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Introdução a Cromatografia líquida e gasosa.ppt

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Classificação dos métodos analíticos CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS Baseados em propriedades físicas (químicas em alguns casos ) Chamados de métodos de via úmida Gravimetria Volumetria Eletroanalítico Propriedades Propriedades elétricas elétricas Espectrométrico Propriedades Propriedades ópticas ópticas Cromatográfico Propriedades Propriedades mistas* mistas* * *Separação Separação: interações físico-químicas. : interações físico-químicas. Identificação/quantificaçã Identificação/quantificação o: propriedades ópticas ou elétricas. : propriedades ópticas ou elétricas.
Histórico Histórico Cromatografia Cromatografia Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico russo: Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados. éter de petróleo CaCO3 mistura de pigmentos pigmentos separados 1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)
• Método desenvolvido por Mikhail Tswett (1903), que consistia na separação de pigmentos vegetais presentes em um extrato de plantas. A mistura apresentava uma única coloração inicial, mas quando passada por uma coluna esta se decompunha em várias cores diferentes. Histórico
Experimento de Tswett Fase Estacionária CaCO3 Fase Móvel Éter de petróleo Amostra Extrato vegetal
Experimento de Tswett
Definição - Princípio Básico Definição - Princípio Básico Cromatografia é um método físico-químico de Cromatografia é um método físico-químico de separação de misturas, identificação e separação de misturas, identificação e quantificação de seus componentes. quantificação de seus componentes. • A separação depende da interação dos componentes da mistura com a fase móvel e com a fase estacionária. • A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade. • A identificação se dá mediante a comparação da interação de padrões com as fases estacionárias. • A quantificação é feita também pela comparação com padrões de concentrações conhecidas, através de curvas analíticas. Cromatografia Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com o sistema cromatográfico De acordo com o sistema cromatográfico • Em Coluna Em Coluna • Cromatografia Líquida • Cromatografia Gasosa • Cromatografia Supercrítica • Planar Planar • Centrífuga (Chromatotron®) • Cromatografia em Camada Delgada (CCD) • Cromatografia em Papel (CP) Cromatografia Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com a fase móvel De acordo com a fase móvel • Utilização de Gás Utilização de Gás • Cromatografia Gasosa (CG) • Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) • Utilização de Líquido Utilização de Líquido • Cromatografia Líquida Clássica (CLC) • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) • Utilização de Gás Pressurizado Utilização de Gás Pressurizado • Cromatografia Supercrítica (CSC) Cromatografia Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com a Fase Estacionária De acordo com a Fase Estacionária • Líquida • Sólida • Quimicamente Ligadas • De acordo com o modo de separação De acordo com o modo de separação • Por Adsorção • Por Partição • Por Troca Iônica • Por Afinidade Cromatografia Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas Classificação das técnicas cromatográficas Cromatografia Cromatografia Técnica Técnica Planar Planar Coluna Coluna FM FM FE FE Líquido Líquido Líq Líq Sól Sól Gás Gás Líquido Líquido Líq Líq Sól Sól CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE Exclusão Exclusão Fase Fase Ligada Ligada Troca Troca Iônica Iônica Sól Sól Líq Líq Afinidade Afinidade Tipo de Tipo de cromato- cromato- grafia grafia
Analogia Analogia O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo de abelhas e moscas sobrevoando uma certa região. de abelhas e moscas sobrevoando uma certa região. Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as moscas e abelhas. moscas e abelhas. Cromatografia Cromatografia Fase estacionária Analitos
Analogia Analogia Para uma mesma mistura, a simples troca da fase Para uma mesma mistura, a simples troca da fase estacionária pode ser suficiente para alterar completamente estacionária pode ser suficiente para alterar completamente a ordem de eluição de componentes da mistura. a ordem de eluição de componentes da mistura. Cromatografia Cromatografia Fase estacionária Analitos
Cromatografia Cromatografia Princípio Básico Princípio Básico Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
Cromatografia em papel - CP Cromatografia em papel - CP A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! Fase estacionária líquida suportada na celulose. Fase móvel Separação Cromatografia Cromatografia A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos (líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom (líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela. verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.
Cromatografia em papel - CP Cromatografia em papel - CP A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! Cromatografia Cromatografia Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis.
Cromatografia de Camada Delgada - CCD Cromatografia de Camada Delgada - CCD Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica. estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica. Cromatografia Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD Cromatografia de Camada Delgada - CCD Termos e parâmetros técnicos Termos e parâmetros técnicos Cromatografia Cromatografia solvente mancha f ΔS ΔS R  s a R a f  s b R b f  s c Rc f  c b a s
Cromatografia Cromatografia Cromatografia de Camada Delgada - CCD Cromatografia de Camada Delgada - CCD FASES ESTACIONÁRIAS FASES ESTACIONÁRIAS Sílica (SiO Sílica (SiO2 2) ) Alumina (Al Alumina (Al2 2O O3 3) ) Celulose Celulose Poliamida Poliamida Ativação de 30 a 60 min Ativação de 30 a 60 min de 105 a 110 de 105 a 110 o o C C Ativação de 10 min Ativação de 10 min a 105 a 105 o o C C
Cromatografia Cromatografia Cromatografia de Camada Delgada - CCD Cromatografia de Camada Delgada - CCD ANÁLISE QUALITATIVA ANÁLISE QUALITATIVA - Comparação com valores de R Comparação com valores de Rf f tabelados tabelados - Comparação com padrão eluído em conjunto Comparação com padrão eluído em conjunto - Extração e aplicação de métodos instrumentais Extração e aplicação de métodos instrumentais
Introdução a Cromatografia líquida e gasosa.ppt
Introdução a Cromatografia líquida e gasosa.ppt
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Cromatografia Cromatografia Cromatografia de Camada Delgada - CCD Cromatografia de Camada Delgada - CCD A A B B Após Eluição Amostra não contém a espécie B Amostra não contém a espécie B Amostra pode conter a espécie A Amostra pode conter a espécie A Para se certificar da presença, Para se certificar da presença, eluir em outros solventes eluir em outros solventes Conclusões: Conclusões: Amostra
Cromatografia Cromatografia Cromatografia de Camada Delgada - CCD Cromatografia de Camada Delgada - CCD Solvente 1 Solvente 2 Cromatografia Cromatografia Bi-dimensional Bi-dimensional
Cromatografia planar Cromatografia planar Cromatografia Cromatografia Chromatotron é uma cromatografia de camada fina preparativa acelerada centrifugamente. Pode substituir pequenas colunas e HPLC.
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna PROCESSOS DE SEPARAÇÃO PROCESSOS DE SEPARAÇÃO Exclusão Exclusão Adsorção Adsorção Partição Partição Troca Iônica Troca Iônica Afinidade Afinidade
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna ADSORÇÃO ADSORÇÃO - Fase Móvel Líq. ou Gás - Fase Móvel Líq. ou Gás - Fase Estacionária Sólida - Fase Estacionária Sólida Processos de Processos de Adsorção/Dessorção Adsorção/Dessorção Ligações de hidrogênio; Forças de Van der Waals
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna Diferença entre Ab Absorção sorção e Ad Adsorção sorção
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna ADSORÇÃO ADSORÇÃO Fase Estacionária Sólida: Fase Estacionária Sólida: Polar Polar Aumento da Atividade -CO -CO2 2H > -OH > -NH H > -OH > -NH2 2 > > -SH > -CHO > -C=O > -SH > -CHO > -C=O > -CO -CO2 2R > -OCH R > -OCH3 3 > -CH=CH- > -CH=CH-
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano < Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno < Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico < Acetato de Etila < Acetona < Etanol < Metanol < Ácido Acético SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente A função das fases móveis na cromatografia por adsorção A função das fases móveis na cromatografia por adsorção tem sentido amplo: tem sentido amplo: a) Função solvente • Solubilizar os componentes • Ter baixo ponto de ebulição b) Função eluente • Conduzir os componentes da mistura pela coluna • Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna Usos: Usos: a) Laboratórios de química orgânica  separar e purificar reagentes e materiais obtidos em síntese. b) Laboratórios de produtos naturais  escala preparativa e analítica. c) Laboratórios de análises clínicas  separação de esteróides de urina ou de sangue, etc. ADSORÇÃO ADSORÇÃO
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna PARTIÇÃO PARTIÇÃO Fase Móvel Gasosa Fase Móvel Gasosa Fase Estacionária Líquida Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade Processos de Solubilidade O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua volatilidade volatilidade.
