Regulação e expressão gênica bacteriana
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O documento descreve os processos de transcrição e regulação gênica em bactérias. A transcrição envolve as etapas de iniciação, alongamento e término, mediadas pela RNA polimerase e reconhecimento de seqüências específicas de DNA como promotores e terminadores. A expressão gênica pode ser regulada em diferentes níveis como transcrição, processamento e tradução do RNA.
Regulação e expressão gênica bacteriana
- 1. Regulação e expressão gênica bacteriana Prof. Dra. Adriana Dantas Genética de microorganismos UERGS Bento Gonçalves
- 2. TRANSCRIÇÃO : EUCARIOTO X PROCARIOTO EUCARIOTOS PROCARIOTOS
- 3. Enzimas responsáveis pela replicação 1 Rompem as pontes de hidrogênio às custas da energia de hidrólise do ATP, 5 entre as bases. 2 Sintetiza o iniciador (primer): 1 + 2 = complexo de iniciação da 1 replicação (CIR). 2 3 Duas DNA polimerase (I e III) acoplam-se ao CIR e iniciam o alongamento da cadeia, uma na fita contínua (leading) e outra na fita descontínua (lagging). DNA pol III - 30.000/min DNA pol I –600/min. 3 4 Une a extremidade 5´fosfato de um fragmento novo à extremidade 3´- OH do próximo 5 Diminuem o grau de 4 superenrolamento do DNA no ponto de origem da replicação
- 4. O RNA ou ARN O Ácido Ribonucléico é um polinucleotídeo que difere do DNA em três aspectos básicos: O açúcar é uma Ribose; DNA É formado, geralmente, por A-T T-A uma fita simples que pode G-C enrolar-se; C-G Não existe a base pirimídica Timina e no seu lugar se encontra a base Uracila. Os pareamentos seguem a RNA ordem A-U e G-C). A-U U-A G-C C-G
- 5. Tipos de RNA RNAm O RNA mensageiro é formado no núcleo e contém a “mensagem” - o código transcrito a partir do DNA - para a síntese das proteínas. Cada conjunto de três nucleotídeos no RNAm é chamado de CÓDON. RNAt O RNA transportador está presente no citoplasma e é responsável pelo transporte dos aminoácidos até os ribossomos para a síntese protéica. No RNAt existe uma seqüência de nucleotídeos correspondente ao códon chamada de ANTI-CÓDON. RNAr O RNA ribossômico ou ribossomal faz parte da estrutura dos ribossomos e participa do processo de tradução dos códons para construção das proteínas.
- 6. Regulação gênica As regulações metabólicas são catalisadas por enzimas; A transcrição e a tradução dirigem a síntese de proteínas, muitas das quais servem como enzimas; Síntese de proteínas requer gasto energético; Regulação da síntese protéica é importante para a economia energética celular; Produção de proteínas necessárias em momentos específicos
- 7. Genes Muitos genes, em torno de 60 a 80% não são regulados, são constitutivos, ou seja seus produtos são constantemente produzidos em velocidade fixa. Produção de outras enzimas é regulada, de modo que estejam presentes somente quando necessário. Apenas 1% do DNA é transcrito em RNAm codificante de proteínas e até 10% do DNA são transcritos em RNA
- 8. Tipos de genes Os que já funcionaram em uma fase anterior e atualmente não funcionam mais Os que estão em funcionamento em um determinado momento Os que ainda irão funcionar mais tarde Os que funcionam sempre
- 9. Controle da expressão gênica Controle do que é expresso pode ocorrer em vários níveis: Transcrição Processamento Transporte do RNAm Tradução Pós-tradução Funcionamento enzimático
- 10. RNA polimerase Na maioria dos procariontes, uma única espécie de RNA polimerase transcreve todos os tipos de RNA. RNA polimerase consiste em quatro tipos de subunidades: Beta: 150.000 dáltons (β); beta primo: 160.000 dáltons (β’); alfa: 40.000 dáltons (α); sigma: 70.000 dáltons (σ)
- 11. Estrutura do RNA polimerase O cerne da enzima contém dois polipeptídios α, um polipeptídio β e β’. A adição da subunidade α permite a iniciação nos sítios promotores, formando uma holoenzima β’ α β’ α + σ α β α σ β’ Fator sigma Cerne da enzima Holoenzima
- 12. Subunidades da RNA polimerase de E. coli • Grande e complexa, a holoenzima RNA polimerase de E. coli possui 5 tipos de subunidades. •Seu centro catalítico se encontra no chamado cerne da enzima (a2bb’). •E, além das funções descritas no quadro1, a RNA polimerase também interage com proteínas ativadoras e repressoras que modulam a taxa de expressão gênica nas células.
