Guía de introducción

Applied Biosystems StepOne™

Real-Time PCR System
Experimentos de cuantificación relativa
y CT comparativos
Guía de introducción

Introducción

Applied Biosystems StepOne™ Diseño del

experimento de
curva
Real-Time PCR System estándar relativa

Experimentos de cuantificación relativa

Preparación de las
reacciones de la
curva
estándar relativa

Realización del
experimento de
curva estándar
relativa

Análisis del
experimento de
curva
estándar relativa

Diseño del
experimento de CT
comparativos

Preparación de las
reacciones de CT
comparativos

Realización del
experimento de CT
comparativos

Análisis del
experimento de CT
comparativos
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Número de referencia 4377742 Rev. B

06/2010
 Contenido

Prólogo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii
Cómo utilizar esta guía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii
Cómo obtener más información . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii
Cómo obtener asistencia técnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x
Convenciones de seguridad utilizadas en este documento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi
Símbolos en los instrumentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii
Etiquetas de seguridad en los instrumentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiv
Seguridad general del instrumento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvi
Seguridad química . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii
Seguridad de residuos químicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xix
Seguridad eléctrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xx
Seguridad de los LED . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxi
Seguridad biológica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxi
Seguridad de la estación de trabajo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxii
Estándares de seguridad y compatibilidad electromagnética (EMC) . . . . . . . . . . . xxiii

Capítulo 1 Introducción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Acerca del sistema StepOne™ ...........................................2
Acerca de los experimentos de cuantificación relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Cómo utilizar esta guía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Acerca del experimento de ejemplo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Flujo de trabajo del experimento de ejemplo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa . 15

Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Creación de un nuevo experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Definición de las propiedades del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Definición de los métodos y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Configuración de los genes diana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
Configuración de los estándares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Configuración de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Configuración de las opciones de cuantificación relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Configuración del protocolo de termociclado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Revisión de la configuración de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Solicitud de materiales para el experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de iii
cuantificación relativa
Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva
estándar relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
Preparación del molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
Preparación de las diluciones de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Preparación de la dilución seriada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Preparación de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Preparación de la placa de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar

relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
Preparación de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
(Opcional) Activación de las notificaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Inicio de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
Monitorización de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar

relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

Sección 5.1: Revisión de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

Análisis del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
Visualización de la curva estándar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
Revisión de la gráfica de amplificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos . . . . . . . . . . . . . . . 108
Presentación de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

Sección 5.2: Solución de problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

Revisión de las opciones de análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
Revisión del resumen QC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
Omisión de pocillos para el análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
Revisión de la gráfica multicomponente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
Revisión de la gráfica de datos brutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

iv Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos . . . . . 125
Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
Creación de un nuevo experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
Definición de las propiedades del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
Definición de los métodos y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
Configuración de los genes diana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
Configuración de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
Configuración de las opciones de cuantificación relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
Configuración del protocolo de termociclado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
Revisión de la configuración de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
Solicitud de materiales para el experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148
Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152

Capítulo 7 Preparación de las reacciones

de CT comparativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
Preparación del molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
Preparación de las diluciones de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
Preparación de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160
Preparación de la placa de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163

Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos. . 167

Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
Preparación de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
Realización del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171

Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos . . . . . 173

Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174

Sección 9.1: Revisión de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175

Análisis del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos . . . . . . . . . . . . . . . 182
Revisión de la gráfica de amplificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
Presentación de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191

Sección 9.2: Solución de problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193

Revisión de las opciones de análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
Revisión del resumen QC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
Omisión de pocillos para el análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
Revisión de la gráfica multicomponente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200
Revisión de la gráfica de datos brutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de v
cuantificación relativa
Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento . . . . 205
Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206
Flujo de trabajo QuickStart (Inicio rápido) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207
Flujo de trabajo de molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
Flujo de trabajo de exportación/importación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211

Glosario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213

Índice. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 227

vi Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Prólogo

Cómo utilizar esta guía

Finalidad de esta En esta guía, se explica cómo realizar experimentos de curva estándar relativa y CT
guía (∆∆CT) en Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System (sistema StepOne™).
Esta guía sirve de:
• Tutorial, utilizando los datos de los experimentos de ejemplo que se incluyen en
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software (software
StepOne™).
• Guía para realizar sus propios experimentos.

Público Esta guía está destinada al personal de laboratorio y a los investigadores que realizan
experimentos de cuantificación relativa con el sistema StepOne.

Suposiciones En esta guía, se asume que el usuario:

• Está familiarizado con el sistema operativo Microsoft Windows® XP.
• Está familiarizado con Internet y los navegadores de Internet.
• Sabe cómo manejar muestras de DNA y/o RNA y prepararlas para la PCR.
• Sabe almacenar datos, transferir archivos y copiar y pegar.
• Tiene experiencia con redes si tiene pensado integrar el sistema StepOne en el flujo
de datos existente de su laboratorio.

Convenciones del En esta guía, se utilizan las siguientes convenciones:

texto • El texto en negrita indica una acción del usuario. Por ejemplo:
Escriba 0 y, a continuación, pulse Intro en cada uno de los campos restantes.
• El texto en cursiva señala palabras nuevas o importantes y también se utiliza para
enfatizar algo. Por ejemplo:
Antes de realizar el análisis, prepare siempre una matriz fresca.
• El símbolo de la flecha que apunta a la derecha () separa los comandos sucesivos
que se seleccionan en un menú desplegable o un menú de acceso directo. Por
ejemplo:
Seleccione File (Archivo)Open (Abrir).

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de vii
cuantificación relativa
Prólogo
Cómo obtener más información

Palabras de aviso En la documentación de Applied Biosystems, aparecen dos palabras de aviso para el
para el usuario usuario. Cada palabra implica un nivel concreto de observación o acción, tal y como se
describe a continuación:

Nota: Proporciona información que puede ser interesante o útil, pero no es esencial para
el uso del producto.

¡IMPORTANTE! Proporciona información que es necesaria para poder utilizar el

instrumento correctamente, para poder utilizar un kit de reactivos con precisión o para
poder utilizar un producto químico de manera segura.

A continuación, se muestran algunos ejemplos de palabras de aviso para el usuario:

Nota: La función de calibración también está disponible en la consola de control.

¡IMPORTANTE! Para comprobar la conexión del cliente, necesita un identificador de

usuario válido.

Palabras de aviso En la documentación del usuario, también aparecen palabras de aviso de seguridad. Para
de seguridad obtener más información, consulte “Palabras de aviso de seguridad” en la página xi.

Cómo obtener más información

Documentación El sistema StepOne incluye la siguiente documentación:
relacionada
Núm. ref. Núm. ref.
Documento
inglés español

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting 4376786 4377729

Started Guide for Genotyping Experiments

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting —

Started Guide for Presence/Absence Experiments 4376787

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting 4377742

Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative CT 4376785
Experiments

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting 4376784 4377736

Started Guide for Standard Curve Experiments

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation, 4376782 4377798

Maintenance, and Networking Guide

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation 4376783 4377792

Quick Reference Card

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Site 4376768 4378359

Preparation Guide

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software — —

Help

viii Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Prólogo
Cómo obtener más información

Applied Biosystems puede proporcionarle la siguiente documentación auxiliar:

Número
Documento de
referencia

Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays Application Note 127AP05

Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol 4375575

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation Performance 4376791

Verification Protocol

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation Qualification- 4376790

Operation Qualification Protocol

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Planned Maintenance 4376788

Protocol

Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4334429

Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide 4362460

TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4333458

User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression 4303859

Nota: Para obtener más documentación, consulte “Cómo obtener asistencia técnica” en
la página x.

Obtención de La ayuda del software StepOne describe cómo se utiliza cada función de la interfaz de
información de la usuario. Para acceder a la ayuda desde el software StepOne, realice una de las siguientes
ayuda del acciones:
software • Pulse F1.
• Haga clic en en la barra de herramientas.
• Seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).
Para buscar temas de interés en la ayuda:
• Consulte el índice de contenido.
• Busque un tema específico.
• Busque en un índice alfabético.

Envíenos sus Applied Biosystems agradece sus comentarios y sugerencias para mejorar sus
comentarios documentos de usuario. Puede enviar sus comentarios a la dirección de correo
electrónico:
[email protected]

¡IMPORTANTE! Esta dirección sólo sirve para enviar comentarios y sugerencias en

relación con la documentación. Para solicitar documentos, descargar archivos PDF u
obtener ayuda sobre una cuestión técnica, vaya a www.appliedbiosystems.com y, a
continuación, haga clic en el vínculo Support (Asistencia técnica). (Consulte “Cómo
obtener asistencia técnica” más adelante).

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de ix
cuantificación relativa
Prólogo
Cómo obtener asistencia técnica

Cómo obtener asistencia técnica

Para acceder a los servicios más recientes y obtener información acerca de la asistencia
técnica, vaya a www.appliedbiosystems.com y, a continuación, haga clic en el vínculo
Support (Asistencia técnica).
En la página Support (Asistencia técnica), puede:
• Buscar las preguntas más frecuentes (FAQ)
• Enviar una pregunta directamente al Servicio de asistencia técnica
• Solicitar a Applied Biosystems documentos de usuario, fichas técnicas de solicitud
de materiales (MSDS), certificados de análisis y otros documentos relacionados
• Descargar documentos PDF
• Obtener información acerca de la formación del cliente
• Descargar actualizaciones y parches de software
Asimismo, en la página Support (Asistencia técnica) podrá acceder a los números de
teléfono y fax para ponerse en contacto con el Servicio de asistencia técnica y las
instalaciones de venta de Applied Biosystems en todo el mundo.

¡IMPORTANTE! Cuando se le solicite que lo haga en esta guía o cuando tenga que
programar el mantenimiento del instrumento StepOne™ (por ejemplo, el mantenimiento
anual planificado o la verificación/calibración de la temperatura), póngase en contacto
con el Centro de atención al cliente de Applied Biosystems. Para obtener un número de
teléfono o enviar un mensaje de correo electrónico al centro, visite
http://www.appliedbiosystems.com/support/contact.

x Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Prólogo
Convenciones de seguridad utilizadas en este documento

Convenciones de seguridad utilizadas en este documento

Palabras de aviso En la documentación del usuario de Applied Biosystems, aparecen cuatro palabras de
de seguridad aviso de seguridad en los puntos del documento en los que debe conocer la existencia de
peligros importantes. Cada palabra de aviso (IMPORTANTE, PRECAUCIÓN,
ADVERTENCIA, PELIGRO) implica un nivel de observación o acción particular, tal y
como se explica a continuación.

Definiciones

¡IMPORTANTE! Proporciona información que es necesaria para poder utilizar el

instrumento correctamente, para poder utilizar un kit de reactivos con precisión o para
poder utilizar un producto químico de manera segura.

Indica una situación potencialmente peligrosa que, de no evitarse,

podría causar lesiones leves o moderadas. También puede utilizarse para alertar de
prácticas no seguras.

Indica una situación potencialmente peligrosa que, de no evitarse,

podría causar lesiones graves o mortales.

Indica una situación inminentemente peligrosa que, de no evitarse,

tendrá como resultado lesiones graves o mortales. Esta palabra de aviso se limita a las
situaciones más extremas.

A excepción de los avisos IMPORTANTE, todas las palabras de aviso de seguridad de un

documento de Applied Biosystems aparecen con la figura de un triángulo abierto que
contiene un símbolo de peligro. Estos símbolos de peligro son idénticos a los que se
incorporan en los instrumentos de Applied Biosystems (consulte “Símbolos de
seguridad” en la página xiii).

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de xi
cuantificación relativa
Prólogo
Convenciones de seguridad utilizadas en este documento

Ejemplos

¡IMPORTANTE! Debe crear una hoja de cálculo de entradas de las muestras diferente
para cada placa de 96 pocillos.

PELIGRO QUÍMICO. TaqMan® Universal PCR Master Mix

puede causar irritaciones en la piel y los ojos. Puede provocar molestias si se ingiere o se
inhala. Consulte la ficha técnica de seguridad (MSDS) y siga las instrucciones de
manipulación indicadas. Use protectores oculares, vestimenta protectora y guantes
apropiados.

PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Durante el uso de los

instrumentos, la cubierta caliente y el bloque, se pueden alcanzar temperaturas
superiores a 100 °C.

PELIGRO ELÉCTRICO. La continuidad del circuito de toma a

tierra es vital para la seguridad. Jamás utilice el sistema con el conductor de toma de
tierra desconectado.

xii Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Prólogo
Símbolos en los instrumentos

Símbolos en los instrumentos

Electricidad En la siguiente tabla, se describen los símbolos eléctricos que pueden aparecer en los
Símbolos en los instrumentos de Applied Biosystems.
instrumentos
Símbolo Descripción Símbolo Descripción

Indica la posición On (Encendido) Indica un terminal que puede

del interruptor de encendido estar conectado a la referencia
principal. del retorno de tierra del circuito
de señal de otro instrumento.
Indica la posición Off (Apagado) No es un terminal de tierra
del interruptor de encendido protegido.
principal.
Este símbolo indica que se
Indica un interruptor de espera debe conectar a tierra un
por medio del cual se activa la terminal de toma a tierra de
posición Standby (Espera) en el protección antes de realizar
instrumento. Si este interruptor ninguna otra conexión eléctrica
está en la posición de espera, en el instrumento.
puede haber peligro de tensión.
Indica que un terminal puede
recibir o suministrar tensión o
corriente alterna.

Indica la posición On/Off Indica que un terminal puede

(Encendido/Apagado) de un recibir o suministrar tensión o
interruptor de encendido principal corriente alterna o continua.
de contrafase.

Símbolos de En la siguiente tabla, se describen los símbolos de seguridad que pueden aparecer en los
seguridad instrumentos de Applied Biosystems. Estos símbolos pueden aparecer en solitario o con
un texto que explique el peligro correspondiente (consulte “Etiquetas de seguridad en los
instrumentos” en la página xiv). Estos símbolos de seguridad también pueden aparecer
junto a PELIGROS, ADVERTENCIAS y PRECAUCIONES que se incluyen en el texto
de este o de otros documentos de ayuda de productos.