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna PARTIÇÃO PARTIÇÃO Fase Móvel Líquida Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Líquida Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade Processos de Solubilidade O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua solubilidade solubilidade.
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna TROCA IÔNICA TROCA IÔNICA Fase Móvel Líquida Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida Fase Estacionária Sólida Processos de Troca Iônica Processos de Troca Iônica Adsorção reversível e diferencial dos íons da fase móvel pelo grupo trocador da matriz Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de extraordinário valor em processos analíticos.
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna Maior Interação Maior Interação • Íons de alta carga • Íons de menor tamanho TROCA IÔNICA TROCA IÔNICA Resinas Catiônicas Resinas Catiônicas e Aniônicas e Aniônicas FE altamente carregada Fluxo da FM A diferença de afinidade entre A diferença de afinidade entre os íons da FM pode ser os íons da FM pode ser controlada por pH e força iônica controlada por pH e força iônica
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO EXCLUSÃO Fase Móvel Líquida Fase Móvel Líquida Fase Estacionária em Gel Fase Estacionária em Gel Enquanto as partículas menores penetram nas cavidades, as maiores vão sendo eluídas contornando as estruturas moleculares da FE.
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO EXCLUSÃO A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão, A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão, introduzida por volta de 1960, de outros tipos de introduzida por volta de 1960, de outros tipos de cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas, constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis. com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis. - Separação de tamanhos específicos - Separação de polímeros e proteínas - Determinação de Massa Molar
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO EXCLUSÃO Características desejáveis para os Géis -Inércia Química: Inércia Química: Não pode haver uma interação química entre a matriz e o soluto. -Estabilidade: Estabilidade: O gel deve suportar uso contínuo quanto mantido em condições brandas de temperatura e pH. -Baixo teor de íons: Baixo teor de íons: Grupos carregados interferem no processo de separação.
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO EXCLUSÃO Tipos de Géis Dextrano (Sephadex) Poliacrilamida Ágar e Agarose Fluxo da FM
Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna Fase Móvel Líquida Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida Fase Estacionária Sólida Propriedades Biológicas e Funcionais AFINIDADE AFINIDADE
Cromatografia Cromatografia Teoria Básica Teoria Básica SOLUTO SOLUTO FASE FASE ESTACIONÁRIA ESTACIONÁRIA FASE FASE MÓVEL MÓVEL ⇌ ⇌ ⇌ Sem Sem importância importância na CG, mas na CG, mas com grande com grande importância importância na CLAE na CLAE
Teoria Básica Teoria Básica Cromatografia Cromatografia Coluna cromatográfica Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase móvel:    FM FE C A A K  KC = Constante de Distribuição [A]FE = concentração do analito na FE [A]FM = concentração do analito na FM Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito sorvido na FE e dissolvido na FM. MENOR RETENÇÃO !!! MENOR RETENÇÃO !!! Volatilidade [A]FM Afinidade pela FE [A]FE No caso da CL, é a solubilidade na FM
Quantificação da eficiência Quantificação da eficiência Cromatografia Cromatografia Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM: Cada “estágio” de equilíbrio é chamado de PRATO TEÓRICO O número de pratos teóricos de uma coluna (N) pode ser calculado por: Coluna mais eficiente tR wb N
Quantificação da eficiência Quantificação da eficiência Cromatografia Cromatografia ALTURA EQUIVALENTE A UM ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO PRATO TEÓRICO (H) (H) “Tamanho” de cada estágio de equilíbrio Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes (L = comprimento da coluna) Valores típicos de H e N: dC df H N 0,10 0,25 0,081 370370 0,25 0,25 0,156 192308 0,32 0,32 0,200 150000 0,32 0,50 0,228 131579 0,32 1,00 0,294 102041 0,32 5,00 0,435 68966 0,53 1,00 0,426 70423 0,53 5,00 0,683 43924 2,16 10% 0,549 3643 2,16 5% 0,500 4000 Capilares, L = 30 m Empacotadas, L = 2 m d dc c = diâmetro da coluna em mm = diâmetro da coluna em mm d df f = espessura da fase estacionária em = espessura da fase estacionária em  m m
Cromatografia em fase gasosa Cromatografia em fase gasosa Fase estacionária Fase móvel Separação Cromatografia Cromatografia Detecção
Cromatografia em fase gasosa Cromatografia em fase gasosa Cromatografia Cromatografia Coluna: contendo a fase estacionária está submetida à temperaturas controladas Fase móvel: gás inerte Detector: submetido à temperatura controlada Injetor: submetido à temperatura controlada
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Aplicabilidade Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CG ? Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS VOLÁTEIS para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás. DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300 constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300o o C e que C e que sejam termicamente estáveis. sejam termicamente estáveis. pressão de vapor < 60 torr (0,079atm)
Requisitos - Gás de arraste (FM) Requisitos - Gás de arraste (FM) INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem com a fase estacionária ou superfícies do instrumento. PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. Impurezas típicas em gases e seus efeitos: oxida / hidrolisa algumas FE incompatíveis com DCE H2O, O2 hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa
Requisitos - Gás de arraste (FM) Requisitos - Gás de arraste (FM) CUSTO: Gases de altíssima pureza podem ser muito caros. COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento. Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector: He , H2 DCT DIC N2 , H2 DCE He, N2 (SS), P-5 ou P-10 (P-5 = Argônio + 5% CH4) CUSTO PUREZA A B C A = 99,995 % (4.5) B = 99,999 % (5.0) C = 99,9999 % (6.0) Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa
Injetor Injetor Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica Injeção instantânea: Injeção lenta: t = 0 t = x t = 0 t = x Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa
Injetor “on column” Injetor “on column” 1 2 3 4 1 - Septo (silicone) 2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa
Injetor “on column” Injetor “on column” 1 2 3 1 - Ponta da agulha da microsseringa é introduzida no início da coluna. 2 - Amostra injetada e vaporizada instantaneamente no início da coluna. 3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa
Parâmetros de injeção Parâmetros de injeção Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição. Regra Geral Regra Geral: Tinj = 50o C acima acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil. VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra. COLUNA Amostras Gasosas Amostras Líquidas empacotada  = 3,2 mm (1 /4”) 0,1 mL ... 50 mL 0,2 L ... 20 L capilar  = 0,25 mm 1 L ... 100 L 0,01 L ... 3 L Sólidos Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L êmbolo corpo (pirex) agulha (inox 316) Microsseringa de 10  L: Microsseringa de 1  L (seção ampliada): corpo guia êmbolo (fio de aço soldado ao guia) agulha Microsseringas para injeção Microsseringas para injeção
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Colunas Colunas EMPACOTADA  = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m Recheada com sólido pulverizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio) CAPILAR  = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de m) de FE líquida ou sólida
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna Temperatura da coluna Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0 ). p0 = f Estrutura química do analito Temperatura da coluna Temperatura da coluna Pressão de vapor Velocidade de migração ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃO MENOR RETENÇÃO)
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna Temperatura da coluna AUMENTO DA TEMPERATURA DA COLUNA CONTROLE CONFIÁVEL CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG SEPARAÇÃO EM CG
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura Programação linear de temperatura Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE: TCOL BAIXA: - Componentes mais voláteis são separados - Componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos TCOL ALTA: - Componentes mais voláteis não são separados - Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura Programação linear de temperatura A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação: : Consegue-se boa Consegue-se boa separação dos separação dos componentes da componentes da amostra em menor amostra em menor tempo tempo TEMPO TEMPERATURA tINI tFIM TINI TFIM R TINI - Temperatura Inicial TFIM - Temperatura Final tINI - Tempo Isotérmico Inicial tFIM - Tempo Final do Programa R - Velocidade de Aquecimento
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Programação linear de Programação linear de temperatura temperatura a) Isotérmico a 45 ºC; b) isotérmico a 145 °C; c) programado de 30 ºC a 180 ºC
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura Programação linear de temperatura VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE: A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura. viscosidad e vazão DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE: Devido ao aumento de volatilização de FE líquida Possíveis problemas associados à PLT: Possíveis problemas associados à PLT:
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Fase Estacionária Fase Estacionária REGRA GERAL REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível : a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...) próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...) FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra. FE Seletiva: separação adequada dos constituintes da amostra FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com coluna de boa eficiência
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Fase estacionária sólida Fase estacionária sólida • O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO ADSORÇÃO A adsorção ocorre na A adsorção ocorre na interface entre o gás de interface entre o gás de arraste e a FE sólida arraste e a FE sólida • Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros) • Solutos polares • Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de elétrons...) ADSORÇÃO
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Fase estacionária líquida Fase estacionária líquida • O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃO ABSORÇÃO A absorção ocorre no interior A absorção ocorre no interior do filme de FE líquida do filme de FE líquida (fenômeno INTRAfacial) (fenômeno INTRAfacial) • Filmes espessos de FE líquida • Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste • Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade) ABSORÇÃO
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Fase estacionária quirais Fase estacionária quirais • As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são MUITO SIMILARES  FE convencionais não interagem FE convencionais não interagem diferencialmente com os isômeros óticos diferencialmente com os isômeros óticos. FÁRMACOS - Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica. PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção entre produtos de origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Detectores Detectores Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste. quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste. Características ideais Características ideais: 1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. 2.Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza. 4.Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 400 ºC. 5.Tempo de resposta curto e independente da vazão. 6.Alta confiabilidade e facilidade de uso. 7.Similaridade de resposta para todos os solutos. 8.Não destrutivo.