- 13. Transcrição do DNA • Quando se escreve um seqüência de nucleotídios correspondente a um gene •A seqüência é sempre escrita no sentido 5'-> 3'
- 14. Estágios da transcrição Iniciação Alongamento Término
- 15. A enzima RNA-polimerase abre a dupla hélice do DNA; Inicia-se a produção de uma molécula de RNAm, no sentido 5’ 3’ Os nucleotídeos são ligados respeitando a ordem A-U, G-C. Fita de RNA em Fita molde Finaliza a transcrição quando formação DNA a RNA-polimerase se desliga do DNA, a molécula de RNAm primário está formada e segue para o citoplasma onde será traduzida.
- 16. Iniciação Regiões que indicam o inicio da transcrição em procariontes são chamadas de promotores Seqüenciais promotoras em 13 pontos diferentes de inicio de transcrição no genoma E. coli.
- 17. A Unidade de T ranscrição A transcrição de um segmento se inicia quando a RNA polimerase reconhece e liga-se a seqüências específicas de nucleotídios em uma região especial, no início do gene, denominada promotor Além destas seqüências, o promotor engloba o ponto de início: Primeiro par de bases a ser transcrito em RNA A partir daí a RNA polimerase move-se ao longo do molde, sintetizando RNA, até alcançar uma outra seqüência específica que sinaliza o término da transcrição. Unidade de transcrição estende-se do ponto de início (+1) no promotor, até o terminador
- 18. Unidade de transcrição Diagrama representativo de um promotor genérico de E. coli. As caixas -35 e -10 (também chamada caixa de Pribnow ou caixa TATA) são muito conservadas entre distintos promotores. Pequenas variações nestas seqüências podem reduzir drasticamente a afinidade do fator sigma da RNA pol pelo promotor. A base +1 é, por convenção, aquela onde se inicia a transcrição. A RNA pol, uma vez acoplada ao promotor, ocupa cerca de 5 voltas do DNA.
- 19. Reconhecimento do P romotor Para que este processo ocorra é necessário, antes de mais nada, que a RNA polimerase identifique sinais específicos no DNA, os quais direcionarão a transcrição de genes específicos no momento adequado Uma enorme variedade de sinais pode ser encontrada nas regiões promotoras de diferentes genes. É por este motivo que os promotores são locais extremamente importantes no controle da expressão gênica
- 20. Promotor Existe, um consenso em torno de sua seqüência. A primeira base transcrita em RNA com a base +1 = seqüência de consenso de um promotor da bactéria Escherichia coli. A freqüência com que um promotor é ligado e o gene é transcrito pela RNA pol, está diretamente associada à homologia com a seqüência de consenso. consenso É através da variação das seqüências nas duas caixas (conhecidas como caixa TATA, ou caixa de Pribnow, e caixa -35) que é modulada a transcrição relativa dos genes constitutivos (aqueles que são expressos o tempo todo durante a vida da célula). Um gene cujo produto deva ser abundante tem um promotor com seqüência mais próxima ao consenso
- 21. Processo de T ranscrição •Diz-se que as seqüências que antecedem o ponto de início localizam-se à montante (upstream) e as que o sucedem localizam-se à jusante (downstream) •A posição das bases é numerada nos dois sentidos, a partir do ponto de início, ao qual se atribui o valor +1. Os valores aumentam (valor positivo) à jusante e diminuem (valor negativo) à montante •A taxa de transcrição gênica também pode ser afetada pela ligação de proteínas ativadoras e repressoras a sítios próximos aos pontos de iniciação e pela distância entre as seqüências de consenso dos promotores, sendo a separação ideal igual a 17 nucleotídeos (em procariotos).
