3S_Resumo técnica de pcr
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O documento descreve a história, técnica e aplicações da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). A PCR foi descrita por Kary Mullis em 1983 e patenteada em 1989, permitindo a replicação in vitro de DNA e ampliação de sequências específicas através de ciclos de desnaturação, anelamento e extensão. A técnica é sensível, rápida e barata, mas requer conhecimento prévio da sequência-alvo e é susceptível a contaminação.
3S_Resumo técnica de pcr
- 1. HISTÓRIA Em 1983, o processo de Reação em Cadeia de Polimerase foi descrito por Kary Mullis e em 1989 patenteado pela Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation. K. Mullis recebeu o Prémio Nobel da Química após 10 anos de sua descoberta. O QUE É A PCR? A técnica de biologia molecular por PCR promove, in vitro, a duplicação de cadeias de DNA, envolvendo nucleotídeos, sequências iniciadoras (primers) e enzimas polimerases (enzima que catalisam a reação de polimerização de ácidos nucléicos a partir dos seus monômeros). É a obtenção de muitas cópias de uma sequência específica de ácido nucléico, a partir de uma fita molde, ou seja, consiste na produção de DNA, in vitro. A TÉCNICA A Reação em Cadeia da Polimerase é feita do seguinte modo: primeiro, extrai-se o material a ser estudado: DNA, vestígios de crimes, etc. Na segunda etapa o DNA é colocado em microtubo de ensaio juntamente com a enzima taq polimerase, nucleotídeos, os primers complementares a sequência de DNA, Mg ²+ e solução tampão. Todos os “ingredientes” são colocados em uma máquina termocicladora, nas condições ideais, semelhantes às do nosso organismo, onde ocorrerão cerca de 60 ciclos, cada um deles divido em 3 etapas, sendo estas: desnaturação, anelamento e extensão. A desnaturação é uma etapa com duração entre 30s e 1min a temperatura de 92-96ºC, onde ocorre a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples através da quebra das pontes de hidrogênio. Durante o anelamento, com duração de 30s a 1min a temperatura entre 58 e 65ºC, os primers se anelam as duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase. E, é nesta etapa que se tem o seqüenciamento de DNA pelo Método de Sanger. O sequenciamento de DNA faz parte da etapa de extenção - uma etapa com duração entre 45s e 1min, a 72ºc - pois é nesta etapa que se criam condições ideais para a atividade enzimática da taq polimerase (temperatura ótima), que estimulada pela presença de magnésio, irá “completar” o seqüenciamento iniciado pelos primers, que se incorporaram nas extremidades da fita simples de DNA. Estas 3 etapas acontecem repetidas vezes até a formação de milhares de novas fitas de DNA. Após cada ciclo, o número de fragmentos se duplica, o que pode ser resumido pela fórmula matemática N = No x 2n. A leitura dos resultados é feita através da eletroforese em gel de agarose um gel que se dissolve em água fervente e geleifica quando esfria. O gel de agarose é a “Fase Estacionária”, que possui pequenos poços onde a amostra a ser analisada será colocada. Por este gel, aplica-se uma corrente elétrica e como o DNA é negativamente carregado, ele será atraído pelo pólo eletrodo positivo, migrando através do gel. O tamanho exato de um fragmento pode ser obtido através da razão de migração. Após a eletroforese em gel, os fragmentos de DNA normalmente são corados com brometo de etídeo, que possui afinidade pelo DNA e fluorece (torna-se visível) vivamente em contato com a luz ultravioleta (procedimento realizado em câmera escura). Dessa forma podem-se localizar as bandas que correspondem ao DNA e, através de comparação, descobrir se o resultado foi positivo ou negativo. VANTAGENS As vangagens de se utilizar este método são: não é necessário isolar o DNA que se pretende amplificar, mesmo que se encontre misturado com o DNA de outras espécies, uma vez que os primers definirão a especificidade; a capacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA; a elevada sensibilidade e especificidade; ser uma técnica rápida, barata e segura. LIMITAÇÕES As limitações são: a necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para sintetizar primers específicos; a relativa facilidade com que ocorre a contaminação por DNA estranho; a limitada extensão da sequência; a incorporação errônea de bases durante a replicação; substâncias que conhecidamente inibem a reação, como é o caso da hemoglobina.