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Detectores Detectores Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma. REGISTRO DE SINAL ANALÓGICO Registradores XY DIGITAL Integradores Computadores
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Detectores Detectores UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluída. SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química. ESPECÍFICOS: Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas DCT DCE DNP
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Detectores - Funcionamento Detectores - Funcionamento DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos. DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste. DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar. DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação do DIC. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por uma superfície de silicato de rubídio onde se formam íons de moléculas com N e P.
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Detectores – Limites de detecção Detectores – Limites de detecção DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Seletivo Seletivo. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0,01 a 1 pg com linearidade até ng. (104) DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Universal Universal. Observa-se para qualquer substância eluída. Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de g (104 ). DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Quase-universal Quase-universal. Detecta qualquer substância que contenha ligações C-H. Não responde a gases nobres, H2, O2, N2, CX4, SiX4 (X=halogênio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2, NH3. Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (107 – 108 ). DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): Específico Específico. Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg (P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. (103 - 105 )
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Detectores – Espectrometria de massas Detectores – Espectrometria de massas CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico Universal / Seletivo / Específico. Um dos detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa. É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de determinada razão m/z. Detecção Detecção TIC Universal Universal Similar a DCT Similar a DCT SIM Seletivo Seletivo Maior Sensibilidade Maior Sensibilidade
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico Universal / Seletivo / Específico. TEMPO CONTAGENS MASSA / CARGA CONTAGENS Cromatograma de íons totais: TIM ou TIC TIM ou TIC Em cada posição do cromatograma tem-se um espectro de massa. Detectores – Espectrometria de massas Detectores – Espectrometria de massas
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico Universal / Seletivo / Específico. TEMPO CONTAGENS Cromatograma de íons selecionados: SIM SIM Em cada posição do cromatograma tem-se o sinal somente da m/z selecionada. MASSA / CARGA CONTAGENS Oferece a vantagem Oferece a vantagem de registrar de registrar somente o sinal do somente o sinal do constituinte de constituinte de interesse, sendo interesse, sendo “cego” para os “cego” para os demais demais. Detectores – Espectrometria de massas Detectores – Espectrometria de massas
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM Interface CG-EM. CG EM Vácuo Separador Molecular O gás de arraste leve (He) difunde mais rapidamente que o analito e tende a ser drenado para o vácuo. Câmara de Ionização Coluna Capilar Interface Capilar Direta Com colunas capilares a vazão baixa de gás de arraste pode ser drenada pelo sistema de vácuo. Detectores – Espectrometria de massas Detectores – Espectrometria de massas
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Análise qualitativa Análise qualitativa tR tM tR’ = tR - tM TEMPO SINAL O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’: tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico) tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna) tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE)
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Análise qualitativa Análise qualitativa Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 m Detector FID: 250 ºC Injetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC Volume injetado: 1 L Como se explica esta ordem de eluição? Mistura de benzeno, n-propanona, Mistura de benzeno, n-propanona, n-propanol, n-butanol, isobutanol e n-propanol, n-butanol, isobutanol e n-pentanol. n-pentanol. 1. A n-propanona elui primeiro devido à sua maior volatilidade. 2. O benzeno em segundo devido sua natureza apolar (menor ) e maior volatilidade que os demais. 3. Para os demais compostos, cujas diferenças de polaridade não são elevadas, a volatilidade se torna o principal parâmetro que define a ordem de eluição.
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Análise quantitativa Análise quantitativa TEMPO SINAL O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é: • Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois a banda necessita ser perfeitamente simétrica. • Área da banda cromatográfica. Altura Altura Área Área
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Análise quantitativa Análise quantitativa tempo tempo Concentração Concentração Área Área amostra amostra
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Análise quantitativa Análise quantitativa MASSA ÁREA A partir de certo ponto o sinal não aumenta mais linearmente O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razão (Área / Massa) diverge em mais de 5 % da inclinação da reta na região linear: MASSA ÁREA / MASSA 0,95 S 1,05 S
Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa tempo tempo amostra amostra Concentração Adicionada Concentração Adicionada Área Área concentração concentração na amostra na amostra Análise quantitativa Análise quantitativa
Cromatografia em fase líquida Cromatografia em fase líquida Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida
Cromatografia Líquida - CLAE Cromatografia Líquida - CLAE Aplicabilidade Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CLAE ? Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4.000.000. de 32 até 4.000.000. para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido. DE FORMA GERAL: CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam solúveis na FM. constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica volatilidade ou de estabilidade térmica. .