- 22. Região consenso Essas seqüências podem ser bastante variáveis, porém, mantêm conservadas regiões responsáveis pela função promotora. Em procariotos, duas dessas regiões: 10 pb = 5´ TATATT 3´ 35pb = 5' TTGACA 3’
- 23. Processo de T ranscrição Regiões chamadas de -35 e -10 devido as suas localizações relativas ao ponto de inicio de transcriçao A subunidade σ permite que a RNA polimerase reconheça (sinalização) e se ligue especificamente a regiões de promotores A holoenzima procura um promotor e inicialmente se liga frouxamente a ele, reconhecendo as regiões -35 e -10 Forma uma estrutura chamada “complexo promotor fechado” fechado A partir daí a enzima se liga fortemente, deselicoizando bases próximas a região -10.
- 24. Probabilidades dos arranjos O arranjo particular da estrutura do promotor permite que, com apenas um par de 6 bases (cada caixa consenso tem em geral uma dúzia de bases) um promotor seja determinado com imensa precisão. O que queremos dizer com isto? Podemos formular a questão de outra forma: qual a probabilidade de uma seqüência de 6 bases ocorrer ao acaso no DNA? Para cada base a probabilidade de ser um T, digamos, é 1/4, pois podemos ter T, A, G ou C. O mesmo se aplica para as demais bases da seqüência, portanto, a probabilidade de se ter a seqüência TAATTA, por exemplo: ¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼ = (¼ )6 ~ 1/4000
- 25. Considerações Não é uma probabilidade muito pequena, considerando que há de 2 a 10 milhões de bases num genoma procarioto. O encontro de uma tal seqüência não pode ser fortuito! Embora se tenha mais liberdade em alterar a seqüência da região promotora fora das caixas de consenso, não podemos retirar nem acrescentar bases entre as caixas, porque a distância entre elas deve ser mantida. Chegamos, então, a um importante conceito na biologia molecular: distância também é informação. O fator σ deve reconhecer as duas caixas de consenso. primeiro a TATA e depois a -35 e para tal elas devem estar a uma determinada distância entre si.
- 26. Alogamento O RNA é sempre produzido no sentido 5’- 3’ Durante essa fase, o RNA recém-sintetizado pareia-se temporariamente com a fita molde de DNA = híbrido curto RNA- DNA. Diferentemente da DNA polimerase, a RNA polimerase não tem atividade de nuclease, ou seja, não revisa a cadeia de RNA nascente. Conseqüentemente, a fidelidade da síntese de RNA (transcrição) é bem menor que aquela observada para o DNA (replicação). Os RNAs sintetizados que apresentarem problemas serão degradados e têm pouca probabilidade de serem prejudiciais, uma vez que outros transcritos serão rapidamente produzidos.
- 27. Regiões Terminadoras A análise de muitas dezenas de regiões terminadoras mostrou que sua sequência apresenta características comuns, que comuns podem ser resumidas da seguinte forma: Na fita de DNA que está servindo de molde para a síntese do RNA surge uma sequência com cerca de 8 bases que, após um espaçador de tamanho variável (4 a 15 bases, em geral), É seguida de outra sequência complementar a ela, porém em sentido contrário; Logo após esta região simétrica há uma sequência longa de Timinas (um poliT), na fita 5’-3’. Esta estrutura, conhecida como grampo de terminação, sinaliza terminação para a polimerase que ela deve terminar a síntese de RNA.
- 28. Sinais de início e término da síntese de RNA pela RNA polimerase bacteriana. O sinal de início é o promotor, reconhecido pelo fator sigma. O sinal de término é reconhecido a posteriori (isto é, pela estrutura formada no RNA), e tem, no DNA uma sequencia poli-T.
- 29. Término O final da transcrição é um processo bem controlado no qual seqüências típicas dos transcritos de RNA (sinais de término) indicam o local para a finalização da síntese dessa molécula. Na bactéria E. coli existem no mínimo duas classes de seqüências de sinalização do término da transcrição: uma utiliza a proteína r (rho) outra não (rho-independente).
- 30. Formação do grampo de finalização O pareamento intramolecular das seqüências complementares do RNA recém-sintetizado forma uma estrutura em grampo. Esse acontecimento desencadeia os seguintes eventos: Parada da RNA polimerase: Destruição parcial do híbrido RNA-DNA (proporcionando instabilidade da região que permanece ligada); Dissociação do RNA nascente da enzima RNA polimerase Restabelecimento da região dupla-fita do DNA; Liberação da RNA polimerase da fita molde do DNA.