Símbolo Descripción Símbolo Descripción

Indica que debería consultar el Indica la presencia de piezas

manual para obtener más móviles y recomienda
información y proceder con el proceder con el cuidado
cuidado correspondiente. correspondiente.

Indica la presencia de un
Indica la presencia de una peligro de descarga eléctrica
superficie caliente u otro peligro y recomienda proceder con el
debido a altas temperaturas y cuidado correspondiente.
recomienda proceder con el
cuidado correspondiente. Indica la presencia de un láser
en el interior del instrumento y
recomienda proceder con el
cuidado correspondiente.

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de xiii
cuantificación relativa
Prólogo
Etiquetas de seguridad en los instrumentos

Medio ambiente El siguiente símbolo se aplica a todos los productos eléctricos y electrónicos de
Símbolos en los Applied Biosystems que salieron al mercado europeo después del 13 de agosto de 2005.
instrumentos
Símbolo Descripción

No tire este producto a la basura municipal normal. Cumpla las ordenanzas

municipales sobre residuos correspondientes para reducir el impacto
medioambiental de los residuos de equipos eléctricos y electrónicos (WEEE).
Clientes de la Unión Europea:
Llame a la oficina de atención al cliente local de Applied Biosystems para
informarse sobre la recogida de equipos y el reciclaje. Consulte en
http://www.appliedbiosystems.com un listado de oficinas de atención al cliente
de la Unión Europea.

Etiquetas de seguridad en los instrumentos

Los siguientes símbolos de PRECAUCIÓN, ADVERTENCIA y PELIGRO pueden
aparecer en los instrumentos de Applied Biosystems en combinación con los símbolos
de seguridad que se han descrito en la sección anterior.

Inglés Francés

CAUTION Hazardous chemicals. Read the ATTENTION Produits chimiques dangeureux.

Material Safety Data Sheets (MSDSs) before Lire les fiches techniques de sûreté de
handling. matériels avant la manipulation des produits.

CAUTION Hazardous waste. Refer to ATTENTION Déchets dangereux. Lire les

MSDS(s) and local regulations for handling fiches techniques de sûreté de matériels et la
and disposal. régulation locale associées à la manipulation
et l'élimination des déchets.

CAUTION Hot surface. ATTENTION Surface brûlante.

DANGER High voltage. DANGER Haute tension.

WARNING To reduce the chance of electrical AVERTISSEMENT Pour éviter les risques
shock, do not remove covers that require tool d'électrocution, ne pas retirer les capots dont
access. No user-serviceable parts are inside. l'ouverture nécessite l'utilisation d'outils.
Refer servicing to Applied Biosystems L’instrument ne contient aucune pièce
qualified service personnel. réparable par l’utilisateur. Toute intervention
doit être effectuée par le personnel de service
qualifié de Applied Biosystems.

CAUTION Moving parts. ATTENTION Parties mobiles.

DANGER Class 3B (III) visible and/or invisible DANGER Rayonnement visible ou invisible
LED radiation present when open and d’un faisceau LED de Classe 3B (III) en cas
interlocks defeated. Avoid exposure to beam. d’ouverture et de neutralisation des
dispositifs de sécurité. Evitez toute
exposition au faisceau.

xiv Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Prólogo
Etiquetas de seguridad en los instrumentos

Ubicaciones de El sistema StepOne contiene una advertencia en el lugar que se indica a continuación:
los símbolos de
advertencia

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de xv
cuantificación relativa
Prólogo
Seguridad general del instrumento

Seguridad general del instrumento

PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Si el instrumento se utiliza

de alguna forma que no especifica Applied Biosystems, se pueden producir lesiones
personales o daños en el instrumento.

Movimiento y PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. El instrumento sólo puede

levantamiento del moverlo y colocarlo el personal o el distribuidor que se especifique en la guía de
instrumento preparación del emplazamiento correspondiente. Si decide levantar o mover el
instrumento después de instalarlo, no intente hacerlo sin la ayuda de otras personas, el
equipo de traslado adecuado y las técnicas de elevación correctas. El levantamiento
inapropiado puede causar dolorosas lesiones dorsales, que pueden resultar permanentes.
Dependiendo del peso, se podrían necesitar dos personas para mover o levantar un
instrumento.

Movimiento y No intente levantar o mover el ordenador ni el monitor sin la ayuda

levantamiento de de otras personas. Dependiendo del peso del ordenador y/o el monitor, se podrían
ordenadores y necesitar dos o más personas para moverlos.
monitores
autónomos Aspectos a tener en cuenta antes de levantar el ordenador y/o el monitor:
• Asegúrese de sujetar el ordenador o el monitor de un lugar seguro y cómodo para
levantarlos.
• Asegúrese de que no hay ningún obstáculo entre el lugar en el que se encuentra el
objeto y su lugar de destino.
• No levante un objeto a la vez que gira el torso.
• Mantenga la columna espinal en una posición neutral mientras levanta el objeto con
las piernas.
• Los participantes deben coordinar las labores de levantamiento y movimiento antes
de realizarlas.
• En lugar de levantar el objeto desde la caja del embalaje, incline cuidadosamente la
caja hacia un lado y manténgala fija mientras alguien desliza su contenido hacia
fuera.

Uso del Asegúrese de que todas las personas que utilicen el instrumento:
instrumento • Han recibido instrucciones sobre prácticas de seguridad generales para laboratorios
y prácticas de seguridad generales para el instrumento.
• Lea y comprenda todas las fichas técnicas de seguridad de los materiales (MSDS)
aplicables. Consulte “Acerca de las fichas técnicas de seguridad de los materiales
(MSDS)” en la página xvii.

Limpieza o Antes de utilizar un método de limpieza o descontaminación que no

descontamina- sea el que recomienda el fabricante, consulte al fabricante para comprobar que el método
ción del propuesto no va a dañar el equipo.
instrumento

xvi Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Prólogo
Seguridad química

Seguridad química
Advertencia de PELIGRO QUÍMICO. Antes de manejar algún producto químico,
peligro químico consulte la ficha técnica de seguridad de los materiales (MSDS) que suministra el
fabricante y observe todas las precauciones relevantes.

PELIGRO DE ALMACENAMIENTO QUÍMICO. No recoja ni

almacene nunca los residuos en un envase de cristal, pues corre el riesgo de que se rompa
o se resquebraje. Las botellas de reactivos y de residuos pueden agrietarse y presentar
fugas. Cada botella de residuos deberá asegurarse en un recipiente de seguridad de
polietileno de baja densidad con la tapa fija y las asas bloqueadas en posición vertical.
Utilice la protección ocular, la vestimenta y los guantes adecuados cuando manipule
botellas de reactivos o de residuos.

Directrices de Para reducir al mínimo el peligro de los productos químicos:

seguridad • Lea y comprenda las fichas técnicas de seguridad de los materiales (MSDS) que
química proporciona el fabricante de los productos químicos antes de almacenar, manipular
o trabajar con cualquier producto químico o material peligroso. (Consulte “Acerca
de las fichas técnicas de seguridad de los materiales (MSDS)” en la página xvii.)
• Minimice el contacto con productos químicos. Utilice un equipo adecuado de
protección personal durante la manipulación de productos químicos (por ejemplo,
protectores oculares, guantes o vestimenta protectora). Puede encontrar más normas
de seguridad en las MSDS.
• Minimice la inhalación de productos químicos. No deje abiertos los recipientes de
productos químicos. Utilícelos únicamente con la ventilación adecuada (por
ejemplo, una campana extractora). Puede encontrar más normas de seguridad en las
MSDS.
• Compruebe periódicamente la ausencia de fugas o salpicaduras. Si se produce una
fuga o un derrame, siga los procedimientos de limpieza del fabricante, tal y como se
recomienda en la MSDS.
• Cumpla todas las leyes y normativas locales, estatales/provinciales o nacionales en
materia de almacenamiento, manipulación y eliminación de productos químicos.

Acerca de las Los fabricantes de productos químicos incluyen fichas técnicas de seguridad de los
fichas técnicas de materiales (MSDS) con los productos químicos peligrosos que envían a sus clientes
seguridad de los nuevos. También incluyen MSDS con el primer envío de un producto químico peligroso
materiales a un cliente después de que esa MSDS se haya actualizado. En las MSDS, encontrará la
(MSDS) información de seguridad necesaria para almacenar, manipular, transportar y desechar
los productos químicos de forma segura.
Cada vez que reciba una MSDS nueva con un producto químico peligroso, no se olvide
de reemplazar la MSDS correspondiente en sus archivos.

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de xvii
cuantificación relativa
Prólogo
Seguridad química

Obtención Las MSDS de cualquier producto químico de Applied Biosystems están a su disposición
de MSDS de manera gratuita las 24 horas del día. Para obtener MSDS:

1. Vaya a https://docs.appliedbiosystems.com/msdssearch.html

2. En el campo de búsqueda de la página de búsqueda de MSDS:

a. Escriba el nombre del producto químico, el número de serie u otra información
de interés que espere que aparezca en la MSDS.
b. Seleccione el idioma que desee.

c. Haga clic en Search (Buscar).

3. Para ver, descargar o imprimir el documento que le interesa:

a. Haga clic con el botón derecho en el título del documento.

b. Seleccione:
• Open (Abrir): para ver el documento.
• Save Target As (Guardar destino como): para descargar una versión PDF
del documento en el destino que seleccione.
• Print Target (Imprimir destino): para imprimir el documento.

4. Para enviar una copia de una MSDS por fax o correo electrónico, en la página de
resultados de la búsqueda:
a. Seleccione Fax o Email bajo el título del documento.

b. Haga clic en RETRIEVE DOCUMENTS (Recuperar documentos) al final de

la lista de documentos.
c. Introduzca la información requerida.

d. Haga clic en View/Deliver Selected Documents Now (Ver/enviar ahora los

documentos seleccionados).

Nota: Para obtener las MSDS de productos químicos que no distribuye

Applied Biosystems, póngase en contacto con el fabricante del producto químico.

xviii Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Prólogo
Seguridad de residuos químicos

Seguridad de residuos químicos

Peligro de RESIDUOS PELIGROSOS. Para obtener información acerca de su
residuos químicos manipulación y eliminación, consulte las fichas técnicas de seguridad de los materiales y
las normativas locales.

PELIGRO DE RESIDUOS QUÍMICOS. Los residuos producidos

por los instrumentos de Applied Biosystems son potencialmente peligrosos y pueden
causar lesiones, enfermedades o la muerte.

PELIGRO DE ALMACENAMIENTO QUÍMICO. No recoja ni

almacene nunca los residuos en un envase de cristal, pues corre el riesgo de que se rompa
o se resquebraje. Las botellas de reactivos y de residuos pueden agrietarse y presentar
fugas. Cada botella de residuos deberá asegurarse en un recipiente de seguridad de
polietileno de baja densidad con la tapa fija y las asas bloqueadas en posición vertical.
Utilice la protección ocular, la vestimenta y los guantes adecuados cuando manipule
botellas de reactivos o de residuos.

Directrices de Para reducir al mínimo el peligro de los residuos químicos:

seguridad de • Lea y comprenda las fichas técnicas de seguridad de los materiales (MSDS)
residuos químicos proporcionadas por los fabricantes de los productos químicos en el recipiente de
residuos antes de almacenar, manipular o eliminar los residuos químicos.
• Disponga de contenedores de residuos principales y secundarios. (Los contenedores
principales contienen los residuos inmediatos. Los contenedores secundarios
contienen cualquier derrame o fuga del contenedor principal. Ambos contenedores
deben ser compatibles con el material de residuo y deben cumplir los requisitos
federales, estatales y locales sobre el almacenamiento en contenedores).
• Minimice el contacto con productos químicos. Utilice un equipo adecuado de
protección personal durante la manipulación de productos químicos (por ejemplo,
protectores oculares, guantes o vestimenta protectora). Puede encontrar más normas
de seguridad en las MSDS.
• Minimice la inhalación de productos químicos. No deje abiertos los recipientes de
productos químicos. Utilícelos únicamente con la ventilación adecuada (por
ejemplo, una campana extractora). Puede encontrar más normas de seguridad en las
MSDS.
• Manipule los residuos químicos bajo una campana extractora.
• Después de vaciar el recipiente de residuos, ciérrelo bien con la tapa suministrada.
• Elimine el contenido de la bandeja de residuos y de la botella de residuos conforme
a las buenas prácticas de laboratorio y a la normativa local, estatal/provincial o
nacional en materia de medio ambiente y salud.

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de xix
cuantificación relativa
Prólogo
Seguridad eléctrica

Eliminación de Si se generan residuos potencialmente peligrosos al utilizar el instrumento, debe:

residuos • Identificar (mediante análisis, si es necesario) los residuos generados por las
aplicaciones, los reactivos y los sustratos utilizados en su laboratorio.
• Garantizar la salud y la seguridad de todo el personal de su laboratorio.
• Garantizar que los residuos producidos por el instrumento se almacenan,
transfieren, transportan y eliminan de acuerdo con todas las normativas locales,
estatales/provinciales y/o nacionales.

¡IMPORTANTE! Los materiales radiactivos o que impliquen un peligro biológico pueden

requerir una manipulación especial, pudiéndose aplicar limitaciones en materia de
eliminación.

Seguridad eléctrica

PELIGRO DE DESCARGA ELÉCTRICA. Se puede producir una

descarga eléctrica grave si se utiliza el sistema StepOne sin haber colocado los paneles
del instrumento. No quite los paneles del instrumentos. Los contactos de alta tensión
quedan expuestos al quitar estos paneles del instrumento.

Fusibles PELIGRO DE INCENDIO. El uso de fusibles o de una fuente de

alimentación de alta tensión incorrectos puede dañar el sistema de cableado del
instrumento y provocar un incendio. Antes de encender el instrumento, compruebe que
los fusibles están bien instalados y que la tensión del instrumento se corresponde con la
fuente de alimentación del laboratorio.

