Berk. Penel.

Hayati: 13 (39–44), 2007

STUDI PERBANDINGAN METODE TRANSFORMASI DNA

MENGGUNAKAN VEKTOR Agrobacterium tumefaciens PADA TANAMAN
TEBU (Sacharum hybrid)
Sri Setyati*, Purnama Oktaviandari*, Muhammad Hazmi**, dan Bambang Sugiharto***
* Pusat Penelitian Biologi Molekul dan *** Fakultas Matematika dan Pengetahuan Alam Universitas Jember
** Fakultas Pertanian Universitas Muhammadiyah Jember.

ABSTRACT
In order to compare transient expression of gus gene driven by CaMV 35S and rice ubiquitin RUBQ2 promoters, a DNA
transformation was conducted using embryogenic callus and suspension cultures of sugarcane. The transient gus expression was
observed by histochemical staining method. The histochemical observation of GUS activity after co-cultivation showed that RUBQ2
promoter produced high level of clear blue spots both in embryogenic callus and suspension cultures, while the CaMV35S promoter
was not detected. The suspension cultures slightly increased transient gus gene expression compared to embryogenic callus. However,
the histochemical analysis of regenerated putative transformant plants after 5 successive cycles on the selection medium showed no
blue spots of gus gene expression. PCR amplification of DNA for CaMV35 or nptII in putative transformant plants confirmed that there
was no integration of the transformed gene in the genome DNA. The results suggested a possibility of somaclonal variation with callus
propagation, thus did not produce transformed plants. To avoid the somaclonal variation, the transformation was conducted using in
vitro plants and multiple shoots without intervening callus phase. Histochemical observation of infected materials after co-cultivation
showed that almost all of the infected materials partially exhibited blue color in the basal region. In case of in vitro plants, they rapidly
grow and multiplied in the selection medium, thus the method provided an excellent system for the transformation in sugarcane. The
results suggest that in vitro plants as well as multiple shoots need further investigation to be used as target tissues for Agrobacterium-
mediated transformation in sugarcane.

Key words: DNA transformation, Agrobacterium tumefaciens, rice ubiquitin promoter, CaMV35S promoter, sugarcane

PENGANTAR masih perlu diperbaiki untuk dapat dimanfaatkan secara

rutin.
Teknik pemuliaan tanaman telah banyak digunakan
dalam perbaikan sifat-sifat tanaman yang mempunyai nilai Promoter DNA merupakan elemen regulator atau
ekonomis penting. Akan tetapi teknik tersebut memerlukan pengendali yang secara langsung mengendalikan ekspresi
tenaga dan waktu banyak, seperti yang ada pada tanaman gen baik secara konstitutif maupun spesifik. Ada beberapa
tebu. Perkembangan bioteknologi menawarkan teknik tipe promoter yang dapat mengendalikan ekspresi gen
transformasi DNA untuk memasukkan gen penting dalam secara kuat, konstitutif atau secara spesifik. Sebagai contoh,
perbaikan sifat tanaman, di mana hal semacam itu tidak dapat promoter Cauliflower Mosaic Virus 35S (CaMV 35S)
dilakukan menggunakan teknik pemuliaan tanaman. biasanya digunakan pada transformasi beberapa tanaman
Perkembangan bioteknologi tanaman saat ini dikotil maupun monokotil. Namun aktivitas promoter
menunjukkan bahwa transformasi DNA mengunakan CaMV 35S ini rendah pada tanaman tebu (Chowdhury et al.,
Agrobacterium telah berhasil dilakukan pada tanaman 1992). Promoter actin padi 1 dan elemen emu menunjukkan
monokotil seperti padi (Raineri et al., 1990; Park et al., aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan CaMV 35S pada
1996), jagung (Ishida et al., 1996), dan pisang (May jaringan tebu (Gallo-Meager dan Ervine, 1996), dan saat
et al., 1995). Metode ini memberikan beberapa keuntungan ini dilaporkan bahwa promoter ubiquitin padi RUBQ2
seperti, tekniknya sederhana, tidak banyak mengubah mempunyai ekspresi lebih tinggi pada tanaman transgenik
genom tanaman transforman, dan mampu mentransfer DNA tebu (Liu et al., 2003). Oleh karena itu, studi perbandingan
lebih besar. Walaupun metode menggunakan Agrobacterium beberapa tipe promoter pada transformasi tebu penting
telah dicobakan pada tanaman tebu (Arencibia et al., 1998; untuk melihat efisiensinya.
Enriquez-Obregon et al., 1998), tetapi rendahnya akurasi Pertimbangan utama dalam transformasi DNA
hasil untuk dapat diulang kembali, menyebabkan teknik ini adalah munculnya sifat yang dikehendaki pada tanaman
40 Studi Perbandingan Metode Transformasi DNA

