2. Biologia
Biotecnologia
É a área do conhecimento que utiliza os processos
celulares e biomoleculares presentes nos seres vivos
para desenvolver produtos à escala industrial.
A maioria dos processos biotecnológicos atuais
envolve a utilização de seres vivos obtidos com
recurso à engenharia genética.
Orgânico
3. Biologia
Técnica de DNA recombinante
• Recorre a enzimas de restrição para isolar
e combinar segmentos de DNA de diferentes
origens.
• As enzimas cortam as cadeias da molécula
em locais específicos.
• São originados fragmentos que possuem
extremidades de cadeia simples –
extremidades coesivas.
Técnicas de engenharia genética
Local de restrição
da enzima Hind III
Extremidade
coesiva
4. Biologia
Etapas da técnica de DNA recombinante
Técnicas de engenharia genética
Uso da mesma enzima de
restrição para:
– isolar o gene de interesse;
– clivar DNA a usar como vetor
do gene de interesse.
1
DNA
Gene de
interesse
Vetor (plasmídeo) Corte com enzima
de restrição
1
1
5. Biologia
Etapas da técnica de DNA recombinante
Técnicas de engenharia genética
Uso da mesma enzima de
restrição para:
– isolar o gene de interesse;
– clivar DNA a usar como vetor
do gene de interesse.
1
DNA
Gene de
interesse
Vetor (plasmídeo) Corte com enzima
de restrição
1
1
Inserção do gene isolado
no vetor (que pode ser um plasmídeo);
atuam as DNA ligases,
que unem as extremidades coesivas.
2
Plasmídeo
recombinante
2
6. Biologia
Etapas da técnica de DNA recombinante
Técnicas de engenharia genética
Uso da mesma enzima de
restrição para:
- Isolar o gene de interesse;
- Clivar DNA a usar como vetor
do gene de interesse.
1
DNA
Gene de
interesse
Vetor (plasmídeo) Corte com enzima
de restrição
1
1
Inserção do gene isolado
no vetor (que pode ser um plasmídeo);
atuam as DNA ligases
que unem as extremidades coesivas.
2
Plasmídeo
recombinante
2
Introdução do plasmídeo de rDNA
na célula hospedeira.
3
Bactéria com o gene
de interesse
3
Inserção na
bactéria
7. Biologia
Etapas da técnica de DNA recombinante
Técnicas de engenharia genética
Seleção das células nas quais o gene de interesse se expressa.
4
8. Biologia
Eletroforese
• Técnica que utiliza um gel de agarose
ou de poliacrilamida.
• O gel atua como uma peneira, para
separar moléculas de DNA.
• À medida que se movem do polo
negativo para o positivo, as moléculas
vão sendo separadas por tamanho.
• As moléculas mais pequenas avançam
mais no gel.
Técnicas de engenharia genética
Fonte
elétrica
Solução-tampão
Poços
(amostras)
Elétrodo
Elétrodo
9. Biologia
Eletroforese
• As moléculas são separadas em bandas,
cada uma com vários milhares de
moléculas de DNA com o mesmo
tamanho.
• Esta técnica permite separar de forma
rápida os fragmentos de restrição de
uma molécula de DNA clivada.
Técnicas de engenharia genética
Fonte
elétrica
Solução-tampão
Poços
(amostras)
Elétrodo
Elétrodo
10. Biologia
Técnica do DNA complementar (cDNA)
• Consiste na produção de cDNA a partir de mRNA
processado.
• É catalisado pelas enzimas transcriptases reversas.
• São obtidos genes eucarióticos apenas com exões.
• A DNA polimerase produz a cadeia complementar
em falta.
Técnicas de engenharia genética
Transcriptase
reversa
DNA
polimerase
11. Biologia
Reação em cadeia da polimerase – PCR
Técnicas de engenharia genética
• Técnica de polimerização de DNA in vitro que permite
a obtenção rápida de milhões de cópias de um dado
segmento.
• Após o processo de amplificação, o produto é sujeito
a eletroforese para determinar se um dado fragmento
de DNA foi amplificado.
12. Biologia
Reação em cadeia da polimerase – PCR
Técnicas de engenharia genética
Material necessário:
• Amostra de DNA
• DNA primers
• nucleótidos livres (dNTPs)
• DNA polimerase
• Solução-tampão
Amostra de DNA
Solução-tampão
DNA
primers
dNTPs
DNA polimerase
13. Biologia
Reação em cadeia da polimerase – PCR
Técnicas de engenharia genética
• As amostras são colocadas num termociclador.
Amostra de DNA
Solução-tampão
DNA
primers
dNTPs DNA
polimerase
14. Biologia
Reação em cadeia da polimerase – PCR
Técnicas de engenharia genética
• No termociclador, a amplificação ocorre graças à variação cíclica da temperatura das amostras.
Desnaturação Alongamento
Ligação dos primers
1 2 3
DNA-molde
DNA polimerase
15. Biologia
Reação em cadeia da polimerase – PCR
Técnicas de engenharia genética
• A repetição do ciclo permite a obtenção de milhões
de cópias do DNA.
Desnaturação Alongamento
Ligação dos primers
1 2 3
DNA-molde
DNA polimerase
Ciclo 1 Ciclo 2
Ciclo 3
Ciclo 4
16. Biologia
Reação em cadeia da polimerase – PCR
Técnicas de engenharia genética
A técnica PCR ocupa uma posição nuclear em
engenharia genética.
Amostra de DNA
Solução-tampão
DNA
primers
dNTPs DNA
polimerase
Termociclador
Ciclo 1
Ciclo 2
Ciclo 3
Ciclo 4
Cópias de DNA
Alongamento
Ligação dos primers
Desnaturação
25-40 ciclos
17. Biologia
Edição genética
Técnicas de engenharia genética
• Esta técnica baseia-se na utilização de sistemas enzimáticos
designados por CRISPR-Cas, sendo o mais utilizado o sistema
CRISPR-Cas9, do tipo II.