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Tipos e Tipos e Aplicações da Aplicações da Cromatografia Cromatografia Líquida Líquida Insolúvel em água Solúvel em água Aumento de polaridade Aumento de polaridade Polar não iônico Apolar Iônico Massa molecular 102 103 104 105 106 Troca iônica Partição Partição Partição em fase em fase reversa reversa Partição Partição em fase em fase normal normal Exclusão Permeação Permeação em gel em gel Filtração Filtração em gel em gel Adsorção
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Componentes típicos - CLAE Componentes típicos - CLAE
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Requisitos dos sistemas de bombeamento Requisitos dos sistemas de bombeamento 1 – Geração de pressões até 6.000 psi 2 – Saída com ausência de pulsos 3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min 4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de 0,5% ou melhor 5 – Componentes resistentes à corrosão Bomba recíproca Bomba recíproca (também são chamadas de bombas de pistão ou de diafragma)
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Suportam pressões de até 7.000 psi Volumes típicos: 5 a 500 L Microamostragem: 0,5 a 5 L Sistemas de injeção de amostras Sistemas de injeção de amostras
• Eluição isocrática: Eluição isocrática: • Quando a separação é feita utilizando um único solvente de composição constante. • Eluição com gradiente Eluição com gradiente: • São utilizados dois ou três sistemas de solventes que diferem bastante entre si em polaridade. • Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é variada de modo programado, de forma contínua ou em passos. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida A eluição com gradiente produz efeitos similares aos A eluição com gradiente produz efeitos similares aos produzidos pela programação de temperatura na CG. produzidos pela programação de temperatura na CG. Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a polaridade requerida na separação. polaridade requerida na separação. Fase móvel para CLAE Fase móvel para CLAE
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Eluição com gradiente Eluição com gradiente Coluna C18, 5 m, fase reversa Detector fluorescência: excit. 334 nm – emis. 425 nm
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Colunas para CLAE Colunas para CLAE As colunas geralmente são construídas de aço inox, embora tubos de vidro com paredes resistentes sejam encontrados ocasionalmente. No entanto, estes últimos são restritos a pressões mais baixas do que 600 psi. Existem comercialmente centenas de colunas empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Colunas para CLAE Colunas para CLAE Pré-coluna •Remoção de material particulado •Contaminantes do solvente •Contaminantes da amostra •Saturar a FM com a FE Aumenta a vida útil da coluna Aumenta a vida útil da coluna COLUNAS TÍPICAS COLUNAS TÍPICAS •Material Material: aço inox •Comprimento Comprimento: 10 a 30 cm •Diâmetro Diâmetro: 4 a 10 mm •FE FE: Partículas de 5 a 10 m •Eficiência Eficiência: 40 mil a 60 mil pratos/metro
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Separação isocrática de alta velocidade Separação isocrática de alta velocidade 1– p-xileno 1– p-xileno 2- anisol 2- anisol 3- acetato de benzila 3- acetato de benzila 4- dioctil-ftalato 4- dioctil-ftalato 5- dipentil-ftalato 5- dipentil-ftalato 6- dibutil-ftalato 6- dibutil-ftalato 7- dipropil-ftalato 7- dipropil-ftalato 8- dietil-ftalato 8- dietil-ftalato - 4 cm de comprimento - 0,4 cm d.i. - FE: spherisorb 3 m Coluna de alta velocidade e alta eficiência FM: 4,1% EtAc em n-Hexano 100.000 pratos/metro
• Pelicular: Pelicular: • Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 m, recoberto com uma camada fina e porosa de: • Sílica • Alumina • Resina de poliestireno-divinil-benzeno • Resina trocadora de íons • Partícula porosa Partícula porosa: • Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10 m. As partículas são constituídas dos mesmos As partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular materiais do recobrimento pelicular. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Basicamente são dois tipos de FE: Basicamente são dois tipos de FE: Fase estacionária para CLAE Fase estacionária para CLAE
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Detectores Detectores As características desejáveis para os detectores As características desejáveis para os detectores para CLAE não são diferentes daquelas para CG. para CLAE não são diferentes daquelas para CG. Existem dois tipos de detectores: Existem dois tipos de detectores: • Propriedades universais Propriedades universais (índice de refração, densidade ou constante dielétrica). • Propriedades do soluto Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc). Características ideais Características ideais: 1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. 2.Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza. 4.Tempo de resposta curto e independente da vazão. 5.Alta confiabilidade e facilidade de uso. 6.Similaridade de resposta para todos os solutos. 7.Não destrutivo. 8.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Detectores Detectores • Absorbância Absorbância • UV/Vis – Sens.: 10-9 g/mL – FL: 105 • IV • Fluorescência Fluorescência – – S: 10 S: 10-9 -9 a 10 a 10-12 -12 g/mL – FL: 10 g/mL – FL: 103 3 • Índice de refração Índice de refração (universal) (universal) – – Sens.: 10 Sens.: 10-7 -7 g/mL – Faixa Linear: 10 g/mL – Faixa Linear: 104 4
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Detectores Detectores • Eletroquímicos Eletroquímicos: : existem vários tipos disponíveis atualmente. Embora não sejam tão explorados quanto os detectores ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade. • Amperométricos • Coulométricos • Condutométricos – S: 10 Condutométricos – S: 10-8 -8 g/mL – FL: 10 g/mL – FL: 104 4 • Polarográficos – S: 10 Polarográficos – S: 10-12 -12 g/mL – FL: 10 g/mL – FL: 106 6
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Detectores Detectores • Espectrometria de massa Espectrometria de massa - universal - universal • Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa potencializa a técnica de separação e quantificação • Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM. Interface CL-EM
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Detectores Detectores • Espectrometria de massa Espectrometria de massa TEMPO CONTAGENS MASSA / CARGA CONTAGENS TEMPO CONTAGENS MASSA / CARGA CONTAGENS TIC TIC SIM SIM
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Tipos de CLAE Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como um gás ideal e não contribui para o processo de um gás ideal e não contribui para o processo de separação, a FM líquida da CLAE interage tanto separação, a FM líquida da CLAE interage tanto quanto a FE com os componentes da amostra. quanto a FE com os componentes da amostra. Isto torna o desenvolvimento dos métodos em Isto torna o desenvolvimento dos métodos em CLAE um tanto mais complexo que na CG. CLAE um tanto mais complexo que na CG.
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Tipos de CLAE • PARTIÇÃO PARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do suporte do empacotamento  Adsorção e ligação química Adsorção e ligação química. Dois tipos de eluição podem ser distinguidos: Fase normal Fase normal (FN) e Fase reversa (FR) (FN) e Fase reversa (FR). Observação Observação: FN e FR são artificiais, pois são designações históricas, já que a FM apolar e FE polar por terem sido as primeiras utilizadas foram chamadas de fase normal.
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Tipos de CLAE Fase normal Fase normal: : FE de natureza fortemente polar (ex. água) FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico) O componente menos polar é eluído primeiro por ser o mais solúvel na fase móvel. O aumento aumento da polaridade da FM diminui diminui o tempo de eluição. Fase reversa Fase reversa: : FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos) FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila) O componente mais polar aparece primeiro e a diminuição diminuição da polaridade da FM diminui diminui o tempo de eluição. Baixa polaridade FM Média polaridade FM Alta polaridade FM Média polaridade FM
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Tipos de CLAE • É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses recobrimentos é uma cadeia C recobrimentos é uma cadeia C8 8 (n-octil) ou C (n-octil) ou C18 18 (n-octadecil) (n-octadecil)
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Tipos de CLAE Campo Misturas típicas Farmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides, analgésicos Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios Produtos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Produtos químicos Aromáticos condensados, surfactantes, propelentes, corantes industriais Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas policloradas) Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue, narcóticos Clínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas, extratos de urina, estrógenos
Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Tipos de CLAE • ADSORÇÃO ADSORÇÃO: líquido-sólido. FE sílica ou alumina FE sílica ou alumina. É a forma clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de HPLC. • TROCA IÔNICA TROCA IÔNICA: líquido-sólido. FE resina com capacidade FE resina com capacidade de troca iônica de troca iônica. • EXCLUSÃO EXCLUSÃO: líquido-gel. FE gel FE gel. Um material polimérico, hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas, são capazes de promover a separação de acordo com os tamanhos das moléculas  EXCLUSÃO DE TAMANHO EXCLUSÃO DE TAMANHO. Se o material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONS EXCLUSÃO DE ÍONS.
Para refletir e responder: Para refletir e responder: Duas substâncias diferentes com a mesma concentração apresentarão a mesma área sob suas bandas cromatográficas? Cromatografia Cromatografia Para um mesmo analito, a área ou altura aumentam com o aumento da concentração. A área sob a banda cromatográfica de duas substâncias diferentes dependerá da resposta do detector para aquele tipo de substância, independentemente do tipo de detector utilizado.
Para refletir e responder: Para refletir e responder: A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de analito? A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são os casos em que isto ocorre? Cromatografia Cromatografia
F I M F I M

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  • 2. Classificação dos métodos analíticos CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS Baseados em propriedades físicas (químicas em alguns casos ) Chamados de métodos de via úmida Gravimetria Volumetria Eletroanalítico Propriedades Propriedades elétricas elétricas Espectrométrico Propriedades Propriedades ópticas ópticas Cromatográfico Propriedades Propriedades mistas* mistas* * *Separação Separação: interações físico-químicas. : interações físico-químicas. Identificação/quantificaçã Identificação/quantificação o: propriedades ópticas ou elétricas. : propriedades ópticas ou elétricas.
