Complement Activation EIA (CAE) Kit

For the qualitative determination of

total classical complement activity in
human serum by enzyme immunoassay (EIA)

Instruction Manual
Manuel dInstructions
Testanleitung
Manual de Instrucciones
Manuale di Istruzioni
Manual de instrues
Brukermanual

REF: 6200

Stillwater, Minnesota 55082-0285, U.S.A.

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00:00 AM/PM

TABLE OF CONTENTS
English ................................................................................................................ Page 1
Franais .................................................................................................................... 11
Deutsch .......................................................................................................................23
Espaol .......................................................................................................................36
Italiano.........................................................................................................................48
Portugus....................................................................................................................60
Norsk...........................................................................................................................72

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00:00 AM/PM

COMPLEMENT ACTIVATION EIA (CAE) KIT

1.

INTENDED USE

This product is intended FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE. The CAE kit contains
instructions and materials for the qualitative determination of total classical complement
activity in human serum by enzyme immunoassay (EIA).

2.

SUMMARY AND EXPLANATION

The functional evaluation of the classical complement pathway is usually carried out
together with the assessment of the components of the membrane attack complex by
means of the CH50 assay, which for decades has been the standard assay for the
functional activity of complement. The CH50 measures the complement activity required
to obtain 50% hemolysis of sheep red cells under standardized conditions. Hemolysis is
measured colorimetrically by determining the amount of hemoglobin released from the
red cells. The CH50 assay has been an important tool for the evaluation of the classical
complement pathway and the components of the membrane attack complex. However,
the test is very time-consuming and has a number of reagents that are difficult to
standardize. In addition, the sheep cells may vary extensively in their hemolytic
response to complement.1- 3
The Complement Activation EIA (CAE) combines principles of the hemolytic assay for
complement activation with the use of labeled antibodies specific for neoantigen produced as a result of complement activation. The amount of neoantigen generated is
proportional to the functional activity of C1q through C9.
In vitro activation of the complement sequence leads to the consumption of complement
components which, in turn, could lead to a decrease in their concentration. Thus, the
determination of complement proteins or complement activity is used to indicate whether
the complement system has been activated by an immunologic and/or pathogenic
mechanism. Both functional and immunochemical complement measurements are used
to evaluate patients when a complement-activating disease is suspected or an inherited
deficiency is possible. The level of complement activity evaluated by functional assays
such as CAE and CH50 take into account the rate of synthesis, degradation, and use of
the components and measure the integrity of the classical pathway as opposed to
immunochemical methods which specifically measure the concentration of various complement components.1- 3
When decreased levels of complement components or complement function are found,
an ongoing, immunologic process, leading to use of components and depression of
complement levels is considered by clinicians. Increased complement levels are usually
a nonspecific expression of an acute phase response.1- 3

3.

PRINCIPLE OF THE ASSAY

The Complement Activation EIA (CAE) test kit is a novel method for measurement of
total classical complement activity. This method uses an enzyme-conjugated monoclonal antibody specific for neoantigen of terminal complement proteins. Microtiter wells
are coated with complement activator into which a single dilution of patient or control
serum is added. The complete classical complement pathway is activated and the
cascade of C1q through C9 is formed within the well of the microtiter plate. Horseradish
peroxidase-conjugated monoclonal antibody is allowed to react with the resulting
neoantigen bound to the plate wells. After addition of chromogen, quantitation is
achieved by comparison of the resultant absorbances, measured at 450 nm, to a
reference, and verified by two controls.

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4.

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REAGENTS PROVIDED IN THE KIT

CAE Coated Strips
CAE Sample Diluent
CAE HRP Conjugate
Chromogen
Wash Buffer (10x)
CAE Stop Solution
Dilution tubes and rack
Plate Cover
CAE Calibrator
CAE Control Level 1
CAE Control Level 2
Number of tests

12 x 8 wells
1 vial, 60 mL
1 vial, 20 mL
1 vial, 22 mL
1 vial, 100 mL
1 vial, 20 mL
1 box, 96 vials
1 cover
3 vials, lyophilized
3 vials, lyophilized
3 vials, lyophilized
96

STORAGE: Upon receipt, the Reagent Set should be stored at 2-8C. The Calibrator
and Control Set should be stored at 20C. After opening, store all reagents at 2-8C
until the expiration date on the label, except for the single-use Calibrator and Controls,
which are discarded and the coated strips, which can be stored for 8 weeks.
Reagents should not be used past the expiration date.
4.1 CAE Coated Strips: ready to use reagent
Allow strips and holder to equilibrate to room temperature (20-25C) in the foil pouch to
protect wells from condensation. Once opened, reseal to assure proper closure in a
desiccated environment.
NOTE: When the pouch containing strips is first opened, the desiccant indicator MUST
be blue. If indicator is not blue, do not use the strips.
4.2 CAE Sample Diluent: ready to use reagent
Contains buffer, green dye and preservative. NOTE: Do not use if the diluent appears
turbid.
4.3 CAE HRP Conjugate: ready to use reagent
Contains monoclonal antibody conjugated with horseradish peroxidase. NOTE: Do not
use if the conjugate appears turbid.
4.4 Chromogen: ready to use reagent
Buffered substrate and chromogen (3,3, 5,5 Tetramethylbenzidine [TMB]). Protect from
light. NOTE: Do not use if blue precipitate is present.
4.5 Wash Buffer (10X): liquid solution
Contains phosphate buffer and Tween. The 1X Wash Buffer is stable when stored at
room temperature (20-25C) for 2 months. NOTE: Do not use if buffer is turbid. Some
crystallization may occur in the 10X Wash Buffer when stored refrigerated. Redissolve at
room temperature (20-25C) before dilution.
4.6 CAE Stop Solution: ready to use reagent
Contains 2N Sulfuric Acid. See Warnings and Precautions section.
4.7 CAE Calibrator: lyophilized human serum
(Package as Catalog Number 6300)
See Warning and Precautions section. The reconstituted calibrator is stable when
placed on ice for up to four hours. Discard after use. The calibrator has been calibrated
against an established CH50 method. Any comparison with other products or
procedures should be done with this method. The kit calibrator demonstrates
commutability with patient samples when used with reagents and operating procedure of
this in vitro diagnostic test as recommended.
Calibrator CAE value is listed on the vial label.
NOTE: Do not use if the lyophilized material appears moist or sticky.

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4.8 CAE Control Sera (Level 1, Level 2): lyophilized human serum
(Package as Catalog Number 6300)
See Warnings and Precautions section. The reconstituted Controls are stable when
placed on ice for up to four hours. Discard after use. Control CAE value ranges are listed
on the vial labels.
NOTE: Do not use if the lyophilized material appears moist or sticky.

5.

WARNINGS AND PRECAUTIONS

FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY.

Reagents Containing Human Source Material

CAUTION: Controls and Calibrator contain Human Serum. Treat as potentially
infectious.
Each serum/plasma donor unit used in the preparation of this product has been tested
by a U.S. FDA approved method and found non-reactive for the presence of HBsAg,
antibody to HCV and antibody to HIV 1/2. While these methods are highly accurate, they
do not guarantee that all infected units will be detected. This product may also contain
other human source material for which there is no approved test. Because no known test
method can offer complete assurance that hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus
(HCV), Human Immunodeficiency Virus (HIV) or other infectious agents are absent, all
products containing human source material should be handled in accordance with good
laboratory practices using appropriate precautions as described in the U.S. Centers for
Disease Control and Prevention/National Institutes of Health Manual, Biosafety in
Microbiological and Biomedical Laboratories, 4th., May 1999 or current edition.
ADDITIONAL WARNINGS
Stop Solution (2N Sulfuric Acid) May cause severe burns upon contact with skin.
Do not get in eyes, on skin, or on clothing. Do not ingest or inhale fumes. On contact,
flush with copious amounts of water for at least 15 minutes.
European Communities Hazardous Substance Risk Phrases (Council Directive
1999/45 EC)
R34 - Causes burns.
S26 - In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek
medical attention.
S30 - Never add water to this product.
S37/39 - Wear suitable gloves and eye/face protection.
Chromogen: This product contains 3,3',5,5' Tetramethylbenzidine (TMB) (0.05%)
which has shown possible mutagenic effects in laboratory experiments.

6.

SPECIMEN REQUIREMENTS

Blood samples are to be collected using aseptic venipuncture technique and serum
obtained using standard complement procedures. A minimum of 5 mL of whole blood is
recommended. Allow blood to clot in red-top tubes, without serum separator, for 6065 minutes at room temperature (20-25C). Centrifuge blood samples in a refrigerated
centrifuge and transfer cell-free serum to a clean tube. Sera must be handled properly to
prevent in vitro complement activation. Sera should be frozen at -70C or lower in tightly
sealed sterile tubes for extended storage or for transport on dry ice. Samples should not be
frozen and thawed more than three times. Self-defrosting freezers are not recommended as
sample may desiccate and/or complement degradation may occur.
Elevated levels of hemoglobin (5 mg/dL), bilirubin (20 mg/dL), cholesterol (10 mg/dL)
and triglycerides (4926 mg/dL) spiked into a low serum pool have been shown to not
alter CAE test results. Reliability of results from human plasma or contaminated,
particulated, or heat-inactivated specimens is unknown. Mishandling of samples may
produce erroneous results.

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7.

EQUIPMENT AND MATERIALS REQUIRED, BUT NOT SUPPLIED

7.1
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
7.10
7.11

8.

00:00 AM/PM

Plate washing system, manual or automated.

1000 mL buffer reservoir.
Timer (60 minute range).
Absorbent paper towels.
Reagent Reservoirs (Cat. No. 4505).
EIA plate reader capable of reading at 450 nm.
Incubator, 37 2C.
Pipettes: (5-20 L, 20-1000 L) or autodilutor.
Multichannel Pipette (50-150 L).
One liter graduated cylinder.
Purified water

WELL IDENTIFICATION
Blanks, Controls, Calibrator, and patients samples may need to be positioned differently
as required by the EIA plate reader manufacturer. The following plate configuration is
recommended (see FIGURE 1).
BLANK: Run in duplicate.
CALIBRATOR: Run in quadruplicate.
CONTROLS AND PATIENT SAMPLES: Run in duplicate.

FIGURE 1: Microtiter Plate Configuration

1
A
B
C
D
E
F
G
H

BLANK
CAL.
CAL.
LEVEL 2
LEVEL 1
SAMPLE 1
SAMPLE 2
SAMPLE 3

9.

2
BLANK
CAL.
CAL
LEVEL 2
LEVEL 1
SAMPLE 1
SAMPLE 2
SAMPLE 3

10

11

12

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

SERUM AND REAGENT PREPARATION

9.1
9.2
9.3
9.4

Allow unopened pouched Plate strips, Wash Buffer, HRP Conjugate,

Chromogen, and Stop Solution to equilibrate to room temperature (20-25C).
Serum samples should be partially thawed while attended by briefly placing in a
37 2C water bath with gentle mixing. Place immediately in an ice bath.
Place Sample Diluent, Purified Water, Controls, Calibrator, and thawed
patient samples on ice prior to use.
Preparation of Controls and Calibrator.
a. Remove the vials from ice.
b. Gently tap down all lyophilized material to the bottom of the vial and
carefully remove the crimp seal and stopper.
c. Immediately add 0.1 mL of cold (2-8C) purified water directly to the
lyophilized material.
d. Replace the stopper securely.
e. Allow the vial to stand on ice for 5 -10 minutes with occasional gentle
shaking or vortexing, until completely dissolved.
The reconstituted Controls and Calibrator can be stored for up to
4 hours prior to use if kept at 2-8C or on ice.

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9.5

9.6

00:00 AM/PM

To prepare 1X Wash Buffer, pour the contents of the 10X Wash Buffer bottle
into a 1000 mL container. Rinse the bottle with purified water to remove
residual liquid and add the rinse to the container. Add purified water until total
volume of 1000 mL is reached. Mix until completely dissolved.
Separate the Dilution Tube Rack and partially fill the bottom section with ice
and add water in order to form an ice bath. Reinsert the dilution tube holder
into the rack

10. ASSAY PROCEDURE

10.1
10.2

10.3

10.4

10.5
10.6
10.7

10.8
10.9
10.10
10.11
10.12
10.13

10.14

Prepare sera and reagents as described in the previous section.

Remove plate from the foil pouch being careful not to touch the optical
surface on the bottom of the wells. Strips should be used only if the desiccant
included in the pouch is blue when first opened. Remove appropriate number
of strips to be used and label to avoid confusion. Replace the remaining
strips in the foil pouch, reseal and return to refrigeration for future use.
Dilution of Serum Samples Using the Dilution Tube Rack, dilute Calibrator,
each Control, and patient serum 1:120 (5 L + 595 L) with cold Sample
Diluent. Vortex diluted material in each tube three times and return dilution
tube to ice bath.
Sample Addition Pipette 150 L of each diluted Calibrator, Control, and
patient sera into duplicate wells using a multichannel pipette. For the Blank,
pipette 150 L of Sample Diluent into duplicate wells, then subsequently treat
as sample wells.
Complement Activation Cover and incubate the plate undisturbed at
37 2C for 60 minutes.
Discard Sera from the wells by decanting or aspirating with a vacuum device.
Wash Completely fill all wells with 1X Wash Buffer (300 L or greater per
well). Soak for 30 seconds. Empty by shaking into disposal container or
aspirate. Repeat two more times for a total of three washes. Automated
washer systems used for washing strips should be adjusted to permit a
30-second soak cycle between steps.
NOTE: Erroneous results may occur if wells are not completely filled during
wash cycle. Residual liquid should be removed by holding the plate with
enough pressure to keep the strips in the frame and repeatedly striking the
plate several times while it is upside down onto a paper towel or other
absorbent surface.
HRP Conjugate Addition Pipette 150 L of HRP Conjugate into each well
using a multichannel pipette.
Binding of HRP Conjugate Cover and incubate the plate undisturbed at
37 2C for 30 minutes.
Wash Discard conjugate from wells and wash plate as described in step 7.
Chromogen Addition Add 150 L of Chromogen to each well using a multichannel pipette.
Color Development Cover and incubate the plate undisturbed at room
temperature (20-25C) for 30 minutes. DO NOT WASH PLATE!
Stop Color Development To stop reaction at the end of the Chromogen
incubation, pipette 100 L of Stop Solution (2N Sulfuric Acid) into all of the
wells at the same regular intervals and in the same order that the prepared
Chromogen was added. Gently tap the plate to disperse Stop Solution. The
color will change from blue to yellow.
Read Plate at 450 nm on an EIA Plate Reader Read and record the results at
450 nm within 30 minutes.

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11. PROCEDURAL COMMENTS

11.1

Careful use of properly calibrated pipetting devices and plate readers will
significantly enhance the accuracy and reproducibility of the CAE test kit.
11.2 Incubation times or temperatures other than those stated in this insert
may affect the results.
11.3 Use all components at their recommended temperatures.
11.4 Air bubbles in assay wells lower binding efficiency.
11.5 Touch pipette tips to side of well before withdrawing.
11.6 Washing procedures other than those stated in this insert may adversely
affect the results.
11.7 Use aseptic technique to avoid contamination of reagents which may cause
erroneous results. Store 1X Wash Buffer in a clean container to avoid contamination.
11.8 Sterile or disposable glass or plasticware is recommended. Re-usable
glassware should be washed thoroughly and rinsed free of all detergents with
purified water. Do not re-use wells.
11.9 Do not allow wells to dry once the procedure has begun. Avoid exposure to
strong light while running the assay.
11.10 Do not interchange kit reagents with reagents from other suppliers. The
reagents in these tests are optimized to detect total complement according to
specifications. Dilution or adulteration will result in loss of sensitivity. Crosscontamination of reagents and patient samples or use of reagents other than
those supplied in this kit may produce erroneous results.
11.11 No assurance is given that these reagents are free of microbial
contamination.

12. QUALITY CONTROL

12.1
12.2
12.3
12.4
12.5
12.6

Calibrator and Controls must be run with each test run.

The Blank must have an absorbance lower than 0.15 when read at 450 nm.
The Level 1 Control must have an average absorbance (ABS) lower than that
of the Calibrator.
The Level 2 Control must have an average absorbance (ABS) higher than
that of the Calibrator.
Control values must fall within their labeled CAE unit ranges.
The test is valid if ALL of the above criteria are met.

13. CALCULATION OF RESULTS

Results are expressed relative to the Calibrator as CAE units. Determine the results
using the formula below.
Reference
Serum CAE units

Avg Sample (ABS) Avg Blank (ABS)

Avg Reference (ABS) Avg Blank (ABS) = CAE Units of Sample

Patient results are reported as low or normal/high CAE based upon the cut-off
established using an appropriate reference population.
Interpretation of Results
Based upon normal range studies, DiaSorin has established a cut-off of 60 CAE units to
define low complement activity. Patient samples reading above 60 CAE units are
reported as normal/high for CAE. Each laboratory should establish their own cut-off to
determine low CAE values.

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14. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE

14.1
14.2

Absorbances above 3.0 are above the reportable limits of the assay and
should be so reported.
CAE test results in and of themselves are not diagnostic. Assay results are to
be interpreted in conjunction with other laboratory tests as well as the clinical
presentation of the patient.

15. EXPECTED VALUES

Normals
The CAE assay was performed by DiaSorin using serum samples obtained from
apparently healthy individuals. All samples gave results above the established cut-off
and would be classified as normal/high.
Table 1: REPRESENTATIVE NORMAL RANGE STUDY
Mean
Standard Deviation
n
(CAE Units)
(CAE Units)
102
104
20.4

Range
(CAE Units)
63-145

16. PERFORMANCE DATA

16.1 PRECISION
The DiaSorin CAE kit precision was evaluated using modified principles from the
National Committee for Clinical Laboratory Standards Guideline Evaluation of Precision
Performance of Clinical Chemistry Devices: (EP5-T2).
Seven samples were tested in duplicate over a 10 day period at 3 sites. Duplicate wells
were prepared from a single dilution of each sample. The samples are pools prepared
from human sera chosen to span the range of complement activation activity from low to
high levels. All data was pooled for analysis. Outliers were defined as observations
whose standardized CAE values were more than 2.6 standard deviations from zero.
Outliers were deleted and the remaining data was subject to Analysis of Variance
(ANOVA) to obtain estimates of within-run, between day, between site and total
precision.
Final results are shown in Table 2 below. Values are based upon CAE units as defined
in Calculation of Results Section.
TABLE 2: CAE Precision
(Values in CAE Units)
Within run

Between day

Between site

Total

Sample

Mean

Std.
Dev.

%C.V.

Std.
Dev.

%C.V.

Std.
Dev.

%C.V.

Std.
Dev.

60

10.7

2.131

19.9

1.865

17.5

1.111

10.4

3.042

28.5

58

12.0

1.210

10.1

1.422

11.9

1.327

11.1

2.291

19.1

60

25.3

3.032

12.0

2.354

9.3

1.728

6.8

4.209

16.7

58

83.4

5.685

6.8

9.088

10.9

0.000

0.0

10.720

12.9

60

134.2

5.916

4.4

11.832

8.8

10.158

7.6

16.679

12.4

60

146.6

6.308

4.3

9.158

6.2

10.879

7.4

15.557

10.6

59

147.7

5.170

3.5

4.829

3.3

11.229

7.6

13.272

9.0

16.2 Trueness: THE ASSAY TRUENESS HAS BEEN CHECK BY

COMPARISON (COMPARISON TO THE CH50 METHOD).
Accuracy
The CAE assay was compared to both a commercially available CH50 test
with the Kent Fife CH50 procedure used by an established Immunology
Laboratory. Test results were classified as either low or normal/high
established cut-off values for each method.

%C.V.

METHOD

as well as
Reference
using the

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Using the CH50 method as the reference (or true method), relative sensitivity, relative
specificity, and overall agreement were calculated as follows:
Relative Sensitivity =

Number of true lows (low in both assays)

Number true lows + Number of CAE normal/high samples

Relative Sensitivity =

Number of true normal/highs (normal/highs in both assays)

(Number true normal/high + Number of CAE low samples)

Overall Agreement =

Number of true lows + Number of true normal/high samples

Total number samples tested

Table 3: KENT FIFE CH50 VS. CAE

CAE
Low

Normal/High

Low

48

50

Relative sensitivity

96%

Normal/High

71

73

Relative specificity

97%

Total

50

73

123

Overall agreement

97%

Kent Fife
CH50

Total

Figure 3: KENT FIFE CH50 VS. CAE

250

Norm al / High

CAE units

200

150

100

Low

50

0
0

50

100

150

200

250

CH50 Units

300

350

400

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Table 4: COMMERCIAL CH50 VS. CAE

Commercial
CH50

Low

CAE
Normal/High

Total

Low

20

22

Normal/High

57

57

Total

20

59

79

Relative
sensitivity
Relative
specificity
Overall
agreement

Figure 4: COMMERCIAL CH50 VS. CAE

300
Normal / High
250

CAE Units

200

150

100

50
Low
0
0

50

100

150

200

250

Commercial CH50 Units

300

350

400

91%
100%
97%

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TROUBLESHOOTING
Problem
Control CAE values out of range.

All test results negative.

All test results positive.

Possible Causes
1. Incorrect temperature, timing or
pipetting; reagents not mixed.

2.
3.
4.

Cross contamination of controls.

Improper dilution.
Optical pathway not clean.

5.
6.

Wavelength of filter incorrect.

Overdilution or underdilution of
calibrators.

1.

2.

One or more reagents not

added, or added in wrong
sequence.
Conjugate activity lost.

3.
4.

Improper dilution of wash buffer.

Coated plate inactive.

3.
4.

1.

Contaminated chromogen
solution.
Contaminated buffers and
reagents.
Wash Buffer (1X) contaminated.

1.

2.
3.

Poor precision (Duplicate

absorbance readings greater
than 20% of their mean).

Solution
1.
Check that temperature was correct.
Check that time was correct. See
Poor Precision (below) No. 2 - 4.
Repeat test.
2.
Pipette carefully.
3.
Repeat test.
4.
Check for moisture or dirt. Wipe
bottom and reread if stop solution
used.
5.
Change filter to 450 5 nm.
6.
Recheck procedure. Redilute
calibrator, controls, and samples.
Repeat test.
1.
Recheck procedure. Check for
unused solutions. Repeat test.
2.

2.
3.

4.
1.

Improper dilution of serum.

Pipettor delivery CV greater than
5% or samples not added slowly.

4.
1.

2.

Serum or reagents not mixed

sufficiently; reagents not at right
temperature prior to addition.
Reagent addition taking too long;
inconsistency in timing intervals,
air bubbles.

2.

Air currents blowing over plate

during incubations.
Optical pathway not clean.

4.

3.

4.
5.

6.

3.

5.

Instrument not equilibrated

before readings were taken.
Washing not consistent; trapped
bubbles; liquid left in wells at end
of wash cycle.

6.

7.

8.

Improper pipetting.

8.

SEE LAST PAGE FOR REFERENCES

10

7.

Remove a small amount of

chromogen into a test tube (approx.
0.1 mL) and pipette conjugate (5-10
L) directly into chromogen. Solution
should rapidly turn blue.
Redilute wash buffer. Repeat test.
Check desiccant color. Check for
obvious moisture in unused wells.
Rerun test with controls only for
activity. Check conjugate activity as in
No. 2 above.
Check absorbance of unused
chromogen solution.
Check all solutions for turbidity.
Check purified water supply used to
dilute buffer. Should have resistivity
greater than 5 megaohms.
Redilute samples. Repeat test.
Check calibration of pipettor. Use
reproducible technique.
Mix all reagents gently but thoroughly
and equilibrate to appropriate
temperature.
Develop consistent uniform technique
and avoid splashing or use
multipipetting device or autodispenser
to decrease time.
Cover plate or place in chamber.
Wipe bottom of plate with soft tissue.
Check instrument light source and
detector for dirt.
Check instrument manual for warm
up procedure.
Use only acceptable washing devices.
Lengthen timing delay on automated
washing devices or increase number
of wash cycles. Check that all wells
are filled and aspirated uniformly.
Dispense liquid above level of reagent
in well.
Avoid air bubbles in pipette tips.
Ensure tips are tightly secured.

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00:00 AM/PM

TROUSSE CAE DE DOSAGE IMMUNO-ENZYMATIQUE DE

L'ACTIVATION DU COMPLMENT
1.

INDICATION
Ce produit est destin UN USAGE DIAGNOSTIQUE IN VITRO. La trousse CAE
contient des instructions et des ractifs permettant d'effectuer la dtermination
qualitative de l'activit classique du complment total dans le srum humain par dosage
immuno-enzymatique (EIA).

2.

RSUM ET COMMENTAIRE

L'valuation fonctionnelle de la voie classique d'activation du complment va gnralement

de pair avec l'valuation des composants du complexe lytique via le dosage du CH50 qui,
pendant des dcennies, a t la mthode de dtermination standard de l'activit
fonctionnelle du complment. Le CH50 mesure l'activit du complment ncessaire
l'obtention d'une hmolyse 50 % des globules rouges de mouton dans des conditions
normalises. L'hmolyse est mesure par colorimtrie en dterminant la quantit
d'hmoglobine libre par les globules rouges. Le dosage du CH50 constitue un outil majeur
d'valuation de la voie classique d'activation du complment et des composants du
complexe lytique. Toutefois, ce test est trs long et comporte un certain nombre de ractifs
difficiles normaliser. Par ailleurs, la raction hmolytique des cellules de mouton face au
complment peut varier de faon significative.1- 3
Le dosage immuno-enzymatique de l'activation du complment (CAE) associe les
principes du dosage hmolytique de l'activation du complment l'utilisation d'anticorps
marqus spcifiquement dirigs contre un noantigne produit par l'activation du
complment. La quantit de noantigne gnre est proportionnelle l'activit
fonctionnelle de C1q C9.
L'activation in vitro de la squence du complment engendre la consommation des
composants de celui-ci qui, son tour, pourrait aboutir une diminution de leur
concentration. Ainsi, la dtermination des protines ou de l'activit du complment
permet d'indiquer si le systme complmentaire a t activ par un mcanisme
immunologique et/ou pathogne. Les mesures fonctionnelles et immunochimiques du
complment visent valuer des patients en cas de suspicion de maladie activatrice du
complment ou de possibilit d'une dficience congnitale. Les dosages fonctionnels
tels que le CAE ou le CH50, qui permettent d'valuer le niveau d'activit du
complment, tiennent compte de la vitesse de synthse, de dgradation et d'utilisation
des composants et mesurent l'intgrit de la voie classique, contrairement aux
mthodes immunochimiques qui mesurent spcifiquement la concentration de diffrents
composants du complment.1- 3
En cas de diminution des niveaux de composants du complment ou de chute de sa
fonction, les mdecins envisagent un processus immunologique volutif qui aboutit
l'utilisation des composants et la rduction des niveaux de complment. Une hausse
des niveaux de complment constitue gnralement un signe aspcifique d'une raction
de phase aigu.1- 3

3.

DESCRIPTION DE LA MTHODE DE DOSAGE

La trousse de dosage immuno-enzymatique de l'activation du complment (CAE) est

une mthode novatrice de mesure de l'activit classique du complment total. Elle utilise
un anticorps monoclonal conjugu une enzyme, qui est spcifique d'un noantigne
des protines terminales du complment. Les cupules d'une plaque de microtitrage sont
enduites d'activateur de complment auquel est ajoute une dilution unique de srum du
patient ou de contrle. La voie classique d'activation du complment total est active et
les ractions en cascade de C1q C9 se forment dans les cupules de la microplaque.
L'anticorps monoclonal conjugu la peroxydase de raifort ragit alors avec le
noantigne qui en rsulte et qui est fix aux cupules de la plaque. Une fois le
chromogne ajout, la dtermination quantitative est obtenue par comparaison de
l'absorbance de la rsultante, mesure 450 nm, une rfrence. Elle est ensuite
vrifie par deux contrles.

