em trabalhos científicos, já que o DNA
é uma molécula mais estável que o RNA.
Fig. 5: Representação do uso de cDNA para a produção de uma
proteína humana

Reações de Polimerização em Cadeia (PCR)
As técnicas anteriormente apresentadas têm como objetivo a manipulação genética. As
reações de polimerização em cadeia ou PCR (do inglês Polymerase Chain Reaction) têm como
objetivo a rápida multiplicação de um determinado fragmento da molécula de DNA, que pode
ter sido obtido através de enzimas de restrição.
Esta técnica começou a ser utilizada na década de 1980, mais propriamente, a partir do
ano de 1983 quando o cientista Kary Mullis inventou este processo de fazer milhares de cópias
de uma única porção de DNA, o qual lhe valeu o nobel da química. Esta técnica é usada em tubos
de ensaio contendo o DNA que se pretende clonar, primers (segmentos de ácidos nucleicos
necessários à iniciação da replicação do DNA, também chamados de iniciadores) e a enzima
indispensável à replicação do DNA, a DNA-polimerase.
Os primers são fitas de DNA com bases complementares, isto é, que se ligam por
complementaridade ao início da sequência de DNA que se quer multiplicar. Quando uma
molécula de DNA vai ser multiplicada, ela tem de ser separada em duas cadeias complementares
entre si. Como cada cadeia irá servir de molde para a duplicação, serão precisos dois tipos de
primers diferentes.
Toda esta mistura é colocada na máquina de PCR, o termociclador, que efetua ciclos de
temperatura preestabelecidos com tempos exatos.
Na primeira etapa do ciclo, a
temperatura é elevada, por pouco
tempo, a 94ºC para que haja a
separação da dupla cadeia de DNA.
Na segunda etapa, a temperatura
desce para próximo dos 60ºC para que os
primers se emparelhem com o DNA. Os
primers irão se ligar aos terminais 3’ do DNA
permitindo assim que a DNA-polimerase
possa entrar em ação. Na última etapa do
ciclo, a temperatura é elevada a 72ºC para
que a DNA polimerase possa atuar,
sintetizando assim a nova molécula a partir
de cada uma das duas cadeias simples do
DNA a amplificar.
Fig. 6: Separação de duas cadeias de DNA
Fig. 7: Segunda e terceira etapa de PCR

De seguida, inicia-se um novo ciclo. Normalmente são realizados de 25 a 30 ciclos para
cada reação, resultando num número de cópias final do dobro do número de ciclos.
Existe ainda várias modificações da técnica original do PCR, como por exemplo:
PCR competitiva – Além do DNA que se quer ampliar, é adicionado à reação um outro segmento
de DNA, de sequência, tamanho e concentração conhecidos (DNA de controlo), cujas
extremidades são complementares aos iniciadores que irão amplificar o DNA-alvo. O resultado é
a amplificação de dois segmentos de DNA. Assim, conhecendo a quantidade final do fragmento
de controlo, por comparação à sua concentração inicial, podemos dizer a quantidade de DNA-
alvo que foi amplificado;
PCR em tempo real – Permite que a amplificação e a quantificação do DNA ocorram
simultaneamente, num sistema fechado, sendo necessário um termociclador especializado;
PCR multiplex – Mais de um segmento de DNA com interesse é amplificado numa única reação,
cada um com o seu par de iniciadores específicos;
RT-PCR – Utiliza a transcriptase reversa para converter uma amostra de RNA em cDNA antes da
etapa de amplificação por PCR.
A técnica de PCR continua a ser muito usada já que esta tem a capacidade de ampliar uma
sequência muito precisa de DNA e não é necessário isolar o DNA que se pretende amplificar
(mesmo que se encontre misturado com DNA de outras espécies), já que a especificidade da PCR
é dada pelos iniciadores. É uma técnica rápida, barata, segura e de grande utilidade.
Fig. 8: Representação gráfica da duplicação de DNA através da técnica PCR

Eletroforese em Gel
Para se poder identificar diferentes fragmentos de DNA estes terão de ser separados pelo
seu tamanho. Para a sua identificação é utilizada a eletroforese em gel. A técnica de separação
dos fragmentos de DNA mais utilizada é a eletroforese através de gel de agarose. A agarose é um
polissacarídeo (como ágar e pectina), extraída de algas marinhas e o seu gel é formado por uma
rede complexa desse polímero. O gel de agarose dissolve-se na água a ferver e gelifica quando
arrefece, tal como a gelatina de uso culinário, permitindo assim a sua modificação de forma,
dependendo do que se pretender fazer com ele.
Para se realizar uma eletroforese em gel de agarose terá de se seguir algumas etapas:
1. Terá de se preparar uma
solução de agarose, na qual a
sua concentração irá
depender do tamanho da
molécula que se pretende
visualizar, numa solução
tampão (de TAE ou de TBE).
De seguida terá de se aquecer
a solução até uma dissolução
total.
2. Esperar algum tempo para
arrefecer e colocar esta
solução no suporte de
eletroforese.
3. Colocar um pente para criar
poços numa das
extremidades do gel.
Aguardar que o gel endureça
e retirar o pente.
4. Colocar todo este conjunto na
cuba de eletroforese,
cobrindo com o tampão.
5. De seguida deverá colocar-se
as amostras de DNA, diluído,
misturado com uma solução
de azul de bromofenol e de brometo de etídio. Estas duas soluções vão permitir a fácil
identificação da posição do DNA. O azul de bromofenol tem uma carga negativa, tal como
o DNA, fazendo com que se movimente como o DNA. Já o brometo de etídio tem uma
grande afinidade com o DNA, logo irá juntar-se a esta cadeia movimentando-se com ela.
6. Ajustar a voltagem e o tempo do processo.
Fig. 9: Representação gráfica de algumas
etapas da eletroforese em gel