  • 3. Histórico Histórico Cromatografia Cromatografia Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico russo: Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados. éter de petróleo CaCO3 mistura de pigmentos pigmentos separados 1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)
  • 4. • Método desenvolvido por Mikhail Tswett (1903), que consistia na separação de pigmentos vegetais presentes em um extrato de plantas. A mistura apresentava uma única coloração inicial, mas quando passada por uma coluna esta se decompunha em várias cores diferentes. Histórico
  • 5. Experimento de Tswett Fase Estacionária CaCO3 Fase Móvel Éter de petróleo Amostra Extrato vegetal
  • 7. Definição - Princípio Básico Definição - Princípio Básico Cromatografia é um método físico-químico de Cromatografia é um método físico-químico de separação de misturas, identificação e separação de misturas, identificação e quantificação de seus componentes. quantificação de seus componentes. • A separação depende da interação dos componentes da mistura com a fase móvel e com a fase estacionária. • A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade. • A identificação se dá mediante a comparação da interação de padrões com as fases estacionárias. • A quantificação é feita também pela comparação com padrões de concentrações conhecidas, através de curvas analíticas. Cromatografia Cromatografia
  • 8. Classificação das técnicas cromatográficas Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com o sistema cromatográfico De acordo com o sistema cromatográfico • Em Coluna Em Coluna • Cromatografia Líquida • Cromatografia Gasosa • Cromatografia Supercrítica • Planar Planar • Centrífuga (Chromatotron®) • Cromatografia em Camada Delgada (CCD) • Cromatografia em Papel (CP) Cromatografia Cromatografia
  • 9. Classificação das técnicas cromatográficas Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com a fase móvel De acordo com a fase móvel • Utilização de Gás Utilização de Gás • Cromatografia Gasosa (CG) • Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) • Utilização de Líquido Utilização de Líquido • Cromatografia Líquida Clássica (CLC) • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) • Utilização de Gás Pressurizado Utilização de Gás Pressurizado • Cromatografia Supercrítica (CSC) Cromatografia Cromatografia
  • 10. Classificação das técnicas cromatográficas Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com a Fase Estacionária De acordo com a Fase Estacionária • Líquida • Sólida • Quimicamente Ligadas • De acordo com o modo de separação De acordo com o modo de separação • Por Adsorção • Por Partição • Por Troca Iônica • Por Afinidade Cromatografia Cromatografia
  • 11. Classificação das técnicas cromatográficas Classificação das técnicas cromatográficas Cromatografia Cromatografia Técnica Técnica Planar Planar Coluna Coluna FM FM FE FE Líquido Líquido Líq Líq Sól Sól Gás Gás Líquido Líquido Líq Líq Sól Sól CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE Exclusão Exclusão Fase Fase Ligada Ligada Troca Troca Iônica Iônica Sól Sól Líq Líq Afinidade Afinidade Tipo de Tipo de cromato- cromato- grafia grafia
  • 12. Analogia Analogia O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo de abelhas e moscas sobrevoando uma certa região. de abelhas e moscas sobrevoando uma certa região. Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as moscas e abelhas. moscas e abelhas. Cromatografia Cromatografia Fase estacionária Analitos
  • 13. Analogia Analogia Para uma mesma mistura, a simples troca da fase Para uma mesma mistura, a simples troca da fase estacionária pode ser suficiente para alterar completamente estacionária pode ser suficiente para alterar completamente a ordem de eluição de componentes da mistura. a ordem de eluição de componentes da mistura. Cromatografia Cromatografia Fase estacionária Analitos
  • 14. Cromatografia Cromatografia Princípio Básico Princípio Básico Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
  • 15. Cromatografia em papel - CP Cromatografia em papel - CP A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! Fase estacionária líquida suportada na celulose. Fase móvel Separação Cromatografia Cromatografia A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos (líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom (líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela. verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.
  • 16. Cromatografia em papel - CP Cromatografia em papel - CP A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! Cromatografia Cromatografia Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis.
  • 17. Cromatografia de Camada Delgada - CCD Cromatografia de Camada Delgada - CCD Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica. estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica. Cromatografia Cromatografia
  • 18. Cromatografia de Camada Delgada - CCD Cromatografia de Camada Delgada - CCD Termos e parâmetros técnicos Termos e parâmetros técnicos Cromatografia Cromatografia solvente mancha f ΔS ΔS R  s a R a f  s b R b f  s c Rc f  c b a s
  • 19. Cromatografia Cromatografia Cromatografia de Camada Delgada - CCD Cromatografia de Camada Delgada - CCD FASES ESTACIONÁRIAS FASES ESTACIONÁRIAS Sílica (SiO Sílica (SiO2 2) ) Alumina (Al Alumina (Al2 2O O3 3) ) Celulose Celulose Poliamida Poliamida Ativação de 30 a 60 min Ativação de 30 a 60 min de 105 a 110 de 105 a 110 o o C C Ativação de 10 min Ativação de 10 min a 105 a 105 o o C C
  • 20. Cromatografia Cromatografia Cromatografia de Camada Delgada - CCD Cromatografia de Camada Delgada - CCD ANÁLISE QUALITATIVA ANÁLISE QUALITATIVA - Comparação com valores de R Comparação com valores de Rf f tabelados tabelados - Comparação com padrão eluído em conjunto Comparação com padrão eluído em conjunto - Extração e aplicação de métodos instrumentais Extração e aplicação de métodos instrumentais
  • 24. Cromatografia Cromatografia Cromatografia de Camada Delgada - CCD Cromatografia de Camada Delgada - CCD A A B B Após Eluição Amostra não contém a espécie B Amostra não contém a espécie B Amostra pode conter a espécie A Amostra pode conter a espécie A Para se certificar da presença, Para se certificar da presença, eluir em outros solventes eluir em outros solventes Conclusões: Conclusões: Amostra
  • 25. Cromatografia Cromatografia Cromatografia de Camada Delgada - CCD Cromatografia de Camada Delgada - CCD Solvente 1 Solvente 2 Cromatografia Cromatografia Bi-dimensional Bi-dimensional
  • 26. Cromatografia planar Cromatografia planar Cromatografia Cromatografia Chromatotron é uma cromatografia de camada fina preparativa acelerada centrifugamente. Pode substituir pequenas colunas e HPLC.
  • 28. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna PROCESSOS DE SEPARAÇÃO PROCESSOS DE SEPARAÇÃO Exclusão Exclusão Adsorção Adsorção Partição Partição Troca Iônica Troca Iônica Afinidade Afinidade
  • 29. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna ADSORÇÃO ADSORÇÃO - Fase Móvel Líq. ou Gás - Fase Móvel Líq. ou Gás - Fase Estacionária Sólida - Fase Estacionária Sólida Processos de Processos de Adsorção/Dessorção Adsorção/Dessorção Ligações de hidrogênio; Forças de Van der Waals
  • 30. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna Diferença entre Ab Absorção sorção e Ad Adsorção sorção
  • 31. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna ADSORÇÃO ADSORÇÃO Fase Estacionária Sólida: Fase Estacionária Sólida: Polar Polar Aumento da Atividade -CO -CO2 2H > -OH > -NH H > -OH > -NH2 2 > > -SH > -CHO > -C=O > -SH > -CHO > -C=O > -CO -CO2 2R > -OCH R > -OCH3 3 > -CH=CH- > -CH=CH-
  • 32. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano < Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno < Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico < Acetato de Etila < Acetona < Etanol < Metanol < Ácido Acético SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente A função das fases móveis na cromatografia por adsorção A função das fases móveis na cromatografia por adsorção tem sentido amplo: tem sentido amplo: a) Função solvente • Solubilizar os componentes • Ter baixo ponto de ebulição b) Função eluente • Conduzir os componentes da mistura pela coluna • Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)
  • 33. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna Usos: Usos: a) Laboratórios de química orgânica  separar e purificar reagentes e materiais obtidos em síntese. b) Laboratórios de produtos naturais  escala preparativa e analítica. c) Laboratórios de análises clínicas  separação de esteróides de urina ou de sangue, etc. ADSORÇÃO ADSORÇÃO
  • 34. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna PARTIÇÃO PARTIÇÃO Fase Móvel Gasosa Fase Móvel Gasosa Fase Estacionária Líquida Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade Processos de Solubilidade O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua volatilidade volatilidade.