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ECO Number: ?????

4.

00:00 AM/PM

RACTIFS FOURNIS DANS LA TROUSSE

Bandes enduites CAE
Diluant d'chantillon CAE
Conjugu de peroxydase de raifort CAE
Chromogne
Tampon de lavage (10x)
Solution d'arrt CAE
Tubes de dilution et portoir
Couvercle de plaque
talon CAE
Contrle CAE de niveau 1
Contrle CAE de niveau 2
Nombre de dosages

Cupules 12 x 8
1 flacon, 60 mL
1 flacon, 20 mL
1 flacon, 22 mL
1 flacon, 100 mL
1 flacon, 20 mL
1 bote, 96 flacons
1 couvercle
3 flacons, lyophiliss
3 flacons, lyophiliss
3 flacons, lyophiliss
96

CONSERVATION : ds rception, le jeu de ractifs doit tre stock entre 2 et 8 C. L'talon

et le jeu de contrles doivent tre conservs une temprature de -20 C. Aprs ouverture,
conservez tous les ractifs entre 2 et 8 jusqu' la date de premption indique sur
l'tiquette, hormis l'talon et les contrles usage unique, qui doivent tre jets, et les
bandes enduites, qui peuvent tre conserves pendant 8 semaines.
Les ractifs ne doivent pas tre utiliss au-del de la date de premption.
4.1 Bandes enduites CAE : ractif prt l'emploi
Laissez les bandes et leur support s'adapter la temprature ambiante (20 25 C)
dans le sachet en aluminium afin de protger les cupules de la condensation. Une fois
ouvert, obturez nouveau le sachet pour garantir une fermeture adquate dans un
environnement dshydrat.
REMARQUE : lors de la premire ouverture du sachet contenant les bandes, l'indicateur
du dshydratant DOIT tre bleu. Si ce n'est pas le cas, n'utilisez pas les bandes.
4.2 Diluant d'chantillon CAE : ractif prt l'emploi
Contient un tampon, un colorant vert et un conservateur. REMARQUE : n'utilisez pas le
diluant s'il est trouble.
4.3 Conjugu de peroxydase de raifort CAE : ractif prt l'emploi
Contient un anticorps monoclonal conjugu de la peroxydase de raifort.
REMARQUE : n'utilisez pas le conjugu s'il est trouble.
4.4 Chromogne : ractif prt l'emploi
Substrat tamponn et chromogne (Ttramthylbenzidine [TMB] 3,3, 5,5).
Protgez-le de la lumire. REMARQUE : ne l'utilisez pas en cas de prcipit bleu.
4.5 Tampon de lavage (10X) : solution liquide
Contient un tampon phosphat et du polysorbate. Le tampon de lavage 1X est stable
lorsqu'il est conserv temprature ambiante (20 25 C) pendant 2 mois.
REMARQUE : n'utilisez pas le tampon s'il est trouble. Le tampon de lavage 10X peut
lgrement cristalliser lorsqu'il est rfrigr. Laissez dissoudre nouveau temprature
ambiante (20 25 C) avant dilution.
4.6 Solution d'arrt CAE : ractif prt l'emploi
Contient de l'acide sulfurique 2N. Voir la section Avertissements et prcautions.
4.7 talon CAE : srum humain lyophilis
(Conditionnement sous numro de catalogue 6300)
Voir la section Avertissements et prcautions. L'talon reconstitu est stable lorsqu'il est
plac sur de la glace pendant quatre heures maximum. Jetez-le aprs utilisation.
L'talon a t calibr selon une mthode CH50 avre. Toute comparaison avec
d'autres produits ou procdures doit tre faite sur la base de cette mthode. L'talon de
la trousse dmontre sa commutabilit avec les chantillons des patients lorsqu'il est
utilis avec des ractifs et selon le mode d'emploi de ce dosage diagnostique in vitro,
comme recommand.

12

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ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

La valeur de l'talon CAE est stipule sur l'tiquette du flacon.

REMARQUE : n'utilisez pas le produit lyophilis s'il est humide ou collant.
4.8 Srums de contrle CAE (niveaux 1 et 2) : srum humain lyophilis
(Conditionnement sous numro de catalogue 6300)
Voir la section Avertissements et prcautions. Les contrles reconstitus sont stables
lorsqu'ils sont placs sur de la glace pendant quatre heures maximum. Jetez-les aprs
utilisation. Les plages de valeurs des contrles CAE sont stipules sur les tiquettes des
flacons.
REMARQUE : n'utilisez pas le produit lyophilis s'il est humide ou collant.

5.

AVERTISSEMENTS ET PRCAUTIONS

POUR USAGE DIAGNOSTIQUE IN VITRO UNIQUEMENT.

REACTIFS CONTENANT DES PRODUITS D'ORIGINE HUMAINE

ATTENTION : les contrles et l'talon contiennent du srum humain. Traitez-les
comme potentiellement infectieux.
Chaque don de srum/plasma intervenant dans la prparation de ce produit a t test
par une mthode agre par la FDA et s'est avr non ractif en prsence de HBsAG,
d'anticorps anti-VHC et d'anticorps anti-VIH1/2. Mme si ces mthodes sont
extrmement prcises, elles ne garantissent pas la dtection de tous les dons infects.
Ce produit peut galement contenir d'autres produits d'origine humaine pour lesquels il
n'existe aucun test agr. Comme aucune mthode de test connue ne peut offrir
l'assurance complte de l'absence du virus de l'hpatite B (HBV) ou de l'hpatite C
(HCV), du virus de l'immunodficience humaine (VIH) ou d'autres agents infectieux, tous
les produits d'origine humaine doivent tre manipuls conformment aux bonnes
pratiques de laboratoire en prenant les prcautions appropries dcrites dans le
document U.S. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health
Manual, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 4 mai 1999 ou
dernire dition.
AVERTISSEMENTS SUPPLEMENTAIRES
Solution d'arrt (acide sulfurique 2N) : peut causer de graves brlures en cas de
contact avec la peau. vitez absolument tout contact avec les yeux, la peau et les
vtements. N'ingrez pas et n'inhalez pas les vapeurs. En cas de contact, rincez
grande eau pendant au moins 15 minutes.
Dclaration des risques relatifs aux substances dangereuses des communauts
europennes (Directive du conseil 1999/45/CE)
R34 - Cause des brlures.
S26 - En cas de contact avec les yeux, rincez immdiatement grande eau et consultez
un mdecin.
S30 - N'ajoutez jamais d'eau ce produit.
S37/39 - Portez des gants et des lunettes/un masque de protection adapts.
Chromogne : ce produit contient du Ttramthylbenzidine (TMB) 3,3',5,5' (0.05 %)
qui a dmontr des effets mutagnes potentiels lors d'expriences en laboratoire.

6.

BESOINS EN CHANTILLONS

Les chantillons sanguins doivent tre prlevs par une technique de ponction veineuse
aseptique et le srum doit tre obtenu l'aide de procdures complmentaires standard.
Un minimum de 5 mL de sang total est recommand. Laissez le sang coaguler dans les
tubes rouges, sans sparateur de srum, pendant 60 65 minutes temprature
ambiante (20 25 C). Centrifugez les chantillons sanguins dans une centrifugeuse
rfrigre et transfrez le srum acellulaire dans une prouvette propre. Les srums
doivent tre manipuls correctement pour viter une activation in vitro du
complment. Ils doivent tre congels au minimum 70 C dans des tubes striles
hermtiquement ferms pour une conservation prolonge ou pour leur transport sur
glace sche. Les chantillons ne doivent pas tre congels puis dcongels plus de
trois fois. Les conglateurs dgivrage automatique ne sont pas conseills cause du
risque de desschement des chantillons et/ou de dgradation du complment.

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ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

Il a t prouv que des taux importants d'hmoglobine (5 mg/dL), de bilirubine

(20 mg/dL), de cholestrol (10 mg/dL) et de triglycrides (4926 mg/dL) dops dans un
ensemble de srum faiblement concentr n'affectent pas les rsultats du dosage CAE.
La fiabilit des rsultats obtenus partir de plasma humain ou bien d'chantillons
contamins, particulaires ou inactivs par la chaleur est inconnue. Une manipulation
incorrecte des chantillons peut produire des rsultats errons.

7.

MATRIEL ET PRODUITS REQUIS MAIS NON FOURNIS

7.1
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
7.10
7.11

8.

Systme de lavage des plaques, manuel ou automatis.

Rservoir de tampon de 1000 mL.
Minuteur (plage de 60 minutes).
Serviettes en papier absorbant.
Rservoirs de ractifs (n de cat. 4505).
Lecteur de plaque de dosage immuno-enzymatique capable de lire 450 nm.
Incubateur, 37 2 C.
Pipettes : (5 20 L, 20 1000 L) ou diluteur automatique.
Pipette multicanaux (50 150 L).
prouvette gradue d'un litre.
Eau purifie

IDENTIFICATION DES CUPULES

Vous devrez peut-tre positionner diffremment les tmoins, les contrles, l'talon et les
chantillons des patients en fonction des instructions du fabricant du lecteur de plaque
de dosage immuno-enzymatique. La configuration de plaque suivante est conseille
(voyez la FIGURE 1).
TMOIN : dos en double.
TALON : dos quatre fois.
CONTRLES ET CHANTILLONS DES PATIENTS : doss en double.

FIGURE 1 : configuration de la plaque de microtitrage

1
A
B
C
D
E
F
G
H

TMOIN
TALON
TALON
NIVEAU 2
NIVEAU 1
CHANTILLON 1
CHANTILLON 2
CHANTILLON 3

9.

TMOIN
TALON
TALON
NIVEAU 2
NIVEAU 1
CHANTILLON 1
CHANTILLON 2
CHANTILLON 3

10

11

12

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

PRPARATION DES SRUMS ET DES RACTIFS

9.1

9.2

9.3

Laissez les bandes, le tampon de lavage, le conjugu de peroxydase de

raifort, le chromogne et la solution d'arrt, dont les sachets ne sont pas
encore ouverts, s'adapter la temprature ambiante (20 25 C).
Vous devez partiellement dcongeler les chantillons de srum, tout en les
surveillant. Pour cela, placez-les brivement dans un bain d'eau 37 2 C en
les remuant dlicatement. Disposez-les immdiatement dans un bain de glace.
Placez le diluant d'chantillon, l'eau purifie, les contrles, l'talon et les
chantillons dcongels des patients sur de la glace avant toute utilisation.

14

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ECO Number: ?????

9.4

9.5

9.6

00:00 AM/PM

Prparation des contrles et de l'talon.

a. Retirez les flacons de la glace.
b. Faites descendre tout le produit lyophilis au fond du flacon en le
tapotant dlicatement et retirez avec soin la bague de sertissage et le
bouchon.
c. Ajoutez immdiatement 0.1 mL d'eau purifie froide (2 8 C)
directement sur le produit lyophilis.
d. Remettez bien le bouchon en place.
e. Laissez le flacon reposer sur de la glace 5 10 minutes en l'agitant
manuellement ou sur un mlangeur Vortex de temps autre, jusqu'
dissolution complte de son contenu.
Les contrles et l'talon reconstitus peuvent tre conservs 4 heures
maximum avant utilisation s'ils sont rfrigrs 2-8 C ou placs sur
de la glace.
Pour prparer le tampon de lavage 1X, versez le contenu du flacon de
tampon de lavage 10X dans un rcipient de 1000 mL. Rincez le flacon avec
de l'eau purifie afin de rcuprer le liquide rsiduel et ajoutez l'eau de
rinage au rcipient. Ajoutez de l'eau purifie jusqu' atteindre le volume total
de 1000 mL. Mlangez jusqu' dissolution complte.
Dtachez le portoir des tubes de dilution et remplissez partiellement la partie
infrieure avec de la glace, puis ajoutez de l'eau pour former un bain de
glace. Rinsrez le support des tubes de dilution dans le portoir.

10. PROCDURE DE DOSAGE

10.1
10.2

10.3

10.4

10.5
10.6
10.7

Prparez les srums et les ractifs selon les instructions donnes au

paragraphe prcdent.
Retirez la plaque du sachet en aluminium en prenant soin de ne pas toucher
la surface optique situe au fond des cupules. Les bandes ne doivent tre
utilises que si le dshydratant inclus dans le sachet est bleu lors de sa
premire ouverte. Retirez le nombre adquat de bandes utiliser et
tiquetez-les pour viter de les confondre. Replacez les bandes restantes
dans le sachet en aluminium, obturez-le nouveau et replacez le tout au
rfrigrateur pour une utilisation ultrieure.
Dilution des chantillons de srum. En utilisant le portoir des tubes de dilution,
diluez l'talon, chaque contrle et le srum patient 1:120 (5 L + 595 L) avec
du diluant d'chantillon froid. Diluez le produit contenu dans chaque prouvette
trois fois sur le mlangeur Vortex et replacez le tube de dilution dans le bain de
glace.
Ajout des chantillons. Pipetez 150 L de l'talon, du contrle et des srums
patients, tous dilus, dans des cupules en double l'aide d'une pipette
multicanaux. Pour le tmoin, pipetez 150 L de diluant d'chantillon dans des
cupules en double. Traitez-les ensuite comme des cupules d'chantillons.
Activation du complment. Couvrez la plaque d'chantillons non perturbs et
mettez-la en incubation 37 2 C pendant 60 minutes.
Retirez les srums des cupules par dcantation ou aspiration l'aide d'un
appareil sous vide.
Lavage. Remplissez compltement l'ensemble des cupules de tampon de
lavage 1X (300 L au minimum par cupule). Laissez tremper 30 secondes.
Videz en secouant dans le rcipient dchets ou en aspirant. Rptez
l'opration deux fois de plus pour atteindre un total de trois lavages. Les
systmes de lavage automatiss utiliss pour laver les bandes doivent tre
rgls afin de prvoir un cycle de trempage de 30 secondes entre les tapes.

15

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ECO Number: ?????

10.8
10.9

10.10
10.11
10.12

10.13

10.14

00:00 AM/PM

REMARQUE : des rsultats errons peuvent tre obtenus si les cupules ne

sont pas totalement remplies pendant le cycle de lavage. Le liquide rsiduel
doit tre retir. Pour cela, tenez la plaque l'envers en exerant une pression
suffisante pour que les bandes y restent et tapez la plaque plusieurs
reprises sur une serviette en papier ou tout autre surface absorbante.
Ajout du conjugu de peroxydase de raifort. Pipetez 150 L de conjugu
dans chaque cupule l'aide d'une pipette multicanaux.
Fixation du conjugu de peroxydase de raifort. Couvrez la plaque
d'chantillons non perturbs et mettez-la en incubation 37 2 C pendant
30 minutes.
Lavage. Retirez le conjugu des cupules et lavez la plaque selon les
instructions donnes l'tape 7.
Ajout du chromogne. Ajoutez 150 L de chromogne dans chaque cupule
l'aide d'une pipette multicanaux.
Fixation de la couleur. Couvrez la plaque d'chantillons non perturbs et
mettez-la en incubation temprature ambiante (20 25 C) pendant
30 minutes. NE LAVEZ PAS LA PLAQUE !
Arrt de fixation de la couleur. Pour arrter la raction l'issue de l'incubation
du chromogne, pipetez 100 L de solution d'arrt (acide sulfurique 2N) dans
l'ensemble des cupules intervalles rguliers et identiques et selon l'ordre
dans lequel le chromogne prpar a t ajout. Tapotez dlicatement sur la
plaque pour disperser la solution d'arrt. La couleur passe du bleu au jaune.
Lecture de la plaque 450 nm sur un lecteur de plaque de dosage immunoenzymatique. Effectuez une lecture et notez les rsultats 450 nm d'ici
30 minutes.

11. COMMENTAIRES SUR LA PROCDURE

11.1

11.2
11.3
11.4
11.5
11.6
11.7

11.8

11.9

Une utilisation soigneuse de dispositifs de pipetage et de lecteurs de plaque

correctement calibrs augmentera de faon considrable la prcision et la
reproductibilit de la trousse de dosage CAE.
Des temps ou des tempratures d'incubation autres que ceux stipuls
dans cette notice peuvent affecter les rsultats.
Utilisez tous les composants aux tempratures conseilles.
Les bulles d'air dans les cupules de dosage rduisent l'efficacit de la
fixation.
Touchez le bord de la cupule avec la pointe de la pipette avant de la retirer.
Des procdures de lavage autres que celles stipules dans cette notice
peuvent affecter les rsultats.
Utilisez une technique aseptique afin d'viter une contamination des ractifs,
qui pourrait aboutir des rsultats errons. Conservez le tampon de lavage
1X dans un rcipient propre afin de ne pas le contaminer.
Il est recommand d'utiliser des ustensiles en plastique ou en verre jetables
ou striles. Les ustensiles en verre rutilisables doivent tre soigneusement
lavs puis rincs avec de l'eau purifie pour liminer toute trace de dtergent.
Ne rutilisez pas les cupules.
Ne laissez pas les cupules scher une fois la procdure entame.
vitez toute exposition une lumire forte pendant le dosage.

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00:00 AM/PM

11.10 N'changez pas les ractifs contenus dans la trousse avec des ractifs
obtenus auprs d'autres fournisseurs. Les ractifs utiliss pour ces dosages
sont optimiss afin de dtecter le complment total selon les spcifications.
Toute dilution ou tout frelatage aboutira une perte de sensibilit. La
contamination croise des ractifs et des chantillons des patients ou
l'utilisation de ractifs autres que ceux fournis dans cette trousse peuvent
produire des rsultats errons.
11.11 Il n'est aucunement garanti que ces ractifs soient exempts de contamination
microbienne.

12. CONTRLE QUALIT

12.1
12.2
12.3
12.4
12.5
12.6

L'talon et les contrles doivent tre doss chaque srie de dosage.

L'absorbance du tmoin doit tre infrieure 0.15 lors d'une lecture
450 nm.
L'absorbance moyenne (ABS) du contrle de niveau 1 doit tre infrieure
celle de l'talon.
L'absorbance moyenne (ABS) du contrle de niveau 2 doit tre suprieure
celle de l'talon.
Les valeurs des contrles doivent tomber dans les plages d'units CAE
apparaissant sur leurs tiquettes.
Le dosage est valide si TOUS les critres mentionns ci-dessus sont remplis.

13. CALCUL DES RSULTATS

Les rsultats sont exprims par rapport l'talon en units CAE. Dterminez-les l'aide
de la formule ci-dessous.
Units CAE de
srum de rfrence

chantillon moyen(ABS) Tmoinmoyen(ABS)

Rfrencemoyenne(ABS) Tmoinmoyen(ABS) = Units d'chantillon CAE

Les rsultats des patients sont rapports comme ayant un CAE faible ou normal/lev
en fonction du seuil tabli l'aide d'une population de rfrence approprie.
Interprtation des rsultats
Sur la base d'tudes conduites avec des valeurs normales, DiaSorin a tabli un seuil de
60 units CAE pour dfinir une activit complmentaire faible. Les chantillons de
patients dont le relev dpasse 60 units CAE sont dcrits comme ayant un CAE
normal/lev. Chaque laboratoire doit tablir son propre seuil de dtermination des
valeurs CAE faibles.

14. LIMITATIONS DE LA PROCDURE

14.1
14.2

Les absorbances suprieures 3.0 dpassent les limites de la dclaration

obligatoire du dosage et doivent tre signales de la sorte.
Les rsultats du dosage CAE ne constituent pas un diagnostic en soi.
Ils doivent tre interprts en conjonction avec d'autres essais de laboratoire
et avec le tableau clinique du patient.

15. VALEURS ESCOMPTES

Normales
DiaSorin a effectu le dosage CAE partir d'chantillons de srum prlevs sur des
individus apparemment en bonne sant. Tous les chantillons ont donn des rsultats
suprieurs au seuil tabli et seraient classs comme normaux/levs.
Tableau 1 : ETUDE REPRESENTATIVE CONDUITE AVEC DES VALEURS
NORMALES
Moyenne
cart-type
Intervalle
n
(Units CAE)
(Units CAE)
(Units CAE)
102
104
20.4
63-145

17

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ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

16. CRITRES DE PERFORMANCE

16.1 PRECISION
La prcision de la trousse CAE de DiaSorin a t value l'aide de principes modifis
tirs du National Committee for Clinical Laboratory Standards Guideline Evaluation of
Precision Performance of Clinical Chemistry Devices: (EP5-T2).
Sept chantillons ont t doss en double sur une priode de 10 jours dans 3 sites
diffrents. Des cupules doubles ont t prpares partir d'une dilution unique de
chacun des chantillons. Ceux-ci sont des ensembles prpars partir de srums
humains choisis pour couvrir la plage d'activation du complment, des niveaux infrieurs
aux niveaux suprieurs. Toutes les donnes ont t regroupes pour tre analyses.
Les valeurs aberrantes ont t dfinies comme des observations dont les valeurs CAE
normalises taient plus de 2.6 carts-types de zro.
Ces valeurs aberrantes ont t supprimes et les donnes restantes ont t soumises
une analyse de variance afin d'obtenir des estimations de la prcision intra-sries, intersries, inter-sites et totale.
Les rsultats finaux sont donns dans le tableau 2 ci-dessous. Les valeurs sont bases
sur les units CAE telles que dfinies dans la section Calcul des rsultats.
TABLEAU 2 : prcision du CAE
(Valeurs en units CAE)
Intra-sries

Inter-sries

Moyenne

60

10.7

2.131

19.9

1.865

17.5

1.111

10.4

3.042

28.5

58

12.0

1.210

10.1

1.422

11.9

1.327

11.1

2.291

19.1

60

25.3

3.032

12.0

2.354

9.3

1.728

6.8

4.209

16.7

58

83.4

5.685

6.8

9.088

10.9

0.000

0.0

10.720 12.9

60

134.2

5.916

4.4

11.832

8.8

10.158

7.6

16.679 12.4

60

146.6

6.308

4.3

9.158

6.2

10.879

7.4

15.557 10.6

59

147.7

5.170

3.5

4.829

3.3

11.229

7.6

13.272

(% C.V.)

carttype

Totale

chantillon

(% C.V.)

carttype

Inter-sites

carttype

cart(% C.V.) type

(% C.V.)

9.0

16.2 Puret : la puret du dosage a t vrifie par une comparaison de mthodes

(comparaison avec la mthode CH50).
Exactitude
Le dosage CAE a t compar la fois un dosage du CH50 disponible dans le
commerce et la procdure CH50 Kent Fife utilise par un laboratoire de rfrence en
immunologie renomm. Les rsultats des dosages ont t classs comme faibles ou
normaux/levs sur la base des valeurs de seuil tablies pour chaque mthode.

18

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ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

En utilisant la mthode CH50 comme rfrence (ou mthode "vraie"), la sensibilit

relative, la spcificit relative et la concordance globale ont t calcules comme suit :

Sensibilit relative =

Nombre de vraies valeurs faibles (faibles dans les deux

dosages)
Nombre de vraies valeurs faibles + nombre
d'chantillons CAE normaux/levs

Sensibilit relative =

Nombre de vraies valeurs normales/leves (normales/leves

dans les deux dosages)
(Nombre de vraies valeurs normales/leves + nombre
d'chantillons CAE faibles)
(Nombre de vraies valeurs faibles + nombre de vrais
chantillons normaux/levs)
Nombre total d'chantillons doss

Concordance globale =

Tableau 3 : PROCEDURE CH50 KENT FIFE COMPAREE AU CAE

CAE
Kent Fife
CH50

Faible

Normal/lev

Faible

48

Total
50

Sensibilit relative

96%

Normal/lev

71

73

97%

Total

50

73

123

Spcificit relative
Concordance globale

Figure 3 : PROCDURE CH50 KENT FIFE COMPARE AU CAE

250

Normal / lev

Units CAE

200

150

100

Faible

50

0
0

50

100

150

200

250

300

Units de dosage CH50

19

350

400

97%

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

Tableau 4 : DOSAGE DU CH50 DISPONIBLE DANS LE COMMERCE COMPARE

AU CAE
Faible

CAE
Normal/lev

Total

Faible

20

22

Normal/lev

57

57

Total

20

59

79

Disponible
dans le
commerce
CH50

Sensibilit
relative
Spcificit
relative
Concordance
globale

91%
100%
97%

Figure 4 : DOSAGE DU CH50 DISPONIBLE DANS LE COMMERCE COMPARE

AU CAE

300
Normal / lev
250

Units CAE

200

150

100

50
Faible
0
0

50

100

150

200

250

300

350

Units de dosage CH50 disponible dans le commerce

20

400

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

RSOLUTION DES PROBLMES

Problme
Valeurs CAE de contrle hors
norme.

Causes possibles
1. Temprature, minutage ou
pipetage incorrects ; ractifs non
mlangs.
2. Contamination croise des
contrles.
3. Dilution inadquate.
4. Voie optique souille.

Tous les rsultats des dosages

sont ngatifs.

Tous les rsultats des dosages

sont positifs.

Prcision insuffisante (Relevs

d'absorbance en double
suprieurs 20 % de leur
temprature adquate.
moyenne).

Solution
1.
Vrifiez que la temprature tait
correcte. Vrifiez que le minutage tait
correct. Voyez "Prcision insuffisante"
(cidessous) n 2 4. Refaites le dosage.
2.
Prenez des prcautions lors du pipetage.
3.
4.

5. Longueur d'onde du filtre

incorrecte.
6. Dilution excessive ou insuffisante
es talons.

5.

1. Un ou plusieurs ractifs non

ajouts, ou ajouts dans le
mauvais ordre.
2. Activit du conjugu perdue.

1.

6.

2.

Refaites le dosage.
cartez la prsence d'humidit ou de
salet. Essuyez le fond et refaites une
lecture en cas d'utilisation d'une solution
d'arrt.
Passez le filtre 450 5 nm.
Revrifiez la procdure. Diluez
nouveau l'talon, les contrles et les
chantillons. Refaites le dosage.
Revrifiez la procdure. cartez la
prsence de solutions non utilises.
Refaites le dosage.
Placez une petite quantit de
chromogne dans une prouvette
(environ 0.1 mL) et pipetez le conjugu
(5 10 L) directement dans le
chromogne. La solution doit rapidement
devenir bleue.
Diluez nouveau le tampon de lavage.
Refaites le dosage.
Vrifiez la couleur du dshydratant.
cartez la prsence d'humidit vidente
dans les cupules non utilises. Refaites
le dosage en utilisant les contrles
uniquement pour l'activit. Vrifiez
l'activit du conjugu comme au n2 cidessus.
Vrifiez l'absorbance de la solution
chromogne non utilise.
Vrifiez qu'aucune des solutions n'est
trouble.
Vrifiez l'eau purifie utilise pour diluer
le tampon. Elle doit avoir une rsistivit
suprieure 5 mgohms.
Diluez nouveau les chantillons.
Refaites le dosage.
Vrifiez le calibrage du pipeteur. Utilisez
une technique reproductible.

3. Dilution inadquate du tampon

3.

4. Plaque enduite inactive.

4.

1. Solution chromogne contamine.

1.

2. Tampons et ractifs contamins.

2.

3. Tampon de lavage (1X) contamin.

3.

4. Dilution inadquate du srum.

4.

1. CV de distribution du pipeteur
suprieur 5 % ou chantillons
ajouts trop rapidement.

1.

2. Srum ou ractifs pas assez

mlangs; les ractifs ne sont pas
la bonne laissez-les s'adapter
la temprature.
3. L'ajout des ractifs prend trop de
temps ; incohrence des intervalles
de minutage, bulles d'air.

2.