transgenik. Selain sifat dari DNA yang ditransformasikan tunas tanaman ini (0,5 cm) dipisahkan dan digunakan
tidak dikehendaki munculnya sifat lain yang berbeda sebagai eksplan untuk transformasi.
dengan tanaman asalnya. Akan tetapi metode regenerasi
tanaman menggunakan kultur kalus sering memunculkan Plasmid Vektor dan Kultur Agrobacterium
terjadinya risiko variasi somaklonal, khususnya pada tebu Transformasi dilakukan dengan menggunakan
(Lee, 1987). Variasi somaklonal telah dilaporkan pada Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 yang
tanaman transgenik tebu resisten terhadap insekta yang mengandung plasmid pB1121 atau pCL4. Plasmid pB1121
diperoleh dari elektroforasi embriogenik tebu (Arencibia (Toyobo, Inc) dan pCL4 berisi gen gus masing-masing
et al., 1999). Regenerasi secara langsung dari tanaman dengan promotor CaMV35S dan ubiquitin padi (RUBQ2)
tanpa pembentukan kalus terlebih dahulu dilaporkan (Liu et al., 2003). Koloni tunggal Agrobacterium yang berisi
memerlukan waktu lebih pendek, efisiensi transformasi masing-masing plasmid diinokulasi dalam 3 ml media YEP
lebih tinggi sekitar 50%, dan dapat menekan terjadinya cair yang mengandung 50 mg l–1 kanamisin dan 50 mg l–1
variasi somaklonal (Manickavasagam et al., 2004). rimfamicin dan diinkubasi pada shaker inkubator dengan
Pada tulisan ini dilaporkan hasil penelitian transformasi suhu 28 °C selama 2 hari. Satu ml dari kultur Agrobacterium
gen gus yang dikendalikan oleh CaMV 35S dan ubiquitin tersebut disubkultur pada 50 ml media YEP cair dan
padi RUBQ2 (Liu et al., 2003) dengan target jaringan diinkubasi pada kondisi yang sama sampai mencapai OD600
(eksplan) tebu yang berbeda. 0,8–1,0. Kemudian kultur disentrifuga pada 4000× g selama
10 menit dan sel bakteri disuspensikan pada media 2 ml
BAHAN DAN CARA KERJA LB medium.