  • 35. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna PARTIÇÃO PARTIÇÃO Fase Móvel Líquida Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Líquida Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade Processos de Solubilidade O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua solubilidade solubilidade.
  • 36. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna TROCA IÔNICA TROCA IÔNICA Fase Móvel Líquida Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida Fase Estacionária Sólida Processos de Troca Iônica Processos de Troca Iônica Adsorção reversível e diferencial dos íons da fase móvel pelo grupo trocador da matriz Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de extraordinário valor em processos analíticos.
  • 37. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna Maior Interação Maior Interação • Íons de alta carga • Íons de menor tamanho TROCA IÔNICA TROCA IÔNICA Resinas Catiônicas Resinas Catiônicas e Aniônicas e Aniônicas FE altamente carregada Fluxo da FM A diferença de afinidade entre A diferença de afinidade entre os íons da FM pode ser os íons da FM pode ser controlada por pH e força iônica controlada por pH e força iônica
  • 38. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas
  • 39. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO EXCLUSÃO Fase Móvel Líquida Fase Móvel Líquida Fase Estacionária em Gel Fase Estacionária em Gel Enquanto as partículas menores penetram nas cavidades, as maiores vão sendo eluídas contornando as estruturas moleculares da FE.
  • 40. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO EXCLUSÃO A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão, A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão, introduzida por volta de 1960, de outros tipos de introduzida por volta de 1960, de outros tipos de cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas, constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis. com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis. - Separação de tamanhos específicos - Separação de polímeros e proteínas - Determinação de Massa Molar
  • 41. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO EXCLUSÃO Características desejáveis para os Géis -Inércia Química: Inércia Química: Não pode haver uma interação química entre a matriz e o soluto. -Estabilidade: Estabilidade: O gel deve suportar uso contínuo quanto mantido em condições brandas de temperatura e pH. -Baixo teor de íons: Baixo teor de íons: Grupos carregados interferem no processo de separação.
  • 42. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO EXCLUSÃO Tipos de Géis Dextrano (Sephadex) Poliacrilamida Ágar e Agarose Fluxo da FM
  • 43. Cromatografia Cromatografia Cromatografia em Coluna Cromatografia em Coluna Fase Móvel Líquida Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida Fase Estacionária Sólida Propriedades Biológicas e Funcionais AFINIDADE AFINIDADE
  • 45. Teoria Básica Teoria Básica Cromatografia Cromatografia Coluna cromatográfica Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase móvel:    FM FE C A A K  KC = Constante de Distribuição [A]FE = concentração do analito na FE [A]FM = concentração do analito na FM Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito sorvido na FE e dissolvido na FM. MENOR RETENÇÃO !!! MENOR RETENÇÃO !!! Volatilidade [A]FM Afinidade pela FE [A]FE No caso da CL, é a solubilidade na FM
  • 46. Quantificação da eficiência Quantificação da eficiência Cromatografia Cromatografia Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM: Cada “estágio” de equilíbrio é chamado de PRATO TEÓRICO O número de pratos teóricos de uma coluna (N) pode ser calculado por: Coluna mais eficiente tR wb N
  • 47. Quantificação da eficiência Quantificação da eficiência Cromatografia Cromatografia ALTURA EQUIVALENTE A UM ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO PRATO TEÓRICO (H) (H) “Tamanho” de cada estágio de equilíbrio Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes (L = comprimento da coluna) Valores típicos de H e N: dC df H N 0,10 0,25 0,081 370370 0,25 0,25 0,156 192308 0,32 0,32 0,200 150000 0,32 0,50 0,228 131579 0,32 1,00 0,294 102041 0,32 5,00 0,435 68966 0,53 1,00 0,426 70423 0,53 5,00 0,683 43924 2,16 10% 0,549 3643 2,16 5% 0,500 4000 Capilares, L = 30 m Empacotadas, L = 2 m d dc c = diâmetro da coluna em mm = diâmetro da coluna em mm d df f = espessura da fase estacionária em = espessura da fase estacionária em  m m
  • 48. Cromatografia em fase gasosa Cromatografia em fase gasosa Fase estacionária Fase móvel Separação Cromatografia Cromatografia Detecção
  • 49. Cromatografia em fase gasosa Cromatografia em fase gasosa Cromatografia Cromatografia Coluna: contendo a fase estacionária está submetida à temperaturas controladas Fase móvel: gás inerte Detector: submetido à temperatura controlada Injetor: submetido à temperatura controlada
  • 50. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Aplicabilidade Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CG ? Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS VOLÁTEIS para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás. DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300 constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300o o C e que C e que sejam termicamente estáveis. sejam termicamente estáveis. pressão de vapor < 60 torr (0,079atm)
  • 51. Requisitos - Gás de arraste (FM) Requisitos - Gás de arraste (FM) INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem com a fase estacionária ou superfícies do instrumento. PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. Impurezas típicas em gases e seus efeitos: oxida / hidrolisa algumas FE incompatíveis com DCE H2O, O2 hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa
  • 52. Requisitos - Gás de arraste (FM) Requisitos - Gás de arraste (FM) CUSTO: Gases de altíssima pureza podem ser muito caros. COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento. Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector: He , H2 DCT DIC N2 , H2 DCE He, N2 (SS), P-5 ou P-10 (P-5 = Argônio + 5% CH4) CUSTO PUREZA A B C A = 99,995 % (4.5) B = 99,999 % (5.0) C = 99,9999 % (6.0) Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa
  • 53. Injetor Injetor Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica Injeção instantânea: Injeção lenta: t = 0 t = x t = 0 t = x Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa
  • 54. Injetor “on column” Injetor “on column” 1 2 3 4 1 - Septo (silicone) 2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa
  • 55. Injetor “on column” Injetor “on column” 1 2 3 1 - Ponta da agulha da microsseringa é introduzida no início da coluna. 2 - Amostra injetada e vaporizada instantaneamente no início da coluna. 3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa
  • 56. Parâmetros de injeção Parâmetros de injeção Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição. Regra Geral Regra Geral: Tinj = 50o C acima acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil. VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra. COLUNA Amostras Gasosas Amostras Líquidas empacotada  = 3,2 mm (1 /4”) 0,1 mL ... 50 mL 0,2 L ... 20 L capilar  = 0,25 mm 1 L ... 100 L 0,01 L ... 3 L Sólidos Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução
  • 57. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L êmbolo corpo (pirex) agulha (inox 316) Microsseringa de 10  L: Microsseringa de 1  L (seção ampliada): corpo guia êmbolo (fio de aço soldado ao guia) agulha Microsseringas para injeção Microsseringas para injeção
  • 58. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Colunas Colunas EMPACOTADA  = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m Recheada com sólido pulverizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio) CAPILAR  = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de m) de FE líquida ou sólida
  • 59. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna Temperatura da coluna Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0 ). p0 = f Estrutura química do analito Temperatura da coluna Temperatura da coluna Pressão de vapor Velocidade de migração ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃO MENOR RETENÇÃO)
  • 60. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna Temperatura da coluna AUMENTO DA TEMPERATURA DA COLUNA CONTROLE CONFIÁVEL CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG SEPARAÇÃO EM CG
  • 61. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura Programação linear de temperatura Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE: TCOL BAIXA: - Componentes mais voláteis são separados - Componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos TCOL ALTA: - Componentes mais voláteis não são separados - Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente
  • 62. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura Programação linear de temperatura A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação: : Consegue-se boa Consegue-se boa separação dos separação dos componentes da componentes da amostra em menor amostra em menor tempo tempo TEMPO TEMPERATURA tINI tFIM TINI TFIM R TINI - Temperatura Inicial TFIM - Temperatura Final tINI - Tempo Isotérmico Inicial tFIM - Tempo Final do Programa R - Velocidade de Aquecimento
  • 63. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Programação linear de Programação linear de temperatura temperatura a) Isotérmico a 45 ºC; b) isotérmico a 145 °C; c) programado de 30 ºC a 180 ºC
  • 64. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura Programação linear de temperatura VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE: A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura. viscosidad e vazão DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE: Devido ao aumento de volatilização de FE líquida Possíveis problemas associados à PLT: Possíveis problemas associados à PLT:
  • 65. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Fase Estacionária Fase Estacionária REGRA GERAL REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível : a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...) próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...) FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra. FE Seletiva: separação adequada dos constituintes da amostra FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com coluna de boa eficiência
  • 66. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Fase estacionária sólida Fase estacionária sólida • O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO ADSORÇÃO A adsorção ocorre na A adsorção ocorre na interface entre o gás de interface entre o gás de arraste e a FE sólida arraste e a FE sólida • Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros) • Solutos polares • Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de elétrons...) ADSORÇÃO
  • 67. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Fase estacionária líquida Fase estacionária líquida • O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃO ABSORÇÃO A absorção ocorre no interior A absorção ocorre no interior do filme de FE líquida do filme de FE líquida (fenômeno INTRAfacial) (fenômeno INTRAfacial) • Filmes espessos de FE líquida • Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste • Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade) ABSORÇÃO
  • 68. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Fase estacionária quirais Fase estacionária quirais • As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são MUITO SIMILARES  FE convencionais não interagem FE convencionais não interagem diferencialmente com os isômeros óticos diferencialmente com os isômeros óticos. FÁRMACOS - Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica. PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção entre produtos de origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).