7. No fim do tempo determinado terá de se visualizar as bandas de DNA obtidas com o
auxílio de uma luz ultravioleta (luz UV), já que o brometo de etídio (que está intercalado
com a cadeia de DNA), quando exposto a este tipo de radiação, emite uma luz.
Os resultados observados serão bandas
de DNA a diferentes distâncias do poço
onde estavam inicialmente. Isto é
resultado da velocidade de migração de
DNA ser inversamente proporcional aos
seus pesos moleculares. As moléculas
maiores migram mais devagar já que estas
têm um maior atrito com o gel em
comparação às moléculas de tamanhos
menores que são mais ‘ágeis’.
Para a realização desta técnica é
necessário ter cuidados especiais em
relação às técnicas vistas anteriormente, já
que esta técnica exige o uso de materiais perigosos e mutagénicos (luz UV e brometo de etídio):
-O uso de luvas para manipular os géis e as soluções que contêm brometo de etídio;
-O uso de óculos e outros equipamentos de proteção ao trabalhar com a luz UV, já que esta é
mutagénica;
-Ter cuidado com a manipulação da agarose quando fundida, esta pode estar a borbulhar, logo
deve-se ter cuidado para evitar queimaduras.
Esta técnica é muito utilizada no mundo atual, quer para DNA humano quer para DNA de
outros seres vivos. Um exemplo do uso da eletroforese noutros seres vivos é na contribuição
para a identificação de um melhor tipo de sémen nos bovinos. Desde a década de 1950, esta
técnica é usada para identificar proteínas presentes no sémen de bovinos, podendo assim estes
serem qualificados segundo as suas caraterísticas. Um dos principais usos da eletroforese é a
identificação de indivíduos. Por exemplo, em testes de paternidade ou na investigação forense,
a partir de uma amostra de DNA, pode-se compara essa amostra a diversos indivíduos.
Fig. 10: Possível resultado de uma eletroforese
em gel de 9 amostras

Conclusão
A Engenharia Genética constitui um conjunto de técnicas de análise moleculares que
permitem estudos de caracterização, expressão e modificações do material genético (DNA e
RNA) dos seres vivos. Estas técnicas, foram evoluindo ao longo dos anos, fazendo com que
ficassem mais precisas, tornando assim cada vez mais fiável e seguro realizar modificações
genéticas.
A Engenharia Genética tem também sido um tema polémico. A sua prática levanta
aspetos relacionados com a ética, pois baseia-se em modificações de material genético natural
ou a sua clonagem. Existem pessoas que não concordam com este tipo de práticas, com a
justificação de serem agressões à vida, como é o caso de algumas religiões ou de movimentos
ecologistas.
A verdade é que a Engenharia Genética é usada no mundo atual, e cada vez mais, quer na
produção de vacinas ou insulina, quer na identificação de pessoas e outros seres vivos, quer na
agricultura para a produção de produtos mais rentáveis, nutritivos e de melhor qualidade ou até
na pecuária na seleção de características das raças ou na resolução de problemas relacionados
com doenças genéticas.
Fig. 11: Representação de deleção de um gene numa
molécula de DNA

Bibliografia
DIAS DA SILVA, Amparo et al. (2013) Terra, Universo de vida. Porto: Porto editora
Webgrafia
biologia12eportefolio.blogspot.pt/2011/03/fundamentos-da-engenharia-genetica_9085.html
biologia-ap.no.comunidades.net/engenharia-genetica
ciencianews.com.br/arquivos/ACET/IMAGENS/biologia_molecular/testesgeneticos.pdf
infoescola.com/bioquimica/eletroforese/
oportaldomundobiologico.blogspot.pt/2011/04/tecnica-do-dna-complementar-cdna.html
portaleducacao.com.br/biologia/artigos/23315/eletroforese-em-gel-de-agarose
pt.slideshare.net/sousamarina/relatrio-extrao-de-dna-e-eletroforese
sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/recombinante.php
stao.ca/resources/curriculum-resources/grade12support/dna.pdf

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