Bahan Tanaman Infeksi Agrobacterium dan Ko-kultivasi

Kalus tebu dari cultivar Ni9 dan NiF4 didapat dari Kurang-lebih 2 gram EC atau SC dikumpulkan dan
Laboratorium Crops Breeding, Japan International Research diberi perlakuan pengeringan di atas kertas saring steril
Center for Agricultural Sciences. Kalus dipropagasi di dalam laminar air flow selama 30 menit. EC dan SC
menggunakan medium Murashige-Skoog (MS) ditambah ditempatkan dalam Erlemeyer yang berisi 50 ml media LB
3 mg l–1 2,4 D (MS1) dalam kondisi gelap dengan suhu dan disonifikasi selama 5 menit. Infeksi Agrobacterium
26 °C dan setiap tiga minggu sekali disubkultur pada dilakukan dengan cara merendam EC dan SC dalam
medium yang baru. suspensi Agrobacterium (OD600 akhir disetarakan 0,8) yang
Tunas samping (axillary buds) diisolasi dari batang tebu mengandung acetosyringone (100 mg l–1), yang selanjutnya
(cultivar BL) yang diambil dari lapangan secara aseptik diinkubasi pada suhu 28 °C selama 30 menit. Sebelum
dan disterilkan menggunakan etanol 70%, selanjutnya ko-kultivasi, material yan telah terinfeksi dicuci satu kali
ditumbuhkan pada media MS ditambah 0,1 Mgl –1 6- dengan air steril kemudian dikeringkan dalam laminar air
benzyladenin (BA) pada ruangan bercahaya bersuhu 26 °C flow. Ko-kultivasi dilakukan dengan menginokulasi kalus
selama 3 minggu untuk menghasilkan tanaman in vitro. yang diinfeksi pada media MSI padat berisi aceosyringone
pada kondisi gelap dengan suhu 28 °C selama 3 hari.
Persiapan Eksplan Untuk infeksi tanaman in-vitro, bagian basal tanaman in-
Kalus disubkultur pada media MS1 baru dan diinkubasi vitro ditusuk 4–5 kali menggunakan jarum steril dan tanaman
dengan kondisi yang sama dengan interval 3 minggu. Kalus yang telah dilukai direndam dalam suspensi Agrobacterium
embriogenik (EC) diperoleh dengan menyeleksi kalus (OD600 1.0) yang mengandung acetosyringone (100 mg l–1),
dengan ciri-ciri nodular, kompak, dan menunjukkan warna selanjutnya diinkubasi pada shaker (150 rpm) pada suhu
kekuningan (Matsuoka et al., 2002). Kultur EC ditransfer 28 °C selama 30 menit. Eksplan terinfeksi dikeringkan
pada MS1 cair untuk membuat kultur sel (SC) dengan cara menggunakan kertas filter steril dan diinokulasi pada media
seperti yang dilaporkan oleh Arencibia et al. (1998). MS padat yang menandung acetosyringone. Ko-kultivasi
Tanaman pertama yang diperoleh dari tunas samping dilakukan selama 3 hari pada kondisi gelap dengan suhu 28 °C.
disubkultur pada media yang sama untuk memperoleh tunas
dan diinkubasi pada kondisi yang sama. Tunas-tunas yang Seleksi dan Regenarasi Transforman
hijau dan sehat (± 3 cm) dipisahkan dan dikultur dalam Bahan yang telah diko-kultivasi dicuci tiga kali dengan
MS tanpa hormon untuk memacu pertumbuhan akar pada 500 mg l–1 cefotaxime dan kemudian dikeringkan di atas
tanaman in-vitro selama 2 minggu. Bagian basal (pangkal) kertas filter steril dalam laminar air flow. Materi yang
 Setyati, Oktaviandari, Hazmi, dan Sugiharto 41

