Studi Perbandingan Metode Transformasi Dna Menggunakan Vektor Tebu (
Studi Perbandingan Metode Transformasi Dna Menggunakan Vektor Tebu (
ABSTRACT
In order to compare transient expression of gus gene driven by CaMV 35S and rice ubiquitin RUBQ2 promoters, a DNA
transformation was conducted using embryogenic callus and suspension cultures of sugarcane. The transient gus expression was
observed by histochemical staining method. The histochemical observation of GUS activity after co-cultivation showed that RUBQ2
promoter produced high level of clear blue spots both in embryogenic callus and suspension cultures, while the CaMV35S promoter
was not detected. The suspension cultures slightly increased transient gus gene expression compared to embryogenic callus. However,
the histochemical analysis of regenerated putative transformant plants after 5 successive cycles on the selection medium showed no
blue spots of gus gene expression. PCR amplification of DNA for CaMV35 or nptII in putative transformant plants confirmed that there
was no integration of the transformed gene in the genome DNA. The results suggested a possibility of somaclonal variation with callus
propagation, thus did not produce transformed plants. To avoid the somaclonal variation, the transformation was conducted using in
vitro plants and multiple shoots without intervening callus phase. Histochemical observation of infected materials after co-cultivation
showed that almost all of the infected materials partially exhibited blue color in the basal region. In case of in vitro plants, they rapidly
grow and multiplied in the selection medium, thus the method provided an excellent system for the transformation in sugarcane. The
results suggest that in vitro plants as well as multiple shoots need further investigation to be used as target tissues for Agrobacterium-
mediated transformation in sugarcane.
Key words: DNA transformation, Agrobacterium tumefaciens, rice ubiquitin promoter, CaMV35S promoter, sugarcane
transgenik. Selain sifat dari DNA yang ditransformasikan tunas tanaman ini (0,5 cm) dipisahkan dan digunakan
tidak dikehendaki munculnya sifat lain yang berbeda sebagai eksplan untuk transformasi.
dengan tanaman asalnya. Akan tetapi metode regenerasi
tanaman menggunakan kultur kalus sering memunculkan Plasmid Vektor dan Kultur Agrobacterium
terjadinya risiko variasi somaklonal, khususnya pada tebu Transformasi dilakukan dengan menggunakan
(Lee, 1987). Variasi somaklonal telah dilaporkan pada Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 yang
tanaman transgenik tebu resisten terhadap insekta yang mengandung plasmid pB1121 atau pCL4. Plasmid pB1121
diperoleh dari elektroforasi embriogenik tebu (Arencibia (Toyobo, Inc) dan pCL4 berisi gen gus masing-masing
et al., 1999). Regenerasi secara langsung dari tanaman dengan promotor CaMV35S dan ubiquitin padi (RUBQ2)
tanpa pembentukan kalus terlebih dahulu dilaporkan (Liu et al., 2003). Koloni tunggal Agrobacterium yang berisi
memerlukan waktu lebih pendek, efisiensi transformasi masing-masing plasmid diinokulasi dalam 3 ml media YEP
lebih tinggi sekitar 50%, dan dapat menekan terjadinya cair yang mengandung 50 mg l–1 kanamisin dan 50 mg l–1
variasi somaklonal (Manickavasagam et al., 2004). rimfamicin dan diinkubasi pada shaker inkubator dengan
Pada tulisan ini dilaporkan hasil penelitian transformasi suhu 28 °C selama 2 hari. Satu ml dari kultur Agrobacterium
gen gus yang dikendalikan oleh CaMV 35S dan ubiquitin tersebut disubkultur pada 50 ml media YEP cair dan
padi RUBQ2 (Liu et al., 2003) dengan target jaringan diinkubasi pada kondisi yang sama sampai mencapai OD600
(eksplan) tebu yang berbeda. 0,8–1,0. Kemudian kultur disentrifuga pada 4000× g selama
10 menit dan sel bakteri disuspensikan pada media 2 ml
BAHAN DAN CARA KERJA LB medium.