Mlangez tous les ractifs dlicatement

mais soigneusement et avant d'tre
ajouts.

3.

4. Des courants d'air passent sur la

plaque pendant les incubations.

4.

Mettez au point une technique

homogne et cohrente et vitez les
claboussures ou utilisez un dispositif de
pipetage multiple ou un distributeur
automatique pour gagner du temps.
Couvrez la plaque ou placez-la dans une
cuve.

21

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ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

5. Voie optique souille.

5.

6. L'appareil n'est pas temprature

avant que les relevs ne soient
faits.
7. Lavage non homogne ; bulles
emprisonnes ; liquide rsiduel
dans les cupules la fin du cycle
de lavage.

6.

8. Pipetage inadquat.

8.

7.

Essuyez le fond de la plaque avec un tissu

doux. Vrifiez la propret de la source de
lumire et du dtecteur de l'appareil.
Consultez la procdure de prchauffage
dans le manuel de l'appareil.
Utilisez uniquement des dispositifs de
lavage acceptables. Allongez le dlai sur
les appareils de lavage automatiss ou
augmentez le nombre de cycles de
lavage. Vrifiez que toutes les cupules
sont remplies et aspires niformment.
Versez le liquide au-dessus du niveau de
ractif dans les cupules.
vitez la formation de bulles d'air dans les
pointes des pipettes. Veillez ce que les
pointes soient solidement fixes.

CONSULTEZ LA DERNIRE PAGE POUR LES RFRENCES

22

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

KOMPLEMENTAKTIVIERUNGS-EIA- (CAE-) KIT

1.

VERWENDUNGSZWECK

Dieses Produkt dient ZUR IN-VITRO-DIAGNOSTIK. Das CAE-Kit (Completement

Activation EIA, Komplementaktivierungs-EIA) enthlt Anleitungen und Material fr die
qualitative Bestimmung der gesamten klassischen Komplementaktivitt in humanem
Serum durch Enzymimmunoassay (EIA).

2.

ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLRUNG

Die funktionelle Beurteilung des klassischen Komplementwegs wird in der Regel

zusammen mit der Bewertung der Komponenten des Membranangriffskomplexes mit Hilfe
des CH50-Assays durchgefhrt, der seit Jahrzehnten der Standardassay fr die funktionelle
Komplementaktivitt ist. Durch den CH50-Test wird die Komplementaktivitt gemessen,
die erforderlich ist, um eine 50 %ige Hmolyse von Schafserythrozyten unter
Standardbedingungen zu erhalten. Die Hmolyse wird kolorimetrisch durch Bestimmung
der aus den Erythrozyten freigesetzten Hmoglobinmenge gemessen. Der CH50-Assay ist
ein wichtiges Hilfsmittel zur Beurteilung des klassischen Komplementwegs und der
Komponenten des Membranangriffskomplexes. Der Test ist jedoch sehr zeitaufwendig und
umfasst eine Reihe von Reagenzien, die schwierig zu standardisieren sind. Auerdem
knnen die Schafszellen hinsichtlich ihrer hmolytischen Reaktion auf Komplement stark
voneinander abweichen.1- 3
Durch das Komplementaktivierungs-EIA (CAE) werden die Prinzipien des hmolytischen
Assays zur Komplementaktivierung mit der Anwendung von markierten Antikrpern
kombiniert, die fr das infolge der Komplementaktivierung produzierte Neoantigen
spezifisch sind. Die Menge des erzeugten Neoantigens ist proportional zur funktionellen
Aktivitt von C1q bis C9.
Die In-vitro-Aktivierung der Komplementsequenz fhrt zum Verbrauch von
Komplementkomponenten, der wiederum zu einer Verringerung der Konzentration dieser
Komponenten fhren kann. Daher wird durch die Bestimmung von Komplementproteinen
oder der Komplementaktivitt angezeigt, ob das Komplementsystem durch einen
immunologischen und/oder pathogenen Mechanismus aktiviert wurde. Sowohl funktionelle
als auch immunochemische Komplementmessungen dienen zur Beurteilung von Patienten,
wenn der Verdacht auf eine komplementaktivierende Krankheit besteht oder ein vererbter
Fehler mglich ist. Hinsichtlich des Ausmaes der durch funktionelle Assays wie CAE und
CH50 gemessenen Komplementaktivitt werden die Geschwindigkeit von Synthese und
Abbau sowie die Verwendung der Kompenenten bercksichtigt, und im Gegensatz zu
immunochemischen Methoden, bei denen speziell die Konzentration verschiedener
Komplementkomponenten gemessen wird, wird die Integritt des klassischen Wegs
gemessen.1- 3
Wenn eine Verringerung von Komplementkomponenten oder der Komplementfunktion
festgestellt wird, wird von Klinikern ein fortlaufender immunologischer Prozess in
Betracht gezogen, der zum Einsatz von Komponenten und zur Senkung von
Komplementniveaus fhrt. Erhhte Komplementniveaus sind normalerweise ein
unspezifischer Ausdruck einer Akutphasenreaktion.1- 3

3.

TESTPRINZIP

Das Komplementaktivierungs-EIA- (CAE-) Testkit ist eine neuartige Methode zur

Messung der gesamten klassischen Komplementaktivitt. Bei dieser Methode wird ein
enzymkonjugierter monoklonaler Antikrper verwendet, der fr Neoantigen von
terminalen Komplementproteinen spezifisch ist. Mikrotiter-Wells sind mit einem
Komplementaktivierungsmittel beschichtet, zu dem eine einzelne Verdnnung von
Patienten- oder Kontrollserum hinzugegeben wird. Der vollstndige klassische
Komplementweg wird aktiviert, und die Kaskade von C1q bis C9 wird in dem Well der
Mikrotiterplatte gebildet. Der mit Meerrettich-Peroxidase konjugierte monoklonale
Antikrper kann mit dem resultierenden, an die Platten-Wells gebundenen Neoantigen

23

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

reagieren. Nach Zugabe von Chromogen wird die Quantifizierung durch Vergleich der
bei 450 nm gemessenen resultierenden Absorptionswerte mit einem Referenzwert
erhalten und durch zwei Kontrollen besttigt.

4.

KITREAGENZIEN
Beschichtete CAE-Mikrotiterstreifen
CAE-Proben-Diluent
CAE-HRP-Konjugat
Chromogen
Waschpuffer (10x)
CAE-Stopplsung
Verdnnungsrhrchen und Stnder
Plattendeckel
CAE-Kalibrator
CAE-Kontrollstufe 1
CAE-Kontrollstufe 2
Anzahl der Tests

12 x 8 Wells
1 Flschchen / 60 mL
1 Flschchen / 20 mL
1 Flschchen / 22 mL
1 Flschchen / 100 mL
1 Flschchen / 20 mL
1 Karton / 96 Flschchen
1 Deckel
3 Flschchen, lyophilisiert
3 Flschchen, lyophilisiert
3 Flschchen, lyophilisiert
96

LAGERUNG: Der Reagenzsatz sollte bei 2-8C aufbewahrt werden. Kalibrator und
Kontrollsatz sollten bei 20C aufbewahrt werden. Nach dem ffnen alle Reagenzien bei 28C nicht lnger als bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum lagern,
mit Ausnahme des Einwegkalibrators und der Einwegkontrollen, die entsorgt werden,
und der beschichteten Mikrotiterstreifen, die 8 Wochen lang aufbewahrt werden knnen.
Die Reagenzien drfen nach dem Verfallsdatum nicht verwendet werden.
4.1 Beschichtete CAE-Mikrotiterstreifen: gebrauchsfertiges Reagenz
Alle Mikrotiterstreifen und den Halter im Folienbeutel auf Raumtemperatur (20-25C)
bringen, um die Wells vor Kondensation zu schtzen. Geffnete Beutel wieder versiegeln,
um einen richtigen Verschluss in einer dehydrierten Umgebung sicherzustellen.
HINWEIS: Beim ersten ffnen des Beutels mit den Mikrotiterstreifen MUSS der
Dehydrierungsindikator blau sein. Wenn der Indikator nicht blau ist, die Streifen nicht
verwenden.
4.2 CAE-Proben-Diluent: gebrauchsfertiges Reagenz
Enthlt Puffer, grnen Farbstoff und Schutzmittel. HINWEIS: Nicht verwenden,
wenn das Diluent trbe erscheint.
4.3 CAE-HRP-Konjugat: gebrauchsfertiges Reagenz
Enthlt
monoklonalen
Antikrper,
konjugiert
mit
Meerrettich-Peroxidase.
HINWEIS: Nicht verwenden, wenn das Konjugat trbe erscheint.
4.4 Chromogen: gebrauchsfertiges Reagenz
Gepuffertes Substrat und Chromogen (3,3, 5,5-Tetramethylbenzidin [TMB]). Vor Licht
schtzen. HINWEIS: Nicht verwenden, wenn ein blauer Niederschlag vorhanden ist.
4.5 Waschpuffer (10X): flssige Lsung
Enthlt Phosphatpuffer und Tween. Der 1X Waschpuffer ist bei Raumtemperatur
(20-25C) 2 Monate lang stabil. HINWEIS: Nicht verwenden, wenn der Puffer trbe ist.
Wenn der 10X Waschpuffer gekhlt aufbewahrt wird, kann eine Kristallisation eintreten.
Den Puffer vor der Verdnnung erneut bei Raumtemperatur (20-25C) auflsen.
4.6 CAE-Stopplsung: gebrauchsfertiges Reagenz
Enthlt 2N Schwefelsure. Siehe den Abschnitt Warnhinweise und Vorsichtsmanahmen.

24

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

4.7 CAE-Kalibrator: lyophilisiertes humanes Serum

(Paket als Katalognummer 6300)
Siehe den Abschnitt Warnhinweise und Vorsichtsmanahmen. Der wiederhergestellte
Kalibrator ist bis zu vier Stunden lang stabil, wenn er auf Eis gelegt wird. Nach der
Verwendung entsorgen. Der Kalibrator wurde anhand einer etablierten CH50-Methode
kalibriert. Jeder Vergleich mit anderen Produkten oder Verfahren sollte mit dieser Methode
durchgefhrt werden. Der Kitkalibrator ist mit Patientenproben austauschbar, wenn er mit
Reagenzien verwendet wird und dieser diagnostische In-vitro-Test wie empfohlen
durchgefhrt wird.
Der CAE-Wert des Kalibrators ist auf dem Flschchenetikett aufgefhrt.
HINWEIS: Nicht verwenden, wenn das lyophilisierte Material feucht oder klebrig erscheint.
4.8 CAE-Kontrollseren (Stufe 1, Stufe 2): lyophilisiertes humanes Serum
(Paket als Katalognummer 6300)
Siehe den Abschnitt Warnhinweise und Vorsichtsmanahmen. Die wiederhergestellten
Kontrollen sind bis zu vier Stunden lang stabil, wenn sie auf Eis gelegt werden. Nach der
Verwendung entsorgen. Die CAE-Wertebereiche der Kontrollen sind auf den
Flschchenetiketten aufgefhrt.
HINWEIS: Nicht verwenden, wenn das lyophilisierte Material feucht oder klebrig erscheint.

5.

WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN

NUR ZUR IN-VITRO-DIAGNOSTIK.

REAGENZIEN MIT MATERIAL HUMANEN URSPRUNGS

VORSICHT: Kontrollen und Kalibrator enthalten humanes Serum. Dieses Produkt ist
als potenzieller Infektionserreger zu behandeln.
Alle in der Herstellung dieses Produktes verwendeten Serum- bzw. Plasmaspendeeinheiten
wurden nach einer FDA-genehmigten Methode getestet und fr nicht reaktiv auf Hepatitis-BOberflchenantigen (HBsAg), Hepatitis-C-Antikrper (HCV) und Antikrper fr HIV-1/2
befunden. Obwohl diese Methode uerst genau ist, bietet sie keine Gewhr dafr, dass alle
infizierten Einheiten identifiziert werden knnen. Dieses Produkt kann auch Material
humanen Ursprungs enthalten, fr welches es noch kein genehmigtes Testverfahren gibt. Da
keine der zur Zeit bekannten Testmethoden absolute Gewhr fr die Abwesenheit des
Hepatitis-B-Virus (HBV), des Hepatitis-C-Virus (HCV), des Retrovirus (HIV) oder anderer
Infektionserreger bieten kann, sind alle Produkte mit Komponenten humanen Ursprungs
unter Einhaltung guter Laborpraktiken und entsprechender Vorsichtsmanahmen laut
Empfehlungen des Leitfadens der Centers for Disease Control and Prevention/National
Institutes
of
Health
(amerikanische
Krankheitsforschungszentren/Staatliche
Gesundheitsinstitute): Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories
(Biosicherheit in mikrobiologischen und biomedizinischen Laboren), 4. Auflage, Mai 1999,
oder aktuelle Auflage, als potenzielle infektise Substanzen zu behandeln.
WEITERE WARNHINWEISE
Stopplsung (2N Schwefelsure) Kann bei Hautkontakt zu schweren Verbrennungen
fhren. Kontakt mit Augen, Haut oder Kleidung vermeiden. Nicht einnehmen und Dmpfe
nicht inhalieren. Bei Kontakt mindestens 15 Minuten lang mit reichlich Wasser splen.
Europische Gemeinschaften: Gefahrenbezeichnungen fr gefhrliche Stoffe
(Richtlinie 1999/45/EG)
R34 - Ruft Verbrennungen hervor.
S26 - Bei Augenkontakt sofort mit reichlich Wasser splen und einen Arzt aufsuchen.
S30 - Niemals Wasser zu diesem Produkt hinzufgen.
S37/39 - Bei der Arbeit geeignete Handschuhe sowie einen geeigneten Augen- und
Gesichtsschutz tragen.
Chromogen: Dieses Produkt enthlt 3,3',5,5' Tetramethylbenzidin (TMB) (0.05 %), das
bei Laborexperimenten mgliche mutagene Wirkungen gezeigt hat.

25

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

6.

00:00 AM/PM

PROBENANFORDERUNGEN

Blutproben mssen mit Hilfe einer aseptischen Venenpunktionstechnik genommen

werden, und Serum muss mit Standardkomplementverfahren erhalten werden. Eine
Mindestmenge von 5 mL an gesamtem Blut wird empfohlen. Blut in Rhrchen mit rotem
Deckel ohne Serumseparator 60-65 Minuten bei Raumtemperatur (20-25C) gerinnen
lassen. Die Blutproben in einer gekhlten Zentrifuge zentrifugieren und das zellfreie
Serum in ein sauberes Rhrchen umfllen. Die Seren mssen richtig behandelt
werden, um In-vitro-Komplementaktivierung zu vermeiden. Die Seren sollten zur
lngeren Lagerung oder zum Transport auf Trockeneis bei mindestens -70C in dicht
verschlossenen sterilen Rhrchen eingefroren werden. Die Proben sollten nicht mehr als
dreimal eingefroren und aufgetaut werden. Selbstabtauende Gefrierschrnke werden
nicht empfohlen, da die Proben dehydrieren knnen und/oder Komplementabbau
eintreten kann.
Durch Zugabe erhhter Mengen von Hmoglobin (5 mg/dL), Bilirubin (20 mg/dL),
Cholesterol (10 mg/dL) und Triglyceriden (4926 mg/dL) zu einem geringen Serumpool
wurden die CAE-Testergebnisse nicht verndert. Die Verlsslichkeit von Ergebnissen
aus Humanplasmaproben oder aus kontaminierten, partikulierten oder durch Hitze
deaktivierten Proben ist nicht bekannt. Eine falsche Behandlung von Proben kann zu
fehlerhaften Ergebnissen fhren.

7.

ZUSTZLICH BENTIGTE GERTE UND MATERIALIEN

7.1
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
7.10
7.11

8.

Plattenwaschsystem, manuell oder automatisch

1000 mL-Pufferbehlter
Zeitgeber (60-Minuten-Bereich)
Saugfhige Papiertcher
Reagenzbehlter (Katalognr. 4505).
EIA-Plattenleser mit Lesefhigkeit bei 450 nm
Inkubator, 37 2C
Pipetten: (5-20 L, 20-1000 L) oder Autodilutor.
Mehrkanalpipette (50-150 L).
Einliter-Messzylinder
Gereinigtes Wasser

WELL-IDENTIFIZIERUNG
Blanks, Kontrollen, Kalibrator und Patientenproben mssen mglicherweise je nach den
Anforderungen des EIA-Plattenleserherstellers unterschiedlich positioniert werden. Die
folgende Plattenkonfiguration wird empfohlen (siehe ABBILDUNG 1).
BLANK: In doppelter Ausfhrung
KALIBRATOR: In vierfacher Ausfhrung
KONTROLLEN UND PATIENTENROBEN: In doppelter Ausfhrung

ABBILDUNG 1: Mikrotiterplatten-Konfiguration
1

10

11

12

BLANK

BLANK

B
C
D
E
F
G
H

KAL.
KAL.
STUFE 2
STUFE 1
PROBE 1
PROBE 2
PROBE 3

KAL.
KAL.
STUFE 2
STUFE 1
PROBE 1
PROBE 2
PROBE 3

O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
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O
O

O
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O
O
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O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O

26

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

9.

00:00 AM/PM

SERUM- UND REAGENZZUBEREITUNG

9.1

9.2

9.3
9.4

9.5

9.6

Ungeffnete, im Beutel enthaltene Plattenstreifen, Waschpuffer, HRPKonjugat, Chromogen und Stopplsung auf Raumtemperatur (20-25C)
bringen.
Serumproben sollten whrend ihrer Behandlung teilweise aufgetaut werden,
indem sie kurz in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 37 2C gelegt
und leicht vermischt werden. Sofort in ein Eisbad legen.
Proben-Diluent, gereinigtes Wasser, Kontrollen, Kalibrator und aufgetaute
Patientenproben vor der Verwendung auf Eis legen.
Zubereitung von Kontrollen und Kalibrator
a. Die Flschchen vom Eis entfernen.
b. Das gesamte lyophilisierte Material durch vorsichtiges Klopfen nach
unten auf den Boden des Flschchens bringen und Crimp-Dichtung und
-Verschlussstopfen vorsichtig entfernen.
c. Sofort 0.1 mL kaltes (2-8C) gereinigtes Wasser direkt zu dem
lyophilisierten Material hinzugeben.
d. Den Verschlussstopfen sicher wieder aufsetzen.
e. Das Flschchen 5-10 Minuten lang auf Eis stehen lassen und
gelegentlich leicht schtteln oder vortexen, bis der Inhalt vollstndig
gelst ist.
Die wiederhergestellten Kontrollen und der wiederhergestellte
Kalibrator knnen vor der Verwendung bis zu 4 Stunden lang bei 28C oder auf Eis aufbewahrt werden.
Zur Zubereitung der 1X Waschlsung den Inhalt der Flasche mit der 10X
Waschlsung in einen 1000 mL-Behlter schtten. Die Flasche mit
gereinigtem Wasser aussplen, um restliche Flssigkeit zu entfernen, und
die ausgesplte Flssigkeit in den Behlter schtten. Gereinigtes Wasser
hinzugeben, bis das Gesamtvolumen von 1000 mL erreicht ist. Mischen, bis
der Inhalt vollstndig gelst ist.
Den Verdnnungsrhrchen-Stnder abtrennen und den unteren Abschnitt
teilweise mit Eis fllen und Wasser hinzugeben, um ein Eisbad herzustellen.
Den Verdnnungsrhrchen-Halter wieder in den Stnder einsetzen.

10. TESTVERFAHREN
10.1
10.2

10.3

10.4

Seren und Reagenzien zubereiten, wie im vorigen Abschnitt beschrieben.

Die Platte aus dem Folienbeutel entfernen. Dabei vorsichtig vorgehen, um
die optische Oberflche auf dem Boden der Wells nicht zu berhren. Die
Mikrotiterstreifen drfen nur verwendet werden, wenn der im Beutel enthaltene
Dehydrierungsindikator beim ersten ffnen des Beutels blau ist. Die bentigte
Anzahl an Streifen herausnehmen und beschriften, um Verwechslungen zu
vermeiden. Die restlichen Streifen wieder in den Beutel legen, den Beutel
wieder versiegeln und zur spteren Verwendung in den Gefrierschrank legen.
Verdnnung von Serumproben Mit Hilfe des Verdnnungsrhrchen-Stnders
den Kalibrator, jede Kontrolle und das Patientenserum im Verhltnis 1:120
(5 L + 595 L) mit kaltem Proben-Diluent verdnnen. Das verdnnte
Material in jedem Rhrchen dreimal vortexen und die Verdnnungsrhrchen
wieder in das Eisbad stellen.
Probenzugabe 150 L aller einzelnen verdnnten Kalibratoren, Kontrollen und
Patientenseren mit Hilfe einer Mehrkanalpipette in zweifacher Ausfhrung in
Wells pipettieren. Fr den Blank 150 L des Proben-Diluents in zweifacher
Ausfhrung in Wells pipettieren und spter als Probe-Wells behandeln.

27

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

10.5
10.6
10.7

10.8
10.9
10.10
10.11
10.12
10.13

10.14

00:00 AM/PM

Komplementaktivierung Die Platte abdecken und ungestrt 60 Minuten lang

bei 37 2C inkubieren.
Die Seren durch Dekantieren oder Aufsaugen mit einem Sauggert aus den
Wells entfernen.
Waschen Alle Wells vollstndig mit 1X Waschpuffer (mindestens 300 L pro
Well) fllen. 30 Sekunden lang einweichen. Durch Schtteln in einen
Entsorgungsbehlter entleeren oder aufsaugen. Den Vorgang zweimal
wiederholen, so dass insgesamt drei Waschungen durchgefhrt werden. Wenn
zum Waschen von Mikrotiterstreifen automatische Waschsysteme verwendet
werden, sollten diese so eingestellt werden, dass zwischen den einzelnen
Schritten ein 30 Sekunden langer Einweichungszyklus ermglicht wird.
HINWEIS: Unvollstndiges Fllen der Wells whrend des Waschzyklus kann
zu fehlerhaften Ergebnissen fhren. Restliche Flssigkeit sollte entfernt
werden, indem die Platte mit gengend Druck so gehalten wird, dass die
Streifen im Rahmen bleiben, und die Flssigkeit mehrmals durch Schlagen
auf die umgedrehte Platte auf ein Papiertuch oder eine andere absorbierende
Oberflche entleert wird.
Zugabe von HRP-Konjugat Mit einer Mehrkanalpipette 150 L HRP-Konjugat
in jedes Well pipettieren.
Bindung des HRP-Konjugats Die Platte abdecken und ungestrt 30 Minuten
lang bei 37 2C inkubieren.
Waschen Das Konjugat aus den Wells entfernen und die Platte waschen, wie
in Schritt 7 beschrieben.
Chromogenzugabe Mit einer Mehrkanalpipette 150 L Chromogen zu jedem
Well hinzugeben.
Farbentwicklung Die Platte abdecken und ungestrt 30 Minuten lang bei
Raumtemperatur (20-25C) inkubieren. DIE PLATTE NICHT WASCHEN!
Farbentwicklung
stoppen
Um
die
Reaktion
am
Ende
der
Chromogeninkubation zu stoppen, 100 L Stopplsung (2N Schwefelsure)
in identischen regelmigen Intervallen in alle Wells geben. Dabei dieselbe
Reihenfolge einhalten, in der das zubereitete Chromogen hinzugefgt wurde.
Leicht auf die Platte klopfen, um die Stopplsung zu dispergieren. Die Farbe
ndert sich von Blau in Gelb.
Ablesen der Platte bei 450 nm auf einem EIA-Plattenleser Die Ergebnisse
innerhalb von 30 Minuten bei 450 nm ablesen und aufzeichnen.

11. ANMERKUNGEN ZUM VERFAHREN

11.1

11.2
11.3
11.4
11.5
11.6
11.7

11.8

11.9

Durch die vorsichtige Verwendung von richtig kalibrierten Pipettiergerten

und Plattenlesern wird die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des CAETestkits erheblich verbessert.
Durch andere als die in diesem Insert angegebenen Inkubationszeiten
und Temperaturen knnen die Ergebnisse beeintrchtigt werden.
Alle Komponenten bei den jeweils empfohlenen Temperaturen verwenden.
Durch Luftblasen in Assay-Wells wird die Bindungswirksamkeit verringert.
Mit den Pipettenspitzen die Seite der Wells berhren, bevor die Pipetten
herausgezogen werden.
Durch andere als die in diesem Insert angegebenen Waschverfahren knnen
die Ergebnisse nachteilig beeintrchtigt werden.
Eine aseptische Technik anwenden, um die Kontamination von Reagenzien zu
vermeiden, die zu fehlerhaften Ergebnissen fhren kann. 1X Waschpuffer in
einem sauberen Behlter aufbewahren, um Kontamination zu vermeiden.
Sterile oder entsorgbare Glas- oder Kunststoffprodukte werden empfohlen.
Wieder verwendbare Glasprodukte mssen grndlich gewaschen und durch
Splen mit gereinigtem Wasser von allen Detergenzien befreit werden. Wells
nicht wieder verwenden.
Die Wells nach dem Beginn des Verfahrens nicht trocknen lassen. Einwirkung
von starkem Licht whrend der Durchfhrung des Assays vermeiden.
28

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

11.10 Die Kitreagenzien nicht durch Reagenzien anderer Anbieter austauschen.

Die Reagenzien in diesen Tests sind optimiert, um das gesamte Komplement
gem den Spezifikationen zu erkennen. Verdnnung oder Verunreinigung
fhrt zu einem Empfindlichkeitsverlust. Kreuzkontamination von Reagenzien
und Patientenproben oder die Verwendung von anderen als den in diesem
Kit enthaltenen Reagenzien kann zu fehlerhaften Ergebnissen fhren.
11.11 Es wird nicht gewhrleistet, dass diese Reagenzien frei von
mikrobiologischer Kontamination sind.

12. QUALITTSKONTROLLE
12.1
12.2
12.3
12.4
12.5
12.6

Kalibrator und Kontrollen mssen bei jeder Testdurchfhrung verwendet

werden.
Der Absorptionswert des Blanks muss bei Ablesung bei 450 nm weniger als
0.15 betragen.
Der durchschnittliche Absorptionswert (ABS#) der Stufe 1-Kontrolle muss
kleiner sein als der entsprechende Wert des Kalibrators.
Der durchschnittliche Absorptionswert (ABS) der Stufe 2-Kontrolle muss
grer sein als der entsprechende Wert des Kalibrators.
Die
Kontrollwerte
mssen
innerhalb
der
angegebenen
CAEEinheitenbereiche liegen.
Der Test ist gltig, wenn ALLE der oben genannten Kriterien erfllt werden.

13. ERGEBNISBERECHNUNG
Die Ergebnisse werden relativ zum Kalibrator als CAE-Einheiten ausgedrckt. Zur
Bestimmung der Ergebnisse die nachfolgende Formel verwenden.
CAE Einheiten des
X
Referenzserums

Durchschn. Probe (ABS) Durchschn. Blank (ABS)

Durchschn. Referenz (ABS) Durchschn. Blank (ABS) =

CAE Einheiten
der Probe

Ergebnisauswertung
Auf der Grundlage von Normalbereichsstudien hat DiaSorin einen Cut-Off-Wert von 60
CAE-Einheiten zur Definition von geringer Komplementaktivitt festgelegt.
Patientenproben, bei deren Ablesung mehr als 60 CAE-Einheiten ermittelt wurden,
werden fr CAE als normal/hoch berichtet. Jedes Labor sollte seinen eigenen Cut-OffWert zur Bestimmung niedriger CAE-Werte festlegen.