  • 69. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Detectores Detectores Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste. quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste. Características ideais Características ideais: 1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. 2.Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza. 4.Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 400 ºC. 5.Tempo de resposta curto e independente da vazão. 6.Alta confiabilidade e facilidade de uso. 7.Similaridade de resposta para todos os solutos. 8.Não destrutivo.
  • 70. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Detectores Detectores Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma. REGISTRO DE SINAL ANALÓGICO Registradores XY DIGITAL Integradores Computadores
  • 71. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Detectores Detectores UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluída. SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química. ESPECÍFICOS: Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas DCT DCE DNP
  • 72. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Detectores - Funcionamento Detectores - Funcionamento DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos. DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste. DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar. DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação do DIC. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por uma superfície de silicato de rubídio onde se formam íons de moléculas com N e P.
  • 73. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Detectores – Limites de detecção Detectores – Limites de detecção DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Seletivo Seletivo. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0,01 a 1 pg com linearidade até ng. (104) DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Universal Universal. Observa-se para qualquer substância eluída. Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de g (104 ). DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Quase-universal Quase-universal. Detecta qualquer substância que contenha ligações C-H. Não responde a gases nobres, H2, O2, N2, CX4, SiX4 (X=halogênio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2, NH3. Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (107 – 108 ). DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): Específico Específico. Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg (P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. (103 - 105 )
  • 74. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Detectores – Espectrometria de massas Detectores – Espectrometria de massas CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico Universal / Seletivo / Específico. Um dos detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa. É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de determinada razão m/z. Detecção Detecção TIC Universal Universal Similar a DCT Similar a DCT SIM Seletivo Seletivo Maior Sensibilidade Maior Sensibilidade
  • 75. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico Universal / Seletivo / Específico. TEMPO CONTAGENS MASSA / CARGA CONTAGENS Cromatograma de íons totais: TIM ou TIC TIM ou TIC Em cada posição do cromatograma tem-se um espectro de massa. Detectores – Espectrometria de massas Detectores – Espectrometria de massas
  • 76. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico Universal / Seletivo / Específico. TEMPO CONTAGENS Cromatograma de íons selecionados: SIM SIM Em cada posição do cromatograma tem-se o sinal somente da m/z selecionada. MASSA / CARGA CONTAGENS Oferece a vantagem Oferece a vantagem de registrar de registrar somente o sinal do somente o sinal do constituinte de constituinte de interesse, sendo interesse, sendo “cego” para os “cego” para os demais demais. Detectores – Espectrometria de massas Detectores – Espectrometria de massas
  • 77. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM Interface CG-EM. CG EM Vácuo Separador Molecular O gás de arraste leve (He) difunde mais rapidamente que o analito e tende a ser drenado para o vácuo. Câmara de Ionização Coluna Capilar Interface Capilar Direta Com colunas capilares a vazão baixa de gás de arraste pode ser drenada pelo sistema de vácuo. Detectores – Espectrometria de massas Detectores – Espectrometria de massas
  • 78. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Análise qualitativa Análise qualitativa tR tM tR’ = tR - tM TEMPO SINAL O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’: tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico) tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna) tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE)
  • 79. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Análise qualitativa Análise qualitativa Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 m Detector FID: 250 ºC Injetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC Volume injetado: 1 L Como se explica esta ordem de eluição? Mistura de benzeno, n-propanona, Mistura de benzeno, n-propanona, n-propanol, n-butanol, isobutanol e n-propanol, n-butanol, isobutanol e n-pentanol. n-pentanol. 1. A n-propanona elui primeiro devido à sua maior volatilidade. 2. O benzeno em segundo devido sua natureza apolar (menor ) e maior volatilidade que os demais. 3. Para os demais compostos, cujas diferenças de polaridade não são elevadas, a volatilidade se torna o principal parâmetro que define a ordem de eluição.
  • 80. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Análise quantitativa Análise quantitativa TEMPO SINAL O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é: • Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois a banda necessita ser perfeitamente simétrica. • Área da banda cromatográfica. Altura Altura Área Área
  • 81. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Análise quantitativa Análise quantitativa tempo tempo Concentração Concentração Área Área amostra amostra
  • 82. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa Análise quantitativa Análise quantitativa MASSA ÁREA A partir de certo ponto o sinal não aumenta mais linearmente O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razão (Área / Massa) diverge em mais de 5 % da inclinação da reta na região linear: MASSA ÁREA / MASSA 0,95 S 1,05 S
  • 83. Cromatografia Gasosa Cromatografia Gasosa tempo tempo amostra amostra Concentração Adicionada Concentração Adicionada Área Área concentração concentração na amostra na amostra Análise quantitativa Análise quantitativa
  • 84. Cromatografia em fase líquida Cromatografia em fase líquida Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida
  • 85. Cromatografia Líquida - CLAE Cromatografia Líquida - CLAE Aplicabilidade Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CLAE ? Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4.000.000. de 32 até 4.000.000. para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido. DE FORMA GERAL: CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam solúveis na FM. constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica volatilidade ou de estabilidade térmica. .
  • 86. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Tipos e Tipos e Aplicações da Aplicações da Cromatografia Cromatografia Líquida Líquida Insolúvel em água Solúvel em água Aumento de polaridade Aumento de polaridade Polar não iônico Apolar Iônico Massa molecular 102 103 104 105 106 Troca iônica Partição Partição Partição em fase em fase reversa reversa Partição Partição em fase em fase normal normal Exclusão Permeação Permeação em gel em gel Filtração Filtração em gel em gel Adsorção
  • 87. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Componentes típicos - CLAE Componentes típicos - CLAE
  • 88. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Requisitos dos sistemas de bombeamento Requisitos dos sistemas de bombeamento 1 – Geração de pressões até 6.000 psi 2 – Saída com ausência de pulsos 3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min 4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de 0,5% ou melhor 5 – Componentes resistentes à corrosão Bomba recíproca Bomba recíproca (também são chamadas de bombas de pistão ou de diafragma)
  • 89. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Suportam pressões de até 7.000 psi Volumes típicos: 5 a 500 L Microamostragem: 0,5 a 5 L Sistemas de injeção de amostras Sistemas de injeção de amostras
  • 90. • Eluição isocrática: Eluição isocrática: • Quando a separação é feita utilizando um único solvente de composição constante. • Eluição com gradiente Eluição com gradiente: • São utilizados dois ou três sistemas de solventes que diferem bastante entre si em polaridade. • Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é variada de modo programado, de forma contínua ou em passos. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida A eluição com gradiente produz efeitos similares aos A eluição com gradiente produz efeitos similares aos produzidos pela programação de temperatura na CG. produzidos pela programação de temperatura na CG. Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a polaridade requerida na separação. polaridade requerida na separação. Fase móvel para CLAE Fase móvel para CLAE
  • 91. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Eluição com gradiente Eluição com gradiente Coluna C18, 5 m, fase reversa Detector fluorescência: excit. 334 nm – emis. 425 nm
  • 92. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Colunas para CLAE Colunas para CLAE As colunas geralmente são construídas de aço inox, embora tubos de vidro com paredes resistentes sejam encontrados ocasionalmente. No entanto, estes últimos são restritos a pressões mais baixas do que 600 psi. Existem comercialmente centenas de colunas empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.