PELIGRO DE INCENDIO. Para protegerse contra el riesgo de

incendio, sólo cambie los fusibles por otros que sean del tipo y la potencia que se
especifica para el instrumento.

Alimentación PELIGRO ELÉCTRICO. La continuidad del circuito de toma de

eléctrica tierra es vital para la seguridad del equipo. Jamás utilice el equipo con el conductor de
toma de tierra desconectado.

PELIGRO ELÉCTRICO. Utilice cordones eléctricos certificados y

bien configurados para el suministro eléctrico de la instalación.

PELIGRO ELÉCTRICO. Enchufe el sistema a una toma eléctrica

que tenga una toma de tierra adecuada y la capacidad de corriente apropiada.

Potencia de El sistema StepOne se incluye en la categoría II (de sobretensión) de las instalaciones y

sobretensión está clasificado como un equipo portátil.

xx Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Prólogo
Seguridad de los LED

Seguridad de los LED

Para garantizar un funcionamiento seguro de los LED:
• Un representante de Applied Biosystems debe realizar el mantenimiento del
sistema.
• Todos los paneles del instrumentos deben estar colocados en el instrumento
mientras éste está en funcionamiento. Cuando todos los paneles están instalados, no
se detecta ninguna radiación. Si se quita algún panel cuando el LED está en
funcionamiento (durante una reparación con los interbloqueos de seguridad
desactivados), podría exponerse a emisiones LED superiores a la potencia de la
clase 3B.
• No quite las etiquetas de seguridad ni desactive los interbloqueos de seguridad.

Seguridad biológica
Peligro biológico PELIGRO BIOLÓGICO. Las muestras biológicas como, por
general ejemplo, de tejidos, fluidos corporales, agentes infecciosos y sangre humana o de otros
animales, pueden transmitir enfermedades infecciosas. Siga todas las normativas locales,
estatales/provinciales y/o nacionales aplicables. Lleve el equipo de protección adecuado,
lo que incluye, entre otras cosas: protección ocular, protección facial, vestimenta/bata de
laboratorio y guantes. Todo el trabajo se debe realizar en instalaciones que dispongan del
equipamiento adecuado y con el equipo de seguridad apropiado (por ejemplo,
dispositivos de contención física). Los trabajadores deberían recibir formación de
acuerdo con los requisitos de la institución o empresa y los requisitos legales aplicables
antes de trabajar con materiales potencialmente infecciosos. Lea y siga las directrices y/o
los requisitos legales aplicables en:
• Las directrices del Departamento de Salud y Servicios Humanos (Department of
Health and Human Services) de EE.UU. publicadas en Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories (nº 017-040-00547-4; http://bmbl.od.nih.gov)
• Occupational Safety and Health Standards, Bloodborne Pathogens (29
CFR§1910.1030; http://www.access.gpo.gov/ nara/cfr/waisidx_01/
29cfr1910a_01.html).
• Los protocolos del programa de seguridad biológica de su empresa o institución
para trabajar o manipular materiales potencialmente infecciosos.
Puede encontrar más información acerca de las directrices sobre peligros biológicos en:
http://www.cdc.gov

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de xxi
cuantificación relativa
Prólogo
Seguridad de la estación de trabajo

Seguridad de la estación de trabajo

Si configura correctamente la ergonomía de su estación de trabajo, puede reducir o evitar
problemas de fatiga, dolor y tensión. Para minimizar o eliminar estos problemas,
configure la estación de trabajo para adoptar posiciones neutrales o relajadas cuando esté
trabajando.

PELIGRO MUSCULOESQUELÉTICO Y POR

MOVIMIENTOS REPETITIVOS. Estos peligros están causados por posibles factores
de riesgo, incluidos, entre otros, movimientos repetitivos, posturas incómodas, esfuerzos,
mantenimiento de posturas estáticas poco saludables, presión por contacto y otros
factores medioambientales de la estación de trabajo.

Para minimizar los riesgos musculoesqueléticos y por movimientos repetitivos:

• Utilice equipos en los que pueda colocarse cómodamente en posiciones neutrales y
que permitan acceder de manera adecuada al teclado, el monitor y el ratón.
• Coloque el teclado, el ratón y el monitor de forma que pueda adoptar una postura
relajada de la cabeza y el cuerpo.

xxii Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Prólogo
Estándares de seguridad y compatibilidad electromagnética (EMC)

Estándares de seguridad y compatibilidad electromagnética

(EMC)
Estándares de El sistema StepOne ha sido probado y cumple el estándar:
seguridad de
UL 61010A-1/CAN/CSA C22.2 No. 1010.1-92, “Requisitos de seguridad de equipos
EE.UU.
eléctricos para la medición, el control y el uso en laboratorios, Primera parte: Requisitos
y Canadá
Generales”.
UL 61010A-2-010/CAN/CSA 1010.2.010, “Requisitos particulares de equipos de
laboratorio para el calentamiento de materiales”.
“Estándar de rendimiento 21 CFR 1040.10 y 1040.11 de la Ley de control de radiaciones
para la salud y la seguridad de 1968” de la FDA, de la forma que sea aplicable.

Estándar EMC Este instrumento ha sido probado y cumple la edición 3 del estándar ICES-001:
canadiense “Generadores de frecuencias de radio industriales, científicas y médicas”.

Estándares de Seguridad
seguridad y EMC Este instrumento cumple los requisitos de seguridad europeos (Directiva de baja tensión
europeos 73/23/EEC). Este instrumento ha sido probado y cumple los estándares EN 61010-
1:2001, “Requisitos de seguridad de equipos eléctricos para la medición, el control y el
uso en laboratorios, Primera parte: Requisitos Generales”.
EN 61010-2-010, “Requisitos particulares de equipos de laboratorio para el
calentamiento de materiales”.
EN 61010-2-081, “Requisitos particulares para equipos de laboratorio automáticos y
semiautomáticos para análisis y otras finalidades”.
EN 60825-1, “Seguridad frente a las radiaciones de los productos láser, clasificación de
los equipos, requisitos y guía del usuario”.

EMC
Este instrumento cumple los requisitos de emisiones e inmunidad europeos (Directiva
EMC 89/336/EEC). Este instrumento ha sido probado y cumple los estándares
EN 61326 (Grupo 1, Clase B) “Equipos eléctricos para la medición, el control y el uso
en laboratorios: requisitos EMC”.

Estándares EMC Este instrumento ha sido probado y cumple el estándar AS/NZS 2064, “Medición de
australianos límites y métodos de características de perturbaciones electromagnéticas de equipos de
radiofrecuencia industriales, científicos y médicos (ISM)”.

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de xxiii
cuantificación relativa
Prólogo
Estándares de seguridad y compatibilidad electromagnética (EMC)

xxiv Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 1

Introducción

Este capítulo cubre los siguientes temas:

■ Acerca del sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
■ Acerca de los experimentos de cuantificación relativa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
■ Cómo utilizar esta guía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
■ Acerca del experimento de ejemplo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
■ Flujo de trabajo del experimento de ejemplo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en
esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o
seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 1
cuantificación relativa
 Capítulo 1 Introducción
Acerca del sistema StepOne™

Acerca del sistema StepOne™

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System (sistema StepOne™) utiliza
reactivos de reacción en cadena de polimerasa (PCR) basados en fluorescencias para
proporcionar:
• Detección cuantitativa de las secuencias de ácidos nucléicos de interés (dianas)
mediante análisis a tiempo real.
• Detección cualitativa de secuencias de ácidos nucléicos de interés (dianas) mediante
análisis de punto final y curva de disociación.

Acerca de la El sistema StepOne recoge datos de fluorescencia brutos en diferentes puntos de una
recogida de PCR, dependiendo del tipo de reacción que realice:
datos
Tipo de proceso Punto de recogida de datos

Procesos a Curva estándar El instrumento recoge datos después de cada paso

tiempo real de extensión de la PCR.
Curva estándar
relativa

CT comparativos
(∆∆CT)

Procesos a Genotipado El instrumento recoge datos antes y después de la

punto final PCR. En los experimentos de genotipado, el software
StepOne™ también puede recoger datos durante la
reacción (tiempo real), que pueden resultar de ayuda
para solucionar problemas.

Presencia/ausencia El instrumento recoge datos antes y después de la

PCR.

Con independencia del tipo de reacción que se realice, un punto de recogida de datos o
una lectura consta de tres fases:

1. Excitación: el instrumento StepOne™ ilumina todos los pocillos de la placa de

reacción para excitar los fluorocromos correspondientes.

2. Emisión: la óptica del instrumento StepOne recoge la fluorescencia residual emitida

en todos los pocillos de la placa de reacción. La imagen resultante captada por el
dispositivo sólo consta de la luz emitida en un estrecho rango de longitudes de onda.

3. Recogida: el instrumento StepOne crea una representación digital de la

fluorescencia residual recogida en un intervalo fijo de tiempo. El software StepOne
almacena el dato bruto de la imagen fluorescente para analizarlo. Si fuera necesario,
el software realizaría lecturas adicionales si lo requirieran los reactivos fluorescentes
utilizados en el experimento.
Después de una reacción, el software StepOne utiliza datos de calibración (espacial,
espectral y de ruido de fondo) para determinar la ubicación y la intensidad de las señales
fluorescentes en cada lectura, el fluorocromo asociado a cada señal fluorescente y el
significado de la señal.

Notas

2 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 1 Introducción
Acerca del sistema StepOne™

Consumibles El sistema StepOne admite los consumibles que se enumeran a continuación. Estos
admitidos consumibles se utilizan tanto para reacciones en modo estándar como en modo rápido.

Número de
Consumible
referencia

• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates • 4375816

• MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film • 4375323

• MicroAmp™ Fast 8-Tube Strips • 4358293

• MicroAmp™ Optical 8-Cap Strips • 4323032

• MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps • 4358297

• MicroAmp™ Fast 48-Well Trays • 4375282

• MicroAmp™ 48-Well Base Adaptor • 4375284
• MicroAmp™ Splash Free 96-Well Base • 4312063

D
F
G E

B B
A
A

C C C

# Consumible

A MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate

B MicroAmp™ Fast 48-Well Tray
C MicroAmp™ Splash Free 96-Well Base
D MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip
E MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip
F MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps
G MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 3
cuantificación relativa
 Capítulo 1 Introducción
Acerca de los experimentos de cuantificación relativa

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • El sistema StepOne, consulte Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
Software Help.

Nota: Para acceder a la ayuda, seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de

StepOne) desde el software StepOne.

• Experimentos de cuantificación absoluta, consulte Guía de introducción a Applied

Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de curva estándar.
• Experimentos de genotipado, consulte Guía de introducción a Applied Biosystems
StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de genotipado.
• Experimentos de presencia/ausencia, consulte Applied Biosystems StepOne™ Real-
Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments.

Acerca de los experimentos de cuantificación relativa

Experimentos de Los experimentos de cuantificación relativa son experimentos de PCR a tiempo real. En
PCR a tiempo los experimentos de PCR a tiempo real:
real • El instrumento monitoriza el progreso de la PCR mientras se produce (Kwok y
Higuchi, 1989).
• Se recogen datos durante la reacción de PCR.
• Las reacciones se caracterizan por el ciclo en el que se detecta por primera vez la
amplificación de un gen diana (Saiki et al., 1985).

Nota: En esta guía, el término experimento se refiere a todo el proceso del experimento,
desde su diseño hasta el análisis de los datos.

Acerca de los Los experimentos de curva estándar relativa determinan el cambio de expresión de un
experimentos de gen diana en una muestra en relación con el mismo gen en una muestra de referencia.
curva estándar Para conseguir los resultados, se utiliza una curva estándar construida a partir de una
relativa dilución seriada de una muestra de concentración conocida.
Los experimentos de curva estándar relativa se suelen utilizar para:
• Comparar niveles de expresión de un gen en diferentes tejidos.
• Comparar los niveles de expresión de un gen en una muestra tratada y en una
muestra no tratada.
• Comparar los niveles de expresión de alelos de tipo salvaje y alelos mutados.

Componentes
Estos son los componentes que se necesitan para preparar las reacciones de PCR para los
experimentos de curva estándar relativa:
• Muestra: la muestra en la que la cantidad del gen diana es desconocida.

Notas

4 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 1 Introducción
Acerca de los experimentos de cuantificación relativa

• Muestra de referencia: la muestra utilizada como referencia para los resultados de

la comparación. Por ejemplo, en un estudio sobre los efectos de las drogas en la
expresión génica, un control no tratado sería una muestra de referencia apropiada.
• Estándar: una muestra de concentración conocida.
• Dilución seriada: un conjunto de diluciones del estándar (por ejemplo, 1:2, 1:4, 1:8,
1:16, 1:32) que se utilizan para construir una curva estándar. En todas las muestras,
la cantidad del gen diana se determina realizando una interpolación a partir de la
curva estándar y luego dividiendo por la cantidad del gen diana de la muestra de
referencia. Dado que la muestra de referencia es la muestra 1✕, todas las demás
cantidades se expresan como una diferencia multiplicada por n relativa a ella.
Asimismo, la unidad de la curva estándar se cancela porque la cantidad de muestra
se divide por la cantidad de muestra de referencia. Por consiguiente, lo único que se
necesita de los estándares es conocer sus diluciones relativas. Por lo tanto, se puede
utilizar cualquier cDNA, RNA o DNA de la solución de partida que contenga el gen
diana apropiado para preparar los estándares.
• Control endógeno: un gen presente en un nivel de expresión uniforme en todas las
muestras. El control endógeno sirve para normalizar posibles variaciones de la
cantidad de cDNA que se añade a cada reacción que se producen a consecuencia de
imprecisiones en el pipeteo.
• Réplicas: reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes idénticos.
• Controles negativos: muestras que contienen agua o tampón en lugar de un molde.
En los controles negativos no debería haber amplificación.

