Pcr para o diagnóstico da mastite bovina
Transferir como PPT, PDF0 gostou1,443 visualizações
O documento descreve um estudo sobre o diagnóstico da mastite bovina utilizando a técnica de PCR multiplex. O trabalho desenvolveu um método de extração de DNA bacteriano a partir de amostras de leite e validou primers para detecção de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberis e S. aureus resistente à meticilina através de PCR multiplex. O método mostrou-se sensível, específico e eficiente para diagnóstico etiológico da mastite.
![ A caseína é um dos principais inibidores
presentes no leite, em associção com cálcio
forma micelos
Adição de solução com alta concentração de
EDTA quelam (eliminam os metais tóxicos) o
cálcio dissolvendo os micelos de caseína
No experimento usou-se o tampão NET (alta
[EDTA])](https://image.slidesharecdn.com/pcrparaodiagnsticodamastitebovina-160813184945/85/Pcr-para-o-diagnostico-da-mastite-bovina-37-320.jpg)
Pcr para o diagnóstico da mastite bovina
- 1. Aline Lemes Fernanda Aquino Marília Gomes Viviane Pessin
- 2. Inflamação das glândulas mamárias Prejuízos econômicos: 1. Queda na produção 2. Queda na qualidade 3. Perda de teto 4. Descarte de animais 5. custos com drogas, veterinário e mão de obra Perda mundial 35 bilhões $/ano Atividade leiteira
- 3. Multifatorial 1. Trauma 2. Irritação química 3. Infecção microbiana Predomínio de Staphilococcus e Streptococcus Tipos: sub clínica ou clínica
- 6. Patógenos contagiosos: 1. Contaminam os quartos – ordenha 2. S. agalacteae, S. aureus, Corynebacterium bovis Patógenos ambientais: 1. Fezes, cama, solo, represas... 2. E. coli, S. dysgalacteae, S. uberis S. aureus, S. agalacteae, S. dysgalacteae, S. uberis 90 – 95% dos casos
- 7. Etiológico é fundamental 1. Rápido 2. Barato 3. Eficiente Análise fenotípica: Expressão de fatores biológicos celulares – produção de enzima, utilização de nutrientes, metabolismo, susceptibilidade aos agentes químicos Análise genotípica Detectam variações no DNA, normalmente estáveis e pouco afetadas pelas condições ambientais – identifica espécie, virulência, transmissão e fonte de infecção
- 8. Bacteriológico 1. Caro 2. Ineficiente 3. Baixa sensibilidade 4. Cultura bacteriológica lenta 5. Isolamento e identificação 6. Técnicas bioquímicas Vacas sub clinicamente infectadas podem eliminar intermitentemente o patógeno Cultura negativa por resíduos de antibióticos
- 9. ETIOLÓGICO Bacteriológico Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus resistente à meticilina Streptococcus MOLECULAR PCR Multiplex PCR Ribotipagem Detecção de microrganismos no leite
- 10. Local: EV – DMP – UFMG Doações da Embrapa Gado de Leite, Universidade Federal de Lavras e Hospital das Clínicas da UFMG As amostras foram mantidas em caldo BHI (Brain Heart Infusion Broth Acumedia Manufacters) com 50% de glicerol a -20ºC até o momento do uso.
- 11. Plano de execução do experimento
- 12. PCR – Primer – amplifica segmentos específicos
- 13. Extração de DNA 1. Preparação da amostra: retira cálcio, principal inibidor da PCR no leite 2. Extração: retira o DNA 3. Purificação do DNA: retira proteínas e debris celulares através do protocolo de Fenol-Clorofórmio
- 14. Extração de DNA a partir de amostras de bactérias de referência em cultura pura Extração de DNA a partir de amostras de bactérias de referência em leite artificialmente contaminadas Extração de DNA a partir de amostras de leite de tanque de expansão
- 15. Padronização das PCRs Individual Multiplex Ambas com DNA obtido a partir de amostras de bactérias de referência em cultura pura PCR Multiplex para detecção de microrganismos a partir das amostras de leite de tanque de expansão
- 16. Avaliação da especificidade verificada: Utilizando Streptococcus bovis, Staphylococcus intermedius e S. epidermidis, comumente encontradas no leite
- 17. Especificidade dos Primers Bandas de DNA esperadas para cada microorganismo Exceto, S.aureus em que se observou 3 bandas com predomínio de 900pb na maioria
- 18. Figura 1: Fragmentos de DNA amplificados por PCR a partir de culturas puras de S. aureus e Streptococcus spp.