terinfeksi diinokulasi pada media MS yang berisi cefotaxime dengan DNA genom yang telah diisolasi menggunakan
(500 mg l–1) dan diinkubasi pada kondisi gelap (EC dan TaKaRa Ex Taq polymerase (Takara Bio Inc) dan satu set
SC) dan ada sinar (tanaman in-vitro) pada suhu 26 °C primer yang didesain dari sekuen DNA CaMV, nptII atau
selama satu minggu. Kemudian kultur ditransfer pada gus. Kondisi reaksi PCR yang digunakan untuk denaturasi,
media seleksi yang mengandung antibiotik geneticin annealing, dan extention berturut-turut adalah pada 98 °C
(50 mg l–1) dan cefotaxime (500 mg l–1), serta diinkubasi selama 10 detik, 55 °C selama 30 detik, 72 °C selama
pada kondisi yang sama selama 2–3 minggu. 1 menit dengan 30 siklus. DNA yang teramplifikasi
Kalus resisten (tahan) antibiotik yang tumbuh dari EC kemudian dianalisis dengan elektroforesis pada 1% gel
dan SC disubkultur pada media seleksi untuk regenerasi agarosa dan difoto.
yang mengandung cefotaxime dan geneticin selama
3 minggu. Tunas yang tumbuh kemudian disubkultur pada HASIL
media seleksi yang sama dan setelah 3 siklus subkultur,
Transformasi Menggunakan Kalus Embriogenik
tanaman kemudian dipindahkan ke media seleksi untuk
(EC) dan Kultur Sel (SC)
pembentukan akar selama 3 minggu. Tunas yang diperoleh
dari kalus tunggal ditetapkan sebagai satu klon putative Untuk membandingkan ekspresi sementara gen gus yang
transforman. dikendalikan oleh promoter CaMV dan RUBQ2 dilakukan
analisis histokimia. Pengamatan histokimia ekspresi gen gus
Pengujian Ekspresi Gen Gus setelah ko-kultivasi menunjukkan bahwa promoter ubiquitin
Materi yang terinfeksi diuji ekspresi gen gus dengan padi RUBQ2 menghasilkan lebih banyak noda biru pada EC
prosedur histokimia sesuai metode yang ditunjukkan maupun SC, sementara promoter CaMV35S tidak terdeteksi
oleh Jefferson et al., (1987) dengan beberapa modifikasi. (Gambar 1). Pengamatan dilakukan dengan menghitung
Uji histokimia dilakukan terhadap eksplan terinfeksi sekurangnya satu noda biru yang mengekspresikan gen
EC, SC, dan tanaman in-vitro satu minggu setelah ko- gus pada setiap gerombol kalus diberi nilai satu. Tabel 1
kultivasi. Sampel dicuci satu kali dengan larutan 0,1 M bufer menunjukkan perbandingan ekspresi gen gus antara SC
potassium phosphate (pH 7,0), dan kemudian diinkubasi dan EC (Tabel 1). Hasilnya menyatakan bahwa promoter
dengan larutan yang mengandung 2% metanol, 0,3% Triton RUBQ2 merupakan elemen (DNA) regulator yang dapat
X-100, 0,5 mM potassium ferricyanide, 0,5 mM potassium memberikan ekspresi lebih tinggi dibandingkan CaMV35S
ferrocyanide dan 0,5 mg ml–1 5-bromo-4-chloro-indolyl-b- pada transgen tebu.
D-glucoronide pada suhu 37 °C semalam. Pengamatan spot Untuk perbanyakan sel transforman, kalus yang telah
atau bercak berwarna biru karena adanya ekspresi gen gus diinfeksi dari EC mupun SC dikulturkan satu minggu setelah
dilakukan menggunakan mikroskop. ko-kultivasi tanpa seleksi, kemudian ditransfer pada media
seleksi induksi kalus. Kalus resisten terhadap antibiotik
Analisis PCR yang terbentuk selanjutnya disubkultur pada media seleksi
Total genomik DNA diisolasi dari daun yang masih untuk regenerasi. Kalus yang tidak transforman tidak
muda tanaman putative transforman mengunakan Kit menunjukkan pertumbuhan lebih lanjut dan berubah menjadi
Dneasy Plant Mini Kit (Qiagen). Analisis PCR dilakukan

Tabel 1. Perbandingan efektivitas transformasi menggunakan Agrobacterium LBA4404 dengan perbedaan kultivars, eksplan, dan
plasmid vektor

Aktivitas GUS Jumlah Jumlah Putative Aktivitas

Kultivar Eksplan Plasmid
(%)* plantlet (%) transformants GUS (%)**
NiF4 EC pBI121 ND 3,1 0 0
pCL4 54 1,5 0 0
SC pBI121 ND 17,8 0 0
pCL4 61.5 17,5 0 0
NiF9 EC pBI121 ND 29,4 6 0
pCL4 73 25,1 2 0
SC pBI121 ND 69,6 2 0
pCL4 85.5 71,4 5 0
Data merupakan rerata dari dua eksperimen terpisah.
* Sesudah ko-kultivasi, ** pada daun putative transformants
42 Studi Perbandingan Metode Transformasi DNA