14. GRENZEN DES VERFAHRENS

14.1
14.2

Absorptionswerte von mehr als 3.0 liegen ber den berichtbaren

Grenzwerten des Assays und sollten entsprechend berichtet werden.
CAE-Testergebnisse sind allein nicht diagnostisch. Die Testergebnisse
mssen in Verbindung mit anderen Labortests sowie mit der klinischen
Prsentation des Patienten ausgewertet werden.

29

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

15. ERWARTETE WERTE

Normalwerte
Der CAE-Assay wurde von DiaSorin mit Hilfe von Serumproben von offensichtlich
gesunden Personen durchgefhrt. Bei allen Proben lagen die Ergebnisse ber dem
festgelegten Cut-Off-Wert und wurden als normal/hoch klassifiziert.
Tabelle 1: REPRSENTATIVE NORMALBEREICHSSTUDIE
Mittelwert
Standardabweichung
n
(CAE-Einheiten)
(CAE-Einheiten)
102
104
20.4

Bereich
(CAE-Einheiten)
63-145

16. LEISTUNGSDATEN
16.1 PRZISION
Die Przision des DiaSorin-CAE-Kits wurde mit Hilfe modifizierter Prinzipien der
Richtlinie Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices: (EP5-T2)
(Beurteilung der Przisionsleistung von klinischen chemischen Gerten) des National
Committee for Clinical Laboratory Standards beurteilt.
Sieben Proben wurden ber einen Zeitraum von 10 Tagen an 3 Standorten jeweils
in zweifacher Ausfhrung getestet. Dazu wurden Doppel-Wells aus einer einzigen
Dilution jeder Probe zubereitet. Bei den Proben handelte es sich um Pools, die aus
Humanseren zubereitet und so ausgewhlt wurden, dass der Bereich der
Komplementaktivierungsaktivitt von niedrigen bis zu hohen Stufen abgedeckt wurde.
Alle Daten wurden zur Analyse zusammengefasst. Ausreier wurden als
Beobachtungen
definiert,
bei
denen
die
standardisierten
CAE-Werte
Standardabweichungen von mehr als 2.6 gegenber dem Wert Null aufwiesen.
Die Ausreier wurden gelscht, und die restlichen Daten wurden einer Varianzanalyse
(Analysis of Variance, ANOVA) unterzogen, um Schtzungen bezglich der
Wiederholungsprzision, der Tag-zu-Tag-Przision, der Standort-zu-Standort-Przision
und der Gesamtprzision zu erhalten.
Die Endergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 aufgefhrt. Die Werte basieren
auf CAE-Einheiten gem der Definition im Abschnitt Ergebnisberechnung.
TABELLE 2: CAE-Przision
(Werte in CAE-Einheiten)
Wiederholungen

Tag-zu-Tag

Standort-zuStandort

Gesamt

Probe

Mittel
wert

Std.abw.

% V.K.

Std.abw.

% V.K.

Std.abw.

% V.K.

Std.abw.

%
V.K.

60

10.7

2.131

19.9

1.865

17.5

1.111

10.4

3.042

28.5

58

12.0

1.210

10.1

1.422

11.9

1.327

11.1

2.291

19.1

60

25.3

3.032

12.0

2.354

9.3

1.728

6.8

4.209

16.7

58

83.4

5.685

6.8

9.088

10.9

0.000

0.0

10.720

12.9

60

134.2

5.916

4.4

11.832

8.8

10.158

7.6

16.679

12.4

60

146.6

6.308

4.3

9.158

6.2

10.879

7.4

15.557

10.6

59

147.7

5.170

3.5

4.829

3.3

11.229

7.6

13.272

9.0

30

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

16.2 Richtigkeit: Die Richtigkeit des Assays wurde durch Methodenvergleich

(Vergleich mit der CH50-Methode) berprft.
Genauigkeit
Der CAE-Assay wurde sowohl mit einem kommerziell verfgbaren CH50-Test als auch
mit dem von einem etablierten Labor fr Immunologiereferenz angewendeten Kent Fife
CH50-Verfahren verglichen. Die Testergebnisse wurden entweder als niedrig oder als
normal/hoch klassifiziert, wobei fr jede Methode die festgelegten Cut-Off-Werte
verwendet wurden.
Bei Verwendung der CH50-Methode (der wahren Methode) als Referenz wurden die
relative Empfindlichkeit, die relative Spezifitt und die Gesamtbereinstimmung
folgendermaen berechnet:

Relative Empfindlichkeit =

Anzahl von echten Niedrig-Werten

(bei beiden Assays niedrig)
Anzahl von echten Niedrig-Werten + Anzahl von
Normal/hoch-CAE-Proben

Relative Empfindlichkeit =

Anzahl von echten Normal/hoch-Werten

(bei beiden Assays normal/hoch)
Anzahl von echten Normal/hoch-Werten + Anzahl von
Niedrig-CAE-Proben

Gesamtbereinstimmung =

Anzahl von echten Niedrig-Werten + Anzahl von

echten Normal/hoch-Proben
Gesamtzahl der getesteten Proben

Tabelle 3: KENT FIFE CH50 VS. CAE

CAE
Kent Fife
CH50

Niedrig

Normal/hoch

Gesamt

Niedrig

48

50

Relative
Empfindlichkeit

96%

Normal/hoch

71

73

Relative
Spezifitt

97%

123

Gesamtbereinstimmung

97%

Gesamt

50

73

31

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

Abbildung 3: KENT FIFE CH50 VS. CAE

250

Normal / hoch

CAE-Einheiten

200

150

100

niedrig

50

0
0

50

100

150

200

250

300

350

400

CH50-Einheiten

TABELLE 4: CH50 (KOMMERZIELL) VS. CAE

CAE
Niedrig

Normal/
hoch

Gesamt

Kommerziell

Niedrig

20

22

CH50

Normal/hoch

57

57

Gesamt

20

59

79

32

Relative
Empfindlichkeit
Relative
Spezifitt
Gesamtbereinstimmung

91%
100%
97%

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

Abbildung 4: CH50 (KOMMERZIELL) VS. CAE

300
Normal / hoch

CAE-Einheiten

250

200

150

100

50
niedrig
0
0

50

100

150

200

250

Kommerzielle CH50-Einheiten

33

300

350

400

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

FEHLERBEHEBUNG
Problem
Kontroll-CAE-Werte auerhalb
des Bereichs.

Mgliche Ursachen
1. Falsche emperatur,Zeitabstimmung
oder Pipettierung; Reagenzien nicht
Gemischt.

2. Kreuzkontamination von Kontrollen.

3. Falsche Verdnnung.
4. Optischer Weg nicht sauber.

5. Falsche Filterwellenlnge.
6. Zu hohe bzw. niedrige Verdnnung
des Kalibrators.
Alle Testergebnisse negativ.

1. Ein oder mehrere Reagenzien nicht

oder in falscher Reihenfolge
hinzugefgt.
2. Konjugataktivitt verloren.

3. Falsche Waschpufferverdnnung.
4. Beschichtete Platte inaktiv.

Alle Testergebnisse positiv.

1. Kontaminierte Chromogenlsung.
2. Kontaminierte Puffer und
Reagenzien.
3. Waschpuffer (1X) kontaminiert.

4. Falsche Serumverdnnung.
Schlechte Przision
(Zweifache Absorptionswertablesungen grer als
mischen
und20 % des jeweiligen
Mittelwerts).

1. VK der Pipettorleistung grer als 5

% oder Proben nicht langsam
hinzugefgt.

Lsung
1.
berprfen, ob die Temperatur
korrekt war.berprfen, ob die Zeit
korrekt war. Siehe Schlechte
Przision (unten), Punkte 2 bis 4.
Test wiederholen.
2.
Sorgfltig pipettieren.
3.
Test wiederholen.
4.
Auf Feuchtigkeit oder Schmutz
prfen. Boden abwischen und neu
ablesen, falls eine Stopplsung
verwendet wird.
5.
Filter in 450 5 nm ndern.
6.
Verfahren erneut berprfen.
Kalibrator, Kontrollen und Proben
erneut verdnnen. Test wiederholen.
1.
Verfahren erneut berprfen. Auf
unverbrauchte Lsungen prfen.
Test wiederholen.
2.
Eine kleine Menge Chromogen in ein
Testrhrchen geben (ca. 0.1 mL) und
Konjugat (5-10 L) direkt in das
Chromogen pipettieren. Die Lsung
sollte sich schnell blau frben.
3.
Waschpuffer erneut verdnnen. Test
wiederholen.
4.
Dehydrierungsindikator-Farbe prfen.
Auf offensichtliche Feuchtigkeit in
nicht verwendeten Wells prfen. Test
mit Kontrollen nur zur Aktivitt
wiederholen. Konjugataktivitt wie
unter Punkt 2 oben berprfen.
1.
Absorptionswert von unverbrauchter
hromogenlsung berprfen.
2.
Alle Lsungen auf Trbheit
berprfen.
3.
Gereinigtes Wasser zur
Pufferverdnnung berprfen. Die
Widerstandsfhigkeit sollte grer als
5 Megaohm sein.
4.
Proben erneut verdnnen. Test
wiederholen.
1.
Pipettorkalibrierung berprfen.
Reproduzierbare Technik verwenden.

2. Serum oder Reagenzien nicht

ausreichend gemischt; Reagenzien
vor Zugabe nicht auf richtige
Temperatur gebracht.
3. Reagenzzugabe dauert zu lange;
Inkonsistenz bei Zeitintervallen,
Luftblasen.

2.

Alle Reagenzien leicht, jedoch

grndlich auf geeignete Temperatur
bringen.

3.

4. Luftstrme blasen whrend der

Inkubationen ber die Platte.
5. Optischer Weg nicht sauber.

4.

6. Instrument vor Ablesungen nicht

auf richtige Temperatur gebracht.

6.

Konsistente, einheitliche Technik

entwickeln und Verspritzen vermeiden
oder Mehrkanal-Pipettiergert oder
automatischen Spender verwenden,
um die Zeit zu verkrzen.
Platte abdecken oder in einer
Kammer platzieren.
Plattenboden mit weichem Tuch
abwischen. Instrumenten-Lichtquelle
und Detektor auf Schmutz
berprfen.
Vorwrmverfahren im
Instrumentenhandbuch nachschlagen.

34

5.

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

7. Waschung inkonsistent;
eingeschlossene Blasen; am Ende
des Waschzyklus bleibt Flssigkeit
in den Wells.

7.

8. Falsche Pipettierung.

8.

Nur akzeptable Waschgerte

verwenden. Zeitverzgerung bei
automatischen Waschgerten
verlngern oder Anzahl er
Waschzyklen erhhen. berprfen,
ob alle Wells gleichmig gefllt und
aspiriert sind.Flssigkeit ber
Reagenzniveau im Well dispensieren.
Luftblasen in Pipettenspitzen vermeiden.
Sicherstellen, dass die Spitzen fest
gesichert sin sind.

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35

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

EQUIPO DE EIA DE ACTIVACIN DEL COMPLEMENTO (CAE)

1.

USO INDICADO

Este producto est indicado PARA SU USO EN DIAGNSTICOS IN VITRO. El equipo

CAE contiene instrucciones y material para la determinacin cualitativa de la actividad
clsica total del complemento en suero humano por inmunoensayo enzimtico (EIA).

2.

RESUMEN Y EXPLICACIN

Normalmente, la evaluacin funcional de la va clsica del complemento se realiza junto

con la valoracin de los componentes del complejo de ataque a la membrana por medio
del ensayo CH50, que ha sido el ensayo estndar durante dcadas para la actividad
funcional del complemento. El CH50 mide la actividad del complemento necesaria para
obtener una hemlisis del 50% en glbulos rojos de oveja bajo condiciones
estandarizadas. La hemlisis se mide por colorimetra determinando la cantidad de
hemoglobina desprendida por los glbulos rojos. El ensayo CH50 ha sido una
importante herramienta para la evaluacin de la va clsica del complemento y de los
componentes del complejo de ataque a la membrana. Sin embargo, la prueba lleva
mucho tiempo y tiene diversos reactivos difciles de estandarizar. Adems, las clulas
de oveja pueden variar ampliamente en su respuesta hemoltica al complemento.1- 3
El inmunoensayo enzimtico de activacin del complemento (CAE) combina principios
del ensayo hemoltico para activacin del complemento con el uso de anticuerpos
marcados especficos para neoantgeno producido como resultado de la activacin del
complemento. La cantidad de neoantgeno generado es proporcional a la actividad
funcional de C1q hasta C9.
La activacin in vitro de la secuencia del complemento origina el consumo de
componentes del complemento que, a su vez, podra producir una reduccin de su
concentracin. Por tanto, la determinacin de las protenas o de la actividad del
complemento se utiliza para indicar si el sistema del complemento se ha activado por un
mecanismo inmunolgico y/o uno patognico. Se utilizan mediciones del complemento
tanto funcionales como inmunoqumicas para evaluar a los pacientes si se sospecha de
una enfermedad activadora del complemento o si es posible una deficiencia hereditaria.
En la evaluacin del nivel de actividad del complemento mediante ensayos funcionales
como el CAE y el CH50 se tienen en cuenta la tasa de sntesis, la degradacin y el uso
de los componentes, y se mide la integridad de la va clsica frente a mtodos
inmunoqumicos que miden especficamente la concentracin de distintos componentes
del complemento.1- 3
Si se detecta una reduccin en los niveles de componentes o de funcionamiento del
complemento, mdicamente se considera indicativa de un proceso inmunolgico en
curso que origina el uso de componentes y la cada de los niveles del complemento. Si
los niveles del complemento son altos, normalmente se considera como una expresin
inespecfica de una respuesta de fase aguda.1- 3

3.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

El equipo de ensayo CAE (EIA de activacin del complemento) es un nuevo mtodo

para la medicin de la actividad clsica total del complemento. El mtodo utiliza un
anticuerpo monoclonal conjugado con enzimas especfico para neoantgeno de
protenas del complemento terminal. Los pocillos de la placa microtiter estn recubiertos
con un activador del complemento al que se aade una nica dilucin de suero de
paciente o de control. Se activa la va clsica del complemento completa y se forma la
cascada de C1q a C9 dentro del pocillo de la placa microtiter. Se deja que un anticuerpo
monoclonal conjugado con peroxidasa de rbano picante reaccione con el neoantgeno
resultante unido a los pocillos de la placa. Tras aadir el cromgeno, la cuantificacin se
obtiene comparando las capacidades de absorcin resultantes, medidas a 450 nm, con
una referencia, y se verifica con dos controles.

36

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

4.

00:00 AM/PM

REACTIVOS SUMINISTRADOS CON EL EQUIPO

Tiras recubiertas CAE
Diluente de muestras CAE
Conjugado HRP CAE
Cromgeno
Tampn de lavado (10x)
Solucin de paro CAE
Gradilla y tubos de dilucin
Tapa de placa
Calibrador CAE
Control CAE de nivel 1
Control CAE de nivel 2
Nmero de pruebas

12 x 8 pocillos
1 vial, 60 mL
1 vial, 20 mL
1 vial, 22 mL
1 vial, 100 mL
1 vial, 20 mL
1 caja, 96 viales
1 tapa
3 viales, liofilizados
3 viales, liofilizados
3 viales, liofilizados
96

ALMACENAMIENTO: Tras su recepcin, el juego de reactivos debe almacenarse a

2-8C. El juego de calibrador y controles debe almacenarse a 20C. Una vez abierto,
almacene todos los reactivos a 2-8C hasta la fecha de caducidad de la etiqueta,
excepto el calibrador y controles de un solo uso, que deben desecharse, y las tiras
recubiertas, que se pueden almacenar durante 8 semanas.
Los reactivos no deben utilizarse despus de la fecha de caducidad.
4.1 Tiras recubiertas CAE: reactivo listo para su uso
Deje que las tiras y el soporte se equilibren a temperatura ambiente (20-25C) dentro de
la bolsa de papel de aluminio para proteger los pocillos de la condensacin. Una vez
abierta la bolsa, vuelva a sellarla en un ambiente desecado para garantizar un cierre
correcto.
NOTA: La primera vez que se abre la bolsa que contiene las tiras, el indicador de
desecado DEBE estar azul. Si el indicador no est azul, no utilice las tiras.
4.2 Diluente de muestras CAE: reactivo listo para su uso
Contiene tampn, tinte verde y conservante. NOTA: No utilice el diluente si est turbio.
4.3 Conjugado HRP CAE: reactivo listo para su uso
Contiene anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa de rbano picante.
NOTA: No utilice el conjugado si est turbio.
4.4 Cromgeno: reactivo listo para su uso
Substrato tamponado y cromgeno (tetrametilbencidina [TMB] 3,3, 5,5). Protjase de la
luz. NOTA: No utilice el cromgeno si presenta precipitado azul.
4.5 Tampn de lavado (10X): solucin lquida
Contiene tampn de fosfato y Tween. El tampn de lavado 1X se mantiene estable a
temperatura ambiente (20-25C) durante 2 meses. NOTA: No utilice el tampn si est
turbio. El tampn de lavado 10X puede presentar cristalizacin una vez refrigerado.
Deje que se disuelva a temperatura ambiente (20-25C) antes de diluirlo.
4.6 Solucin de paro CAE: reactivo listo para su uso
Contiene cido sulfrico 2N. Consulte la seccin Advertencias y precauciones.
4.7 Calibrador CAE: suero humano liofilizado
(Paquete con n de catlogo 6300)
Consulte la seccin Advertencias y precauciones. El calibrador reconstituido se mantiene
estable sobre hielo hasta cuatro horas. Deschelo una vez utilizado. El calibrador se ha
calibrado respecto a un mtodo CH50 reconocido. Cualquier comparacin con otros
productos o procedimientos debe hacerse con este mtodo. El calibrador del equipo
demuestra conmutabilidad con muestras de paciente cuando se usa con los reactivos y el
procedimiento recomendados para esta prueba de diagnstico in vitro.
El valor del calibrador CAE se indica en la etiqueta del vial.
NOTA: No utilice el calibrador si el material liofilizado est hmedo o pegajoso.

37

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

4.8 Sueros de control CAE (nivel 1, nivel 2): suero humano liofilizado
(Paquete con n de catlogo 6300)
Consulte la seccin Advertencias y precauciones. Los controles reconstituidos son
estables sobre hielo hasta cuatro horas. Deschelos una vez utilizados. Los valores de
los controles CAE se indican en la etiqueta del vial.
NOTA: No utilice los controles si el material liofilizado est hmedo o pegajoso.

5.

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES

DE USO EXCLUSIVO PARA DIAGNSTICOS IN VITRO.

REACTIVOS QUE CONTIENEN MATERIAL DE ORIGEN HUMANO

PRECAUCIN: Los controles y el calibrador contienen suero humano. Trtelos
como sustancias potencialmente infecciosas.
Todas las unidades de suero/plasma de donante usados en la preparacin de este
producto se han comprobado mediante mtodos aprobados por la FDA estadounidense,
demostrando no ser reactivos para la presencia de AgsHB, anticuerpos de VHC y
anticuerpos de VIH 1/2. Aunque estos mtodos son altamente precisos, no puede
garantizarse que se detecten todas las unidades infectadas. Este producto tambin
puede contener otros materiales de origen humano para los cuales no existe prueba
homologada. Dado que ningn mtodo de prueba puede ofrecer una seguridad total de
la ausencia del virus de la hepatitis B (VHB), de la hepatitis C (VHC), el virus de
inmunodeficiencia humana (VIH) u otros agentes infecciosos, todos los productos que
contengan material de origen humano se deben manejar de acuerdo con las prcticas
de laboratorio correctas utilizando las precauciones adecuadas que se describen en el
manual "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", 4 edicin, mayo de
1999 o edicin actual, para centros de control y prevencin de enfermedades/institutos
nacionales de salud de EE.UU.

ADVERTENCIAS ADICIONALES
Solucin de paro (cido sulfrico 2N) Puede causar quemaduras graves al entrar en
contacto con la piel. Evite el contacto con los ojos, la piel o la ropa. Evite la ingestin o
inhalacin de gases. En caso de contacto, lave la zona afectada con agua abundante
durante al menos 15 minutos.
Advertencias sobre el riesgo de sustancias peligrosas establecidas por la
Comunidad Europea (Directiva del Consejo 1999/45/CE)
R34 - Causa quemaduras.
S26 - En caso de contacto con los ojos, lvense inmediatamente con abundante agua y
solictese asistencia mdica inmediata.
S30 - Nunca aada agua a este producto.
S37/39 - Utilice guantes y proteccin facial/ocular adecuada.
Cromgeno: Este producto contiene tetrametilbencidina (TMB) 3,3', 5,5' (0.05%) que
ha demostrado posibles efectos mutagnicos en experimentos de laboratorio.

6.

REQUISITOS DE MUESTRAS

Deben recogerse muestras de sangre mediante tcnica asptica de puncin venosa y

obtenerse suero mediante procedimientos de complemento estndares. Se recomienda un
mnimo de 5 mL se sangre entera. Deje que la sangre se coagule en tubos de tapa roja, sin
separador de suero, durante 60-65 minutos a temperatura ambiente (20-25C). Centrifugue
las muestras de sangre en un centrifugador refrigerado y transfiera suero sin clulas a un
tubo limpio. Los sueros deben manipularse adecuadamente para evitar la activacin
del complemento in vitro. Los sueros deben congelarse a -70C o menos para
almacenarlos durante un periodo de tiempo largo o transportarlos sobre hielo seco. Las
muestras no deben congelarse y descongelarse ms de tres veces. No se recomienda el
uso de congeladores autodescongelantes, ya que las muestras podran desecarse y/o el
complemento degradarse.

38

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

Se ha demostrado que la introduccin de niveles elevados de hemoglobina (5 mg/dL),

bilirrubina (20 mg/dL), colesterol (10 mg/dL) y triglicridos (4926 mg/dL) en un pool de
suero bajo no altera los resultados de la prueba CAE. La fiabilidad de los resultados con
plasma humano, o con especimenes contaminados, particulados o desactivados por
calor, se desconoce. La manipulacin incorrecta de las muestras puede producir
resultados errneos.

7.

EQUIPO Y MATERIAL NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS

7.1
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
7.10
7.11

8.

Sistema de lavado de placas, manual o automtico.

Recipiente de 1000 mL para el tampn.
Cronmetro (60 minutos).
Toallas de papel absorbentes.
Recipientes para reactivos (n de cat. 4505).
Lector de placas EIA capaz de leer a 450 nm.
Incubadora, 37 2C.
Pipetas: (5-20 L, 20-1000 L) o diluidor automtico.
Pipeta multicanal (50-150 L).
Cilindro graduado de un litro.
Agua purificada

IDENTIFICACIN DE POCILLOS
Es posible que los blancos, los controles, el calibrador y las muestras de paciente
deban colocarse en posiciones diferentes segn lo requiera el fabricante del lector de
placas EIA. Se recomienda la siguiente configuracin de placas (vase la FIGURA 1).
BLANCO: Realizar por duplicado.
CALIBRADOR: Realizar por cuadruplicado.
CONTROLES Y MUESTRAS DE PACIENTE: Realizar por duplicado.

FIGURA 1: Configuracin de placa microtiter

1
A
B
C
D
E
F
G
H

BLANCO
CAL.
CAL.
NIVEL 2
NIVEL 1
MUESTRA 1
MUESTRA 2
MUESTRA 3

9.

2
BLANCO
CAL.
CAL.
NIVEL 2
NIVEL 1
MUESTRA 1
MUESTRA 2
MUESTRA 3

10

11

12

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

PREPARACIN DE SUEROS Y REACTIVOS

9.1

9.2

9.3

Deje que las placas (en la bolsa cerrada), el tampn de lavado, el conjugado
HRP, el cromgeno y la solucin de paro se equilibren a temperatura
ambiente (20-25C).
Las muestras de suero deben descongelarse parcialmente colocndolas
brevemente en un bao de agua a 37 2C y removiendo ligeramente.
Colquelas inmediatamente en un bao de hielo.
Coloque el diluente de muestras, el agua purificada, los controles, el calibrador y
las muestras de paciente descongeladas en hielo antes de su uso.

39

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

9.4

9.5

9.6

00:00 AM/PM

Preparacin de los controles y el calibrador.

a. Saque los viales del hielo.
b. Golpee ligeramente los viales para hacer que el material liofilizado
descienda al fondo del vial y retire con cuidado el sello y el tapn.
c. Aada inmediatamente 0.1 mL de agua purificada fra (2-8 C)
directamente al material liofilizado.
d. Vuelva a colocar el tapn con seguridad.
e. Deje el vial metido en hielo durante 5-10 minutos agitndolo
suavemente de vez en cuando hasta lograr una disolucin completa.
Los controles y el calibrador reconstituidos se pueden almacenar
hasta 4 horas antes de su uso si se mantienen a 2-8 C o sobre
hielo.
Para preparar el tampn de lavado 1X, vierta el contenido del frasco de
tampn de lavado 10X en un recipiente de 1000 mL. Enjuague la botella con
agua purificada para eliminar el lquido residual y aada el agua del
enjuague al recipiente. Aada agua purificada hasta alcanzar un volumen
total
de
1000 mL. Mezcle el contenido del recipiente hasta que est totalmente
disuelto.
Separe la gradilla de tubos de dilucin y llene parcialmente la seccin inferior
con hielo y agua para formar un bao de hielo. Vuelva a insertar el
portatubos en la gradilla.

10. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO

10.1
10.2

10.3

10.4

10.5
10.6
10.7

Prepare los sueros y los reactivos del modo indicado en la seccin anterior.
Saque la placa de la bolsa de papel de aluminio con cuidado de no tocar la
superficie ptica
del fondo de los pocillos. Las tiras deben utilizarse slo si el desecante
incluido en la bolsa est azul al abrir la bolsa por primera vez. Retire el
nmero adecuado de tiras que se vayan a usar y etiqutelas para evitar
confusiones. Vuela a colocar las tiras sobrantes en la bolsa, selle la bolsa y
colquela en refrigeracin para uso futuro.
Dilucin de las muestras de suero: Mediante la gradilla de tubos de dilucin,
diluya el calibrador, cada control y el suero de paciente a 1:120 (5 L +
595 L) con diluente de muestras fro. Agite en un vrtex el material diluido
de cada tubo tres veces y vuelva a colocar el tubo de dilucin en el bao de
hielo.
Incorporacin de la muestra: Dosifique 150 L de cada calibrador, control y
suero de paciente diluidos en pocillos duplicados mediante una pipeta
multicanal. Para el blanco, dosifique 150 L de diluente de muestra en
pocillos duplicados y, a continuacin, trtelos como pocillos de muestra.
Activacin del complemento: Cubra e incube la placa sin moverla a 37 2C
durante 60 minutos.
Deseche los sueros de los pocillos decantando o aspirando con un
dispositivo adecuado.
Lavado: Llene todos los pocillos por completo con tampn de lavado 1X
(300 L o ms por pocillo). Djelos en remojo durante 30 segundos. Vace
los pocillos decantando a un contenedor de desecho o por aspiracin. Repita
el procedimiento dos veces ms (tres lavados en total). Los sistemas de
lavado automticos deben ajustarse de forma que haya un ciclo de remojo
de 30 segundos entre los pasos.
NOTA: Pueden producirse resultados errneos si los pocillos no se llenan del
todo durante el ciclo de lavado. El lquido residual debe eliminarse
sosteniendo la placa con fuerza suficiente para que las tiras se mantengan
en el soporte y golpeando la placa varias veces mientras est boca abajo
sobre una toalla de papel u otra superficie absorbente.
40

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

10.8
10.9
10.10
10.11
10.12
10.13

10.14

00:00 AM/PM

Incorporacin del conjugado HRP: Dosifique 150 L de conjugado HRP en

cada pocillo mediante una pipeta multicanal.
Unin del conjugado HRP: Cubra e incube la placa sin moverla a 37 2C
durante 30 minutos.
Lavado: Deseche el conjugado de los pocillos y lave la placa como se
describe en el paso 7.
Incorporacin del cromgeno: Aada 150 L de cromgeno en cada pocillo
mediante una pipeta multicanal.
Desarrollo del color: Cubra e incube la placa sin moverla a temperatura
ambiente (20-25C) durante 30 minutos. NO LAVE LA PLACA!
Interrupcin del desarrollo del color: Para detener la reaccin al final de la
incubacin del cromgeno, dosifique 100 L de solucin de paro (cido
sulfrico 2N) en todos los pocillos siguiendo los mismos intervalos regulares
y el mismo orden en que se incorpor el cromgeno preparado. Golpee
suavemente la placa para dispersar la solucin de paro. El color cambiar de
azul a amarillo.
Lectura de la placa a 450 nm en lector de placas EIA: Realice la lectura y
antela a 450 nm en el plazo de 30 minutos.