- 19. Sensibilidade do PCR a partir de culturas puras PCR Individual 10pg de DNA PCR multiplex 500pg de DNA S. uberis, S. agalactiae, S. dysgalactiae e S. aureus MRSA 250pg de DNA
- 20. Sensibilidade da PCR a partir de amostras do leite PCR individual 10²UFC/mL PCR multiples 10³UFC/mL
- 21. Figura 2. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. agalactiae (270 pb), visualizados em gel de agarose 2%.
- 22. Figura 3. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. dysgalactiae (264 pb), visualizados em gel de agarose 2%.
- 23. Figura 4. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. uberis (330 pb), visualizados em gel de agarose 2%.
- 24. Figura 5. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. aureus (900 pb, 420 pb, 200 pb), visualizados em gel de agarose 2%.
- 25. Figura 6. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de MRSA (533 pb), visualizados em gel de agarose 2%.
- 26. Testes em amostras de leite de tanque de expansão Nas figuras e na tabela a seguir se encontram os resultados obtidos das 30 amostras de tanque de expansão. Não foi observada interferência do azidiol presente na amostra.
- 27. Figura 7. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de leite de tanque de expansão, visualizados em gel de agarose 2%.
- 28. Figura 8. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de leite de tanque de expansão, visualizados em gel de agarose 2%.
- 29. Figura 9. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de leite de tanque de expansão, visualizados em gel de agarose 2%.
- 30. Tabela 1. Utilização da PCR multiplex para detecção de microrganismos em leite bovino com diferentes contagens bacterianas totais e contagens de células somáticas, diretamente do tanque de expansão.
- 32. Teste diagnóstico Controlar e erradicar doenças OBJETIVO
- 33. Para garantia de sucesso, temos como característica impressindível a Sensibilidade Desenvolvimento de métodos rápidos e sensíveis para a diferenciação de microorganismos Com isso, metódos genotípicos substituem métodos fenotípicos
- 34. Métodos fenotípicos Métodos genotípicos Falso negativo Rápida e acurada identificação Valores ambientais interferem Não tem interferência do meio (genoma) Baixa reprodutibilidade Vantagem da reprodutibilidade Baseia em características instáveis dos microorganismos Rapidez Sensibilidade Reprodutibilidade
- 37. A caseína é um dos principais inibidores presentes no leite, em associção com cálcio forma micelos Adição de solução com alta concentração de EDTA quelam (eliminam os metais tóxicos) o cálcio dissolvendo os micelos de caseína No experimento usou-se o tampão NET (alta [EDTA])
- 39. No trabalho realizado utilizou-se bactérias Gram-positivas parece celular mais resistenteparece celular mais resistente
- 40. O método de extração para DNA dessas bactérias na amostra apresentada mostrou-se: Eficiente Fácil realização Reagentes econômicos Equipamentos sofisticados não foram requeridos Pouca manipulação da amostra Tempo de análise de processo aproximadamente 8 horas
- 44. Pré dipping e pós dipping Terapia da vaca seca Tratamento eficaz e eficiente Descarte de animais crônicos Manutenção regular da ordenhadeira mecânica
- 45. Marisa Araújo Silva. Utilização de PCR multiplex para o diagnóstico etiológico da mastite bovina. Dissertação de mestrado UFMG. 2008.