Pada SC dari cultivar Ni9 menghasilkan lebih banyak

pertumbuhan planlet dibandingkan dari NiF4. Beberapa
planlet Ni9 dapat membentuk akar dan tumbuh pada media
seleksi dan dinamakan putative transforman (Gambar 2),
tapi semua planlet dari NiF4 akarnya tidak tumbuh dan
secara perlahan mati.
Putative transforman yang dibentuk dengan menginfeksi
Gambar 1.  Perbedaan level ekspresi gen gus yang dikendalikan EC dan SC dari kultivar Ni9 diuji secara histokimia untuk
oleh promoter CaMV35S (pBI121) dan RUBQ2 (pCL4) pada EC
dan SC. Noda biru menunjukkan ekspresi gen gus (tanda panah).
ekspresi gen gus (Gambar 3a). Tampak bahwa semua daun
Noda biru yang jelas terlihat pada setiap gerombol kalus dihitung yang diuji tidak menunjukkan adanya noda biru pada daun
dan datanya ditunjukkan pada Tabel 1. Gambar ini dihasilkan putative transforman. Untuk mengkonfirmasi hasil ini,
dengan menggunakan stereoscopic microscopy. genomik DNA diisolasi dari putative transforman dan
digunakan untuk amplifikasi PCR dengan primer CaMV
35S dan nptII. Adanya band DNA yang sesuai dari CaMV
(0,45 kb) dan nptII (0,5 kb) tidak terdeteksi dalam analisis
PCR (Gambar 3b). Hasil ini menunjukkan bahwa gen yang
ditransformasikan tidak dapat berintegrasi dengan genom
putative transforman sehingga tidak menghasilkan tanaman
transgenik.

Transformasi Menggunakan Eksplan Tanaman

In-vitro
Untuk menghindari terjadinya variasi somaklonal,
transformasi dilakukan menggunakan tanaman in-vitro
Gambar 2.  Pertumbuhan putative transformant dari kultivar Ni9
dan multiple shoot. Tunas samping diisolasi dari batang
pada media seleksi untuk pengakaran (kiri) dan sesudah subkultur kultivar BL secara aseptis dan diinokulasikan pada medium
pada media yang sama sesudah 3 minggu (kanan). untuk menghasilkan multiple shoot dan tanaman in-vitro
(Gambar 4a). Bagian basal dari tanaman in-vitro dipotong
coklat, tetapi kalus yang transforman tumbuh menjadi dan dipisahkan dari tanaman, dan digunakan sebagai
tanaman. Di antara eksplan yang diuji, SC menunjukkan jaringan target untuk transformasi (Gambar 4b). Sesudah
persentase regenerasi eksplan lebih tinggi dibandingkan infeksi dan ko-kultivasi dilakukan analisis eskpresi gen
EC (Tabel 1). Hal ini menyatakan bahwa pergantian media gus dengan histokima pada baik multiple shoot maupun
setiap 2 hari sekali pada SC memberikan tersedianya nutrisi tanaman in-vitro. Pengamatan histokimia menunjukkan
lebih baik dan populasi sel yang meristematik lebih tinggi. hampir semua tanaman terinfeksi terlihat warna biru yang

Gambar 3.  Analisis histokimia ekspresi gen gus pada tanaman putative transformant Ni9 (A) dan analisis elektroforesis gel agrose (1%)
hasil amplifikasi PCR menggunakan primer CaMV 35S dan nptII (B).
Tidak ada spot biru menunjukkan bahwa ekspresi gen gus tidak ditemukan pada analisis histokimia. Demikian pula pita DNA untuk DNA
CaMV (0,4 kb) dan nptII (0,5 kb) tidak diketemukan pada analisis elektroforesis.
 Setyati, Oktaviandari, Hazmi, dan Sugiharto 43