• O sistema CRISPR-Cas9 envolve dois componentes essenciais:
as CRISPR RNA, específicas da sequência-alvo do DNA;
a Cas9, uma endonuclease de restrição.
1
2
2 Enzima Cas9
CRISPR RNA-guia
1
• A molécula de RNA possui duas partes:
uma liga-se à sequência CRISP;
outra localiza a sequência de DNA.
3
4
3
4
18. Biologia
Edição genética
• A enzima Cas9 reconhece uma sequência de alguns
nucleótidos, adjacente à sequência-guia (PAM),
cortando a cadeia dupla.
• Das junções das extremidades pode resultar
a inativação dos genes ou a sua substituição.
Técnicas de engenharia genética
Reparação
Inserção
(novo gene)
Enzima Cas9
RNA-guia
DNA-alvo
Sequência-alvo
PAM
Clivagem
Clivagem
19. Biologia
Impressão digital genética
• Em regiões não codificantes do
genoma, ocorrem repetições em
cadeia de dois a seis pares de bases,
os microssatélites ou STR.
• As repetições são herdadas de ambos
os progenitores.
• Cada indivíduo possui um padrão
único de STR, que é utilizado como
uma marca genética do indivíduo, ou
seja, como uma impressão digital
genética (genetic fingerprint).
Técnicas de engenharia genética
= 7 repetições
= 4 repetições
= 12 repetições
= 6 repetições
= 19 repetições
= 14 repetições
STR – local 1 STR – local 2
20. Biologia
Impressão digital genética
• Os STR são amplificados
com recurso a PCR.
• Os fragmentos obtidos são
sujeitos a eletroforese.
Técnicas de engenharia genética
21. Biologia
Impressão digital genética
• É obtido um padrão único de STR, usado como impressão digital genética (genetic fingerprint).
Técnicas de engenharia genética
22. Biologia
Transformação genética de organismos
A modificação de organismos pela adição
ou remoção de sequências de DNA
estranhas ao seu genoma cria
organismos transgénicos, ou organismos
geneticamente modificados (OGM).
Estes organismos são usados para
aumentar a produção vegetal ou animal,
para a produção de vacinas ou para a
resolução de problemas ambientais.
23. Biologia
Transformação genética de organismos
•A transformação dos
organismos assenta,
essencialmente, no uso
da tecnologia do DNA
recombinante.
•Os genes com as
sequências estranhas
ao genoma do organismo
são designados por
transgenes.
24. Biologia
Transformação genética de organismos
Microrganismos geneticamente modificados
Plasmídeo
de rDNA
Extração do plasmídeo
da bactéria
Isolamento do gene
da insulina
Purificação e embalagem
da insulina para tratamento
dos diabetes
Multiplicação das bactérias transgénicas
e produção de insulina
Reintrodução do
plasmídeo na bactéria
• Muitos microrganismos, como
bactérias, leveduras ou vírus, são
facilmente modificados
geneticamente.
• A elevada taxa de reprodução
destes microrganismos
transgénicos permite produzir
grandes quantidades de
diferentes moléculas úteis, como
enzimas e hormonas; é o caso da
insulina.
25. Biologia
Transformação genética
de organismos
Plantas geneticamente modificadas
A transformação genética das plantas permite:
• modificar a proporção de lípidos, de amido
ou de proteínas nas sementes;
• conferir resistência a pragas e a vírus;
• aumentar a tolerância a ambientes extremos.
26. Biologia
Transformação genética de organismos
Plantas geneticamente modificadas
A transferência
de vetores para
células totipotentes
do calo permite a sua
modificação genética
e o desenvolvimento
de plantas que
expressam os genes
introduzidos.
27. Biologia
Transformação genética
de organismos
Animais geneticamente modificados
A transformação genética dos animais permite
alterar características específicas, como,
por exemplo:
• a resistência a doenças;
• o aumento de crescimento;
• a produção de determinados produtos.
28. Biologia
Transformação genética de organismos
Animais geneticamente modificados – processos de transferência de genes
Microinjeção
pró-nuclear
Células estaminais
embrionárias
Retrovírus Transferência
nuclear
29. Biologia
• É uma ferramenta usada para
identificar a expressão de milhares
de genes ao mesmo tempo.
• Consiste numa placa microscópica
com pontos predefinidos onde são
colocadas amostras de DNA em
contacto com sondas
polinucleotídicas.
Diagnóstico e terapêutica de doenças
Microarrays de DNA
30. Biologia
O mRNA é extraído de diversas
células.
É produzido cDNA a partir do mRNA.
As diferentes amostras de cDNA são
colocadas em contacto com as sondas
de cada ponto (previamente
colocadas).
Diferentes processos de hibridização
produzem um padrão de cores
característico, que será sujeito a
interpretação.
Diagnóstico e terapêutica de doenças
Microarrays de DNA – exemplo de uso
1
2
3
3
4
2
1
4
2
1
Células normais
Células tumorais
cDNA
mRNA
cDNA
mRNA
Suporte
de sondas
Resultados
Hibridação do DNA
com a sonda de
prova
Ausente
em ambas
Em ambas
Em células
tumorais
Em células
normais
31. Biologia
• Envolve alterações no genoma dos indivíduos.
• A terapia génica de células está limitada
às células somáticas de determinados tecidos.
• Esta terapia génica recorre a vetores virais
seguros, sendo feita inserindo o gene
funcional numa célula e deixando presente
o gene original não funcional.
Terapia genética