Acerca de los Los experimentos de CT comparativos (∆∆CT) determinan el cambio de expresión de un

experimentos de gen diana en una muestra en relación con el mismo gen en una muestra de referencia.
CT comparativos Para obtener los resultados, se utilizan fórmulas aritméticas.
Los experimentos de CT comparativos se suelen utilizar para:
• Comparar niveles de expresión de un gen en diferentes tejidos.
• Comparar los niveles de expresión de un gen en una muestra tratada y en una
muestra no tratada.
• Comparar los niveles de expresión de alelos de tipo salvaje y alelos mutados.

Componentes
Estos son los componentes que se necesitan para preparar las reacciones de PCR para los
experimentos de CT comparativos:
• Muestra: la muestra en la que la cantidad del gen diana es desconocida.
• Muestra de referencia: la muestra utilizada como referencia para los resultados de
la comparación. Por ejemplo, en un estudio sobre los efectos de las drogas en la
expresión de los genes, un control no tratado sería una muestra de referencia
apropiada.
• Control endógeno: un gen presente en un nivel de expresión uniforme en todas las
muestras. El control endógeno sirve para normalizar posibles variaciones de la
cantidad de cDNA que se añade a cada reacción que se producen a consecuencia de
imprecisiones en el pipeteo.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 5
cuantificación relativa
 Capítulo 1 Introducción
Acerca de los experimentos de cuantificación relativa

• Réplicas: reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes idénticos.

• Controles negativos: muestras que contienen agua o tampón en lugar de un molde.
En los controles negativos no debería haber amplificación.

Experimentos de Tenga en cuenta lo siguiente a la hora de elegir entre experimentos de curva estándar
curva estándar relativa y experimentos de CT comparativos:
relativa y
experimentos de
CT comparativos

Tipo de
Descripción Ventaja Limitación
experimento

Curva estándar Se utiliza una curva estándar Es el experimento que requiere Se debe crear una curva
relativa para determinar el cambio de menos validación, porque las estándar para cada gen diana, lo
expresión de un gen diana en eficiencias de PCR del gen diana que exige más reactivos y más
una muestra en relación con el y el control endógeno no tienen espacio en la placa de reacción.
mismo gen diana en una que ser equivalentes.
muestra de referencia. Es ideal
para los ensayos que tienen una
eficiencia de PCR por debajo de
la óptima.

CT Se utilizan fórmulas aritméticas • Los niveles relativos de • Los ensayos que no son
comparativos para determinar el cambio de expresión de un gen diana en óptimos (con una eficiencia
(∆∆CT) expresión de un gen diana en las muestras se pueden de PCR baja) pueden
una muestra en relación con el determinar sin utilizar una producir resultados
mismo gen diana en una curva estándar, siempre que imprecisos.
muestra de referencia. Es ideal las eficiencias de PCR del • Antes de utilizar el método de
para analizar la expresión gen diana y el control CT comparativos, Applied
relativa de muchos genes de endógeno sean relativamente Biosystems recomienda
interés en un gran número de equivalentes. determinar si las eficiencias
muestras. • Menor uso de reactivos. de PCR del ensayo diana y el
• Más espacio disponible en la ensayo de control endógeno
placa de reacción. son aproximadamente
iguales.

Opciones de la Al realizar una PCR a tiempo real, puede elegir entre:

PCR • PCR en singleplex y en multiplex (más abajo)
y
• RT-PCR de 1 y 2 pasos (página 7)

Notas

6 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 1 Introducción
Acerca de los experimentos de cuantificación relativa

PCR en singleplex y PCR en multiplex

Se puede realizar una reacción de PCR como una:
• Reacción en singleplex, donde sólo hay un ensayo en el tubo de reacción o pocillo.
Sólo se puede amplificar un gen diana o un control endógeno por reacción.
o
• Reacción en multiplex, donde hay dos o más ensayos en el tubo de reacción o
pocillo. Cada conjunto amplifica un gen diana o un control endógeno específicos.

¡IMPORTANTE! No se pueden utilizar reactivos SYBR® Green para las reacciones

en multiplex.

Conjunto de cebadores de gen diana

Conjunto de cebadores
de control endógeno
cDNA
PCR en singleplex PCR en multiplex
GR2331

RT-PCR de 1 y de 2 pasos
Se puede realizar una retrotranscripción (RT) y una PCR en una sola reacción (1 paso) o
en reacciones distintas (2 pasos). Los reactivos que se utilicen dependerán de si va a
realizar una RT-PCR de 1 o de 2 pasos:
• En las RT-PCR de 1 paso, la RT y la PCR se producen en un sistema de tampón, que
permite disponer de un solo tubo para la amplificación de la RT y la PCR. Sin
embargo, no se puede utilizar una mezcla maestra de PCR rápida ni la enzima de
prevención de contaminación cruzada, AmpErase® UNG (uracil-N-glucosilasa),
para realizar la RT-PCR de 1 paso.
• La RT-PCR de 2 pasos se realiza en dos reacciones distintas: En primer lugar, el
RNA total se retrotranscribe a cDNA y, a continuación, el cDNA se amplifica por
medio de la PCR. Este método es útil para generar un pool de cDNAs o para
almacenar alícuotas de cDNA y utilizarlas posteriormente. La enzima AmpErase®
UNG se puede utilizar para evitar la contaminación cruzada.

Nota: Para obtener más información acerca de AmpErase® UNG, consulte la Guía de
reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 7
cuantificación relativa
 Capítulo 1 Introducción
Acerca de los experimentos de cuantificación relativa

Reactivos Reactivos TaqMan® y SYBR® Green

Applied Biosystems ofrece reactivos TaqMan® y SYBR® Green para utilizarlos en el
sistema StepOne. Ambos tipos de reactivos se describen brevemente en la siguiente tabla.

Tipo de reactivo Proceso

Reactivos o kits TaqMan® PCR y detección de cDNA

a. Componentes del ensayo
Descripción MGB
Sonda Cebador reverso
F Q
Los reactivos TaqMan utilizan una sonda Cebador directo

fluorogénica para permitir la detección de un 3'

Molde de cDNA
5'

producto de PCR específico cuando se cDNA

acumula durante los ciclos de PCR. 3' 5'

Ventajas b. Molde desnaturalizado e hibridación de los componentes del ensayo Leyenda

3' 5'
• Aumenta la especificidad con una sonda. La Cebador reverso
RP Cebador aleatorio

hibridación específica entre la sonda y el Sonda

MGB
F Fluorocromo
FAM™
gen diana genera una señal de Cebador directo
F Q
Q Apantallador
fluorescencia.
MGB Ligando de unión
• Permite el trabajo en multiplex. 3' 5' al surco menor

• Hay disponibles ensayos optimizados. c. Generación de señal AmpliTaq Gold ®

DNA Polymerase
3' 5'

• Permite realizar ensayos de 5′ nucleasas Sonda

durante la PCR. F
Cebador reverso
Cebador
Cebador directo MGB
• Se puede utilizar para la RT-PCR de 1 o 2 5'
Q
3'
Molde

pasos. 3' 5' Cebador extendido

Reactivos SYBR® Green Paso 1: Configuración de la reacción

Descripción El fluorocromo SYBR® Green I emite
una fluorescencia cuando se une
Los reactivos SYBR Green utilizan el a DNA de doble cadena.
fluorocromo SYBR® Green I, que se une a DNA
de doble cadena y permite detectar productos Paso 2: Desnaturalización
de PCR cuando se acumulan durante los ciclos Cuando el DNA se desnaturaliza,
de la reacción. se libera el fluorocromo SYBR® Green
I y la fluorescencia disminuye
Ventajas considerablemente.
• Económico (no se necesita una sonda). CEBADOR
DIRECTO Paso 3: Polimerización
• Permite que los análisis de curvas de fusión Durante la extensión, los cebadores
midan la Tm de todos los productos de se hibridan y se genera el producto
PCR. de PCR.
CEBADOR

• Se puede utilizar para la RT-PCR de 1 o 2 REVERSO

pasos.
Paso 4: Polimerización completada
Limitaciones El fluorocromo SYBR® Green I se une
Se une de manera no específica a todas las al producto bicatenario, lo que
produce un aumento neto de
secuencias de DNA de doble cadena. Para
la fluorescencia que detecta
evitar señales positivas falsas, compruebe la el instrumento.
formación de un producto no específico
utilizando un gel de agarosa o las curvas de
fusión.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso de fluorocromo TAMRA™

como notificador o apantallador en el sistema StepOne™.

Notas

8 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 1 Introducción
Cómo utilizar esta guía

Otros reactivos
Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema StepOne, pero
se debe tener en cuenta lo siguiente:
• El software StepOne calcula automáticamente los volúmenes de reacción de los
reactivos TaqMan y SYBR Green, pero no lo hace con otros reactivos.
• Se debe diseñar el experimento con el flujo de trabajo Advanced Setup
(Configuración avanzada), en lugar de con el asistente de diseño. (Consulte “Flujo
de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)” en la página 206.)

Para obtener más Para obtener más información acerca de los experimentos de PCR a tiempo real, las
información opciones de PCR y los reactivos, consulte la Guía de reactivos de Applied Biosystems
StepOne™ Real-Time PCR System.

Cómo utilizar esta guía

Esta guía sirve a la vez de tutorial y de guía para realizar sus propios experimentos.

Uso de esta guía Si emplea los datos de los experimentos de ejemplo que se incluyen con el software
como tutorial StepOne, esta guía le puede servir de tutorial para realizar un experimento de curva
estándar relativa o CT comparativos en el sistema StepOne. Siga los procedimientos que
se indican en los capítulos correspondientes:

Capítulo
Procedimiento
Curva estándar CT
relativa comparativos

2 6 Diseñe el experimento con el asistente de diseño del

software StepOne.

3 7 Prepare el experimento con los reactivos y los

volúmenes que ha calculado el asistente de diseño en
el capítulo 2 (experimento de curva estándar relativa) o
en el capítulo 6 (experimento de CT comparativos).

4 8 Realice el experimento en el instrumento StepOne

(disposición autónoma o conectada).

5 9 Analice los resultados.

Para obtener más información, consulte “Acerca del experimento de ejemplo” en la

página 10.

Uso de esta guía Después de realizar los ejercicios del tutorial de los capítulos 2 a 9, esta guía le puede
con sus propios servir para guiarle por el flujo de trabajo del asistente de diseño para realizar sus propios
experimentos experimentos de curva estándar relativa o CT comparativos. Cada uno de los
procedimientos de los capítulos 2 - 9 contiene un conjunto de directrices que ofrecen
información acerca de cómo realizar sus propios experimentos.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 9
cuantificación relativa
 Capítulo 1 Introducción
Acerca del experimento de ejemplo

Asimismo, puede utilizar cualquiera de los otros flujos de trabajo que se incluyen en el
software StepOne para realizar sus experimentos. En la siguiente tabla, se ofrece un
resumen de todos los flujos de trabajo disponibles en el software StepOne.

Flujo de
Descripción Véase...
trabajo

Design Wizard Escriba los parámetros del experimento mientras el Capítulo 2 o

(Asistente de asistente le guía por los procedimientos óptimos. Capítulo 6
diseño)

Advanced Configure un experimento nuevo basándose en su propio página 206

Setup criterio. Da flexibilidad de diseño a los usuarios
(Configuración experimentados.
avanzada)

QuickStart Realice un experimento nuevo sin introducir información página 207

(Inicio rápido) de la configuración de la placa.

Molde Configure un experimento nuevo utilizando la información página 208

de configuración de un molde anterior.

Exportación/ Importe diseños de experimentos desde archivos de texto página 209

importación ASCII que contienen información de configuración de los
experimentos.

Acerca del experimento de ejemplo

Para ilustrar cómo se realizan los experimentos de curva estándar relativa y CT
comparativos, esta guía le conduce a través del proceso de diseño, preparación,
procesamiento y análisis de un experimento de ejemplo. El experimento de ejemplo
representa una configuración típica que puede utilizar para familiarizarse rápidamente
con el sistema StepOne.

Descripción del El objetivo del experimento de curva estándar relativa de ejemplo es comparar la
experimento de expresión del factor de transcripción c-myc (una oncoproteína que activa la transcripción
curva estándar de los genes asociados al crecimiento) en los tejidos de hígado y riñón.
relativa de
En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:
ejemplo
• Las muestras son cDNA preparados a partir de RNA total aislado de hígado y riñón.
• El gen diana es el gen c-myc humano.
• El control endógeno es la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)
humano.
• La muestra de referencia es RNA aislado de riñón.
• Se configura una curva estándar para el gen c-myc (diana). El estándar que se utiliza
para la dilución seriada es una muestra de cDNA de una muestra de concentración
conocida preparada a partir de RNA aislado de pulmón.
• Se configura una curva estándar para el GAPDH (control endógeno). El estándar
que se utiliza para la dilución seriada es una muestra de cDNA de una muestra de
concentración conocida preparada a partir de RNA aislado de pulmón.

Notas

10 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 1 Introducción
Acerca del experimento de ejemplo

• El experimento está diseñado para una PCR en singleplex, donde los ensayos de gen
diana (c-myc) y control endógeno (GAPDH) se amplifican en diferentes pocillos.
• Las reacciones están preparadas para una RT-PCR de 2 pasos. Se utiliza High-
Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para la retrotranscripción y TaqMan®
Fast Universal PCR Master Mix para la PCR.
• Se seleccionan ensayos de la línea de productos Applied Biosystems TaqMan® Gene
Expression Assays:
– Para el ensayo diana (c-myc), el identificador del ensayo es Hs00153408_m1
(RefSeq NM_002467.3).
– Para el ensayo de control endógeno (GAPDH), el identificador del ensayo es
Hs99999905_m1 (RefSeq NM_002046.2).

Disposición de la placa de reacción

A continuación, se muestra la disposición de la placa de reacción del experimento de
curva estándar relativa de ejemplo.