11. COMENTARIOS SOBRE EL PROCEDIMIENTO

11.1

El uso cuidadoso de dispositivos de dosificacin y lectores de placas

adecuados contribuir significativamente a la precisin y reproducibilidad de
los ensayos realizados con el equipo CAE.
11.2 La modificacin de los tiempos o las temperaturas de incubacin
indicados en este prospecto puede afectar a los resultados finales.
11.3 Utilice todos los componentes a las temperaturas recomendadas.
11.4 La presencia de burbujas de aire en los pocillos de ensayo reduce la eficacia
de la unin.
11.5 Toque el lateral del pocillo con la punta de las pipetas antes de retirar stas.
11.6 El uso de procedimientos de lavado distintos a los indicados en este
prospecto puede afectar adversamente a los resultados.
11.7 Utilice tcnicas aspticas para evitar la contaminacin de reactivos que
podra causar resultados errneos. Almacene el tampn de lavado 1X en un
recipiente limpio para evitar su contaminacin.
11.8 Se recomienda material de plstico o cristal desechable o estril. El material
de cristal reutilizable debe lavarse bien y enjuagarse con agua purificada
hasta eliminar por completo el detergente. Los pocillos no se deben reutilizar.
11.9 No deje que los pocillos se sequen una vez comenzado el procedimiento.
Evite la exposicin a luces intensas mientras se realiza el ensayo.
11.10 No intercambie los reactivos del equipo por reactivos de otros proveedores.
Los reactivos empleados en estas pruebas estn optimizados para la
deteccin del complemento total de acuerdo con las especificaciones.
Su dilucin o adulteracin producira una prdida de sensibilidad.
La contaminacin cruzada entre reactivos y muestras de paciente o el uso de
reactivos distintos de los suministrados en este equipo podra producir
resultados errneos.
11.11 No se ofrece garanta alguna de que estos reactivos estn libres de
contaminacin microbiana.

41

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

12. CONTROL DE CALIDAD

12.1
12.2
12.3
12.4
12.5
12.6

Deben realizarse pruebas de calibrador y controles con cada serie.

El blanco debe tener una capacidad de absorcin inferior a 0.15 en una
lectura a 450 nm.
El control de nivel 1 debe tener una capacidad de absorcin media (ABS)
inferior a la del calibrador.
El control de nivel 2 debe tener una capacidad de absorcin media (ABS)
superior a la del calibrador.
Los valores de los controles deben estar dentro de los rangos de unidades
CAE indicados en su etiqueta.
La prueba es vlida si se cumplen TODOS los criterios anteriores.

13. CLCULO DE RESULTADOS

Los resultados se expresan en relacin a calibrador como unidades CAE. Determine los
resultados mediante la siguiente frmula.
Unidades CAE
del suero de ref.

Muestramedia (ABS) Blanco medio (ABS)

Ref. media (ABS) Blanco medio (ABS) = Unidades CAE de muestra

El informe de resultados del paciente se presenta como "CAE bajo" o "CAE normal/alto"
de acuerdo con el punto de corte establecido a partir de una poblacin de referencia
apropiada.
Interpretacin de resultados
Basndose en estudios de rangos normales, DiaSorin ha establecido un punto de corte
de 60 unidades CAE para definir una actividad de complemento baja. Las muestras de
paciente con lecturas superiores a 60 unidades CAE se consideran como
normales/altas para CAE. Cada laboratorio debe establecer su propio punto de corte
para determinar los valores CAE bajos.

14. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

14.1
14.2

Las capacidades de absorcin superiores a 3.0 estn por encima de los

lmites aceptables del ensayo y deben presentarse as en el informe.
Por s mismos, los resultados de la prueba CAE no constituyen un
diagnstico. Los resultados deben interpretarse en conjuncin con otras
pruebas de laboratorio, as como con la presentacin clnica del paciente.

15. VALORES PREVISTOS

Normales
El ensayo CAE fue realizado por DiaSorin empleando muestras de suero obtenidas de
individuos aparentemente sanos. Todas las muestras dieron resultados superiores al
punto de corte establecido y se clasificaran como normales/altas.
Tabla 1: ESTUDIO DEL RANGO NORMAL REPRESENTATIVO
Promedio
Desviacin estndar
Rango
n
(Unidades CAE)
(Unidades CAE)
(Unidades CAE)
102
104
20.4
63-145

42

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

16. RESULTADOS OBTENIDOS

16.1 PRECISIN
La precisin del equipo CAE de DiaSorin se evalu segn principios modificados de la
Directiva del Comit nacional de estndares para laboratorios clnicos (National
Committee for Clinical Laboratory Standards Guideline), Evaluation of Precision
Performance of Clinical Chemistry Devices: (EP5-T2).
Se analizaron siete muestras por duplicado sobre un periodo de 10 das en 3
instalaciones. Los pocillos duplicados se prepararon a partir de una nica dilucin de
cada muestra. Las muestras son pools preparados a partir de sueros humanos
escogidos para abarcar el rango de actividad de activacin del complemento desde los
niveles inferiores a los superiores. Todos los datos se agruparon para su anlisis. Los
valores atpicos se definieron como observaciones cuyos valores CAE estandarizados
eran desviaciones estndares superiores a 2.6 respecto a cero.
Los valores atpicos se borraron y el resto de datos se someti a un anlisis de
variacin (ANOVA) para obtener clculos de precisin intraensayo, entre das, entre
instalaciones y total.
Los resultados finales pueden verse en la Tabla 2. Los valores se basan en unidades
CAE segn se definen en la seccin Clculo de resultados.
TABLA 2: Precisin CAE
(Valores en unidades CAE)
Intraensayo

Entre das

Entre instalaciones

Total

Muestra

Media

Desv.
est.

%C.V.

Desv.
est.

%C.V.

Desv.
est.

%C.V.

Desv.
est.

60

10.7

2.131

19.9

1.865

17.5

1.111

10.4

3.042

28.5

58

12.0

1.210

10.1

1.422

11.9

1.327

11.1

2.291

19.1

60

25.3

3.032

12.0

2.354

9.3

1.728

6.8

4.209

16.7

58

83.4

5.685

6.8

9.088

10.9

0.000

0.0

10.720

12.9

60

134.2

5.916

4.4

11.832

8.8

10.158

7.6

16.679

12.4

60

146.6

6.308

4.3

9.158

6.2

10.879

7.4

15.557

10.6

59

147.7

5.170

3.5

4.829

3.3

11.229

7.6

13.272

9.0

%C.V.

16.2 Veracidad: La veracidad del ensayo se comprob por comparacin de

mtodos (comparacin con el mtodo CH50).
Exactitud
El ensayo CAE se compar, por un lado, con una prueba CH50 disponible
comercialmente y, por el otro, con un procedimiento Kent Fife CH50 utilizado por un
laboratorio de referencia inmunolgica reconocido. Los resultados de la prueba se
clasificaron como bajos o normales/altos con los valores de punto de corte establecidos
para cada mtodo.

43

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

Con el mtodo CH50 (o mtodo verdadero) como referencia, los valores de sensibilidad
relativa, especificidad relativa y concordancia general fueron los siguientes:
N de bajos verdaderos (bajos en ambos ensayos)
N de bajos verdaderos + N de muestras CAE
normales/altas

Sensibilidad relativa =

Sensibilidad relativa =

N de normales/altos verd. (normales/altos en ambos ensayos)

(N de normales/altos verdaderos + N de muestras CAE bajas)

Concordancia gral. =

(N de bajos verd. + N de muestras verd. normales/altas)

N total de muestras comprobadas

Tabla 3: COMPARACIN DE KENT FIFE CH50 CON CAE

CAE
Bajos

Normales/
altos

Total

Kent Fife

Bajos

48

50

CH50

Normales/altos

71

73

Total

50

73

123

Sensibilidad
relativa
Epecificidad
relativa
Concordanci
a general

Figura 3: COMPARACIN DE KENT FIFE CH50 CON CAE

250

Normales / altos

Unidades. CAE

200

150

100

Bajos

50

0
0

50

100

150

200

250

Unidades CH50

44

300

350

400

96%
97%
97%

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

Tabla 4: COMPARACIN DE CH50 COMERCIAL CON CAE

CAE
Bajos

Normales/altos

Bajos

20

22

Sensibilidad relativa

91%

Normales/altos

57

57

Epecificidad relativa

100%

Total

20

59

79

Concordancia general

97%

CH50
comercial

Total

Figura 4: COMPARACIN DE CH50 COMERCIAL CON CAE

300
Normales / altos
250

Unidades. CAE

200

150

100

50
Bajos
0
0

50

100

150

200

250

Unidades de CH50 comercial

45

300

350

400

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

RESOLUCIN DE PROBLEMAS
Problema
Valores CAE de control fuera de
rango.

Posibles causas
1. Temperatura, tiempos o
dosificacin incorrectos; reactivos
no mezclados.
2. Contaminacin cruzada de
controles.
3. Dilucin incorrecta.
4. La va ptica no est limpia.

5. Longitud de onda del filtro

incorrecta.
6. Dilucin excesiva o insuficiente de
los calibradores.
Todos los resultados de la
prueba negativos.

1. Uno o varios reactivos no

aadidos, o aadidos en
secuencia incorrecta.
2. Actividad del conjugado perdida.

3. Dilucin del tampn de lavado

incorrecta.
4. Placa recubierta inactiva.

Todos los resultados de la

prueba positivos.

1. Solucin de cromgeno
contaminada.
2. Tampones y reactivos
contaminados.
3. Tampn de lavado (1X)
contaminado.

Falta de precisin (Lecturas de

Capacidad de absorcin del
duplicado superiores al 20% de
su media).

1. CV de administracin del
dosificador superior al 5% o
muestras aadidas demasiado
deprisa.
2. Suero o reactivos mezclados de
forma insuficiente; reactivos a
temperatura incorrecta antes de
aadirlos.
3. Lleva demasiado tiempo aadir los
reactivos; intervalos de tiempo
irregulares; burbujas de aire.

4.Dilucin del suero incorrecta.

4. Corrientes de aire sobre la placa

durante las incubaciones.
5. Va ptica sucia.

46

Solucin
1.Compruebe si la temperatura era
correcta. Compruebe si el tiempo era
correcto. Consulte Falta de precisin
(abajo) nms. 2 - 4. Repita la prueba.
2. Dosifique con cuidado.
3. Repita la prueba.
4. Compruebe si hay humedad o suciedad.
Limpie el fondo y repita la lectura si se
usa solucin de paro
5. Cambie el filtro a 450 5 nm.
6. Compruebe de nuevo el procedimiento.
Vuelva a diluir calibradores, controles y
muestras. Repita la prueba.
1. Compruebe de nuevo el procedimiento.
Compruebe si quedan soluciones sin
usar. Repita la prueba.
2. Aparte una pequea cantidad de
cromgeno en un tubo de ensayo
(aprox. 0.1 mL) y dosifique el conjugado
(5-10 L) directamente en el
cromgeno. La solucin debera
volverse azul rpidamente.
3. Vuelva a diluir el tampn de lavado..
Repita la prueba.
4. Compruebe el color del desecante.
Compruebe la presencia de humedad
en los pocillos no usados. Repita la
prueba con controles slo para
actividad. Compruebe la actividad el
conjugado como en m. 2 (arriba).
1. Compruebe la capacidad de absorcin
de la solucin de cromgeno no usada.
2. Compruebe la turbidez de todas las
soluciones.
3. Compruebe la procedencia del agua
purificada usada para diluir el
tampn.Debera tener una resistividad
superior a 5 megaohmios.
4. Vuelva a diluir las muestras. Repita la
prueba.
1. Compruebe la calibracin del
dosificador. Utilice una tcnica
reproducible.
2. Mezcle todos los reactivos despacio a
fondo y equilbrelos a temperatura
adecuada.
3. Desarrolle una tcnica constante y
uniforme y evite salpicar, o use una
pipeta multicanal o un dispensador
automtico para reducir el tiempo.
4. Tape la placa o pngala en una cmara.
5. Limpie el fondo de la placa con una
toalla. Compruebe si la fuente de luz y el
detector del instrumento estn sucios.

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

6. No se ha equilibrado el instrumento
antes de tomar lecturas.
7. Lavado irregular; burbujas
atrapadas; queda lquido en los
pocillos al final del ciclo de lavado.

8. Dosificacin incorrecta.

CONSULTE LA BIBLIOGRAFA EN LA LTIMA PGINA

47

6. Compruebe el procedimiento de
calentamiento en el manual del
instrumento.
7. Use slo dispositivos de lavado
aceptables. Alargue el retardo
programado en dispositivos de lavado
automticos o aumente el nmero de
ciclos de lavado. Asegrese de que
todos los pocillos se llenan y aspiran
uniformemente. Aada lquido por
encima del nivel de reactivo en el
pocillo.
8. Evite las burbujas de aire en la punta de
las pipetas. Compruebe si las puntas
estn bien sujetas.

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

KIT EIA (CAE) DI ATTIVAZIONE DEL COMPLEMENTO

1.

USO PREVISTO

Questo prodotto destinato ALL'IMPIEGO DIAGNOSTICO IN VITRO. Questo kit

contiene istruzioni e materiali per la determinazione quantitativa dell'attivit classica
totale del complemento nel siero umano mediante immunoassay enzimatico (EIA).

2.

SOMMARIO E SPIEGAZIONI

La valutazione funzionale della via classica del complemento viene di norma effettuata
insieme a quella delle componenti del complesso di attacco della membrana mediante
l'analisi CH50, che per decenni stata l'analisi standard dell'attivit funzionale del
complemento. Il CH50 misura l'attivit del complemento necessaria per ottenere
l'emolisi al 50% di eritrociti ovini in condizioni standardizzate. L'emolisi viene misurata
con colorimetria determinando la percentuale di emoglobina rilasciata dagli eritrociti.
L'analisi CH50 stata uno strumento importante per la valutazione della via classica del
complemento e delle componenti del complesso di attacco della membrana. Il test,
tuttavia, richiede molto tempo e comprende una serie di reagenti difficili da
standardizzare. Inoltre, le cellule di ovini possono avere una reazione emolitica al
complemento che varia in larga misura. 1- 3
L'attivazione del complemento EIA (CAE) associa principi dell'analisi emolitica per
l'attivazione del complemento all'impiego di anticorpi marcati specifici di neoantigene
prodotto con attivazione del complemento. La percentuale di neoantigene generato
proporzionale all'attivit funzionale di C1q attraverso C9.
L'attivazione in vitro della sequenza del complemento determina il consumo di
componenti del complemento che, a sua volta, pu comportare una riduzione della loro
concentrazione. La determinazione di proteine del complemento o dell'attivit del
complemento viene quindi utilizzata per stabilire se il sistema del complemento stato
attivato da un meccanismo immunologico e/o patogenetico. Le misurazioni funzionali e
immunochimiche del complemento vengono impiegate per la valutazione dei pazienti in
caso di sospetta patologia con attivazione del complemento o di possibile deficienza
ereditaria. Nella valutazione del livello di attivit del complemento con analisi funzionali,
per es. CAE e CH50, vengono considerati il tasso di sintesi, la degradazione e l'impiego
delle componenti, e viene misurata l'integrit della via classica in contrapposizione ai
metodi immunochimici che valutano specificamente la concentrazione di diverse
componenti del complemento. 1- 3
Se si riscontrano livelli ridotti di componenti del complemento o della sua funzione, i
medici prendono in considerazione la presenza di un processo immunologico in corso
che determina l'uso di componenti e la riduzione dei livelli del complemento. Un
aumento dei livelli del complemento rappresenta di solito un'espressione aspecifica di
una reazione di fase acuta. 1- 3

3.

PRINCIPIO DELL'ANALISI

Il kit per il test di attivazione del complemento EIA (CAE) un nuovo metodo per la
misurazione dell'attivit totale classica del complemento. Questo metodo impiega un
anticorpo monoclonale enzima coniugato specifico di neoantigene di proteine terminali
del complemento. Pozzetti per microtitolazione vengono rivestiti con attivatore del
complemento, aggiungendo un'unica diluizione del siero del paziente o di controllo. Si
attiva la via completa classica del complemento e all'interno del pozzetto della piastra di
microtitolazione si forma la cascata di C1q attraverso C9. L'anticorpo monoclonale di
rafano coniugato con perossidasi pu reagire all'antigene risultante legato ai pozzetti
della piastra. Dopo aggiunta di cromogeno, si procede alla determinazione quantitativa
confrontando con un riferimento gli assorbimenti risultanti, misurati a 450 nm e verificati
con due controlli.

48

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

4.

00:00 AM/PM

REAGENTI FORNITI CON IL KIT

Strip rivestite CAE
Diluente campione CAE
Coniugato HRP CAE
Cromogeno
Tampone di lavaggio (10x)
Soluzione bloccante CAE
Provette per diluizione e
portaprovette
Copripiastra
Calibratore CAE
Controllo Livello 1 CAE
Controllo Livello 2 CAE
Number of tests

12 x 8 pozzetti
1 fiala/ 60 mL
1 fiala/ 20 mL
1 fiala/ 22 mL
1 fiala/ 100 mL
1 fiala/ 20 mL
1 scatola, 96 fiale
1 copripiastra
3 fiale, liofilizzate
3 fiale, liofilizzate
3 fiale, liofilizzate
96

CONSERVAZIONE: Il set di reagente dopo il suo ricevimento deve essere conservato a

2-8 C. Il set del calibratore e del controllo vanno conservati a 20 C. Dopo apertura,
tutti i reagenti vanno conservati a 2-8 fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta,
tranne il calibratore monouso e i controlli che vanno eliminati e le strip rivestite che
possono essere conservate per 8 settimane.
I reagenti non devono essere utilizzati dopo la data di scadenza.
4.1 Strip rivestite CAE: reagente pronto all'uso
Far stabilizzare strip e portaprovette a temperatura ambiente (20-25 C) nel sacchetto di
pellicola metallica per proteggere i pozzetti da condensazione. Una volta aperta la
confezione, sigillarla nuovamente per garantire una chiusura adeguata in ambiente
asciutto.
NOTA: Quando il sacchetto contenente le strip viene aperto la prima volta, l'indicatore
dell'essiccante DEVE essere blu. Se non blu, non usare le strip.
4.2 Diluente campione CAE: reagente pronto all'uso
Contiene tampone, colorante verde e conservante. NOTA: Non usare se il diluente
torbido.
4.3 Coniugato HRP CAE: reagente pronto all'uso
Contiene anticorpo monoclonale coniugato con perossidasi di rafano. NOTA: Non usare
se il coniugato torbido.
4.4 Cromogeno: reagente pronto all'uso
Substrato tamponato e cromogeno (3,3, 5,5 tetrametilbenzidina [TMB]). Proteggere
dalla luce. NOTE: Non usare in presenza di precipitato blu.
4.5 Wash Buffer (10X) (Tampone di lavaggio) (10X): soluzione liquida
Contiene tampone fosfato e Tween. L'1X Wash Buffer stabile se conservato a
temperatura ambiente (20-25 C) per 2 mesi. NOTA: Non usare se il tampone torbido.
Se conservato in frigorifero, il Wash Buffer 10X pu essere soggetto a cristallizzazione.
Sciogliere nuovamente a temperatura ambiente (20-25 C) prima della diluizione.
4.6 Soluzione bloccante CAE: reagente pronto all'uso
Contiene acido solforico 2N. Vedere paragrafo Avvertenze e Precauzioni.
4.7 Calibratore CAE: siero umano liofilizzato
(Confezione con numero di catalogo 6300)
Vedere paragrafo Avvertenze e Precauzioni. Il calibratore ricostituito stabile se messo
in ghiaccio per quattro ore. Eliminare dopo l'uso. Il calibratore stato calibrato rispetto a
un metodo CH50 stabilizzato. Eventuali comparazioni con altri prodotti o procedure
devono essere eseguite con questo metodo. Il calibratore del kit dimostra commutabilit
con i campioni del paziente quando usati con reagenti e con la procedura operativa di
questo test diagnostico in vitro, come raccomandato.
Il valore del calibratore CAE riportato sull'etichetta della fiala.
NOTA: Non usare se il materiale liofilizzato appare umido o viscoso.

49

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

4.8 Sieri di controllo CAE (Livello 1, Livello 2): siero umano liofilizzato
(Confezione con numero di catalogo 6300)
Vedere paragrafo Avvertenze e Precauzioni. I controlli ricostituiti sono stabili se messi in
ghiaccio per quattro ore. Eliminare dopo l'uso. I range del valore del controllo CAE sono
indicati sulle etichette delle fiale.
NOTA: Non usare se il materiale liofilizzato appare umido o viscoso.

5.

AVVERTENZE E PRECAUZIONI

SOLTANTO PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO.

REAGENTI CONTENENTI MATERIALE DI ORIGINE UMANA

ATTENZIONE: i controlli e i calibratori contengono siero umano. Trattare come
potenzialmente infettivi.
Ogni unit di siero/plasma da donatore usata nella preparazione di questo prodotto
stata testata con una metodica approvata dalla FDA statunitense e trovata non reattiva
per la presenza di HBsAg, anticorpi ad HCV ed anticorpi ad HIV 1/2. Anche se questi
metodi sono estremamente accurati, non garantita la localizzazione di tutte le unit
infette. Questo prodotto pu inoltre contenere altro materiale di provenienza umana per
il quale non esiste un test approvato. Poich nessuna metodologia di test approvata pu
offrire garanzia completa sull'assenza del virus dell'epatite B (HBV), dell'epatite C
(HCV), del virus di immunodeficienza umana (HIV) o di altri agenti infettivi, tutto il
materiale di provenienza umana deve essere trattato in conformit con le buone pratiche
di laboratorio adottando le precauzioni appropriate come descritto nei manuali dei
Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health Manual,
"Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories," quarta edizione, Maggio
1999 o edizione corrente.

AVVERTENZE SUPPLEMENTARI
Soluzione bloccante (acido solforico 2N) Pu causare gravi ustioni in caso di contatto
con la pelle. Non deve entrare in contatto con occhi, pelle o indumenti. Non ingerire n
inalare i fumi. In caso di contatto, lavare con abbondante acqua per almeno 15 minuti.
Frasi di rischio per sostanze pericolose della Comunit Europea (Direttiva del
Consiglio 1999/45/CE)
R34 - Provoca ustioni.
S26 - In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente con abbondante acqua e
consultare il medico.
S30 - Non versare acqua sul prodotto.
S37/39 Indossare guanti protettivi adatti e protezione per occhi/viso.
Cromogeno: questo prodotto contiene 3,3',5,5' tetrametilbenzidina (TMB) ( 0.05%)
che, secondo esperimenti condotti in laboratorio, pu essere causa di effetti mutageni.

6.

REQUISITI DEI CAMPIONI

I campioni di sangue vanno prelevati usando la tecnica asettica di puntura in vena e il siero
va raccolto usando procedure standard per il complemento. Si raccomanda una quantit
minima di 5 mL di sangue intero. La coagulazione del sangue deve avvenire in provette con
tappo rosso, senza separatore del siero, per 60-65 minuti a temperatura ambiente
(20-25 C). Centrifugare i campioni di sangue in una centrifuga refrigerata e trasferire il siero
senza cellule in una provetta pulita. I sieri vanno trattati adeguatamente per prevenire
l'attivazione del complemento in vitro. I sieri vanno congelati a 70 C o a temperature
inferiori in provette sterili sigillate ermeticamente per lunga conservazione o trasporto con
ghiaccio secco. I campioni non vanno congelati e scongelati pi di tre volte. Sono sconsigliati
freezer con scongelamento automatico, in quanto il campione pu essiccarsi e/o pu
verificarsi la degradazione del complemento.
stato dimostrato che livelli elevati di emoglobina (5 mg/dL), bilirubina (20 mg/dL),
colesterolo (10 mg/dL) e trigliceridi (4926 mg/dL) in un pool di siero a basso contenuto
non modificano i risultati del test CAE. Non si conosce l'affidabilit dei risultati ottenuti
dal plasma umano o da campioni contaminati, in particelle o inattivati con calore. Il
trattamento errato di campioni pu produrre risultati inesatti.

50

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

7.

00:00 AM/PM

ATTREZZATURE E MATERIALI NECESSARI, NON FORNITI IN DOTAZIONE

7.1
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
7.10
7.11

Sistema di lavaggio della piastra, manuale o automatizzato.

Serbatoio tampone da 1000 mL.
Timer (range di 60 minuti).
Salviette di carta assorbente.
Serbatoi reagente (N. cat. 4505).
Lettore della piastra EIA con capacit di lettura a 450 nm.
Incubatrice, 37 2C.
Pipette: (5-20 L, 20-1000 L) o autodiluitore.
Pipetta multicanali (50-150 L).
Cilindro graduato da un litro.
Acqua depurata

8 . IDENTIFICAZIONE DEL POZZETTO

Pu essere necessario posizionare i bianchi, i controlli, il calibratore e i campioni dei
pazienti in modo diverso da quanto prescritto dal produttore del lettore della piastra EIA.
Si raccomanda la seguente configurazione della piastra (vedere FIGURA 1).
BIANCO: Esecuzione in duplicato.
CALIBRATORE: Esecuzione in quadruplicato.
CONTROLLI E CAMPIONI DEI PAZIENTI: Esecuzione in duplicato.

FIGURA 1: Configurazione della piastra di microtitolazione

A
B
C
D
E
F
G
H

9.

10

11

12

BIANCO
CAL.
CAL.
LIVELLO 2
LIVELLO 1
CAMPIONE 1
CAMPIONE 2
CAMPIONE 3

BIANCO
CAL.
CAL.
LIVELLO 2
LIVELLO 1
CAMPIONE 1
CAMPIONE 2
CAMPIONE 3

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

PREPARAZIONE DEL SIERO E DEL REAGENTE

9.1

9.2

9.3
9.4

Far stabilizzare a temperatura ambiente (20-25C) le strip della piastra nei

sacchetti non aperti, il Wash Buffer, il coniugato HRP, il cromogeno e la
soluzione bloccante.
I campioni di siero nel frattempo vanno parzialmente scongelati mettendoli
brevemente a bagnomaria a 37 2C e mescolando delicatamente. Mettere
immediatamente nel bagno di ghiaccio.
Prima dell'uso mettere nel ghiaccio il diluente del campione, acqua depurata,
controlli, calibratore e campioni scongelati del siero del paziente.
Preparazione dei controlli e del calibratore.
a. Togliere le fiale dal ghiaccio.
b. Picchiettare delicatamente il fondo della fiala contenente tutto il
materiale liofilizzato e rimuovere con attenzione il sigillo applicato e il
tappo.
c. Aggiungere immediatamente 0.1 mL di acqua depurata fredda (2-8 C)
direttamente al materiale liofilizzato.
d. Rimettere il tappo e fissarlo saldamente.

51

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

e.