terinfeksi diinokulasi pada media MS yang berisi cefotaxime dengan DNA genom yang telah diisolasi menggunakan
(500 mg l–1) dan diinkubasi pada kondisi gelap (EC dan TaKaRa Ex Taq polymerase (Takara Bio Inc) dan satu set
SC) dan ada sinar (tanaman in-vitro) pada suhu 26 °C primer yang didesain dari sekuen DNA CaMV, nptII atau
selama satu minggu. Kemudian kultur ditransfer pada gus. Kondisi reaksi PCR yang digunakan untuk denaturasi,
media seleksi yang mengandung antibiotik geneticin annealing, dan extention berturut-turut adalah pada 98 °C
(50 mg l–1) dan cefotaxime (500 mg l–1), serta diinkubasi selama 10 detik, 55 °C selama 30 detik, 72 °C selama
pada kondisi yang sama selama 2–3 minggu. 1 menit dengan 30 siklus. DNA yang teramplifikasi
Kalus resisten (tahan) antibiotik yang tumbuh dari EC kemudian dianalisis dengan elektroforesis pada 1% gel
dan SC disubkultur pada media seleksi untuk regenerasi agarosa dan difoto.
yang mengandung cefotaxime dan geneticin selama
3 minggu. Tunas yang tumbuh kemudian disubkultur pada HASIL
media seleksi yang sama dan setelah 3 siklus subkultur,
Transformasi Menggunakan Kalus Embriogenik
tanaman kemudian dipindahkan ke media seleksi untuk
(EC) dan Kultur Sel (SC)
pembentukan akar selama 3 minggu. Tunas yang diperoleh
dari kalus tunggal ditetapkan sebagai satu klon putative Untuk membandingkan ekspresi sementara gen gus yang
transforman. dikendalikan oleh promoter CaMV dan RUBQ2 dilakukan
analisis histokimia. Pengamatan histokimia ekspresi gen gus
Pengujian Ekspresi Gen Gus setelah ko-kultivasi menunjukkan bahwa promoter ubiquitin
Materi yang terinfeksi diuji ekspresi gen gus dengan padi RUBQ2 menghasilkan lebih banyak noda biru pada EC
prosedur histokimia sesuai metode yang ditunjukkan maupun SC, sementara promoter CaMV35S tidak terdeteksi
oleh Jefferson et al., (1987) dengan beberapa modifikasi. (Gambar 1). Pengamatan dilakukan dengan menghitung
Uji histokimia dilakukan terhadap eksplan terinfeksi sekurangnya satu noda biru yang mengekspresikan gen
EC, SC, dan tanaman in-vitro satu minggu setelah ko- gus pada setiap gerombol kalus diberi nilai satu. Tabel 1
kultivasi. Sampel dicuci satu kali dengan larutan 0,1 M bufer menunjukkan perbandingan ekspresi gen gus antara SC
potassium phosphate (pH 7,0), dan kemudian diinkubasi dan EC (Tabel 1). Hasilnya menyatakan bahwa promoter
dengan larutan yang mengandung 2% metanol, 0,3% Triton RUBQ2 merupakan elemen (DNA) regulator yang dapat
X-100, 0,5 mM potassium ferricyanide, 0,5 mM potassium memberikan ekspresi lebih tinggi dibandingkan CaMV35S
ferrocyanide dan 0,5 mg ml–1 5-bromo-4-chloro-indolyl-b- pada transgen tebu.