Descripción del El objetivo del experimento de CT comparativos de ejemplo es comparar la expresión de

experimento de TP53 (un factor de transcripción que regula otros genes) en tejidos de hígado, riñón y
CT comparativos cerebro.
de ejemplo
En el experimento de CT comparativos de ejemplo:
• Las muestras son cDNA preparados a partir de RNA total aislado de hígado, riñón y
cerebro.
• El gen diana es TP53.
• La muestra de referencia es del cerebro.
• El control endógeno es GAPDH humano.
• El experimento está diseñado para una PCR en singleplex, donde los ensayos de gen
diana (c-myc) y control endógeno (GAPDH) se amplifican en diferentes pocillos.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 11
cuantificación relativa
 Capítulo 1 Introducción
Flujo de trabajo del experimento de ejemplo

• Las reacciones están preparadas para una RT-PCR de 2 pasos. Se utiliza High-
Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para la retrotranscripción y TaqMan®
Fast Universal PCR Master Mix para la PCR.
• Se seleccionan ensayos de la línea de productos Applied Biosystems TaqMan® Gene
Expression Assays:
– Para el ensayo diana (TP53), el identificador del ensayo es Hs00153340_m1
(RefSeq NM_000546.2).
– Para el ensayo de control endógeno (GAPDH), se utiliza el kit de control
endógeno GAPD (GAPDH) humano (PN 4333764T).

Disposición de la placa de reacción

A continuación, se muestra la disposición de la placa de reacción del experimento de CT
comparativos de ejemplo.

Acerca de los Los archivos de datos de los experimentos de ejemplo se instalan con el software
datos del StepOne. Encontrará los archivos de los experimentos de ejemplo en su ordenador:
experimento de
<unidad>:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments\examples
ejemplo
donde <unidad> es la unidad del disco duro del ordenador en la que está instalado el
software StepOne. La unidad de instalación predeterminada del software es la unidad C.

Flujo de trabajo del experimento de ejemplo

La figura de la página 13 muestra el flujo de trabajo de los experimentos de curva
estándar relativa y CT comparativos.

Notas

12 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 1 Introducción
Flujo de trabajo del experimento de ejemplo

Experimento de curva estándar relativa Experimento de CT comparativos (∆∆CT)

Inicio del experimento Inicio del experimento

Diseño del experimento (Capítulo 2)

Diseño del experimento (Capítulo 6)
1. Cree un nuevo experimento. 1. Cree un nuevo experimento.
2. Defina las propiedades del experimento. 2. Defina las propiedades del experimento.
3. Defina los métodos y los materiales. 3. Defina los métodos y los materiales.
4. Configure los genes diana. 4. Configure los genes diana.
5. Configure los estándares. 5. Configure las muestras.
6. Configure las muestras. 6. Configure la cuantificación relativa.
7. Configure la cuantificación relativa. 7. Configure el protocolo de termociclado.
8. Configure el protocolo de termociclado. 8. Revise la configuración de la reacción.
9. Revise la configuración de la reacción. 9. Solicite materiales para el experimento.
10.Solicite materiales para el experimento. 10.Finalice el flujo de trabajo del asistente de
11.Finalice el flujo de trabajo del asistente de diseño. diseño.

 
Preparación de las reacciones (Capítulo 7)
Preparación de las reacciones (Capítulo 3)
1. Prepare el molde.
1. Prepare el molde.
2. Prepare las diluciones de las muestras.
2. Prepare las diluciones de las muestras.
3. Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo
3. Prepare la dilución seriada. diana.
4. Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana. 4. Prepare la placa de reacción.
5. Prepare la placa de reacción.

 
Realización del experimento (Capítulo 8)
Realización del experimento (Capítulo 4) 1. Prepare la reacción.
1. Prepare la reacción. 2. Active las opciones de notificación.
2. Active las opciones de notificación. 3. Inicie la reacción.
3. Inicie la reacción. 4. Monitorice la reacción.
4. Monitorice la reacción. 5. Descargue el instrumento y transfiera los datos.
5. Descargue el instrumento y transfiera los datos.


Análisis del experimento (Capítulo 5)
Análisis del experimento (Capítulo 9)
Sección 1. Revisión de los resultados:
Sección 1. Revisión de los resultados: 1. Analice.
1. Analice. 2. Revise la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica
de expresión génica) o la tabla de pocillos.
2. Revise la pantalla Standard Curve (Curva estándar).
3. Revise la pantalla Amplification Plot (Gráfica de
3. Revise la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación). amplificación).
4. Revise la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión 4. Presente los datos.
génica) o la tabla de pocillos.
Sección 2. Solución de problemas:
5. Presente los datos.
1. Revise las opciones de análisis; ajuste la línea
Sección 2. Solución de problemas: basal y el umbral.
1. Revise las opciones de análisis; ajuste la línea basal y el 2. Revise la pantalla QC Summary (Resumen QC).
umbral.
3. Omita pocillos.
2. Revise la pantalla QC Summary (Resumen QC).
4. Revise la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica
3. Omita pocillos. multicomponente).
4. Revise la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica 5. Revise la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de
multicomponente). datos brutos).
5. Revise la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos).


Fin del experimento

Fin del experimento

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 13
cuantificación relativa
 Capítulo 1 Introducción
Flujo de trabajo del experimento de ejemplo

Notas

14 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2

Diseño del experimento de curva

estándar relativa
Este capítulo cubre los siguientes temas:
■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
■ Creación de un nuevo experimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
■ Definición de las propiedades del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
■ Definición de los métodos y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
■ Configuración de los genes diana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
■ Configuración de los estándares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
■ Configuración de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
■ Configuración de las opciones de cuantificación relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
■ Configuración del protocolo de termociclado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
■ Revisión de la configuración de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
■ Solicitud de materiales para el experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
■ Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en
esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o
seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 15
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Resumen del capítulo

Resumen del capítulo

En este capítulo, se explica cómo utilizar el asistente de diseño en el software StepOne™
para configurar el experimento de curva estándar relativa de ejemplo. El asistente de
diseño le guiará por los procedimientos óptimos recomendados por Applied Biosystems
a medida que vaya introduciendo los parámetros de diseño del experimento de ejemplo.

Flujo de trabajo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para diseñar el experimento de ejemplo que
del experimento se incluye en esta guía de introducción.
de ejemplo
Nota: Diseñe el experimento de ejemplo con el flujo de trabajo del asistente de diseño
del software StepOne. Cuando diseñe sus propios experimentos, puede seleccionar flujos
de trabajo alternativos (consulte “Uso de esta guía con sus propios experimentos” en la
página 9).

Experimento de curva estándar relativa

Inicio del experimento


Diseño del experimento (Capítulo 2)
1. Cree un nuevo experimento.
2. Defina las propiedades del experimento.
3. Defina los métodos y los materiales.
4. Configure los genes diana.
5. Configure los estándares.
6. Configure las muestras.
7. Configure la cuantificación relativa.
8. Configure el protocolo de termociclado.
9. Revise la configuración de la reacción.
10. Solicite materiales para el experimento.
11. Finalice el flujo de trabajo del asistente de diseño.


Preparación de las reacciones (Capítulo 3)


Realización del experimento (Capítulo 4)


Análisis del experimento (Capítulo 5)


Fin del experimento

Notas

16 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Creación de un nuevo experimento

Creación de un nuevo experimento

Cree un experimento nuevo con el asistente de diseño del software StepOne.

Creación de un 1. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start
experimento (Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied
BiosystemsStepOneStepOne v2.0.

2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Design Wizard (Asistente de

diseño) para abrir el asistente de diseño.

3. Consulte “Elementos del software” más adelante para obtener información acerca
de la navegación por el asistente de diseño.

Elementos del A continuación, se ilustran los elementos del software StepOne para el asistente de
software diseño.

1. Barra de menús: muestra los menús disponibles en el software:

• File (Archivo)
• Edit (Edición)
• Instrument (Instrumento)
• Analysis (Análisis)
• Tools (Herramientas)
• Help (Ayuda)

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 17
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Creación de un nuevo experimento

2. Barra de herramientas: muestra las herramientas disponibles en el software:

• New Experiment (Experimento nuevo)
• Open (Abrir)
• Close (Cerrar)
• Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al instrumento)
• Download Experiment from Instrument (Descargar experimento del
instrumento)

3. Cabecera del experimento: indica el nombre del experimento, el tipo de experimento

y los reactivos del experimento abierto.

4. Panel de navegación: ofrece enlaces a todas las pantallas del asistente de diseño:
• Experiment Properties (Propiedades del experimento)
• Methods & Materials (Métodos y materiales)
• Targets (Dianas)
• Opciones de cuantificación relativa
• Standards (Estándares)
• Samples (Muestras)
• Run Method (Protocolo de termociclado)
• Reaction Setup (Configuración de la reacción)
• Materials List (Lista de materiales)

Nota: Inicialmente, el asistente de diseño muestra el tipo de experimento

Quantitation - Standard Curve (Cuantificación: curva estándar). Las pantallas
disponibles de este asistente pueden cambiar si se selecciona otro tipo de
experimento. Por ejemplo, la pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de
cuantificación relativa) no aparece hasta que se selecciona el tipo de experimento de
curva estándar o CT comparativos (∆∆CT).

Notas

18 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Creación de un nuevo experimento

5. Fichas del experimento: muestra una ficha por cada experimento abierto.

1
2
3

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 19
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Definición de las propiedades del experimento

Definición de las propiedades del experimento

En la pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento), escriba la
información de identificación del experimento y, a continuación, seleccione el tipo de
experimento que desea diseñar.

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

experimento de • El experimento se identifica como un ejemplo.
ejemplo
• Se utiliza una MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate.
• El tipo de experimento es de cuantificación.

Pantalla 1. Haga clic en el campo Experiment Name (Nombre de experimento) y, a

Experiment continuación, escriba Relative Standard Curve Example (Ejemplo de curva
Properties estándar relativa).
(Propiedades de
experimento) Nota: La cabecera del experimento se actualiza con el nombre del experimento que
acaba de escribir.

2. Haga clic en el campo Barcode (Código de barras) y, a continuación, escriba el

código de barras que aparece en la placa de reacción de PCR, si es que dispone de
uno.

3. Haga clic en el campo User Name (Nombre de usuario) y, a continuación, escriba

Example User (Usuario de ejemplo).

4. Haga clic en el campo Comments (Comentarios) y, a continuación, escriba Relative

Standard Curve Getting Started Guide Example (Ejemplo de la guía de
introducción de las curvas estándar relativas).

5. Seleccione Quantitation (Cuantificación) en el tipo de experimento.

6. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Notas

20 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Definición de las propiedades del experimento

1
2
3
4

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

diseño • Escriba un nombre para el experimento que sea descriptivo y fácil de recordar. El
nombre del experimento se utiliza como nombre de archivo predeterminado del
experimento. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Experiment Name
(Nombre de experimento).

Nota: No se pueden utilizar los siguientes caracteres en en campo Experiment

Name (Nombre de experimento): barra inclinada hacia delante (/), barra inclinada
hacia atrás (\), signo mayor que (>), signo menor que (<), asterisco (*), signo de
interrogación (?), comillas ("), línea vertical (|), dos puntos (:) o punto y coma (;).

• Utilice MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates, MicroAmp™ Fast 8-Tube
Strips o MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps. Los consumibles tipo rápido se
pueden utilizar tanto con reactivos de modo rápido como de modo estándar.
• (Opcional) Introduzca el código de barras de la placa de reacción de PCR, si es que
lo tiene. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Barcode (Código de
barras).
• (Opcional) Escriba un nombre de usuario para identificar al propietario del
experimento. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo User Name
(Nombre de usuario).
• (Opcional) Escriba comentarios para describir el experimento. Puede introducir
hasta 1000 caracteres en el campo Comments (Comentarios).
• Seleccione Quantitation (Cuantificación) en el tipo de experimento.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 21
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Definición de los métodos y materiales

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento), acceda a la ayuda
del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.
• Consumibles, consulte “Consumibles admitidos” en la página 3.
• Experimentos de cuantificación, consulte la Guía de reactivos de Applied
Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System.

Definición de los métodos y materiales

En la pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales), seleccione el método de
cuantificación, los reactivos, la velocidad de rampa y el tipo de molde que se van a
utilizar en el experimento.

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

experimento de • Se utiliza el método de cuantificación de curva estándar relativa.
ejemplo
• Se utilizan reactivos TaqMan®.
• Se utiliza la velocidad de rampa rápida en el protocolo de termociclado.
• cDNA (preparado a partir de RNA total aislado de hígado y riñón) es el tipo de
molde. Para obtener el molde de cDNA, primero hay que realizar una
retrotranscripción de RNA para convertir el RNA en cDNA (consulte “Preparación
del molde” en la página 51).

Pantalla Methods 1. Seleccione Relative Standard Curve (Curva estándar relativa) como método de
& Materials cuantificación.
(Métodos y
materiales) 2. Seleccione ensayos TaqMan® para los reactivos.

3. Seleccione Fast (~40 minutes to complete a run) (Rápido (40 minutos

aproximadamente para completar una reacción)) para la velocidad de la rampa.

4. Seleccione cDNA (complementary DNA) (cDNA (DNA complementario)) para el

tipo de molde.

5. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Notas

22 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Definición de los métodos y materiales

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

diseño • Seleccione Relative Standard Curve (Curva estándar relativa) como método de
cuantificación. Los experimentos de curva estándar relativa determinan el cambio
de expresión de un gen diana en una muestra en relación con el mismo gen diana de
una muestra de referencia. Para conseguir los resultados, se utiliza una curva
estándar construida a partir de una dilución seriada de cantidad conocida. Para
configurar la placa de reacción, el método de curva estándar relativa requiere dianas,
estándares, muestras, una muestra de referencia y un control endógeno.
• Seleccione los reactivos que desea utilizar:
– Seleccione Reagents TaqMan® (ensayos TaqMan®) si desea utilizar estos
reactivos para detectar la amplificación y cuantificar la cantidad de gen diana en
las muestras. Los reactivos TaqMan se componen de dos cebadores y una sonda
TaqMan®. Los cebadores están diseñados para amplificar el gen diana. La sonda
TaqMan está diseñada para hibridar en el gen diana y generar una señal de
fluorescencia cuando se amplifica el gen diana.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo

TAMRA™ como notificador o apantallador en el sistema StepOne™.