9.5

9.6

00:00 AM/PM

Lasciare la fiala nel ghiaccio per 5-10 minuti, agitando saltuariamente o

agitando con il vortex fino alla soluzione completa.

I controlli e il calibratore ricostituiti possono essere conservati per

4 ore prima dell'uso, se tenuti a 2-8 C o in ghiaccio.
Per preparare l'1X Wash Buffer, porre il contenuto del flacone di 10X Wash
Buffer in un contenitore da 1000 mL. Sciacquare il flacone con acqua
depurata per rimuovere il liquido residuo e aggiungere il liquido di risciacquo
al contenitore. Aggiungere acqua depurata fino a raggiungere il volume totale
di 1000 mL. Miscelare fino a soluzione completa.
Separare la rastrelliera con le provette di diluizione e riempire parzialmente la
parte inferiore con ghiaccio, aggiungendo acqua per ottenere un bagno di
ghiaccio. Rimettere il portaprovette di diluizione nella rastrelliera.

10. PROCEDURA DELL'ANALISI

10.1
10.2

Preparare sieri e reagenti come descritto nel capitolo precedente.

Rimuovere la piastra dal sacchetto di pellicola metallica facendo attenzione a
non toccare la superficie ottica sul fondo dei pozzetti. Le strip vanno usate
soltanto se l'essiccante contenuto nel sacchetto blu quando si apre la prima
volta. Prelevare il numero adeguato di strip da usare ed etichettarle per evitare
confusione. Rimettere le restanti strip nel sacchetto di pellicola metallica,
sigillare nuovamente e rimettere in frigorifero per l'impiego successivo.
10.3 Diluizione di campioni di siero: usando la rastrelliera delle provette di
diluizione, diluire 1:120 (5 L + 595 L) con diluente freddo per campioni il
calibratore, ogni controllo e il siero del paziente. Agitare nel Vortex il
materiale diluito in ogni provetta per tre volte e rimettere la provetta di
diluizione nel bagno di ghiaccio.
10.4 Aggiunta di campione: pipettare 150 L di ogni calibratore diluito, controllo e
siero del paziente in pozzetti duplicati usando una pipetta multicanali. Per il
bianco, pipettare 150 L di diluente campione in pozzetti di duplicati,
trattandoli successivamente come pozzetti di campione.
10.5 Attivazione del complemento: coprire e incubare la piastra intatta a 37 2 C
per 60 minuti.
10.6 Eliminare i sieri dai pozzetti mediante decantazione o aspirazione con un
apparecchio sotto vuoto.
10.7 Lavaggio: riempire completamente tutti i pozzetti con 1X Wash Buffer (300 L
o pi in ogni pozzetto). Immergere per 30 secondi. Svuotare nel contenitore
di smaltimento agitando oppure aspirare. Ripetere altre due volte per un
totale di tre lavaggi. I sistemi di lavaggio automatizzati, usati per il lavaggio
delle strip, vanno regolati per consentire un ciclo di immersione di 30 secondi
fra le fasi.
NOTA: Possono presentarsi risultati erronei se i pozzetti non sono riempiti
completamente durante il ciclo di lavaggio. Il liquido residuo va rimosso
esercitando una pressione sufficiente sulla piastra per mantenere le strip nel
telaio e picchiettando la piastra diverse volte mentre capovolta su un
tovagliolo di carta o altra superficie assorbente.
10.8 Aggiunta di coniugato HRP: pipettare 150 L di coniugato HRP in ciascun
pozzetto con una pipetta multicanali.
10.9 Legame di coniugato HRP: coprire e incubare la piastra intatta a 37 2 C
per 30 minuti.
10.10 Lavaggio: eliminare il coniugato dai pozzetti e lavorare la piastra come
descritto nella fase 7.
10.11 Aggiunta di cromogeno: aggiungere 150 L di cromogeno in ciascun pozzetto
con una pipetta multicanali.

52

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

10.12 Sviluppo del colore: coprire e incubare la piastra intatta a temperatura

ambiente (20-25 C) per 30 minuti. NON LAVARE LA PIASTRA!
10.13 Arresto dello sviluppo di colore: per arrestare la reazione alla fine
dell'incubazione di cromogeno, pipettare 100 L di soluzione bloccante
(acido solforico 2N) in tutti i pozzetti agli stessi intervalli regolari e nello
stesso ordine in cui stato aggiunto il cromogeno preparato. Picchiettare
delicatamente la piastra per spargere la soluzione bloccante. Si produrr un
viraggio del colore dal blu al giallo.
10.14 Lettura della piastra a 450 nm su un lettore di piastre EIA: leggere e
registrare i risultati a 450 nm entro 30 minuti.

11. COMMENTI SULLA PROCEDURA

11.1

L'impiego accurato di dispositivi di pipettatura adeguatamente calibrati e di

lettori di piastre potenzier significativamente l'accuratezza e la riproducibilit
del kit test CAE.
11.2 Tempi d'incubazione o temperature diversi da quelli indicati in questo
inserto possono influire sui risultati.
11.3 Usare tutte le componenti alle temperature raccomandate.
11.4 Bolle d'aria nei pozzetti d'analisi riducono l'efficienza di legame.
11.5 Picchiettare le punte delle pipette lateralmente al pozzetto prima di utilizzarle.
11.6 Procedure di lavaggio diverse da quelle esposte in questo inserto possono
influire negativamente sui risultati.
11.7 Usare tecnica asettica per evitare la contaminazione di reagenti che pu
causare risultati erronei. Conservare l'1X Wash Buffer in un contenitore pulito
per evitare la contaminazione.
11.8 Si raccomanda una provetta sterile o monouso o un contenitore in plastica. Il
contenitore in vetro utilizzabile va lavato accuratamente e ripulito di tutti i
detergenti mediante risciacquo con acqua depurata. Non riutilizzare i pozzetti.
11.9 Non far asciugare i pozzetti quando ha inizio la procedura. Evitare l'esposizione a
luce intensa mentre in corso l'analisi.
11.10 Non sostituire i reagenti del kit con reagenti di altri fornitori. I reagenti di
questi test sono ottimizzati per il rilevamento del complemento totale secondo
le specifiche. La diluizione o l'adulterazione determineranno la perdita di
sensibilit. La contaminazione crociata di reagenti e di campioni dei pazienti
o l'impiego di reagenti diversi da quelli forniti con questo kit possono produrre
risultati erronei.
11.11 Non viene garantita l'assenza di contaminazione microbica di questi reagenti.

12. CONTROLLO DI QUALIT

12.1
12.2
12.3
12.4
12.5
12.6

Il calibratore e i controlli devono essere utilizzati per l'esecuzione di ogni test.

Il bianco deve avere un assorbimento inferiore a 0.15 con lettura a 450 nm.
Il controllo di livello 1 deve avere un assorbimento medio (ABS) inferiore a
quello del calibratore.
Il controllo di livello 2 deve avere un assorbimento medio (ABS) superiore a
quello del calibratore.
I valori del controllo devono rientrare nei loro range etichettati di unit CAE.
Il test valido se sono soddisfatti TUTTI i criteri riportati sopra.

53

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ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

13. CALCOLO DEI RISULTATI

I risultati relativi al calibratore sono espressi come unit CAE. Determinare i risultati
utilizzando la formula riportata qui di seguito.
Unit CAE
del siero di rif .

Media campioni Avg (ABS) Media bianchi (ABS)

Media sieri di rif. (ABS) Media bianchi (ABS) = Unit di campione CAE

I risultati dei pazienti sono riportati come CAE bassa o normale/elevata sulla base del
valore soglia stabilito usando una popolazione di riferimento adeguata.
Interpretazione dei risultati
Sulla base di studi del range normale, DiaSorin ha stabilito un valore soglia di 60 unit
CAE per definire un'attivit bassa del complemento. La lettura di campioni dei pazienti
superiore a 60 unit CAE definisce un'attivit CAE normale/elevata. Ciascun laboratorio
stabilir i propri valori soglia per determinare valori CAE bassi.

14. LIMITI DELLA PROCEDURA

14.1
14.2

Gli assorbimenti superiori a 3.0 sono al di sopra dei limiti riferibili dell'analisi e
vanno riportati come tali.
I risultati del test CAE di per s non sono diagnostici. I risultati dell'analisi
vanno interpretati insieme ad altri esami di laboratorio e all'anamnesi clinica
del paziente.

15. VALORI PREVISTI

Nella norma
L'analisi CAE stata effettuata da DiaSorin con campioni di siero ricavati da soggetti
sani. I risultati di tutti i campioni erano al di sopra del valore limite stabilito e vanno
classificati come normali/elevati.
Tabella 1: STUDIO RAPPRESENTATIVO DI RANGE NORMALE
Media
Deviazione standard
Range
n
(Unit CAE)
(Unit CAE)
(Unit CAE)
102
104
20.4
63-145

16. DATI DI PERFORMANCE

16.1 PRECISIONE
La precisione del kit CAE di DiaSorin stata valutata usando principi modificati ricavati
dalla National Committee for Clinical Laboratory Standards Guideline "Evaluation of
Precision Performance of Clinical Chemistry Devices: (EP5-T2)".
Sette campioni sono stati esaminati in duplicato per un periodo di 10 giorni in 3
laboratori. I pozzetti di duplicati sono stati preparati da una diluizione singola di ciascun
campione. I campioni sono pool preparati da sieri umani scelti per misurare il range
dell'attivit di attivazione del complemento da livelli bassi a elevati. Sono stati raccolti
tutti i dati per l'analisi. Sono stati definiti valori estremi quelle osservazioni, i cui valori
CAE standardizzati erano superiori di 2.6 a deviazioni standard da zero.
I valori estremi sono stati cancellati e i dati restanti sono stati sottoposti ad Analisi della
Varianza (ANOVA) per ottenere valutazioni in termini di esecuzione, giorni, laboratori e
precisione totale.
I risultati finali sono riportati qui di seguito nella Tabella 2. I valori sono basati su unit
CAE come definito nel paragrafo Calcolo dei risultati.

54

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

TABELLA 2: Precisione della CAE

(Valori in unit CAE)
Esecuzione

Totale

Campione

(% C.V.)

Dev.
standard

(% C.V.)

Dev.
standard

(% C.V.)

Dev.
standard

60

10.7

2.131

19.9

1.865

17.5

1.111

10.4

3.042

28.5

58

12.0

1.210

10.1

1.422

11.9

1.327

11.1

2.291

19.1

60

25.3

3.032

12.0

2.354

9.3

1.728

6.8

4.209

16.7

58

83.4

5.685

6.8

9.088

10.9

0.000

0.0

10.720

12.9

60

134.2

5.916

4.4

11.832

8.8

10.158

7.6

16.679

12.4

60

146.6

6.308

4.3

9.158

6.2

10.879

7.4

15.557

10.6

59

147.7

5.170

3.5

4.829

3.3

11.229

7.6

13.272

9.0

Media

Dev.
standard

Confronto fra
laboratori

Confronto fra giorni

(% C.V.)

16.2 Accuratezza: L'accuratezza dell'analisi stata verificata con confronto di

metodi (confronto rispetto al metodo CH50).
Precisione
L'analisi CAE stata confrontata con quella CH50 disponibile in commercio e con la
procedura Kent Fife CH50 usata da un laboratorio immunologico designato di
riferimento. I risultati del test sono stati classificati come bassi o normali/elevati usando i
valori limite definiti per ciascun metodo.
Usando il metodo CH50 come riferimento (o metodo "vero") si proceduto nel modo
seguente al calcolo della sensibilit relativa, specificit relativa e concordanza generale:
Numero dei valori bassi veri
(bassi in entrambe le analisi)
Numero di bassi veri + numero
di campioni CAE normali/elevati

Sensibilit relativa
=

Sensibilit relativa
=

Numero dei valori normali/elevati veri

(normali/elevati in entrambe le analisi)
(Numero dei valori normali/elevati
veri + numero di campioni CAE bassi)

Concordanza generale =

Numero di bassi veri + numero di

campioni veri normali/elevati
Numero totale di campioni
esaminati

Tabella 3: CONFRONTO FRA KENT FIFE CH50 E CAE

CAE
Bassa

Normale/elevata

Totale

Kent
Fife

Bassa

48

50

CH50

Normale/elevata

71

73

Totale

50

73

123

55

Sensibilit
relativa
Specificit
relativa
Concordanza
generale

96%
97%
97%

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

Figura 3: CONFRONTO FRA KENT FIFE CH50 E CAE

250

Normale/elevata

Unit CAE

200

150

100

Bassa

50

0
0

50

100

150

200

250

300

350

400

Unit CH50

TABELLA 4: CONFRONTO FRA CH50 IN COMMERCIO E CAE

Bassa

CAE
Normale/
elevata

Totale

In
commercio

Bassa

20

22

CH50

Normale/elevata

57

57

Totale

20

59

79

56

Sensibilit
relativa
Specificit
relativa
Concordanza
generale

91%
100%
97%

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

Figura 4: CONFRONTO FRA CH50 IN COMMERCIO E CAE

300
Normale/elevata
250

Unit CAE

200

150

100

50
Bassa
0
0

50

100

150

200

250

Unit CH50 in commercio

57

300

350

400

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

ACCERTAMENTO ED ELIMINAZIONE DI DISTURBI

Problema
Valori di controllo CAE fuori
range.

Possibili cause
1. Temperatura errata,
programmazione dei tempi o
pipettatura reagenti non miscelati.
2. Contaminazione crociata di
controlli.
3. Diluizione inadeguata.
4. Via ottica non pulita.

5. Lunghezza d'onda del filtro errata.

6. Diluizione in eccesso o
insufficiente di calibratori.
Tutti i risultati del test negativi.

1. Non aggiunti uno o pi reagenti, o

aggiunti in sequenza errata.
2. Perdita dell'attivit del coniugato.

3. Diluizione inadeguata del tampone

di lavaggio.
4. Piastra rivestita inattiva.

Tutti i risultati del test positivi.

1. Soluzione di cromogeno
contaminata.
2. Tamponi e reagenti contaminati.
3. Tampone di lavaggio (1X)
contaminato.

4. Diluizione inadeguata di siero.

Precisione carente (Letture
assorbimento duplicato superiori
al 20% della loro media).

1. Pipettatura di CV superiore a al 5%
o campioni non aggiunti lentamente.
2. Siero o reagenti non miscelati in
modo sufficiente; reagenti non alla
giusta temperatura prima
dell'aggiunta.
3. Durata eccessiva dell'aggiunta di
reagente; incoerenza degli
intervalli di tempo, bolle d'aria.

4. Correnti d'aria dirette sulla piastra

durante le incubazioni.
5. Via ottica non pulita.

6. Strumento non equilibrato prima

dell'esecuzione delle letture.

58

Soluzione
1. Verificare che la temperatura sia
corretta. Verificare che il tempo sia
corretto. Vedere Scarsa Precisione
(sotto) N. 2 - 4. Ripetere il test.
2. Pipettare con attenzione.
3. Ripetere il test.
4. Controllare la presenza di umidit o
sporco. Pulire il fondo e procedere
nuovamente alla lettura se si usata la
soluzione bloccante.
5. Cambiare il filtro a 450 5 nm.
6. Ricontrollare la procedura. Diluire
nuovamente il calibratore, controlli e
campioni. Ripetere il test.
1. Ricontrollare la procedura. Verifica delle
soluzioni non utilizzate. Ripetere il test.
2. Rimuovere una piccola quantit di
cromogeno in una provetta test (circa
0.1 mL) e pipettare il coniugato (5-10
L) direttamente nel cromogeno. La
soluzione vira rapidamente al blu.
3. Diluire nuovamente il tampone di
lavaggio. Ripetere il test.
4. Verifica del colore dell'essiccante.
Verifica della presenza di miscela in
pozzetti non utilizzati. Ripetere il test
con controlli soltanto per l'attivit.
Verifica dell'attivit del coniugato come
descritto sopra al N. 2.
1. Verifica dell'assorbimento di soluzione
inutilizzata di cromogeno.
2. Verifica dell'intorbidamento di tutte le
soluzioni.
3. Verifica del rifornimento di acqua
purificata usata per diluire il tampone.
Deve avere una resistivit superiore a 5
megaohm.
4. Diluire nuovamente i campioni. Ripetere
il test.
1. Verifica della calibratura della pipetta.
Usare tecnica riproducibile.
2. Miscelare tutti i reagenti delicatamente,
ma in modo accurato, e portare a
temperatura adeguata.
3. Sviluppare tecnica uniforme adeguata
ed evitare spruzzi oppure usare
dispositivo di multipipettatura o
dispenser automatico per ridurre il
tempo.
4. Coprire la piastra o metterla al riparo.
5. Pulire il fondo della piastra con un
panno morbido. Verificare la sorgente
luminosan dello strumento e impiegare
rivelatore di sporco.
6. Verificare manualmente lo strumento
per procedura di riscaldamento.

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00:00 AM/PM

7. Lavaggio non conforme; inclusione

di bolle; liquido lasciato nei
pozzetti al termine del ciclo di
lavaggio.

8. Pipettatura inadeguata.

7. Usare soltanto apparecchi di lavaggio

ammessi.Prolungare il periodo di durata
su apparecchi automatizzati di lavaggio
aumentare il numero dei cicli di
lavaggio. Verificare che tutti i pozzetti
siano riempiti e aspirati in modo
uniforme. Distribuire il liquido a di sopra
del livello del reagente nel pozzetto.
8. Evitare bolle d'aria nelle punte delle
pipette. Accertarsi che le punte siano
fissate saldamente.

FARE RIFERIMENTO ALL'ULTIMA PAGINA PER LA BIBLIOGRAFIA

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00:00 AM/PM

KIT EIA (CAE) DE ACTIVAO DO COMPLEMENTO

1.

UTILIZAO PREVISTA

Este produto destina-se a UTILIZAO EM DIAGNSTICOS IN VITRO. O kit CAE

contm instrues e materiais para a determinao qualitativa da actividade clssica e
total do complemento no soro humano atravs de imunoanlise por enzimas (EIA).

2.

RESUMO E EXPLICAO

A avaliao funcional do percurso do complemento clssico normalmente efectuada

em conjunto com a avaliao dos componentes do complexo de ataque a membrana
atravs do teste de CH50, o qual h dcadas tem sido o teste padro para a actividade
funcional do complemento. O CH50 mede a actividade necessria do complemento
para obter 50% de hemlise de clulas vermelhas de carneiros em condies
normalizadas. A hemlise medida colorimetricamente, determinando a contagem de
hemoglobina libertada pelas clulas vermelhas. O teste de CH50 tem sido uma
importante ferramenta para a avaliao do percurso clssico do complemento e dos
componentes do complexo do ataque a membrana. No entanto, o teste muito
demorado e inclui uma variedade de reagentes que so difceis de normalizar. Alm
disso, as clulas de carneiro podem variar muito na respectiva resposta hemoltica ao
complemento.1- 3
A Activao do complemento EIA (CAE) associa princpios do teste hemoltico para
activao do complemento com a utilizao de anticorpos identificados especficos para
neoantignios produzidos em resultado da activao do complemento. A quantidade de
neoantignios gerados proporcional actividade funcional de C1q atravs de C9.
A activao In vitro da sequncia do complemento conduz ao consumo de
componentes complementares, os quais por sua vez, podiam levar a uma diminuio na
respectiva concentrao. Assim, a determinao de protenas do complemento ou da
actividade do complemento utilizada para indicar se o sistema do complemento foi
activado por um mecanismo imunolgico e/ou patognico. Ambas as medies do
complemento funcional e imuno-qumicas so utilizadas para avaliar pacientes quando
se suspeita de uma doena activadora do complemento ou possvel a existncia de
uma deficincia hereditria. O nvel de actividade do complemento avaliado por testes
funcionais como o CAE e o CH50 tm em considerao a taxa de sntese, degradao,
e utilizao dos componentes e medem a integridade do percurso clssico em
comparao com mtodos imuno-qumicos que medem especificamente a
concentrao de vrios componentes do complemento.1- 3
Quando so detectados nveis inferiores de componentes do complemento ou funo
do complemento, os clnicos consideram um processo imunolgico contnuo que
conduz utilizao de componentes e depresso de nveis do complemento.
Um aumento dos nveis dos complementos so normalmente uma expresso no
especfica da resposta de uma fase aguda.1- 3

3.

PRINCPIO DO TESTE

O kit de teste de Activao do Complemento EIA (CAE) um mtodo novo para a

medio da actividade do complemento clssica total. Este mtodo utiliza um anticorpo
monoclonal conjugado com enzimas, especfico para neoantignios de protenas de
complemento terminais. As cavidades de microtitulao so revestidas com activador
do complemento no qual uma nica diluio de soro do paciente ou de controlo
adicionada. O percurso clssico completo do complemento activado e a cascata de
C1q atravs de C9 forma-se no interior da cavidade da placa de microtitulao. A
peroxidase do rbano conjugada com o anticorpo monoclonal deixada reagir com o
neoantignio confinado s cavidades da placa. Aps adio de cromognio, a
quantificao conseguida por comparao das absorvncias resultantes, medidas a
450 nm, em comparao com uma referncia, e verificadas por dois controlos.

60

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ECO Number: ?????

4.

00:00 AM/PM

REAGENTES FORNECIDOS NO KIT

Tiras revestidas CAE
Amostra de diluente CAE
CAE HRP Conjugado
Cromognio
Tampo de lavagem (10x)
Soluo de paragem CAE
Tubos de Diluio e suporte
Tampa da placa
Calibrador do CAE
Controlo de CAE Nvel 1
Controlo de CAE Nvel 2
Quantidade de testes

12 x 8 cavidades
1 frasco, 60 mL
1 frasco, 20 mL
1 frasco, 22 mL
1 frasco, 100 mL
1 frasco, 20 mL
1 box, 96 frascos
1 tampa
3 frascos, liofilizado
3 frascos, liofilizado
3 frascos, liofilizado
96

ARMAZENAGEM: Logo que seja recebido, o Conjunto de Reagente dever ser

armazenado a uma temperatura entre os 2-8C. O Calibrador e o Conjunto de Controlo
devero ser armazenados a uma temperatura de 20C. Aps abertura, guarde todos
os reagentes a 2-8 at ao fim da data de validade indicada no rtulo, excepto no caso
do Calibrador e Controlos de utilizao nica que so eliminados e as tiras revestidas
que podem ser guardadas at 8 semanas.
Os reagentes no devem ser utilizados aps a data de validade.
4.1 Tiras Revestidas CAE: reagente pronto a utilizar
Deixe que as tiras e o suporte fiquem temperatura ambiente (20-25C) na bolsa de
alumnio de modo a proteger os reservatrios da condensao. Uma vez abertos,
feche-os de novo para garantir um fecho correcto num ambiente seco.
NOTA: Quando a bolsa que contm as tiras aberta pela primeira vez, o indicador
dissecador TEM de estar azul. Se no estiver azul, no utilize as tiras.
4.2 Diluente da Amostra CAE: reagente pronto a utilizar
Contm soluo tampo, corante verde e conservante. NOTA: No utilizar se o diluente
se apresentar turvo.
4.3 Conjugado de CAE HRP: reagente pronto a utilizar
Contm anticorpo monoclonal conjugado com peroxidase de rbano. NOTA: No utilizar
se o conjugado se apresentar turvo.
4.4 Cromognio: reagente pronto a utilizar
Substrato com soluo tampo e cromognio (3,3, 5,5 Tetrametilbenzidino [TMB]).
Proteger da luz. NOTA: No utilizar se houver precipitado azul.
4.5 Soluo Tampo de Lavagem (10X): soluo lquida
Contm soluo tampo de fosfato e Tween. A Sol. Tampo de Lavagem 1X estvel
quando armazenada a uma temperatura ambiente entre (20-25C) durante 2 meses.
NOTA: No utilizar se a soluo tampo se apresentar turva. Poder ocorrer alguma
cristalizao na Soluo Tampo de Lavagem 10X se armazenada sob refrigerao.
Antes de diluir, redissolva a uma temperatura ambiente entre (20-25C) .
4.6 Soluo de Paragem CAE : reagente pronto a utilizar
Contm 2N de cido Slfurico. Consulte a Seco de Avisos e Precaues.
4.7 Calibrador CAE: soro humano liofilizado
(Embalagem conforme Nmero de Catlogo 6300)
Consulte a Seco de Avisos e Precaues. O Calibrador reconstitudo estvel quando
colocado em gelo at quarto horas. Elimine aps utilizao. O Calibrador foi calibrado com
um mtodo CH50 estabelecido. Qualquer comparao com outros produtos ou
procedimentos dever ser efectuada com este mtodo. O Calibrador do kit apresenta
comutabilidade com amostras de paciente quando utilizado com reagentes e procedimento
de funcionamento deste teste de diagnstico in vitro, conforme recomendado.
O valor do Calibrador CAE est indicado no rtulo do frasco.
NOTA: No utilizar se o material liofilizado se apresentar hmido ou pegajoso.

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00:00 AM/PM

4.8 Soro de Controlo CAE (Nvel 1, Nvel 2): soro humano liofilizado
(Embalagem conforme Nmero de Catlogo 6300)
Consulte a Seco de Avisos e Precaues. Os Controlos reconstitudos so estveis
quando colocados sobre gelo at quatro horas. Elimine aps utilizao. A amplitude do
valor do Controlo CAE encontram-se nos rtulos do frasco.
NOTA: No utilizar se o material liofilizado se apresentar hmido ou pegajoso.

5.

AVISOS E PRECAUES

APENAS PARA UTILIZAO EM DIAGNSTICO IN VITRO .

REAGENTES QUE CONTM MATERIAL DE ORIGEM HUMANA

CUIDADO: Os Controlos e o Calibrador contm Soro humano. Tratar como
potencialmente infeccioso.
Cada unidade de dador de soro/plasma utilizada na preparao deste produto foi
testada por um mtodo aprovado por uma FDA (Food and Drug Administration) dos
E.U.A e dada como no-reactiva relativamente presena de HBsAg, anticorpos de
HCV e anticorpos de HIV 1/2. Embora estes mtodos sejam muito exactos, no
garantem que todas as unidades infectadas sejam detectadas. Este produto tambm
pode conter outro material de origem humana para os quais no existe um teste
aprovado. Devido ao facto de nenhum mtodo de teste conhecido poder oferecer totais
garantias de ausncia do vrus da hepatite B (HBV), hepatite C (HCV), Imunodeficincia
humana adquirida (HIV) ou outros agentes infecciosos, todos os produtos que
contenham material de origem humana devero ser manuseados de acordo com as
boas prticas laboratoriais, utilizando as precaues apropriadas conforme descrito nos
manuais dos Centros de Controlo de Doenas e Preveno dos E.U/Institutos Nacionais
de Sade , Biosegurana em Laboratrios microbiolgicos e Biomdicos, de 4 de Maio
de 1999 ou uma edio actual.

AVISOS ADICIONAIS
Soluo de Paragem (cido Slfurico 2N) Pode causar queimaduras graves em
contacto com a pele. No deixe estar em contacto com os olhos, pele ou roupa.
No ingerir ou inalar vapores. Em caso de contacto, lave com muita gua pelo menos
durante 15 minutos.
Frase de Risco e Substncias Perigosas da Comunidade Europeia (Directiva do
Conselho 1999/45 EC)
R34 Causa queimaduras.
S26 Em caso de contacto com os olhos, lave imediatamente com muita gua e
procure assistncia mdica.
S30 Nunca adicione gua a este produto.
S37/39 Calce luvas apropriadas e use proteco para os olhos e cara.
Cromognio: Este produto contm 3,3',5,5' de Tetrametilbenzidino (TMB) (0.05%) o
qual tem apresentado possveis efeitos mutagnicos em experincias laboratoriais.

6.