Gambar 5.  Analisis histokimia eskpresi gen gus pada tanaman

in-vitro dan multiple shoots. Bercak (spot) warna biru pada bagian
pangkal eksplan menunjukkan adanya ekspresi gen gus (tanda
panah).
Gambar 4.  Perbanyakan tanaman in-vitro pada media MS padat
(kiri) dan bagian basal dari tanaman in-vitro yang digunakan untuk
transformasi. dikonfirmasi keberadaannya pada tanaman in-vitro yang
tumbuh sesudah 5 kali siklus seleksi pada media yang
merupakan ekspresi gen GUS pada bagian basal tanaman mengandung antibiotik, namun metode transformasi ini
in-vitro maupun multiple shoot. perlu dikembangkan.
Dalam hal tanaman in-vitro mereka dapat tumbuh Manickavasagam et al. (2004) melaporkan bahwa
dan berkembang dengan cepat dalam medium seleksi transformasi genetik menggunakan tunas samping (axillary
tetapi kontrol eksplan yang tidak terinfeksi mati (data buds) tanaman tebu menghasilkan efisiensi transformasi
tidak dipublikasikan). Hasil penelitian ini menunjukkan tinggi sekitar 50% dan dalam waktu 5 bulan dapat dihasilkan
bahwa penggunaan eksplan tanaman in-vitro maupun tanaman tebu transforman. Akan tetapi, sumber eksplan
multiple shoot untuk transformasi memberikan harapan yang diambil dari tunas samping tanaman tebu yang
dan memerlukan penelitian lanjutan. ditumbuhkan di lapangan menimbulkan masalah kesulitan
dalam sterilisasi eksplan dan sesudah ditumbuhkan pada
PEMBAHASAN media secara in-vitro lambat pertumbuhannya (unpublished
data). Oleh karena itu, keberhasilan penggunaan tanaman
Tingginya ekspresi gen gus yang dikendalikan oleh
in-vitro sebagai eksplan untuk transformasi diharapkan
promoter RUBQ2 pada kalus yang terinfeksi sama dengan
dapat menghindarkan permasalahan tersebut. Beberapa
hasil yang dilaporkan sebelumnya oleh Liu et al. (2003).
perlakuan perlu dikembangkan utamanya untuk
Akan tetapi berdasarkan uji histokimia, ekspresi gen gus
meningkatkan pembentukan tunas-tunas baru sesudah
tidak ditemukan pada tanaman putative transforman yang
ko-kultivasi dengan Agrobacterium, seperti penggunaan
berasal dari kalus embrionik dan suspensi sel. Tidak adanya
media dengan kandungan sukrosa tinggi (50 gram
transgen pada genom tanaman tersebut telah dikonfirmasi
per liter). Secara keseluruhan pengembangan metode
dengan analisis PCR yang mengunakan primer gen CaMV
transformasi menggunakan eksplan tanaman in-vitro ini
dan nptII (Gambar 3b).
perlu disempurnakan karena lebih sederhana, pertumbuhan
Regenerasi secara langsung dari eksplan tanpa melalui
eksplan lebih cepat, dan dapat mengurangi risiko variasi
fase pengkalusan dapat mengurangi atau meminimalkan
somaklonal.
perubahan genetik karena adanya variasi somaklonal.
Oleh karena itu, penggunaan tanaman in-vitro sebagai
Ucapan Terima Kasih
eksplan untuk transformasi dimaksudkan untuk mengurangi
terjadinya variasi somaklonal (Tailor dan Dukie 1993; Penelitian ini dibiayai oleh Hibah Penelitian Tim
Manichavasagam et al., 2004), sehingga tulisan ini Pascasarjana Dirjen Dikti Departemen Pendidikan Nasional
memunculkan suatu ide transformasi menggunakan Tahun Anggaran 2005–2007.
multiple shoot dan tanaman in-vitro pada tebu. Pengamatan
histokimia pada multiple shoot dan tanaman in-vitro yang KEPUSTAKAAN
terinfeksi menunjukkan adanya warna biru yang jelas pada Arencibia AD, Carmona ER, Tellez P, Chan MT, Yu SM,
bagian basal tanaman tersebut. Spot warna biru tersebut Trujillo LE, Oramas P, 1998. An efficient protocol for
menunjukkan adanya ekspresi gen gus dan keberhasilan sugarcane (Saccharum spp L.) transformation mediated by
transformasi. Walaupun ekspresi gen gus belum dapat Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res 7: 213–222
44 Studi Perbandingan Metode Transformasi DNA