  • 93. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Colunas para CLAE Colunas para CLAE Pré-coluna •Remoção de material particulado •Contaminantes do solvente •Contaminantes da amostra •Saturar a FM com a FE Aumenta a vida útil da coluna Aumenta a vida útil da coluna COLUNAS TÍPICAS COLUNAS TÍPICAS •Material Material: aço inox •Comprimento Comprimento: 10 a 30 cm •Diâmetro Diâmetro: 4 a 10 mm •FE FE: Partículas de 5 a 10 m •Eficiência Eficiência: 40 mil a 60 mil pratos/metro
  • 94. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Separação isocrática de alta velocidade Separação isocrática de alta velocidade 1– p-xileno 1– p-xileno 2- anisol 2- anisol 3- acetato de benzila 3- acetato de benzila 4- dioctil-ftalato 4- dioctil-ftalato 5- dipentil-ftalato 5- dipentil-ftalato 6- dibutil-ftalato 6- dibutil-ftalato 7- dipropil-ftalato 7- dipropil-ftalato 8- dietil-ftalato 8- dietil-ftalato - 4 cm de comprimento - 0,4 cm d.i. - FE: spherisorb 3 m Coluna de alta velocidade e alta eficiência FM: 4,1% EtAc em n-Hexano 100.000 pratos/metro
  • 95. • Pelicular: Pelicular: • Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 m, recoberto com uma camada fina e porosa de: • Sílica • Alumina • Resina de poliestireno-divinil-benzeno • Resina trocadora de íons • Partícula porosa Partícula porosa: • Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10 m. As partículas são constituídas dos mesmos As partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular materiais do recobrimento pelicular. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Basicamente são dois tipos de FE: Basicamente são dois tipos de FE: Fase estacionária para CLAE Fase estacionária para CLAE
  • 96. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Detectores Detectores As características desejáveis para os detectores As características desejáveis para os detectores para CLAE não são diferentes daquelas para CG. para CLAE não são diferentes daquelas para CG. Existem dois tipos de detectores: Existem dois tipos de detectores: • Propriedades universais Propriedades universais (índice de refração, densidade ou constante dielétrica). • Propriedades do soluto Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc). Características ideais Características ideais: 1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s. 2.Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza. 4.Tempo de resposta curto e independente da vazão. 5.Alta confiabilidade e facilidade de uso. 6.Similaridade de resposta para todos os solutos. 7.Não destrutivo. 8.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.
  • 97. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Detectores Detectores • Absorbância Absorbância • UV/Vis – Sens.: 10-9 g/mL – FL: 105 • IV • Fluorescência Fluorescência – – S: 10 S: 10-9 -9 a 10 a 10-12 -12 g/mL – FL: 10 g/mL – FL: 103 3 • Índice de refração Índice de refração (universal) (universal) – – Sens.: 10 Sens.: 10-7 -7 g/mL – Faixa Linear: 10 g/mL – Faixa Linear: 104 4
  • 98. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Detectores Detectores • Eletroquímicos Eletroquímicos: : existem vários tipos disponíveis atualmente. Embora não sejam tão explorados quanto os detectores ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade. • Amperométricos • Coulométricos • Condutométricos – S: 10 Condutométricos – S: 10-8 -8 g/mL – FL: 10 g/mL – FL: 104 4 • Polarográficos – S: 10 Polarográficos – S: 10-12 -12 g/mL – FL: 10 g/mL – FL: 106 6
  • 99. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Detectores Detectores • Espectrometria de massa Espectrometria de massa - universal - universal • Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa potencializa a técnica de separação e quantificação • Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM. Interface CL-EM
  • 100. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Detectores Detectores • Espectrometria de massa Espectrometria de massa TEMPO CONTAGENS MASSA / CARGA CONTAGENS TEMPO CONTAGENS MASSA / CARGA CONTAGENS TIC TIC SIM SIM
  • 101. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Tipos de CLAE Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como um gás ideal e não contribui para o processo de um gás ideal e não contribui para o processo de separação, a FM líquida da CLAE interage tanto separação, a FM líquida da CLAE interage tanto quanto a FE com os componentes da amostra. quanto a FE com os componentes da amostra. Isto torna o desenvolvimento dos métodos em Isto torna o desenvolvimento dos métodos em CLAE um tanto mais complexo que na CG. CLAE um tanto mais complexo que na CG.
  • 102. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Tipos de CLAE • PARTIÇÃO PARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do suporte do empacotamento  Adsorção e ligação química Adsorção e ligação química. Dois tipos de eluição podem ser distinguidos: Fase normal Fase normal (FN) e Fase reversa (FR) (FN) e Fase reversa (FR). Observação Observação: FN e FR são artificiais, pois são designações históricas, já que a FM apolar e FE polar por terem sido as primeiras utilizadas foram chamadas de fase normal.
  • 103. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Tipos de CLAE Fase normal Fase normal: : FE de natureza fortemente polar (ex. água) FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico) O componente menos polar é eluído primeiro por ser o mais solúvel na fase móvel. O aumento aumento da polaridade da FM diminui diminui o tempo de eluição. Fase reversa Fase reversa: : FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos) FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila) O componente mais polar aparece primeiro e a diminuição diminuição da polaridade da FM diminui diminui o tempo de eluição. Baixa polaridade FM Média polaridade FM Alta polaridade FM Média polaridade FM
  • 104. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Tipos de CLAE • É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses recobrimentos é uma cadeia C recobrimentos é uma cadeia C8 8 (n-octil) ou C (n-octil) ou C18 18 (n-octadecil) (n-octadecil)
  • 105. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Tipos de CLAE Campo Misturas típicas Farmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides, analgésicos Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios Produtos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Produtos químicos Aromáticos condensados, surfactantes, propelentes, corantes industriais Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas policloradas) Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue, narcóticos Clínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas, extratos de urina, estrógenos
  • 106. Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Tipos de CLAE • ADSORÇÃO ADSORÇÃO: líquido-sólido. FE sílica ou alumina FE sílica ou alumina. É a forma clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de HPLC. • TROCA IÔNICA TROCA IÔNICA: líquido-sólido. FE resina com capacidade FE resina com capacidade de troca iônica de troca iônica. • EXCLUSÃO EXCLUSÃO: líquido-gel. FE gel FE gel. Um material polimérico, hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas, são capazes de promover a separação de acordo com os tamanhos das moléculas  EXCLUSÃO DE TAMANHO EXCLUSÃO DE TAMANHO. Se o material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONS EXCLUSÃO DE ÍONS.
  • 107. Para refletir e responder: Para refletir e responder: Duas substâncias diferentes com a mesma concentração apresentarão a mesma área sob suas bandas cromatográficas? Cromatografia Cromatografia Para um mesmo analito, a área ou altura aumentam com o aumento da concentração. A área sob a banda cromatográfica de duas substâncias diferentes dependerá da resposta do detector para aquele tipo de substância, independentemente do tipo de detector utilizado.
  • 108. Para refletir e responder: Para refletir e responder: A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de analito? A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são os casos em que isto ocorre? Cromatografia Cromatografia
  • 109. F I M F I M