REQUISITOS DE ESPCIMENS

As amostras de sangue devero ser colhidas utilizando a tcnica de venipuno

assptica e soro obtido utilizando procedimentos de complemento normalizados.
Recomenda-se um mnimo de 5 mL de sangue total. Deixe o sangue coagular em tubos
de tampa vermelha, sem soro separador, durante 60-65 minutos a uma temperatura
ambiente entre (20-25C). Centrifugue as amostras de sangue num centrifugador
refrigerado e transfira o soro isento de clulas para um tubo limpo. O Soro tem de ser
manuseado correctamente para evitar a activao do complemento in vitro. O Soro
dever ser congelado a -70C ou menos, em tubos esterilizados e bem fechados para
uma armazenagem prolongada ou para transporte em gelo seco. As amostras no
devero ser congeladas e descongeladas mais de trs vezes. Os congeladores autodescongelantes no so recomendados uma vez que as amostras podem dissecar e/ou
poder ocorrer a degradao do complemento.

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ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

Os nveis elevados de hemoglobina (5 mg/dL), bilirubina (20 mg/dL), colesterol (10 mg/dL)
e triglicerdeos (4926 mg/dL) bloqueados numa reserva de baixo soro, no alteraram os
resultados de testes CAE. conhecida a fiabilidade dos resultados de plasma humano ou
espcimens contaminados, de partculas, ou inactivados por calor. O incorrecto
manuseamento das amostras pode ter como resultado resultados errneos.

7.

EQUIPAMENTOS E MATERIAIS NECESSRIOS, MAS NO FORNECIDOS

7.1
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
7.10
7.11

8.

Sistema de lavagem de placas, manual ou automtico.

Reservatrio tampo de 1000 mL .
Temporizador (60 minutos).
Toalhas de papel absorvente.
Reservatrios para reagentes (Cat. No. 4505).
Leitor de placas EIA com capacidade de leitura a 450 nm.
Incubadora, 37 2C.
Pipetas: (5-20 L, 20-1000 L) ou autodifusor.
Pipeta Multicanais (50-150 L).
Proveta de um litro.
gua desionizada.

IDENTIFICAO DA CAVIDADE
Cavidades virgens, controlos, calibrador, e amostras de pacientes podem ter de ser
posicionadas de modo diferente conforme exigido pelo fabricante do leitor de placas
EIA. Recomendamos a seguinte configurao de placa (consultar a FIGURA 1).
EM BRANCO: Passar em duplicado.
CALIBRADOR: Passar em quadruplicado.
CONTROLOS E AMOSTRAS DE PACIENTES: Passar em duplicado.

FIGURA 1: Configurao da Placa de Microtitulao

1

EM BRANCO

EM BRANCO

B
C
D
E
F
G
H

CAL.
CAL.
NVEL 2
NVEL 1
AMOSTRA 1
AMOSTRA 2
AMOSTRA 3

CAL.
CAL
NVEL 2
NVEL 1
AMOSTRA 1
AMOSTRA 2
AMOSTRA 3

9.

10

11

12

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
O
O
O
O
O
O

PREPARAO DO SORO E DO REAGENTE

9.1

9.2

9.3

Deixe as tiras de placa na bolsa, por abrir, a soluo tampo de lavagem,

o Conjugado de HRP, o Cromognio, e a soluo de Paragem estabilizarem
temperatura ambiente (20-25C).
As amostras de soro devero ser parcialmente descongeladas enquanto so
tratadas, colocando-as brevemente num banho de gua a 37 2C com uma
agitao ligeira. Coloque imediatamente num banho de gelo.
Antes de utilizar, coloque o Diluente da Amostra, a gua Ionizada,
os Controlos, o Calibrador, e as Amostras dos Pacientes descongeladas em
gelo.

63

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ECO Number: ?????

9.4

9.5

9.6

00:00 AM/PM

Preparao dos Controlos e do Calibrador.

a. Retire os frascos do gelo.
b. Cuidadosamente faa deslizar todo o material liofilizado para o fundo do
frasco e com cuidado retire o engaste e a rolha.
c. Imediatamente, adicione 0.1 mL de gua ionizada fria (2-8C)
directamente ao material liofilizado.
d. Coloque de novo a rolha firmemente.
e. Deixe o frasco no gelo durante 5 -10 minutos abanando ou girando
suavemente de vez em quando, at estar completamente dissolvido.
Os Controlos e o Calibrador reconstitudos podem ser
armazenados at 4 horas antes da utilizao se forem mantidos a
2-8C ou em gelo.
Para preparar uma Soluo Tampo de Lavagem, deite o contedo do frasco
de soluo Tampo de Lavagem 10X num recipiente de 1000 mL. Lave o
frasco com gua ionizada para remover o lquido residual e junte esta gua
ao recipiente. Adicione gua ionizada at obter um total de 1000 mL. Misture
at estar completamente dissolvido.
Separe o Suporte de Tubos de Diluio e encha parcialmente com gelo a
seco inferior e adicione gua para obter um banho de gelo. Reinsira o
porta tubos de diluio no suporte.

10. PROCEDIMENTO DO TESTE

10.1
10.2

10.3

10.4

10.5
10.6
10.7

Prepare o soro e os reagentes conforme descrito na seco anterior.

Retire a placa da bolsa de alumnio tendo o cuidado de no tocar na
superfcie ptica no fundo das cavidades. As tiras s devem ser utilizadas se
o dissecante includo na bolsa estiver azul assim que esta for aberta. Retire
a quantidade de tiras necessrias e rotule para evitar confuso. Volte a
colocar as tiras restantes na bolsa de alumnio, feche bem e coloque de novo
no frio para futura utilizao.
Diluio de Amostras de Soro Utilizando o Suporte de Tubos de Diluio,
dilua o Calibrador, cada Controlo, e soro do paciente 1:120 (5 L + 595 L)
com amostra de diluente. Agite rodando o material diludo em cada tubo trs
vezes e coloque de novo o tubo com a diluio no banho de gelo.
Adio de Amostra Pipetar 150 L de cada Calibrador diludo, Controlo, e
Soro do paciente em cavidades duplicadas utilizando uma pipeta
multicanais. Para a cavidade de ensaio em branco, pipetar 150 L do
diluente de amostra nas cavidades duplicadas e depois trate como
cavidades de amostra.
Complemente a Activao Tape e incube a placa sem perturbar a 37 2C
durante 60 minutos.
Elimine o soro das cavidades, decantando ou aspirando com um dispositivo
de vcuo.
Lave Completamente Encha todas as cavidades com soluo de Tampo de
lavagem 1X (300 L ou superior por cavidade). Deixe impregnar durante
30 segundos. Esvazie sacudindo para o recipiente de eliminao ou aspire.
Repita mais duas vezes num total de trs lavagens. Os sistemas de lavagem
automatizados utilizados para lavar tiras devero ser ajustados de modo a
permitir um ciclo de impregnao de 30-segundos entre as etapas.
NOTA: Podem ocorrer resultados errneos se as cavidades no forem
completamente cheias durante o ciclo de lavagem. O lquido residual dever
ser retirado segurando a placa com presso suficiente para manter as tiras
na estrutura e bater com a placa vrias vezes enquanto est ao contrrio
sobre uma toalha de papel ou outra superfcie absorvente.

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ECO Number: ?????

10.8
10.9
10.10
10.11
10.12
10.13

10.14

00:00 AM/PM

Adio de Conjugado HRP Pipetar 150 L de Conjugado de HRP em cada

cavidade utilizando uma pipeta multicanais.
Ligao do Conjugado de HRP Tape e incube a placa sem perturbar a
37 2C durante 30 minutos.
Eliminar o Lavado conjugado das cavidades e lave as placas conforme
descrito na etapa 7.
Adio de Cromognio Adicione 150 L de Cromognio a cada cavidade
utilizando uma pipeta multicanais.
Desenvolvimento da Cor Tape e incube a placa sem perturbar temperatura
ambiente de (20-25C) durante 30 minutos. NO LAVE A PLACA!
Parar o Desenvolvimento da Cor Para parar a reaco no fim da incubao
do Cromognio, pipetar 100 L de Soluo de Paragem (2N cido Slfurico)
em todas as cavidades com os mesmos intervalos regulares e pela mesma
ordem em que o Cromognio preparado foi adicionado. Cuidadosamente
bata com a placa para dispersar a soluo de Paragem. A cor mudar de
azul para amarelo.
Leia a placa a 450 nm num Leitor de Placa EIA Leia e registe os resultados a
450 nm dentro de 30 minutos.

11. COMENTRIOS AO PROCEDIMENTO

11.1

A utilizao previdente de dispositivos de pipetagem cuidadosamente

calibrados e de leitores de placa, destacar significativamente a exactido e
reprodutibilidade do kit de teste CAE.
11.2 Os tempos de incubao ou temperaturas que no sejam as estipuladas
neste suplemento podem afectar os resultados.
11.3 Utilize todos os componentes nas respectivas temperaturas recomendadas.
11.4 Bolhas de ar nas cavidades de teste reduzem a eficcia de ligao.
11.5 Toque com as extremidades das pipetas na parte lateral da cavidade antes
de a retirar.
11.6 Procedimentos de lavagem que no sejam os indicados neste suplemento
podem afectar negativamente os resultados.
11.7 Utilize a tcnica assptica para evitar a contaminao de reagentes que
podem causar resultados errneos. Guarde a Soluo de Lavagem Tampo
1X num recipiente limpo para evitar contaminao.
11.8 Recomendamos a utilizao de vidros ou recipientes plsticos de utilizao
nica. Os vidros reutilizveis devem ser lavados a fundo e passados por
gua ionizada para no reterem vestgios de detergentes. No reutilize as
cavidades.
11.9 No permita que as cavidades sequem uma vez o procedimento iniciado.
Evite exposio a luz forte durante a execuo do teste.
11.10 No troque entre si os reagentes dos kits com reagentes de outros
fornecedores. Os reagentes destes testes esto optimizados para detectar o
complemento total de acordo com as especificaes. A diluio ou
adulterao ter como resultado perda de sensibilidade. A contaminao
cruzada de reagentes e amostras de pacientes ou utilizao de reagentes
que no sejam os fornecidos neste kit pode produzir resultados errneos.
11.11 No garantimos que estes reagentes no tm contaminao microbiana.

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00:00 AM/PM

12. CONTROLO DE QUALIDADE

12.1
12.2
12.3
12.4
12.5
12.6

O Calibrador e os Controlos devem correr com cada teste.

As cavidades virgens devem ter uma capacidade de absoro inferior a 0.15
na leitura a 450 nm.
O Controlo de Nvel 1 deve ter uma absoro mdia (ABS) inferior do
Calibrador.
O Controlo de Nvel 2 deve ter uma absoro mdia (ABS) superior do
Calibrador.
Os valores de Controlo devem encontrar-se dentro da respectiva amplitude
da unidade de CAE rotulada.
O teste vlido se TODOS os critrios anteriores forem cumpridos.

13. CLCULO DOS RESULTADOS

Os resultados so expressos em relao ao Calibrador como unidades CAE. Determine
os resultados utilizando a formula que se segue.
Unidades CAE
Sricas de Referncia

Amostra Md. (ABS) Med. em branco mdia (ABS)

Referncia Md. (ABS) Med. em branco mdia (ABS) =

Unidades CAE
de amostra

Os resultados dos pacientes so referidos como CAE baixos ou normais/altos com base
no limite estabelecido utilizando uma populao de referncia apropriada.
Interpretao dos Resultados
Com base em estudos de amplitude normal, a DiaSorin estabeleceu um limite de
60 unidades CAE para definir uma actividade de complemento baixa. Amostras de
pacientes com resultados acima de 60 unidades CAE so referidas como normais/altas
para CAE. Cada laboratrio deveria estabelecer o seu prprio limite para determinar
valores CAE baixos.

14. LIMITAES DO PROCEDIMENTO

14.1
14.2

Absores superiores a 3.0 esto acima dos limites referveis do teste e

devero ser referidos assim.
Os resultados dos testes CAE interiores e exteriores no constituem
diagnstico. Os resultados de teste devem ser interpretados em conjunto
com testes de outros laboratrios, assim como a apresentao clnica do
paciente.

15. VALORES ESPERADOS

Normais
O teste CAE foi efectuado pela DiaSorin utilizando amostras de soro obtidas em
indivduos aparentemente saudveis. Todas as amostras deram resultados acima do
limite estabelecido e seriam classificados como normais/altos.
TABELA 1: ESTUDO REPRESENTATIVO DE AMPLITUDE NORMAL
Mdio
Desvio Padro
Amp.
n
(Unid. CAE)
(Unid. CAE)
(Unid. CAE)
102
104
20.4
63-145

66

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00:00 AM/PM

16. DADOS DE DESEMPENHO

16.1 EXACTIDO
A exactido do Kit CAE da DiaSorin foi avaliado utilizando princpios modificados do
Comit Nacional para Directivas de Padronizao Laboratorial Clnica Avaliao de
Desempenho de Exactido de Dispositivos de Qumica Clnica: (EP5-T2).
Foram testadas sete amostras em duplicado ao longo de um perodo de 10 dias em
3 locais. Cavidades duplicadas foram preparadas a partir de uma nica diluio de cada
amostra. As amostras so reservas preparadas a partir de soro humano, escolhido para
distribuir a variedade de activao de complemento de nveis baixos a altos. Todos os
dados foram reservados para anlise. Os valores extremos forem definidos como
observaes cujos valores CAE normalizados eram superiores a desvios normais de
2.6 a partir de zero.
Os valores extremos foram eliminados e os restantes dados foram sujeitos a uma
anlise de Variao (ANOVA) para obter estimativas em srie, entre dia, entre local e
exactido total .
Os resultados finais so apresentados na Tabela 2 que se segue. Os valores so
baseados em unidades CAE conforme definido na Seco de Clculo dos Resultados.
TABELA 2: Exactido CAE
(Valores em Unidades CAE)
Em srie
Desvio
Padro

Entre os dias

Entre locais

AMOSTRA

Mdia

%C.V.

60

10.7

2.131

19.9

1.865

17.5

1.111

10.4

3.042

28.5

58

12.0

1.210

10.1

1.422

11.9

1.327

11.1

2.291

19.1

60

25.3

3.032

12.0

2.354

9.3

1.728

6.8

4.209

16.7

58

83.4

5.685

6.8

9.088

10.9

0.000

0.0

10.720

12.9

60

134.2

5.916

4.4

11.832

8.8

10.158

7.6

16.679

12.4

60

146.6

6.308

4.3

9.158

6.2

10.879

7.4

15.557

10.6

59

147.7

5.170

3.5

4.829

3.3

11.229

7.6

13.272

9.0

%C.V.

Desvio
Padro

Total
Desvio
Padro

%C.V.

Desvio
Padro

%C.V.

16.2 Pureza: a pureza do teste foi verificada pela comparao do mtodo

(comparao com o mtodo CH50).
Exactido
O teste CAE foi comparado tanto com um teste CH50 comercialmente disponvel assim
como com o processo Kent Fife CH50 utilizado por um Laboratrio de Imunologia de
Referncia, estabelecido. Os resultados do teste foram classificados quer como baixos
ou normais/altos utilizando os valores de limite estabelecidos para cada mtodo.

67

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ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

Utilizando o mtodo CH50 como referncia (ou mtodo verdadeiro), a sensibilidade

relativa, especificidade relativa, e concordncia geral foram calculadas da seguinte
maneira:
Quant. de mt. baixos (baixo em ambos os testes )
Quant. de mt. baixos+ Quant. de amostras
normal/altas de CAE

Sensibilidade Relativa=

Sensibilidade Relativa =

Quant. de verdadeiros normais/altos

(normais/altos em ambos os testes)
(Quant. de verdadeiros normais/altos + Quant. de amostras
de CAE baixas)

Concordncia geral =

(Quant. de mt. baixos + Quant. de amostras

verdadeiras normal/alta )
Quant. total de amostras testadas

TABELA 3: KENT FIFE CH50 VS. CAE

CAE
Kent Fife
CH50

Baixo

Normal/Alto

Baixo

48

Total
50

Sensibilidade relativa

96%

Normal/Alto

71

73

Especificidade relativa

97%

Total

50

73

123

Concordncia geral

97%

FIGURA 3: KENT FIFE CH50 VS. CAE

250

Normal / Alto

Unidades CAE

200

150

100

Baixo

50

0
0

50

100

150

200

250

Unidades CH50

68

300

350

400

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ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

TABELA 4: CH50 COMERCIAL VS. CAE

CH50
comercial

Baixo

CAE
Normal/Alto

Total

Baixo

20

22

Normal/Alto

57

57

Total

20

59

79

Sensibilidade
relativa
Especificidade
relativa
Concordncia
geral

FIGURA 4: CH50 COMERCIAL VS. CAE

300
Normal / Alto

Unidades CAE

250

200

150

100

50
Baixo
0
0

50

100

150

200

250

Unidades CH50 Comerciais

69

300

350

400

91%
100%
97%

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ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

RESOLUO DE PROBLEMAS
Problema
O controlo dos valores CAE fora
do intervalo de variao.

Causas Possveis
1. Temperatura incorrecta,
temporizao ou
pipetagem; reagentes no
misturados.
2. Contaminao cruzada dos
controlos.
3. Diluio incorrecta.
4. Percurso ptico sujo.

5. Comp. de onda do filtro incorrecto.

6. Diluio demasiada ou insuficiente
dos calibradores.
Todos os testes negativos.

1. Um ou mais reagentes no foram

adicionados ou foram adicionados
na sequncia errada.
2. Actividade conjugada perdida.

3. Diluio imprpria do tampo de

lavagem.
4. Placa revestida inactiva.

Todos os teste positivos.

1. Sol. de cromognio contaminada.

2. Tampes e reagentes
contaminados.
3. Sol. tampo de lavagem (1X)
contaminada

Fraca exactido (Duplicar

leituras de superior a
absorvncia superior a 20% da
media.)

4. Diluio do soro imprpria.

1. A Vel.Const da descarga do
pipetador 5% ou amostras no
adicionadas devagar.
2. Soro ou reagentes mal misturados;
reagentes a temperatura incorrecta
antes da adio.
3. Adio de reagente demasiado
longa; inconsistncia entre
intervalos, bolhas de ar.
4. Correntes de ar na placa durante
as incubaes.
5. Percurso ptico sujo.

6. Instrumento no equilibrado antes

de efectuar as leituras.

70

Soluo
1. Verificar exactido da
temperatura.Verificar exactido do
tempo. Ver Exactido deficiente (em
baixo) No. 2 - 4. Repetir teste.
2. Fazer pipetagem cuidadosamente.
3. Repetir teste.
4. Verificar existncia de humidade ou
sujidade. Limpar o fundo e ler de novo
se tiver usado sol. de lavagem.
5. Mudar filtro para 450 5 nm.
6. Verificar de novo o processo. Rediluir o
calibrador, controlos e amostras. Repetir
teste.
1. Verificar de novo o processo. Verificar
solues no utilizadas. Repetir teste.
2. Retirar uma peq. Quant. de cromognio
para um tubo de ensaio (aprox. 0.1 mL)
e pipetar o conjugado (5-10 L)
directamente para o cromognio. A
soluo dever ficar rapidamente azul.
3. Rediluir tampo de lavagem. Repetir
teste.
4. Verificar cor do dissecante. Verificar
humidade visvel em cavidades no
utilizadas. Repetir o teste com controlos
apenas na actividade. Verificar
actividade do conjugado como no No. 2
anterior.
1. Verificar absorvncia da sol. de
cromognio no utilizada.
2. Verificar turvao de todas as solues.
3. Verificar fornecimento de gua ionizada
utilizada para diluir a sol tampo.
Dever ter uma resistividade superior a
5 megaohms.
4. Rediluir amostras. Repetir teste.
1. Verificar calibrao do pipetador. Use
tcnica reproduzvel.

2. Misturar suavemente mas totalmente

todos os reagentes e nivelar
temperatura adequada.
3. Desenvolver tcnica consistente e
uniforme e evite salpicar ou utilizao de
dispositivo de multipipetagem ou
autodistribuidor para reduzir o tempo.
4. Cobrir a placa ou coloc-la numa
cmara.
5. Limpar fundo da placa com papel macio.
Verificar alimentador de luz do
instrumento e detector de sujidade.
6. Verificar manual do instrumento quanto
ao processo de aquecimento.

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ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

7. Lavagem inconsistente; bolhas de

ar retidas; lquido deixado nas
cavidades no fim do ciclo de
lavagem.

8. Pipetagem incorrecta.

7. Utilizar apenas dispositivos de lavagem

aceitveis. Aumentar o tempo nos
dispositivos de lavagem automtica ou
aumentar o nmero de ciclos de
lavagem. Verificar que todas as
cavidades esto cheias e
uniformemente aspiradas. Eliminar
lquido acima do nvel do reagente na
cavidade.
8. Evitar bolhas de ar nas extremidades da
pipeta. Certifique-se que as
extremidades esto bem fixas.

CONSULTE A LTIMA PGINA SOBRE REFERNCIAS

Distribudo no Brasil por:

DiaSorin Ltda - CNPJ 01.896.764/0001-70 Av.
Ermano Marchetti, 1435 B - Lapa
So Paulo SP S.A.C 0800 7716216
e-mail: [email protected]
Genese Produtos Farmacuticos e Diagnsticos LTDA-CNPJ: 68.384.155/0001.02
Rua Diogo Vaz, 291 Cambuci So Paulo-SP.
Tel.: (11) 3341-6987; FAX: (11) 3207-2246
E-mail: [email protected]

71

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ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

COMPLEMENT ACTIVATION EIA (CAE)-KIT

1.

BRUKSOMRDE

Dette produktet er beregnet p bruk til IN VITRIO-DIAGNOSTIKK. CEA-kitet inneholder

anvisninger og materiale for den kvalitative bestemmelsen av total klassisk
komplementaktivitet i humant serum ved hjelp av enzymimmunoanalyse (EIA).

2.

SAMMENDRAG OG FORKLARING

Den funksjonelle evalueringen av den klassiske komplementbanen utfres vanligvis

sammen med vurderingen av komponenter i membranattakkomplekset (MAC) ved hjelp
av CH50-analysen, som i rtier har vrt standardmetoden for den funksjonelle
komplementaktiviteten. CH50 mler komplementaktiviteten som kreves for oppn
50 % hemolyse i rde blodlegemer fra sau under standardiserte forhold. Hemolyse
mles kolorimetrisk ved bestemme mengden hemoglobin som avgis fra de rde
blodlegemene. CH50-analysen har vrt et viktig verkty for evalueringen av den
klassiske komplementbanen og komponentene i membranattakkomplekset. Testen er
imidlertid veldig tidkrevende og har flere reagenser som det er vanskelig
standardisere. I tillegg kan cellene fra sau variere sterkt med hensyn til deres
hemolytiske respons til komplement1-3.
Complement Activation EIA (CAE) kombinerer prinsipper for den hemolytiske analysen
for komplementaktivering med bruken av merkede antistoffer spesielt for neoantigen
som produseres som en flge av komplementaktivering. Mengden produsert neoantigen
er proporsjonal med den funksjonelle aktiviteten av C1q til og med C9.
In vitro aktivering av komplementsekvensen frer til konsumpsjon av
komplementkomponenter, som igjen kan fre til en reduksjon av konsentrasjonen deres.
Bestemmelsen av komplementproteiner eller komplementaktivitet brukes derfor til
indikere om komplementsystemet har blitt aktivert av en immunologisk og/eller patogen
mekanisme. Bde funksjonelle og immunkjemiske komplementmlinger brukes til
evaluere pasienter nr det foreligger mistanke om en komplementaktiverende sykdom
eller en mulig nedarvet mangel. Nivet komplementaktivitet, som evalueres ved hjelp av
funksjonelle analyser som for eksempel CAE og CH50, tar i betraktning syntese- og
nedbrytningshastigheten og bruken av komponenter, og mler integriteten til den
klassiske banen i motsetning til immunkjemiske metoder som mer spesifikt mler
konsentrasjonen av ulike komplementkomponenter1-3.
Nr
det
pvises
reduserte
niver
av
komplementkomponenter
eller
komplementfunksjon, vil klinikerne vurdere en pgende immunologisk prosess som
frer til bruk av komponentene og senkning av komplementniver. Forhyede
1-3
komplementniver er vanligvis en ikke-spesifikk indikasjon p en akutt faserespons .

3.

ANALYSEPRINSIPPER

Complement Activation EIA (CAE) testkit er en ny metode for mling av total klassisk
komplementaktivitet. Denne metoden benytter et enzymkonjugert monoklonalt antistoff
som er spesifikt for neoantigen for terminale komplementproteiner. Mikrotiterbrnner er
belagt med komplementaktivator tilsatt en enkel fortynning av pasient- eller
kontrollserum. Den fullstendige klassiske komplementbanen er aktivert og kaskaden av
C1q til og med C9 dannes i brnnen til mikrotiterplaten. Monoklonalt antistoff konjugert
med perioksidase fra pepperrot fr reagere med det resulterende neoantigenet som er
bundet til platebrnnene. Etter tilsetning av kromogen, oppns kvantifisering ved hjelp
av sammenligne de resulterende absorbansene, mlt ved 450 nm, med en referanse,
og bekrefte ved hjelp av to kontroller.

72

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ECO Number: ?????

5.

00:00 AM/PM

REAGENSER SOM FLGER MED KITET

CAE-belagte strimler
CAE-prvefortynningsmiddel
CAE HRP-konjugat
Kromogen
Vaskebuffer (10x)
CAE-stopplsning
Fortynningsrr og -stativ
Platedeksel
CAE-kalibrator
CAE-kontrollniv 1
CAE-kontrollniv 2
Antall tester

12 x 8 brnner
1 flaske, 60 mL
1 flaske, 20 mL
1 flaske, 22 mL
1 flaske, 100 mL
1 flaske, 20 mL
1 boks, 96 flasker
1 deksel
3 flasker, lyofilisert
3 flasker, lyofilisert
3 flasker, lyofilisert
96

OPPBEVARING: Ved mottak, skal reagenssettet oppbevares ved 2-8C. Kalibrator- og

kontrollsettet skal oppbevares ved 20C. Etter pning, skal alle reagenser oppbevares
ved 2-8C til utlpsdatoen som str p etiketten, med unntak av kalibratorer og
kontroller til engangsbruk, som avhendes, og de belagte strimlene, som kan oppbevares
i 8 uker.
Reagenser m ikke brukes etter at de er gtt ut p dato.
4.1 CAE-belagte strimler: ferdig reagens
La strimlene og holderen n en likevektig romtemperatur (20-25C) i folieposen for
beskytte brnner fra kondensering. Etter pning, gjenforsegler du posen for sikre et
godt lukket og trt milj.
MERK: Frste gang posen som inneholder strimlene pnes, M trrhetsindikatoren
vre bl. Hvis indikatoren ikke er bl, m ikke strimlene brukes.
4.2 CAE-prvefortynningsmiddel: ferdig reagens
Inneholder buffer, grnn farge og konserveringsmiddel. MERK: M ikke brukes hvis
fortynningsmidlet er turbid.
4.3 CAE HRP-konjugat: ferdig reagens
Inneholder monoklonalt antistoff konjugert med peroksidase fra pepperrot. MERK: M
ikke brukes hvis konjugatet er turbid.
4.4 Kromogen; ferdig reagens
Bufret substrat og kromogen (3,3, 5,5 tetrametylbenzidin [TMB]). M beskyttes mot lys.
MERK: M ikke brukes hvis bltt bunnfall er tilstede.
4.5 Vaskebuffer (10x): vskelsning
Inneholder fosfatbuffer og Tween. 1x vaskebufferen er stabil nr den oppbevares ved
romtemperatur (20-25C) i 2 mneder. MERK: M ikke brukes hvis bufferen er turbid.
En viss krystallisering kan forekomme i 10x vaskebufferen nr den oppbevares nedkjlt.
M gjenopplses ved romtemperatur (20-25C) fr fortynning.
4.6 CAE-stopplsning: ferdig reagens
Inneholder 2N svovelsyre. Se avsnittet Advarsler og forholdsregler
4.7 CAE-kalibrator: lyofilisert humant serum
(Pakke som katalognummer 6300)
Se avsnittet Advarsler og forholdsregler. Den rekonstituerte kalibratoren er stabil nr den
legges p is i opptil fire timer. M avhendes etter bruk. Kalibratoren har blitt kalibrert mot
en etablert CH50-metode. Alle sammenligninger med andre produkter eller prosedyrer
skal utfres med denne metoden. Kit-kalibratoren utviser kommutabilitet med
pasientprver nr den brukes med reagensene og operasjonsprosedyren som er
anbefalt for denne in vitro-diagnostikktesten.
Kalibratorens CEA-verdi str p flaskeetiketten.
MERK: M ikke brukes hvis det lyofiliserte materialet er fuktig eller klebrig.