– Seleccione SYBR® Green Reagents (reactivos SYBR® Green) si desea utilizar

estos reactivos para detectar la amplificación y cuantificar la cantidad de gen
diana en las muestras. Los reactivos SYBR Green se componen de dos cebadores
y un fluorocromo SYBR Green. Los cebadores están diseñados para amplificar el

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 23
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Definición de los métodos y materiales

gen diana. El fluorocromo SYBR Green genera señal de fluorescencia cuando se

une a DNA de doble cadena. El fluorocromo SYBR Green suele formar parte de
la mezcla maestra SYBR Green que se añade a la reacción. Si utiliza el
fluorocromo SYBR Green:
Active la casilla de verificación Include Melt Curve (Incluir curva de
disociación) para realizar un análisis de curva de disociación del gen diana
amplificado.
Seleccione Standard (Estándar) para la velocidad de la rampa. Applied
Biosystems no dispone de una mezcla maestra que funcione en modo rápido para
reactivos SYBR Green.

Nota: Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema

StepOne; sin embargo, debe diseñar su experimento con el flujo de trabajo
Advanced Setup (Configuración avanzada) en lugar de con el asistente de diseño.
Consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)” en la
página 206.

• Seleccione la velocidad de rampa apropiada para el protocolo de termociclado:

– Seleccione Fast (~40 Minutes to Complete a Run) (Rápido (aproximadamente
40 minutos para completar una reacción)) si utiliza reactivos tipo rápido para las
reacciones de PCR.
– Seleccione Standard (~2 Hours to Complete a Run) (Estándar
(aproximadamente 2 horas para completar una reacción)) si utiliza reactivos
estándar para las reacciones de PCR (incluidos reactivos SYBR Green y reactivos
TaqMan estándar).
• Seleccione el molde para la PCR apropiado:
– Seleccione cDNA (complementary DNA) (cDNA (DNA complementario)) si va
a realizar una RT-PCR de 2 pasos y ya ha realizado la retrotranscripción para
convertir el RNA en cDNA. Se añade DNA complementario a las reacciones de
PCR.
– Seleccione RNA si va a realizar una RT-PCR de 1 paso. Se añade el RNA o
mRNA total a las reacciones de PCR.
– Seleccione gDNA (genomic DNA) (gDNA (DNA genómico)) si ya ha extraído el
gDNA de un tejido o una muestra. Se añade DNA genómico purificado a las
reacciones de PCR.

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales), acceda a la ayuda del
software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.
• El uso del método de cuantificación de CT comparativos, consulte los capítulos 6 -9
de esta guía.
• El uso del método de cuantificación de curva estándar, consulte la Guía de
introducción a StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de curva
estándar.
• Los reactivos TaqMan y SYBR Green, consulte la Guía de reactivos de Applied
Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System.

Notas

24 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Configuración de los genes diana

• La PCR, incluida la PCR en singleplex y en multiplex, y la RT - PCR de 1 y de 2

pasos, consulte la Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time
PCR System.

Configuración de los genes diana

En la pantalla Targets (Dianas), escriba el número de genes diana que desea cuantificar
en la placa de reacción de PCR y, a continuación, configure el ensayo para cada gen
diana.

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

experimento de • Se cuantifican dos dianas en la placa de reacción.
ejemplo
• Se activa la casilla de verificación Set Up Standards (Configurar estándares).
Cuando se activa esta casilla de verificación, el software muestra automáticamente
la pantalla Standards (Estándares) después de completar la pantalla Targets
(Dianas). En la pantalla Standards (Estándares), se puede configurar una curva
estándar para cada ensayo diana (consulte “Configuración de los estándares” en la
página 28).
• El ensayo Target 1 (Diana 1) está configurado para el gen diana que se está
estudiando. En el experimento de ejemplo, se trata del gen c-myc humano (una
oncoproteína que activa la transcripción de los genes asociados al crecimiento).
• El ensayo Target 2 (Diana 2) se configura para el control endógeno. Para el
experimento de ejemplo, se trata de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa
(GAPDH) humano. El GAPDH se utiliza como control endógeno, porque sus
niveles de expresión suelen ser relativamente estables.

Pantalla Targets 1. Haga clic en el campo How many targets do you want to quantify in the reaction
(Dianas) plate? (¿Cuántas dianas desea cuantificar en la placa de reacción?) y, a
continuación, escriba 2.

Nota: El número de filas de la tabla de ensayos diana se actualiza con el número

que escriba.

2. Active la casilla de verificación Set Up Standards (Configurar estándares) para

configurar estándares para ambos ensayos diana.

Nota: La casilla de verificación Set Up Standards (Configurar estándares) está

activada de manera predeterminada.

3. Configure el ensayo Target 1 (Diana 1):

a. Haga clic en la celda Enter Target Name (Escriba nombre de gen diana) y, a
continuación, escriba c-myc.
b. En el menú desplegable Reporter (Notificador), seleccione FAM
(predeterminado).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 25
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Configuración de los genes diana

c. En el menú desplegable Quencher (Apantallador), seleccione NFQ-MGB

(predeterminado).
d. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

4. Configure el ensayo Target 2 (Diana 2):

a. Haga clic en la celda Enter Target Name (Escriba nombre de gen diana) y, a
continuación, escriba GAPDH.
b. En el menú desplegable Reporter (Notificador), seleccione FAM
(predeterminado).
c. En el menú desplegable Quencher (Apantallador), seleccione NFQ-MGB
(predeterminado).
d. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

5. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Nota: En todos los genes diana, deje en blanco el campo (Optional) Enter Gene Name
((Opcional) Escriba el nombre del gen). Puede buscar el identificador del gen/ensayo
para solicitar los materiales (consulte “Solicitud de materiales para el experimento” en la
página 43).

2 3
4

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

diseño • Active la casilla de verificación Set Up Standards (Configurar estándares).
Applied Biosystems recomienda configurar una curva estándar para cada ensayo
diana en la placa de reacción.
• Identifique cada ensayo diana con un nombre y un color únicos. Puede introducir
hasta 100 caracteres en el campo Target Name (Nombre de gen diana).

Notas

26 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Configuración de los genes diana

• Seleccione un control endógeno para cada muestra. El control endógeno es un gen

diana que está presente en todas las muestras que se están investigando. Se debería
expresar por igual en todos los tipos de muestras, con independencia del tratamiento
o el origen del tejido (ejemplos de controles endógenos: β-actina, GAPDH y RNA
ribosomal 18S [rRNA 18S]). El control endógeno se utiliza para normalizar los
resultados de la PCR, ya que corrige las variaciones en la cantidad de molde, la
eficiencia de extracción del ácido nucleico, la eficiencia de la retrotranscripción y
los errores de calibración de las pipetas. Tenga en cuenta que:
– Cada tipo de muestra (por ejemplo, cada tejido de un estudio en el que se
comparan múltiples tejidos) requiere un control endógeno.
– Si las muestras están distribuidas en múltiples placas, cada placa debe tener un
control endógeno. Asimismo, cada placa debe incluir un control endógeno para
cada tipo de muestra de la placa.
• Seleccione el fluorocromo del notificador utilizado en el ensayo diana:
– Seleccione FAM si el fluorocromo FAM™ está unido al extremo de 5′ de la sonda
TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana.
– Seleccione JOE si el fluorocromo JOE™ está unido al extremo de 5′ de la sonda
TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana.
– Seleccione VIC si el fluorocromo VIC® está unido al extremo de 5′ de la sonda
TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana.
– Seleccione SYBR si utiliza fluorocromo SYBR® Green para detectar DNA de
doble cadena.
• Seleccione el apantallador utilizado en el ensayo diana:
– Seleccione NFQ-MGB si en el extremo 3′ de a sonda TaqMan que está utilizando
para detectar el gen diana hay unido un apantallador no fluorescente de unión al
surco menor de la doble cadena de DNA.
– Seleccione None (Ninguno) si se utiliza el fluorocromo SYBR Green.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso de fluorocromo

TAMRA™ como notificador o apantallador en el sistema StepOne™.

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La pantalla Targets (Dianas), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic
en o pulsando F1.
• La selección de un control endógeno, consulte la nota de aplicación Using TaqMan®
Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental
Studies.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 27
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Configuración de los estándares

Configuración de los estándares

En la pantalla Standards (Estándares), escriba el número de puntos y réplicas de todas las
curvas estándar de la placa de reacción. Para cada curva estándar, escriba la cantidad
inicial y seleccione el factor de dilución.

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

experimento de • Se configura una curva estándar para el gen diana (c-myc). El estándar que se utiliza
ejemplo para la dilución seriada es una muestra de cDNA de una muestra de concentración
conocida preparada a partir de RNA aislado de pulmón.
• Se configura una curva estándar para el control endógeno (GAPDH). El estándar
que se utiliza para la dilución seriada es una muestra de cDNA de una muestra de
concentración conocida preparada a partir de RNA aislado de pulmón.
• Para cada curva estándar:
– Se utilizan cinco puntos en la curva estándar.
– Se utilizan tres réplicas para cada punto. Las réplicas son reacciones idénticas
que contienen componentes y volúmenes idénticos.
– La cantidad inicial es 200 ng y el factor de dilución es 1:10.

Pantalla 1. Haga clic en el campo How many points do you need for each standard curve?
Standards (¿Cuántos puntos necesita por cada curva estándar?) y, a continuación, escriba 5.
(Estándares)
2. Haga clic en el campo How many replicates do you need for each point?
(¿Cuántas réplicas necesita para cada punto?) y, a continuación, escriba 3.

3. Defina el rango de cantidades estándar para el ensayo de c-myc:

a. Haga clic en el campo Enter Starting Quantity (Escriba cantidad inicial) y, a
continuación, escriba 200.
b. En el menú desplegable Select Serial Factor (Seleccionar factor de dilución),
seleccione 1:10.

4. Defina el rango de cantidades estándar para el ensayo de GAPDH:

a. Haga clic en el campo Enter Starting Quantity (Escriba cantidad inicial) y, a
continuación, escriba 200.
b. En el menú desplegable Select Serial Factor (Seleccionar factor de dilución),
seleccione 1:10.

5. Revise el panel Standard Curve Preview (Vista previa de la curva estándar) para
cada ensayo. La curva estándar tiene los siguientes puntos: 200, 20, 2, 0,2 y 0,02.

6. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Notas

28 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Configuración de los estándares

1
2

3a

3b

Si es necesario, utilice la barra de desplazamiento

para ver el GAPDH y, a continuación, realice los
pasos 4a y 4b.

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

diseño • Configure una curva estándar para cada gen diana de la placa de reacción. Los genes
diana se definen previamente en la pantalla Targets (Dianas) (“Configuración de los
genes diana” en la página 25).
• Escriba el número de puntos para cada curva estándar de la placa de reacción.
Applied Biosystems recomienda al menos cinco puntos de dilución por cada curva
estándar.
• Escriba el número de reacciones idénticas (réplicas) para cada punto de la curva
estándar. Applied Biosystems recomienda tres réplicas para cada punto.
• Dado que el rango de cantidades estándar afecta al cálculo de la eficiencia de la
amplificación, estudie cuidadosamente el rango de cantidades estándar apropiado
para su ensayo:
– Para obtener medidas más precisas de la eficiencia de la amplificación, utilice un
amplio rango de cantidades estándar, de entre 5 y 6 órdenes de magnitud. Si
especifica un amplio rango de cantidades para los estándares, debe utilizar un
producto de PCR o un molde muy concentrado como, por ejemplo, un cDNA
clonado.
– Si tiene una cantidad limitada de molde de cDNA y/o si el gen diana es un
tránscrito de bajo número de copias, o se sabe que está en un rango determinado,
puede que sea necesario un rango menor de cantidades estándar.
• El factor de dilución sirve para calcular las cantidades de todos los puntos de la
curva estándar. Si la cantidad inicial es la cantidad más alta, seleccione un factor de
dilución como, por ejemplo, 1:2, 1:3, etc. Si la cantidad inicial es la cantidad menor,
seleccione un factor de concentración como, por ejemplo, 2✕, 3✕, etc.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 29
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Configuración de las muestras

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La pantalla Standards (Estándares), acceda a la ayuda del software StepOne
haciendo clic en o pulsando F1.
• La eficiencia de la amplificación, consulte Amplification Efficiency of TaqMan®
Gene Expression Assays Application Note.

Configuración de las muestras

En la pantalla Samples (Muestras), escriba el número de muestras, réplicas y controles
negativos que va a incluir en la placa de reacción, escriba los nombres de las muestras y,
a continuación, seleccione las reacciones de muestra/diana que va a configurar.

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

experimento de • Se utilizan dos muestras: cDNA preparado a partir de RNA total aislado de hígado y
ejemplo riñón. Las muestras contienen cantidades desconocidas del gen c-myc (diana) y del
gen GAPDH (control endógeno).
• Se utilizan tres réplicas. Las réplicas son reacciones idénticas que contienen
componentes y volúmenes idénticos.
• Se utilizan tres controles negativos. Las reacciones de control negativo contienen
agua en lugar de la muestra y no se deberían amplificar.

Pantalla Samples 1. Haga clic en el campo How many samples do you want to test in the reaction
(Muestras) plate? (Cuántas muestras desea probar en la placa de reacción?) y, a continuación,
escriba 2.

Nota: El número de filas de la tabla de las muestras se actualiza con el número que
escriba.

2. Haga clic en el campo How many replicates do you need? (¿Cuántas réplicas
necesita?) y, a continuación, escriba 3.

3. Haga clic en el campo How many negative controls do you need for each target
assay? (¿Cuántos controles negativos necesita para cada ensayo diana?) y, a
continuación, escriba 3.

4. Configure la muestra 1:
a. Haga clic en el campo Enter Sample Name (Escriba nombre de muestra) y, a
continuación, escriba Liver (Hígado).
b. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

5. Configure la muestra 2:
a. Haga clic en el campo Enter Sample Name (Escriba nombre de muestra) y, a
continuación, escriba Kidney (Riñón).
b. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

Notas

30 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Configuración de las muestras

6. Seleccione All Sample/Target Reactions (Todas las reacciones de muestra/diana)

para configurar todos los genes diana de todas las muestras.

