TECNICAS DE AMPLIFICACAO DE ACIDOS NUCLEICOS
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1) O documento descreve técnicas de amplificação de ácidos nucleicos, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR) que envolve desnaturação, hibridação e extensão. 2) A PCR em tempo real permite monitorar a amplificação em tempo real através da detecção da fluorescência dos produtos da reação. 3) Outras técnicas incluem a amplificação baseada na sequência dos ácidos nucleicos e a amplificação mediada por transcrição.
TECNICAS DE AMPLIFICACAO DE ACIDOS NUCLEICOS
- 1. TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇAO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS RÉKA M. CANE
- 2. TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇAO DE ÁCIDOS NUCLEICOS: REACÇAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) Repetiçao de 3 processos/ etapas: 1º Desnaturalizaçao térmica do DNA. 2º Hibridaçao dos cebadores especificos (oligonucleótidos) com o DNA de cadeia simples. 3º Extensao enzimática do DNA. PASSO 1: DESNATURALIZAÇAO PASSO 2: HIBRIDAÇAO PASSO 3: EXTENSAO
- 3. MATERIAIS NECESSARIOS PARA A PCR Oligonucleótidos Tampao de reacçao Termociclador com sistema de detecçao É necessario separar as zonas de preparacao das amostras, dos reactivos, amplificaçao e detecçao. Devem-se fazer os controis positivo e negativo em cada ronda das reacçoes.
- 4. LEITURA E INTERPRETAÇAO DA PCR CONVENCIONAL Separaçao electroforética dos fragmentos amplificados – Gel de Agarosa 1º Tinçao com bromuro de etidio 2º Transiluminaçao com luz ultravioleta 3º
- 5. PCR EM TEMPO REAL Termociclador associado a um fluorímetro. A medida que os amplicones vao sendo produzidos, emitem fluorescencia. Permite quantificar, detectar mutaçoes (por discriminaçao alélica) e caracterizar os productos da PCR. Métodos de deteçao: Sondas Fret Hibridaçao de sondas especificas marcadas com 2 fluorocromos (Annealing). Sondas Taqman Sondas específicas com um fluorocromo em cada extremo (Elongaçao). CEPA SELVAGEM HETEROZIGOTO VANTAGEMS DA PCR EM TEMPO REAL Diminui o tempo de análisis; Reaçao monitorizada a tempo real; Menor risco de contaminaçao (ausencia da etapa de processamento post-PCR); Ciclos de amplificaçao más rápidos; Alta especificidade e reproduzibilidade. HOMOZIGOTO
- 6. TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇAO DE ÁCIDOS NUCLEICOS NAO BASEADAS NA REACÇAO EM CADEIA DA POLIMERASE AMPLIFICAÇAO BASEADA NA SEQUENCIA DOS ÁCIDOS NÚCLEICOS (NASBA) * Coordenaçao de 3 enzimas con 2 cebadores especificos para a sequencia diana. Ex: NucliSens (HIV,CMV). AMPLIFICAÇAO MEDIADA POR TRANSCRIPÇAO (TMA) * Transcriptase inversa, RNA polymerase, 2 cebadores complementarios do ácido núcleico diana; * Extensao exponencial do RNA. Ex: GenProbe (HIV, Mycobacterium, C. trachomatis, N. gonorrhoeae). AMPLIFICAÇAO POR MOVIMIENTO ESTÁNDAR * 1º Formaçao do ácido núcleico diana de cadeia simples + 2º Ampificaçao exponencial do ácido núcleico diana. Ex: BD Probe Tec System ( C. trachomatis, N. gonorrhoeae).
- 7. GENPROBER APTIMA COMBO2 assay Combina a técnica de amplificaçao mediada por transcripçao (TMA) com a tecnologia de ensaio dual cinético (DKA). Captura selectiva - as sondas de captura hibridam com um control interno e com as moléculas rRNA diana. O material nao unido e os possiveis inhibidores da reaçao eliminam-se mediante lavagem. Transcriptasa inversa – cria uma copia do DNA (cDNA) do ácido núcleico selecionado. RNA polimerase – inicia a transcripçao, sintetiza RNA. Os nuevos RNA servem de molde para nuevos ciclos de amplificaçao. Sondas marcadas com éster de acridinio – hibridam com os productos da amplificaçao. DKA – permite a deteçao simultanea do control interno y do RNA mediante a produçao de um flash de luz e de uma incandescencia de longa duraçao (quimioluminiscencia). 1º Preparaçao do equipamento. -Ajuste da temperatura: *62oC; *42oC; 62oC. -Limpeza de superficie e pipetas (lejía + agua 1:1). -Preparar o sistema de captura diana: verificar as garrafas de lavagem e a conexao do aspirador a bomba de vazio. 2ºPreparaçao do reagente de constituiçao. - Seguir instruçoes do fabricante. - Preparar o reagente de captura diana (TCR) e o reagente de captura diana B (TCR-B): V(TCR) = (nº reaçoes + 5 reaçoes extra) x0,1mL V(TCR-B) = V(TCR) mL/100 3º Captura diana. 4º Amplificaçao. 5º DKA. 6ºInterpretaçao dos resultados - Para todas etapas: seguir instruçoes do fabricante (varia em funçao do tipo de amostra).