Arencibia AD, Carmona ER, Cornide MT, Castiglione S, O’Relly Liu D, Oard SV, Oard JH, 2003. High transgene expression levels
J, Chine A, Oramas P, Sala F, 1999. Somaclonal variation in sugarcane (Saccharum officinarum L.) driven by the rice
in insect-resistant transgenic sugarcane (Saccharum hybrid) ubiquitin promoter RUBQ2. Plant Sci 165: 743–750.
plants produced by cell electrophoration. Transgenic Res Manickavasagam M, Ganapathi A, Anbazhagan VR, Sudhakar
8: 349–360. B, Selvaraj N, Vasudevan A, Kasthurirengan S, 2004.
Chowdhury MKU, Vasil IK, 1992. Stably transformed herbicide Agrobacterium-mediated genetic transformation and
resistance callus of sugarcane via microprojectile development of herbicide-resistant sugarcane (Saccharum
bombardment of cell suspension cultures and electrophoration species hybrids) using axillary buds. Plant Cell Rep 23:
of protoplasts. Plant Cell Rep 11: 494–498. 134–143.
Enriquez-Obregon GA, Vazquez-Padron RI, Pieto-Samsonov Matsuoka M, Arifin S, Terauchi T, Tamura Y, Tanio M, Hayakawa
DL, Dela Riva GA, Selman-Housein G, 1998. Herbicide- A, Miwa H, 2002. Transformation of sugarcane cell mediated
resistant sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by Agrobacterium and subsequent shoot regeneration.
by Agrobacterium-mediated transformation. Planta 206: Japanese Journal of Tropical Agriculture. 46: 11–12.
20–27. May GD, Afza R, Mason HA, Wiecko A, Novak FJ, Arntzen CJ,
Gallo-Meagher M dan Irvine JM, 1996. Herbicide resistant 1995. Generations of transgenic banana (Musa acuminata)
transgenic sugarcane plants containing the bar gene. Crop plants via Agrobacterium-mediated transformation.
Sci 36: 1367–1374. Biotechnology 13: 486–492.
Ishida Y, Saito H, Ohta S, Hiei Y, Komari T, Kumashiro T, 1996. Park SH, Pinson SRM, Smith RH, 1996. T-DNA integration into
High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) genomic DNA of rice following Agrobacterium inoculation
mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nat Biotechnol of isolated shoots apices. Plant Mol Biol 32: 1135–1148.
14: 745–750. Raineri DM, Bottino P, Gordon MP, Nester EW, 1990.
Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan NW, 1987. GUS fusions: Agrobacterium-mediated transformation of rice (Oryza
b-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion sativa L.). Biotechnology 8: 33–38.
marker in higher plants. EMBO J 6: 3901–3907 Taylor PWJ, Dukie S, 1993. Development of an in vitro culture
Lee TSG, 1987. Micropropagation of sugarcane. Plant Cell Tissue technique for conservation of Saccharum spp. hybrids
Org Cult 10: 47–55. germ-plasm. Plant Tissue Organ Cult 34: 217–222.

Reviewer: Dr. Y. Sriwulan M., MSi.