7. En el panel Well Count (Número de pocillos), confirme que hay:

• 12 pocillos desconocidos
• 30 pocillos estándar
• 6 pocillos de control negativo
• 0 pocillos vacíos

8. En la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa):

a. En el menú desplegable Arrange Plate by (Ordenar placa por), seleccione Rows
(Filas) (predeterminado).
b. En el menú desplegable Place Negative Controls (Colocar controles negativos),
seleccione Upper Left (Superior izquierda) (predeterminado).

9. Haga clic en Next (Siguiente) >.

8a
1 8b
2
3

4
5

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 31
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Configuración de las opciones de cuantificación relativa

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

diseño • Identifique cada muestra con un nombre y un color únicos. Puede introducir hasta
100 caracteres en el campo Sample Name (Nombre de muestra).
• Escriba el número de reacciones idénticas (réplicas) que desea configurar. Applied
Biosystems recomienda tres réplicas para cada reacción de muestra.
• Escriba el número de reacciones de control negativo que desea configurar. Applied
Biosystems recomienda tres reacciones de control negativo por cada ensayo diana.
• Seleccione la combinación de reacciones de muestra/diana deseada:
– Seleccione All Sample/Target Reactions (Todas las reacciones de
muestra/diana) para configurar todos los genes diana de todas las muestras.
– Seleccione Specify Sample/Target Reactions (Especifique reacciones de
muestra/diana) para configurar de uno en uno los genes diana que se van a
amplificar en cada muestra.

Nota: En el asistente de diseño, cada reacción de PCR sólo puede contener una
muestra y un ensayo diana.

Para obtener más Para obtener más información acerca de la pantalla Samples (Muestras) , acceda a la
información ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Configuración de las opciones de cuantificación relativa

En la pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa),
seleccione la muestra de referencia y el control endógeno para realizar la cuantificación
relativa.

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

experimento de • El tejido del riñón se utiliza como muestra de referencia.
ejemplo
• GAPDH se utiliza como control endógeno.

Pantalla Relative 1. En el menú desplegable Which sample do you want to use as the reference sample?
Quantitation (¿Qué muestra desea utilizar como muestra de referencia?), seleccione Kidney
Settings (Riñón).
(Opciones de
cuantificación 2. En el menú desplegable Which target do you want to use as the endogenous control?
relativa) (¿Qué diana desea utilizar como control endógeno?), seleccione GAPDH.

3. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Notas

32 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Configuración del protocolo de termociclado

1
2

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

diseño • Seleccione una muestra de referencia entre las muestras creadas anteriormente
(“Configuración de las muestras” en la página 30). Los resultados de la
amplificación de las muestras se comparan con los resultados de la amplificación de
la muestra de referencia para determinar la expresión relativa.
• Seleccione un control endógeno en los ensayos diana creados previamente
(“Configuración de los genes diana” en la página 25). Los resultados de la
amplificación del control endógeno se utilizan para normalizar los resultados de la
amplificación de el gen diana para corregir las diferencias en la cantidad de molde
añadida a cada reacción.

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa),
acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.
• Muestras de referencia (también denominadas calibradores) y controles endógenos,
consulte User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression.

Configuración del protocolo de termociclado

En la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado), revise el volumen de la reacción
y el perfil térmico del protocolo de termociclado predeterminado. Si es necesario, puede
editar el protocolo de termociclado predeterminado o sustituirlo por otro de la biblioteca
Run Method (Protocolo de termociclado).

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, se utiliza el protocolo de

experimento de termociclado predeterminado sin modificaciones.
ejemplo

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 33
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Configuración del protocolo de termociclado

Revisión de la 1. Haga clic en la ficha Graphical View (Vista gráfica) (predeterminada) o Tabular
pantalla Run View (Vista tabular).
Method
(Protocolo de 2. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por
termociclado) pocillo) aparece 20 µL.

3. Asegúrese de que en el perfil térmico aparecen las etapas y los ciclos que se indican
a continuación.

4. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

diseño • Escriba un número entre 10 y 30 para el volumen de reacción/pocillo. El sistema
StepOne admite volúmenes de reacción de entre 10 y 30 µL.
• Revise el perfil térmico:
– Asegúrese de que el perfil térmico es apropiado para los reactivos.
– Si va a realizar una RT-PCR de 1 paso, incluya un paso de retrotranscripción.
Si el experimento necesita un perfil térmico diferente, modifique el perfil térmico o
cambie el protocolo de termociclado por otro de la biblioteca Run Method
(Protocolo de termociclado). La biblioteca Run Method (Protocolo de termociclado)
está incluida en el software StepOne.

Para obtener más Para obtener más información acerca de la biblioteca Run Method (Protocolo de
información termociclado) o acerca de la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado), acceda a
la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Notas

34 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la configuración de la reacción

Revisión de la configuración de la reacción

En la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción), seleccione el tipo de ensayo
(si utiliza reactivos TaqMan) y, a continuación, revise los volúmenes calculados para
preparar las reacciones de PCR, las series de dilución estándar y las diluciones de las
muestras. Si es necesario, puede editar el volumen de reacción, el volumen de reacción
de exceso, las concentraciones de los reactivos, la concentración del estándar y/o la
concentración de la muestra diluida.

¡IMPORTANTE! Realice estos pasos para cada ensayo diana de la placa de reacción.

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

experimento de • Se utilizan Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays.
ejemplo
• El volumen de reacción por pocillo es 20 µL.
• El volumen de reacción de exceso es del 10%.
• Los componentes de la reacción son:
– TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕)
– Ensayo de c-myc (20✕)
– Ensayo de GAPDH (20✕)
– Muestra o estándar
– Agua
• La concentración del estándar en la solución de partida es de 200 ng/µL.
• La concentración de la muestra diluida es de 5,0 ng/µL.
• La concentración de la solución de partida de la muestra es de 100 ng/µL.

Pantalla Reaction Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para
Setup el ensayo de c-myc
(Configuración de
1. Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción)
reacción)
(predeterminada).

2. En el panel Select Target (Seleccionar diana), seleccione c-myc.

3. En el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo), seleccione Inventoried/Made

to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido).

4. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por
pocillo) aparece 20 µL.

5. Asegúrese de que en el campo Excess Reaction Volume (Volumen de reacción en

exceso) muestra 10%.

6. En el panel Reactions for c-myc (Reacciones para c-myc):

a. Asegúrese de que en el campo Master Mix Concentration (Concentración de
mezcla maestra) aparece 2✕.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 35
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la configuración de la reacción

b. Asegúrese de que en el campo Assay Mix Concentration (Concentración de

ensayo) aparece 20✕.
c. Revise los componentes y los volúmenes calculados para las reacciones de
PCR:

Componente Volumen (µL) para 1 reacción

Mezcla maestra (2✕) 10,0

Ensayo (20✕) 1,0

Muestra (10✕) o estándar 2,0 ‡

H2O 7,0

Volumen total 20,0

‡ El volumen de la muestra o estándar se limita al 10% del volumen

total de la reacción.

3 4 5

2
6a
6b

6c

7. En el panel Standard Dilution Series for c-myc (Dilución seriada estándar para
c-myc):
a. Haga clic en el campo Standard Concentration in Stock (Concentración del
estándar en la solución de partida) y, a continuación, escriba 200.
b. En el campo de las unidades, seleccione ng per µL (ng por L) (predeterminado)
en el menú desplegable.
c. Revise los volúmenes calculados para preparar la dilución seriada:

Notas

36 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la configuración de la reacción

Volumen
Volumen
de Volumen Concentración
Solución de
Dilución solución total del estándar
origen disolvente
origen (µL) (ng/µL)
(µL)
(µL)

1 [200] Solución 5,0 5,0 10,0 100,0

origen

2 [20] Dilución 1 1,0 9,0 10,0 10,0

3 [2] Dilución 2 1,0 9,0 10,0 1,0

4 [0,2] Dilución 3 1,0 9,0 10,0 0,1

5 [0,02] Dilución 4 1,0 9,0 10,0 0,01

7a
7b

7c

Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para

el ensayo de GAPDH

1. Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción)

(predeterminada).

2. En el panel Select Target (Seleccionar diana), seleccione GAPDH.

3. En el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo), seleccione Inventoried/Made

to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido).

4. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por
pocillo) aparece 20 µL.

5. Asegúrese de que en el campo Excess Reaction Volume (Volumen de reacción en

exceso) muestra 10%.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 37
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la configuración de la reacción

6. En el panel Reactions for GAPDH (Reacciones para GAPDH):

a. Asegúrese de que en el campo Master Mix Concentration (Concentración de
mezcla maestra) aparece 2✕.
b. Asegúrese de que en el campo Assay Mix Concentration (Concentración de
ensayo) aparece 20✕.
c. Revise los componentes y los volúmenes calculados para las reacciones de
PCR:

Componente Volumen (µL) para 1 reacción

Mezcla maestra (2✕) 10,0

Ensayo (20✕) 1,0

Muestra (10✕) o estándar 2,0 ‡

H2O 7,0

Volumen total 20,0

‡ El volumen de la muestra o estándar se limita al 10% del volumen

total de la reacción.

3 4 5

2
6a
6b

6c

7. En el panel Standard Dilution Series for GAPDH (Dilución seriada estándar para
GAPDH):
a. Haga clic en el campo Standard Concentration in Stock (Concentración del
estándar en solución de partida) y, a continuación, escriba 200.
b. En el campo de las unidades, seleccione ng per µL (ng por L) (predeterminado)
en el menú desplegable.

Notas

38 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la configuración de la reacción

c. Revise los volúmenes calculados para preparar la dilución seriada:

Volumen
Volumen
de Volumen Concentración
Solución de
Dilución solución total del estándar
origen disolvente
origen (µL) (ng/µL)
(µL)
(µL)

1 [200] Solución 5,0 5,0 10,0 100,0

origen

2 [20] Dilución 1 1,0 9,0 10,0 10,0

3 [2] Dilución 2 1,0 9,0 10,0 1,0

4 [0,2] Dilución 3 1,0 9,0 10,0 0,1

5 [0,02] Dilución 4 1,0 9,0 10,0 0,01

7a
7b

7c

Complete la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de la dilución de muestra)

1. Seleccione la ficha Sample Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de muestra).

2. Haga clic en el campo Diluted Sample Concentration (10✕ for Reaction Mix)
(Concentración de muestra diluida (10X por mezcla de reacción)) y, a continuación,
escriba 5,0.

3. En el menú desplegable de la unidad, seleccione ng/µL (predeterminado).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 39
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la configuración de la reacción

4. Revise los volúmenes calculados para las diluciones de las muestras:

Concentración Volumen de Volumen de Volumen total

Nombre de la
de la solución muestra disolvente de muestra
muestra
origen (ng/µL) (µL) (µL) diluida (µL)

Hígado 100,0 1,0 19,0 20,0

Riñón 100,0 1,0 19,0 20,0

1
2
3

Imprima las instrucciones de la configuración de la reacción

Imprima las instrucciones detalladas de la configuración de la reacción y, a continuación,
guárdelas para el Capítulo 3, “Preparación de las reacciones de la curva
estándar relativa.”

1. Haga clic en Print Reaction Setup (Imprimir configuración de reacción).

2. En el cuadro de diálogo, seleccione:

• Detailed Reaction Setup Instructions (Instrucciones detalladas de la
configuración de la reacción)
• Include Plate Layout (Incluir disposición de la placa)
• Use sample color (Utilizar color de muestra)

Notas

40 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la configuración de la reacción

3. Haga clic en Print (Imprimir).

4. En el cuadro de diálogo Print (Imprimir), seleccione la impresora y las opciones de

impresión y, a continuación, haga clic en OK (Aceptar).

5. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

diseño • Si utiliza reactivos TaqMan, seleccione el tipo de ensayo que va a utilizar:
– Seleccione Inventoried/Made to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido) si
utiliza Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays (en inventario o
fabricados bajo pedido) o Applied Biosystems Custom TaqMan® Gene
Expression Assays.
– Seleccione Custom (Personalizado) si va a diseñar sus propios ensayos con el
software Primer Express®.
• Escriba un número entre 10 y 30 para el volumen de reacción/pocillo. El sistema
StepOne admite volúmenes de reacción de entre 10 y 30 µL.
• Incluya el volumen de reacción en exceso para contabilizar la pérdida que se
produce durante el pipeteo. Applied Biosystems recomienda un volumen de
reacción en exceso de al menos el 10%.
• Revise las concentraciones de la mezcla de reacción para cada gen diana. Si es
necesario:
– Para los reactivos TaqMan, modifique las concentraciones de la mezcla maestra y
del ensayo.
– Para los reactivos SYBR Green, modifique las concentraciones de la mezcla
maestra, el cebador directo y el cebador reverso.
– Para la RT-PCR de 1 paso, modifique la concentración de retrotranscripción.
• Revise los componentes de la mezcla de reacción para cada gen diana:
– Si va a trabajar de modo rápido, asegúrese de utilizar una mezcla maestra rápida
en las reacciones de PCR.
– Si va a realizar reacciones de PCR en modo estándar, asegúrese de utilizar una
mezcla maestra tipo estándar en las reacciones de PCR.
– En la RT-PCR de 1 paso, asegúrese de incluir retrotranscriptasa en las reacciones
de PCR y de utilizar un tampón específico.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 41
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la configuración de la reacción

• Revise los cálculos de diluciones seriadas para cada gen diana. Si es necesario,
modifique la concentración del estándar en la solución de partida (incluidas las
unidades).

Nota: En el campo de las unidades de Standard Concentration in Stock

(Concentración del estándar de la solución de partida), puede seleccionar ng o µg en
el menú desplegable o introducir otra unidad en el campo (por ejemplo, copies
(copias), IU [unidades internacionales], nmol, pg, etc). La tabla se actualiza de la
manera correspondiente.