- 32. Afinal, qual é o destino dos RNAs na bactéria? A verdade é que a vida média de um mRNA bacteriano é muito curta, raramente ultrapassando 60 segundos; Por isso, um mRNA só é necessário por breves instantes, sendo em seguida descartado. No caso dos mRNA de procariotos, a sua degradação é controlada por um processo engenhoso. A transcrição e a tradução estão de tal forma acopladas que, imediatamente após a síntese de um pequeno trecho de mRNA, os ribossomos já se ligam a este RNA nascente, protegendo-o da degradação pelas RNases bacterianas.
- 33. Mecanismo de transcritos Uma primeira categoria em que se dividem os mecanismos reguladores, é a que consiste em ligar (indução) ou desligar (repressão) óperons em resposta a alterações ambientais (este sistema têm maior significância entre os microorganismos). A segunda categoria envolve o desencadeamento de circuitos pré- programados de óperons. Existem três categorias de genes: o regulador o operador os estruturais;
- 34. O modelo ÓPERON LAC: O regulador controla o operador e este, os estruturais; O gene regulador produz uma proteína chamada repressor ; O repressor se liga ao gene operador, impedindo a ligação da RNA pol e portanto impedindo a transcrição dos genes estruturais que codificam as enzimas de degradação da lactose; Quando o indutor (no caso a lactose) é adicionada ao sistema, este se sistema liga ao repressor, liberando o operador, o que permitirá a ligação da RNA pol ao sítio promotor e consequentemente os 3 genes estruturais serão transcritos.
- 35. •Esquema representativo do controle da transcrição dos genes para as enzimas responsáveis pelo uso da lactose em E. coli. • O repressor, produto do gene i, i liga-se ao operador (em verdade, duas moléculas), impedindo a ligação da RNA polimerase ao sítio promotor P e bloqueando a transcrição. •A lactose no citosol bacteriano liga-se ao repressor, inativando-o e liberando o promotor para ser ligado pela RNApol. • O processo de transcrição estará liberado até que a concentração citosólica de lactose seja insuficiente para garantir a inativação das moléculas do repressor.
- 36. Que importância tem o operon lac na genética molecular? Muitos dos vetores de expressão, sejam eles fagos ou plasmídeos, empregados em engenharia genética, têm o gene clonado sob o controle de um promotor/operador lac. Este sistema propicia o controle da expressão do gene clonado através da adição de um análogo da lactose, o IPTG (isopropiltiogalactosídeo). Este produto é muitas vezes mais efetivo que a lactose na indução da expressão do operão lac, além de não ser degradado.
- 37. Processo de Tradução O processo de tradução se inicia pela ligação da sub-unidade menor do ribossomo a um sítio (sequência) específica no mRNA chamado RBS (ribosome binding site). Esta ligação é mediada pelo pareamento de uma sequência do rRNA 16 S (que faz parte da composição da sub-unidade leve) com a sequência de Shine-Delgarno (ou RBS). À sub-unidade menor acopla-se, então, o primeiro tRNA (sempre para formil-metionina, em E. coli), e o conjunto formil-metionina desliza pelo mRNA até encontrar o códon AUG (identificado pelo anticódon correspondente no tRNA).
- 38. Sítio E ( “empty” = vazio), onde se aloja o tRNA descarregado antes de sair do ribossomo Estão representados os diversos fatores que participam do processo de tradução, além do ribossoma e dos tRNAs.
- 39. Síntese Protéica O RNAm transcrito no núcleo chega ao citoplasma e se liga a um ou mais ribossomos. O ribossomo “lê” o primeiro códon e um RNAt com o anticódon correspondente transporta um aminoácido e se liga ao códon. O ribossomo se desloca, no sentido 5’3’ e lê o próximo códon. Os aminoácidos são unidos por ligações peptídicas. Ao final da tradução o polipeptídeo se desliga e se constituí na proteína.
- 40. TRADUÇÃO: SÍNTESE PROTEICA Adição do aminoácido Terminal 3´que liga ao aminoácido - correto: pareamento do fenilalanina (Phe) códon (RNAm) com o anticódon (RNAt) Nucleotídeos modificados
- 42. Proteínas As proteínas se definem como polímeros formados pela união, mediante a cadeias peptídicas, de unidades de menor massa molecular chamadas aminoácidos; As proteínas são macromoléculas São compostos mais abundantes da matéria viva São especificas Através delas se expressam a informação genética