73

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

4.8 CAE-kontrollsera (niv 1, niv 2): lyofilisert humant serum

(Pakke som katalognummer 6300)
Se avsnittet Advarsler og forholdsregler De rekonstituerte kontrollene er stabile nr de
legges p is i opptil fire timer. M avhendes etter bruk. Kontrollens CEA-verdiomrde
str p flaskeetikettene.
MERK: M ikke brukes hvis det lyofiliserte materialet er fuktig eller klebrig.

5.

ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER

KUN FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK.

Reagenser som inneholder humant kildemateriale

FORSIKTIG: Kontroller og kalibrator som inneholder humant serum. M behandles
som potensielt infektist.
Hver serum/plasma-donorenhet som brukes ved preparering av dette produktet har blitt
testet av en metode godkjent av amerikanske FDA og pvist ikke-reaktiv for
tilstedevrelsen av HBsAg, antistoff mot HCV og antistoff mot HIV 1/2. Selv om disse
metodene er svrt nyaktige, garanterer de ikke at alle infiserte enheter vil detekteres.
Dette produktet kan ogs inneholde annet humant kildemateriale som det ikke foreligger
godkjente tester for. Siden ingen kjent testmetode kan tilby fullstendig forsikring om at
hepatitt B-virus (HBV), hepatitt C-virus (HCV), Humant immunsviktvirus (HIV) eller andre
smittestoffer er fravrende, m alle produkter som inneholder humant kildemateriale
hndteres i overensstemmelse med god laboratoriepraksis ved hjelp av egnede
forholdsregler som beskrives i hndboken fra amerikanske Centers for Disease Control
and Prevention/National Institutes of Health, "Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories," 4. utg., mai 1999 eller nvrende utgave.
YTTERLIGERE ADVARSLER
Stopplsning (2N svovelsyre) Kan forrsake alvorlige brannskader ved kontakt med
huden. M ikke komme i kontakt med yne, hud eller klr. Damper m ikke svelges
eller innndes. Ved kontakt, m du skylle med rikelige mengder vann i minst
15 minutter.
EU-risikosetninger for farlige stoffer (rdsdirektiv 1999/45 EC)
R34 Forrsaker brannskader.
S26 Ved kontakt med ynene, m du umiddelbart skylle med rikelig med vann og
oppske legehjelp.
S30 Tilsett aldri vann i produktet.
S37/39 Bruk egnede hansker og ye-/ansiktsvern.
Kromogen; Dette produktet inneholder 3,3, 5,5 tetrametylbenzidin (TMB) ( 0,05 %)
som har vist mulige mutagene effekter i laboratorieeksperimenter.f

6.

PRVEKRAV

Blodprver skal tas ved hjelp av aseptisk venepunksjonmetode og serum ved hjelp av
standard komplementprosedyrer. Et minimum av 5 mL helblod anbefales. La blodet levre
seg i rr med rd hette, uten serumseparator, i 60-65 minutter ved romtemperatur
(20-25C). Sentrifuger blodprver i en nedkjlt sentrifuge og overfr cellefritt serum til et
rent rr. Sera m hndteres riktig for forhindre in vitro komplementaktivering. Sera
skal fryses ned ved -70C eller kaldere i tett forseglede sterile rr for forlenget oppbevaring
eller transport p trris. Prver m ikke fryses ned og tines opp igjen mer enn tre ganger.
Selvavrimende frysere anbefales ikke siden en prve kan trke ut og/eller nedbrytning av
komplementet kan forekomme.
Forhyede niver hemoglobin (5 mg/dL), bilirubin (20 mg/dL), kolesterol (10 mg/dL) og
triglyserider (4926 mg/dL) tilsatt en ansamling med lave serumverdier har vist seg ikke
pvirke CAE-testresultater. Pliteligheten til resultater fra human plasma eller
forurensede, partikulre eller varmeinaktiverte prver kjennes ikke. Gal hndtering av
prver kan gi feilaktige resultater.

74

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

7.

UTSTYR OG MATERIALE SOM KREVES, MEN IKKE FLGER MED

7.1
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
7.10
7.11

8.

00:00 AM/PM

Platevaskingssystem, manuelt eller automatisk

1000 mL bufferlager.
Tidtaker (omrde p 60 minutter).
Absorberende papirservietter.
Reagenslagre (Kat.nr. 4505).
EIA-plateleser som kan lese ved 450 nm.
Inkubator, 37 2C.
Pipetter: (5-20 L, 20-1000 L) eller automatisk fortynner.
Flerkanals pipette (50-150 L).
n liters gradert sylinder.
Renset vann

BRNNIDENTIFIKASJON
Arbeidsstykker, kontroller, kalibrator og pasientprver kan mtte posisjoneres forskjellig
etter hva som kreves av tilvirkeren av EIA-plateleseren. Flgende platekonfigurasjon
anbefales (se FIGUR 1).
ARBEIDSSTYKKE: Kjr dobbelt.
KALIBRATOR: Kjr firedobbelt.
KONTROLLER- OG PASIENTPRVER: Kjr fordoblet.

FIGUR 1: Konfigurasjon av mikrotiterplate

1
ARB.STK.
KAL.
KAL.
NIV 2
NIV 1
PRVE 1
PRVE 2
PRVE 3

A
B
C
D
E
F
G
H

9.

2
ARB.STK.
KAL.
KAL.
NIV 2
NIV 1
PRVE 1
PRVE 2
PRVE 3

10

11

12

O
O
O
O
O
O
O
O

O
O
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O
O
O
O
O

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O
O
O
O
O

SERUM- OG REAGENSPREPARERING
9.1
9.2
9.3
9.4

La upnede poser med platestrimler, vaskebuffer, HRP-konjugat, kromogen og

stopplsning n likevekt ved romtemperatur (20-25C).
Serumprver skal tines delvis under oppsyn ved legges i et vannbad p
37 2C og blandes forsiktig. Legg umiddelbart i et isbad.
Legg prvefortynning, renset vann, kontroller, kalibrator og opptinte
pasientprver p is fr bruk.
Preparering av kontroller og kalibrator.
a. Ta flaskene ut av isen.
b. Tapp forsiktig alt lyofilisert materiale til bunnen av flasken og fjern
krympeforseglingen og korken forsiktig.
c. Tilsett umiddelbart 0,1 mL kaldt (2-8C) renset vann rett fra det
lyofiliserte materialet.
d. Sett korken godt p igjen.
e. La flasken st p is i 5-10 minutter mens du iblant rister eller vender den
til innholdet er fullstendig opplst.
De rekonstituerte kontrollene og kalibratoren kan oppbevares
opptil 4 timer fr bruk nr de oppbevares ved 2-8C eller p is.

75

Printed For Final Review: MM/DD/YY

ECO Number: ?????

9.5

9.6

00:00 AM/PM

Hvis du vil preparere 1 x vaskebuffer, heller du innholdet av den 10 x

vaskebufferen i en 1000 mL beholder. Skyll flasken med renset vann for
fjerne restvske og tilsett skyllevsken i beholderen. Tilsett renset vann til
det totale volumet p 1000 mL er ndd. Bland til innholdet er fullstendig
opplst.
Separer stativet for fortynningsrr, fyll bunndelen med is og tilsett vann for
danne et isbad. Sett fortynningsrrholderen tilbake i stativet.

10. ANALYSEPROSEDYRE
10.1
10.2

10.3

10.4

10.5
10.6
10.7

10.8
10.9
10.10
10.11
10.12
10.13

10.14

Preparer sera og reagenser i henhold til anvisningene i det forrige avsnittet.

Fjern platen fra folieposen og srg for ikke berre den optiske overflaten p
bunnen av brnnene. Strimler skal kun brukes hvis trkemidlet i posen er
bltt nr den frst pnes. Fjern det aktuelle antallet strimler som skal brukes
og merk for unng forvirring. Legg de gjenvrende strimlene tilbake i
folieposen, forsegle den og kjl den ned igjen for fremtidig bruk.
Fortynning av serumprver. Ved hjelp av stativet for fortynningsrr, fortynn
kalibrator, hver kontroll og pasientserum 1:120 (5 L + 595 L) med kald
prvefortynning. Vend det fortynnede materialet i hvert rr tre ganger og sett
fortynningsrret tilbake i isbadet.
Prvetilsetning. Pipetter 150 L av hvert fortynnede kalibrator-, kontroll- og
pasientsera i dupliserte brnner ved hjelp av en flerkanals pipette. For
arbeidsstykket. Pipetter 150 L av prvefortynningen inn i duplikate brnner
og behandle deretter som prvebrnner.
Komplementaktivering. Dekk til og inkuber platen uforstyrret ved 37 2C i
60 minutter.
Forkast sera fra brnnene ved dekantere eller aspirere med en
sugeinnretning.
Vasking. Fyll alle brnner fullstendig med 1x vaskebuffer (300 L eller mer
per brnn). Bltlegg i 30 sekunder. Tm ved riste inn i en avfallscontainer
eller aspirer. Gjenta to ganger til for totalt tre vasker. Automatiske
vaskesystemer som brukes til rengjring av strimler m justeres for tillate
en 30-sekunders syklus mellom trinnene.
MERK: Feilaktige resultater kan oppst hvis brnner ikke er helt fylt opp
under vaskesyklusen. Restvske m fjernes ved holde platen med nok
trykk til holde strimlene i rammen og sl platen gjentatte ganger mens den
er opp ned p en papirserviett eller annen absorberende overflate.
HRP-konjugattilsetning. Pipetter 150 L HRP-konjugat inn i hver brnn ved
hjelp av en flerkanals pipette.
Binding av HRP-konjugat. Dekk til og inkuber platen uforstyrret ved 37 2C i
30 minutter.
Vasking. Tm ut konjugat fra brnnene og vask platen i henhold til
anvisningene i trinn 7.
Kromogentilsetning. Tilsett 150 L kromogen til hver brnn ved hjelp av en
flerkanals pipette.
Fargeutvikling. Dekk til og inkuber platen uforstyrret ved romtemperatur
(20-25C) i 30 minutter. VASK IKKE PLATEN!
Stans fargeutvikling. For stanse reaksjonen p slutten av
kromogeninkubasjonen, pipetterer du 100 L stoppvske (2N svovelsyre)
inn i alle brnnene ved samme regelmessige intervaller og i samme
rekkeflge som det preparerte kromogenet ble tilsatt. Tapp platen forsiktig for
spre stoppvsken. Fargen vil endres fra bl til gul.
Les platen ved 450 nm p en EIA-plateleser. Les og registrer resultatene ved
450 nm i lpet av 30 minutter.

76

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ECO Number: ?????

00:00 AM/PM

11. PROSEDYREKOMMENTARER
11.1

Forsiktig bruk av riktig kalibrerte pipetteringsredskaper og platelesere vil

sterkt forbedre nyaktigheten og reproduserbarheten til CEA-testkitet.
11.2 Inkubasjonstider eller temperaturer andre enn de som oppgis i dette
vedlegget kan pvirke resultatene.
11.3 Bruk alle komponentene ved deres anbefalte temperaturer.
11.4 Luftbobler i analysebrnner reduserer bindingseffektiviteten.
11.5 Berr pipettetuppene p siden av brnnen fr de tas ut.
11.6 Vaskeprosedyrer andre enn de som er oppgitt i dette vedlegget kan ha en
negativ effekt p resultatene.
11.7 Bruk aseptisk teknikk for unng kontaminering av reagenser som kan gi
feilaktige resultater. Oppbevar 1x vaskebuffer i en ren beholder for unng
forurensing.
11.8 Sterile eller engangsglass eller -plastartikler anbefales. Gjenbrukbare
glassartikler m vaskes grundig og skylles fritt for alle vaskemidler med
renset vann. Gjenbruk ikke brnner.
11.9 Ikke la brnner trke s snart prosedyren har startet. Unng eksponering for
sterkt lys mens analysen pgr.
11.10 Bytt ikke ut kitets reagenser med reagenser fra andre leverandrer.
Reagensene i disse testene er optimert for detektere komplement i henhold
til spesifikasjoner. Fortynning eller manipulering vil fre til tap av sensitivitet.
Krysskontaminering av reagenser og pasientprver eller bruk av andre
reagenser enn de som flger med dette kitet kan fre til feilaktige resultater.
11.11 Det foreligger ingen garanti om at disse reagensene ikke inneholder
mikrobiell kontaminering.

12. KVALITETSKONTROLL
12.1
12.2
12.3
12.4
12.5
12.6

Kalibrator og kontroller m brukes med hver testkjring.

Arbeidsstykket m ha en absorbans p mindre enn 0,15 nr det leses ved
450 nm.
Niv 1-kontrollen m ha en gjennomsnittlig absorbans (ABS) som er lavere
enn den for kalibratoren.
Niv 2-kontrollen m ha en gjennomsnittlig absorbans (ABS) som er hyere
enn den for kalibratoren.
Kontrollverdier m falle innenfor deres merkede CAE-enhetsomrder.
Testen er gyldig hvis ALLE kriteriene overfor er oppfylt.

13. BEREGNING AV RESULTATER

Resultater uttrykkes i forhold til kalibratoren som CAE-enheter. Bestem resultatene ved
hjelp av formelen nedenfor.
CAE - enheter i
Referanseserum

Gj.sn. prve (ABS) Gj.sn. arb.stykke (ABS)

X
= CAE-enheter fra prven
Gj.sn referanse (ABS) gj.sn. arbeidsstykke (ABS)

Pasientresultater rapporteres som lav eller normal/hy CAE basert p den etablerte cutoff-verdien ved hjelp av en egnet referansepopulasjon.
Tolkning av resultater
Basert p studier av normale omrder, har DiaSorin etablert en cut-off-verdi p 60 CAEenheter for definere lav komplementaktivitet. Pasientprver som leser over 60 CAEenheter rapporteres som normal/hy for CAE. Hvert laboratorium br etablere sine egne
cut-off-verdier for bestemme lave CAE-verdier.

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14. PROSEDYRENS BEGRENSNINGER

14.1
14.2

Absorbanser over 3,0 er over analysens rapporterbare grenser og skal derfor

ikke rapporteres.
CAE-testresultater er ikke diagnostiske i eller for seg selv. Analyseresultater
skal tolkes i sammenheng med andre laboratorietester i tillegg til den kliniske
presentasjonen for pasienten.

15. FORVENTEDE VERDIER

Normalverdier
CAE-analysen ble utfrt av DiaSorin ved hjelp av serumprver tatt fra tilsynelatende
friske individer. Alle prver ga resultater over de etablerte cut-off-verdiene og ville bli
klassifisert som normal/hy.
Tabell 1: REPRESENTATIV STUDIE AV NORMALT OMRDE
Gj.sn.
Standardavvik
Omrde
n
(CAE-enheter)
(CAE-enheter)
(CAE-enheter)
102
104
20,4
63-145

16. UTFRELSESDATA
16.1 PRESISJON
Presisjonen til DiaSorin CAE-kitet ble evaluert ved hjelp av modifiserte prinsipper fra
National Committee for Clinical Laboratory Standards retningslinje Evaluation of
Precision Performance of Clinical Chemistry Devices: (EP5-T2).
Syv prver ble testet i duplikater over en 10-dagersperiode ved 3 studiesteder.
Dupliserte brnner ble preparert ut fra n enkelt fortynning av hver prve. Prvene er
ansamlinger preparert fra humane sera som er valgt for spenne seg over
aktivitetsomrdet for komplementaktivering fra lave til hye niver. Alle data ble
oppsamlet for analyse. Ekstremverdier ble definert som observasjoner hvis
standardiserte CAE-verdier var over 2,6 standardavvik fra null.
Ekstremverdier ble slettet og gjenvrende data ble underlagt variansanalyse (ANOVA)
for oppn beregninger av innen-serie, mellom-dag, mellom-sted og total presisjon.
Sluttresultater vises i tabell 2 nedenfor. Verdier er basert p CAE-enheter som definert i
avsnittet Beregning av resultater.
TABELL 2: CAE-presisjon
(Verdier i CAE-enheter)
innen-serie

Mellom-dag

Gj.sn.

60

10,7

2,131

19,9

1,865

17,5

1,111

10,4

3,042

28,5

58

12,0

1,210

10,1

1,422

11,9

1,327

11,1

2,291

19,1

60

25,3

3,032

12,0

2,354

9,3

1,728

6,8

4,209

16,7

58

83,4

5,685

6,8

9,088

10,9

0,000

0,0

10,720

12,9

60

134,2

5,916

4,4

11,832

8,8

10,158

7,6

16,679

12,4

60

146,6

6,308

4,3

9,158

6,2

10,879

7,4

15,557

10,6

59

147,7

5,170

3,5

4,829

3,3

11,229

7,6

13,272

9,0

% K.V.

Std.
avvik

Total

Prve

% K.V.

Std.
avvik

Mellom-sted

Std.
avvik

% K.V.

Std.
avvik

% K.V.

16.2 Sikkerhet: ANALYSENS SIKKERHET HAR BLITT KONTROLLERT MED

METODESAMMENLIGNING (SAMMENLIGNING MED CH50-METODEN).
Nyaktighet
CAE-analysen ble sammenlignet med bde en kommersielt tilgjengelig CH50-test og
Kent Fife CH50-prosedyren brukt ved et etablert immunologireferanse-laboratorium.
Testresultater ble klassifisert som enten lave eller normale/hye ved hjelp av de
etablerte cut-off-verdiene for hver metode.

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Ved hjelp av CH50-metoden som referanse (eller riktige" metode), ble relativ
sensitivitet, relativ spesifisitet og generell overensstemmelse beregnet som flger:
Relativ sensitivitet =

Antallet sanne lavpunkter (lave i begge analyser)

Antallet sanne lavpunkter + antallet CAE normale/hye prver

Relativ sensitivitet =

Antallet sanne normale/hye verdier (normale/hye i begge

analyser)
(Antallet sanne normale/hye verdier + Antallet CAE lave
prver)

Generell
overensstemmelse =

Antallet sanne lavpunkter + Antallet sanne normale/hye

prver
Totalt antall prver testet

Tabell 3: KENT FIFE CH50 KONTRA CAE

CAE
Lav

Normal/hy

Lav

48

50

Relativ sensitivitet

96 %

Normal/hy

71

73

Relativ spesifisitet

97 %

Total

50

73

123

Generell
overensstemmelse

97 %

Kent Fife
CH50

Total

Figur 3: KENT FIFE CH50 KONTRA CAE

250

Normal/hy

CAE-enheter

200

150

100

Lav

50

0
0

50

100

150

200

250

CH50-

79

300

350

400

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00:00 AM/PM

Tabell 4: KOMMERSIELL CH50 KONTRA CAE

Lav

Total

Lav

20

22

Normal/hy

57

57

Total

20

59

79

Kommersiell
CH50

CAE
Normal/hy

Relativ
sensitivitet
Relativ
spesifisitet
Generell
overensste
mmelse

Figur 4: KOMMERSIELL CH50 KONTRA CAE

300
Normal/hy

CAE-enheter

250

200

150

100

50
Lav
0
0

50

100

150

200

Kommersielle CH50enheter

80

250

300

350

400

91 %
100 %
97 %

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00:00 AM/PM

FEILSKING
Problem
Kontrollens CAE-verdier utenfor
rekkevidde.

Mulige rsaker
1. Gal temperatur, tid eller pipettering,
reagenser ikke blandet.

2. Krysskontaminering av kontroller.
3. Feilaktig fortynning.
4. Optisk bane er ikke ren.
5. Filterets blgelengde er gal.
6. Overfortynning eller
underfortynning av kalibratorer.
Alle testresultater negative.

1. n eller flere reagenser ikke tilsatt,

eller tilsatt i gal rekkeflge.
2. Konjuger tapt aktivitet.

3. Feilaktig fortynning av vaskebuffer.

4. Belagt plate inaktiv.

Alle testresultater positive.

1. Kontaminert kromogenlsning.
2. Kontaminerte buffere og
reagenser.
3. Vaskebuffer (1x) kontaminert.

Drlig presisjon (dupliserte

absorbansavlesninger mer enn
20 % av deres gjennomsnitt).

4. Feilaktig fortynning av serum.

1. Pipettorlevering KV mer enn 5 %
av prver ikke tilsatt langsomt.
2. Serum eller reagenser ikke blandet
tilstrekkelig, reagenser ikke ved rett
temperatur fr tilsetning.
3. Tilsetning av reagenser tar for lang
tid, ujevne tidsintervaller, luftbobler.

4. Luftstrmmer blser over platen

under inkubasjoner.
5. Optisk bane er ikke ren.

6. Instrumentet ikke i likevekt fr

avlesningene ble foretatt.
7. Vasking ikke konsekvent, fangede
bobler, vske igjen i brnner ved
vaskesyklusens slutt.

8. Feilaktig pipettering.

SE SISTE SIDE FOR REFERANSER

81

Lsning
1. Kontroller at temperaturen var riktig.
Kontroller at tidspunktet var riktig. Se
Drlig presisjon (nedenfor) nr. 2-4.
Gjenta test.
2. Pipetter nye.
3. Gjenta test.
4. Se etter fukt eller skitt. Trk av bunnen
og les p nytt hvis stopplsning brukes.
5. Skift filter til 450 5 nm.
6. Kontroller prosedyren p nytt. Fortynn
kalibratorer, kontroller og prver p nytt.
Gjenta test.
1. Kontroller prosedyren p nytt. Kontroller
ubrukte lsninger. Gjenta test.
2. Overfr en liten mengde kromogen til et
testrr (ca. 0,1 mL) og pipetter konjugat
(5-10 L) rett inn i kromogen. Lsningen
skal raskt bli bl.
3. Fortynn vaskebuffer p nytt. Gjenta test.
4. Kontroller farge p trkemiddel. Se etter
penbar fukt i ubrukte brnner. Analyser
tester p nytt med kontroller kun for
aktivitet. Kontroller konjugataktivitet som
i nr. 2 ovenfor.
1. Kontroller absorbansen til ubrukt
kromogenlsning.
2. Se etter turbiditet i alle lsninger.
3. Kontroller renset vanntilfrsel brukt til
fortynne buffer. Br ha resistivitet p
mer enn 5 megaohms.
4. Fortynn prver p nytt. Gjenta test.
1. Kontroller kalibrering av pipettor. Bruk
reproduserbar metode.
2. bland alle reagenser forsiktig men
grundig og bring til likevekt til passende
temperatur.
3. Utvikle konsekvent uniform metode og
unng sprut eller bruk av
flerpipetteringsenhet eller automatisk
dispenser for redusere tiden.
4. Dekk platen eller plasser i kammer.
5. Trk bunnen av platen med mykt papir.
Kontroller at instrumentets lyskilde og
detektor ikke er skittent.
6. Kontroller instrumenthndboken for
oppvarmingsprosedyre.
7. Bruk kun akseptable vaskeenheter.
Forleng tidsforsinkelsen p automatiske
vaskeenheter eller k antallet
vaskesykluser. Kontroller at alle brnner
er fylt og aspirert uniformt. Dispenser
vske over reagensnivet ut i brnnen.
8. Unng luftbobler i pipettetuppen. Srg
for at tuppene sitter godt p.

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00:00 AM/PM

REFERENCES/BIBLOGRAPHIE/LITERATUR/BIBLIOGRAFA/BIBLIOGRAFIA/
REFERNCIAS/ REFERANSER
1.

2.
3.

Dalmasso, A.P., Complement in the Pathophysiology and Diagnosis of Human

Diseases, CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, Vol. 24, Issue 2
(1986).
Schur, P.H., Inherited Complement Component Abnormalities, Ann. Rev. Med.,
Vol. 37 (1986).
Frank, M., Detection of Complement in Relation to Disease, Journal of Allergy
and Clinical Immunology, Vol. 89, No. 3, March (1992).

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SYMBOLS USED WITH DEVICES

IVD

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Franais

Deutsch

Espaol

Italiano

European
Conformity

Conformit aux
normes
europennes

CE Konformittskennzeichnung

Conformidad
europea

Conformit
europea

Expiration Date

Date limite
d'utilisation

Mindesthaltbarkeitsdatum

Fecha de
caducidad

Data di scadenza

Manufacturer

Fabricant

Hersteller

Fabricante

Fabbricante

Consult
Instructions
for Use

Consulter les
instructions
dutilisation

Gebrauchsanweisung beachten

Consulte las
instrucciones de
uso

Consultare le
istruzioni per
luso

In vitro diagnostic.

Diagnostic in vitro.

In-vitroDiagnostikum.

Diagnstico in
vitro.

Diagnostica in
vitro.

Lot No.

No. de lot

Chargen-Nr.

Nmero de lote

Lotto n

Temperature
limitation.

Limitation de
temprature.

Temperaturbereich

Limitacin de
temperatura

Limite della
temperatura

Calibrator

talon

Kalibrator

Calibrador

Calibratore

Control serum

Srum de contrle

Kontrollserum

Suero de control

Siero di controllo

Wash buffer

Tampon de lavage

Waschpuffer

Tampn de
lavado

Tampone di
lavaggio

Solid phase
(Coated strips).

Phase solide
(lames enduites).

Festphase
(Beschichtete
Mikrotiterstreifen).

Fase slida
(Tiras
recubiertas).

Fase solida
(Vetrini con
rivestimento).

Conjugate

Conjugu

Konjugat

Conjugado

Coniuga

Chromogen
(Tetramethylbenzidine)

Chromogne
(Ttramthylbenzidine)

Chromogen
(Tetramethylbenzidin)

Cromgeno
(tetrametilbencidina)

Cromogeno
(Tetrametilbenzidina)

Reconstitute with
X mL

Reconstituer
avec X mL

Mit X ml
auflsen

Reconstitucin
con X mL

Ricostituire
con X mL

Sample diluent

Diluant
dchantillon

Proben-Diluent

Diluyente de
muestras

Diluente
campione

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IVD

Portugus

Norsk

Conformidade com
as normas europeias

EU-konformitet

Prazo de validade

Utlpsdato

Fabricante

Tilvirker

Consulte as
instrues de
utilizao

Se Bruksanvisninger

Diagnstico
in vitro.

In vitro-diagnostikk

N. do lote

Partinr.

Limite de
temperatura.

Temperaturbegrensning.

Calibrador

Kalibrator

Soro de controlo

Kontrollserum

Tampo de lavagem

Vaskebuffer

Fase slida
(Tiras revestidas ).

Solid-fase (belagte
strimler).

Conjugado

Konjugat

Cromognio
(Tetrametilbenzidina)

Kromogen
(tetrametylbenzidin)

Reconstituir
com X mL

Rekonstituer med
X mL

Diluente da amostra

Prvefortynning

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15131

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