D-glucoronide pada suhu 37 °C semalam. Pengamatan spot Untuk perbanyakan sel transforman, kalus yang telah
atau bercak berwarna biru karena adanya ekspresi gen gus diinfeksi dari EC mupun SC dikulturkan satu minggu setelah
dilakukan menggunakan mikroskop. ko-kultivasi tanpa seleksi, kemudian ditransfer pada media
seleksi induksi kalus. Kalus resisten terhadap antibiotik
Analisis PCR yang terbentuk selanjutnya disubkultur pada media seleksi
Total genomik DNA diisolasi dari daun yang masih untuk regenerasi. Kalus yang tidak transforman tidak
muda tanaman putative transforman mengunakan Kit menunjukkan pertumbuhan lebih lanjut dan berubah menjadi
Dneasy Plant Mini Kit (Qiagen). Analisis PCR dilakukan
Tabel 1. Perbandingan efektivitas transformasi menggunakan Agrobacterium LBA4404 dengan perbedaan kultivars, eksplan, dan
plasmid vektor
Gambar 3. Analisis histokimia ekspresi gen gus pada tanaman putative transformant Ni9 (A) dan analisis elektroforesis gel agrose (1%)
hasil amplifikasi PCR menggunakan primer CaMV 35S dan nptII (B).
Tidak ada spot biru menunjukkan bahwa ekspresi gen gus tidak ditemukan pada analisis histokimia. Demikian pula pita DNA untuk DNA
CaMV (0,4 kb) dan nptII (0,5 kb) tidak diketemukan pada analisis elektroforesis.
Setyati, Oktaviandari, Hazmi, dan Sugiharto 43
Arencibia AD, Carmona ER, Cornide MT, Castiglione S, O’Relly Liu D, Oard SV, Oard JH, 2003. High transgene expression levels
J, Chine A, Oramas P, Sala F, 1999. Somaclonal variation in sugarcane (Saccharum officinarum L.) driven by the rice
in insect-resistant transgenic sugarcane (Saccharum hybrid) ubiquitin promoter RUBQ2. Plant Sci 165: 743–750.
plants produced by cell electrophoration. Transgenic Res Manickavasagam M, Ganapathi A, Anbazhagan VR, Sudhakar
8: 349–360. B, Selvaraj N, Vasudevan A, Kasthurirengan S, 2004.
Chowdhury MKU, Vasil IK, 1992. Stably transformed herbicide Agrobacterium-mediated genetic transformation and
resistance callus of sugarcane via microprojectile development of herbicide-resistant sugarcane (Saccharum
bombardment of cell suspension cultures and electrophoration species hybrids) using axillary buds. Plant Cell Rep 23:
of protoplasts. Plant Cell Rep 11: 494–498. 134–143.
Enriquez-Obregon GA, Vazquez-Padron RI, Pieto-Samsonov Matsuoka M, Arifin S, Terauchi T, Tamura Y, Tanio M, Hayakawa
DL, Dela Riva GA, Selman-Housein G, 1998. Herbicide- A, Miwa H, 2002. Transformation of sugarcane cell mediated
resistant sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by Agrobacterium and subsequent shoot regeneration.
by Agrobacterium-mediated transformation. Planta 206: Japanese Journal of Tropical Agriculture. 46: 11–12.
20–27. May GD, Afza R, Mason HA, Wiecko A, Novak FJ, Arntzen CJ,
Gallo-Meagher M dan Irvine JM, 1996. Herbicide resistant 1995. Generations of transgenic banana (Musa acuminata)
transgenic sugarcane plants containing the bar gene. Crop plants via Agrobacterium-mediated transformation.
Sci 36: 1367–1374. Biotechnology 13: 486–492.
Ishida Y, Saito H, Ohta S, Hiei Y, Komari T, Kumashiro T, 1996. Park SH, Pinson SRM, Smith RH, 1996. T-DNA integration into
High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) genomic DNA of rice following Agrobacterium inoculation
mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nat Biotechnol of isolated shoots apices. Plant Mol Biol 32: 1135–1148.
14: 745–750. Raineri DM, Bottino P, Gordon MP, Nester EW, 1990.
Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan NW, 1987. GUS fusions: Agrobacterium-mediated transformation of rice (Oryza
b-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion sativa L.). Biotechnology 8: 33–38.
marker in higher plants. EMBO J 6: 3901–3907 Taylor PWJ, Dukie S, 1993. Development of an in vitro culture
Lee TSG, 1987. Micropropagation of sugarcane. Plant Cell Tissue technique for conservation of Saccharum spp. hybrids
Org Cult 10: 47–55. germ-plasm. Plant Tissue Organ Cult 34: 217–222.