• Revise los cálculos de la dilución de las muestras para cada muestra. Si es necesario,
modifique la concentración de muestra diluida (incluidas las unidades) y la
concentración de la solución de partida.

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción), acceda a la ayuda del
software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.
• Los ensayos de Applied Biosystems se refieren a:
– TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
– Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

Notas

42 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Solicitud de materiales para el experimento

Solicitud de materiales para el experimento

En la pantalla Materials List (Lista de materiales), revise la lista de materiales que se
recomiendan para preparar para la placa de reacción de PCR.
Opcionalmente, puede solicitar los materiales recomendados a la tienda en línea de
Applied Biosystems. Cree una cesta de la compra, añada productos a la cesta de compra
y, a continuación, inicie la sesión para enviar su pedido. Para acceder a la tienda en línea
de Applied Biosystems, debe tener una conexión a Internet ilimitada.

Nota: El software StepOne recomienda los materiales que debe solicitar de acuerdo con
el diseño del experimento. Se da por hecho que se va a diseñar el experimento, solicitar
los materiales y luego preparar (Capítulo 3) y procesar (Capítulo 4) la placa de reacción
cuando reciba los materiales.

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, los materiales recomendados
experimento de son:
ejemplo • MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate
• MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film
• TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG
• Ensayo de c-myc: Hs00153408_m1 (RefSeq NM_002467.3)
• Ensayo de GAPDH: Hs99999905_m1 (RefSeq NM_002046.2)

Pantalla Ordering 1. Busque el ensayo diana en la tienda en línea de Applied Biosystems:

Materials
a. Asegúrese de que el ordenador está conectado a Internet.
(Solicitud de
materiales) b. Haga clic en el campo Enter Gene Name (Escriba el nombre del gen), escriba
c-myc y, a continuación, haga clic en Find Assay (Buscar ensayo).
c. En el cuadro de diálogo Find Assay Results (Buscar resultados de ensayo),
seleccione la fila Hs00153408_m1.
d. Haga clic en el campo Enter Gene Name (Escriba el nombre del gen), escriba
GAPDH y, a continuación, haga clic en Find Assay (Buscar ensayo).
e. En el cuadro de diálogo Find Assay Results (Buscar resultados de ensayo),
seleccione la fila Hs99999905_m1.
f. Haga clic en Apply Assay Selection (Aplicar selección de ensayo).

2. Complete el panel Experiment Materials List (Lista de materiales del experimento):

a. En el menú desplegable Display (Visualización), seleccione All Items (Todos
los elementos) (predeterminada) y, a continuación, revise los materiales
recomendados. Si es necesario, utilice la barra de desplazamiento situada a la
derecha para ver todos los elementos.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 43
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Solicitud de materiales para el experimento

b. Active la casilla de verificación junto a cada uno de los siguientes elementos:

• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate
• MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film
• TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG
• Ensayo de c-myc: Hs00153408_m1 (RefSeq NM_002467.3)
• Ensayo de GAPDH: Hs99999905_m1 (RefSeq NM_002046.2)

Nota: Para obtener más información acerca de un elemento específico, haga

clic en el vínculo del número de referencia para conectarse a la tienda en línea
de Applied Biosystems. En la página de inicio, escriba el número de referencia
en el campo Search (Búsqueda) y, a continuación, haga clic en Go (Ir).

c. Haga clic en Add Selected Items to Shopping List (Añadir elementos

seleccionados a la cesta de compra).

3. Compruebe si la cesta de compra del experimento contiene los materiales deseados

y que las cantidades son correctas y, a continuación, haga clic en Order Materials
in List (Solicitar materiales de la lista).

1b,1d

2a
2c

2b

4. En el cuadro de diálogo, Order Materials - Log In (Solicitar materiales – Inicio de

sesión), escriba el nombre de usuario y la contraseña de la tienda en línea de
Applied Biosystems y, a continuación, haga clic en Login and Submit (Iniciar la
sesión y enviar).

Nota: Si no tiene cuenta en la tienda en línea de Applied Biosystems, haga clic en

Register Now (Registrarse ahora) para crear una cuenta.

Notas

44 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Solicitud de materiales para el experimento

5. Después de realizar el pedido, haga clic en Finish Designing Experiment (Finalizar

el diseño del experimento).

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

diseño • Confirme que el ordenador tiene una conexión a Internet ilimitada.
• Applied Biosystems recomienda las siguientes versiones de navegadores y Adobe®
Acrobat® Reader para utilizar el sitio web de Applied Biosystems:

Sistema operativo Netscape® Microsoft® Adobe® Acrobat®

del escritorio Navigator Internet Explorer Reader

Windows® v6.x o posterior v6.x o posterior v4.0 o posterior

98/NT/2000

Macintosh® OS 9 o v6.x o posterior v5.2 o posterior v4.0 o posterior

posterior

Nota: Asegúrese de que se han activado las cookies y Java Script para que el sitio
web funcione correctamente.

• Seleccione todos los materiales que necesite para el experimento y añádalos a la

cesta de compra.

Para obtener más Para obtener más información acerca de la pantalla Materials List (Lista de materiales),
información acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 45
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

Para finalizar el flujo de trabajo del asistente de diseño, revise la disposición de la placa
y, a continuación, seleccione una opción de salida.

Acerca del El software StepOne selecciona automáticamente ubicaciones para los pocillos en la
experimento de placa de reacción. En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:
ejemplo • Los pocillos se colocan tal y como se muestra a continuación.

• El experimento se guarda tal y como está y se cierra.

Nota: Para el experimento de ejemplo, no realice el proceso en este momento.

Finalización del 1. En la ventana Review Plate for Experiment (Revisar placa para el experimento),
asistente de revise la disposición de la placa. Asegúrese de que hay:
diseño • 12 pocillos desconocidos
• 30 pocillos estándar
• 6 pocillos de control negativo
• 0 pocillos vacíos

Nota: Si la disposición de la placa es incorrecta, haga clic en Return to the Wizard

(Volver al asistente) y compruebe los valores que ha introducido.

2. Haga clic en Save Experiment (Guardar experimento).

Notas

46 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

3. En el cuadro de diálogo Save Experiment (Guardar experimento), haga clic en Save

(Guardar) para aceptar la ubicación y el nombre de archivo predeterminados. El
experimento de ejemplo se guarda y se cierra, y regresa a la pantalla de inicio.

Nota: De manera predeterminada, el experimento de ejemplo se guarda en la

carpeta Applied Biosystems\StepOne System\experiments.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 47
cuantificación relativa
 Capítulo 2 Diseño del experimento de curva estándar relativa
Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de curva estándar relativa:

diseño • En la ventana Review Plate for Experiment (Revisar placa para el experimento),
seleccione la opción de salida apropiada:
– Haga clic en Save Experiment (Guardar experimento) si desea guardar y cerrar
el experimento sin realizar ningún otro cambio ni iniciar el proceso.
– Haga clic en Start Run for This Experiment (Iniciar proceso para este
experimento) si desea guardar el experimento e iniciar el proceso. Asegúrese de
que la placa de reacción está cargada en el instrumento.
– Haga clic en Edit Plate Layout (Editar disposición de placa) si desea utilizar el
flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para modificar la
disposición de la placa.
– Haga clic en Create Another Experiment Using the Design Wizard (Crear otro
experimento con el asistente de diseño) si desea guardar y cerrar el experimento
y, a continuación, crear otro experimento con el asistente de diseño.
– Haga clic en Return to the Wizard (Regresar al asistente) si desea regresar al
experimento para realizar cambios con el asistente de diseño.
• De manera predeterminada, los experimentos se guardan en la carpeta Applied
Biosystems\StepOne System\experiments. Para cambiar:
– La ubicación en la que se guarda un experimento específico, desplácese a la
ubicación deseada con el cuadro de diálogo Save Experiment (Guardar
experimento).
– La ubicación en la que se guardan los experimentos de manera predeterminada,
seleccione Tools (Herramientas)Preferences (Preferencias) y, a continuación,
seleccione la ficha General (predeterminada). En el campo Default Data Folder
(Carpeta de datos predeterminada), desplácese a la ubicación deseada.

Para obtener más Para obtener más información acerca del uso del flujo de trabajo Advanced Setup
información (Configuración avanzada), consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración
avanzada)” en la página 206.

Notas

48 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 3

Preparación de las reacciones de la

curva estándar relativa
Este capítulo cubre los siguientes temas:
■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
■ Preparación del molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
■ Preparación de las diluciones de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
■ Preparación de la dilución seriada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
■ Preparación de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
■ Preparación de la placa de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en
esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o
seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 49
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Resumen del capítulo

Resumen del capítulo

En este capítulo, se explica cómo preparar las reacciones de PCR para el experimentode
curva estándar relativa de ejemplo y se ofrecen directrices para preparar las reacciones de
PCR para su propio experimento de curva estándar relativa.

Flujo de trabajo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para preparar las reacciones de PCR para el
del experimento experimento de ejemplo que se incluye en esta guía de introducción.
de ejemplo
Experimento de curva estándar relativa
Inicio del experimento

Diseño del experimento (Capítulo 2)

Preparación de las reacciones (Capítulo 3)
1. Prepare el molde.
2. Prepare las diluciones de las muestras.
3. Prepare la dilución seriada.
4. Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana.
5. Prepare la placa de reacción.


Realización del experimento (Capítulo 4)


Análisis del experimento (Capítulo 5)

Fin del experimento

Notas

50 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación del molde

Preparación del molde

Prepare el molde para las reacciones de PCR (muestras y estándares) con el High-
Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems recomienda utilizar High-Capacity cDNA Reverse

Transcription Kit para realizar una retrotranscripción del cDNA a partir de RNA total.
Los TaqMan® Gene Expression Assays se han diseñado utilizando el High-Capacity
cDNA Reverse Transcription Kit; no se han probado otros protocolos para los TaqMan
Gene Expression Assays.

Acerca del Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, el molde para las reacciones
experimento de de PCR es cDNA sintetizado a partir de las muestras de RNA total utilizando el High-
ejemplo Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.

Materiales • Para las muestras, RNA total aislado de hígado y riñón

necesarios • Para los estándares, RNA total aislado de pulmón

Nota: Procure preparar el molde para las muestras y los estándares.

• Uno de los Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits:

Número de
Kit
referencia

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4368814

(200 reacciones)

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4368813

(1000 reacciones)

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4374966

with RNase Inhibitor (200 reacciones)

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4374967

with RNase Inhibitor (1000 reacciones)

Nota: El High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit se llamaba antiguamente

High-Capacity cDNA Archive Kit.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 51
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación del molde

Preparación del Utilice el High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para sintetizar cDNA de
molde cadena sencilla a partir de las muestras de RNA total. Siga los procedimientos de Applied
Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol para:

1. Preparar la mezcla maestra de la reacción.

PELIGRO QUÍMICO. El tampón de reacción 10X puede

causar irritación de los ojos, la piel y las vías respiratorias. Consulte la ficha técnica
de seguridad (MSDS) y siga las instrucciones de manipulación indicadas. Use
protectores oculares, vestimenta protectora y guantes apropiados.

2. Prepare las reacciones de cDNA.

3. Realice la retrotranscripción en un termociclador.

Directrices de Cuando prepare su propio experimento de curva estándar relativa:

preparación • Applied Biosystems recomienda extraer primero el DNA o RNA del tejido o
muestra.
• Applied Biosystems recomienda los siguientes moldes:
– cDNA (cDNA) complementario: cDNA sintetizado a partir de las muestras de
RNA total utilizando un High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.
– RNA: RNA o mRNA total purificado extraído de un tejido o una muestra.
– DNA (gDNA) genómico: gDNA purificado ya extraído de un tejido o una
muestra.

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La preparación de moldes de cDNA, consulte Applied Biosystems High-Capacity
cDNA Reverse Transcription Kits Protocol (PN 4375575). El protocolo no se
incluye en los High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits. Puede descargarlo
desde el sitio web Applied Biosystems Documents on Demand:
http://docs.appliedbiosystems.com/search.taf
• La preparación de moldes de RNA o gDNA, consulte el protocolo de los reactivos
de purificación que haya seleccionado. Para localizar los reactivos de purificación
de Applied Biosystems, visite el sitio web de Applied Biosystems:
http://www.appliedbiosystems.com/

Notas

52 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación de las diluciones de las muestras

Preparación de las diluciones de las muestras

Realice diluciones de las muestras antes de añadir las muestras a la mezcla de reacción
final. Diluya las muestras con los volúmenes que ha calculado el software StepOne™
(“Complete la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de la dilución de muestra)”
en la página 39).

Acerca del Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

experimento de • Las diluciones de las muestras son necesarias porque el volumen de las muestras se
ejemplo limita al 10% del volumen total de la reacción en el software StepOne. El volumen
total de la reacción es de 20 µL/reacción, por lo que el volumen de las muestras es
de 2 µL/reacción.
• La concentración de la solución de partida es de 100 ng/µL. Después de diluir la
muestra de acuerdo con la tabla Sample Dilutions Calculations (Cálculos de
diluciones de las muestras), la muestra tendrá una concentración de 5,0 ng/µL. Esto
supone una concentración de 10✕ cuando se añaden 2 µL al volumen de mezcla de
reacción final de 20 µL. Hay una concentración de 1✕ en la reacción final.
• Los volúmenes calculados en el software son:

Concentración Volumen de Volumen de Volumen total

Nombre de la
de la solución muestra disolvente de muestra
muestra
origen (ng/µL) (µL) (µL) diluida (µL)

Hígado 100,0 1,0 19,0 20,0

Riñón 100,0 1,0 19,0 20,0

Materiales • Agua para diluir la muestra

necesarios • Tubos de microcentrífuga
• Pipetas
• Puntas de pipeta
• Solución origen de las muestras
• Agitador
• Centrífuga

Preparación de 1. Etiquete un tubo de microcentrífuga diferente para cada muestra diluida:

las diluciones de • Hígado
las muestras • Riñón

2. Añada el volumen de agua requerido (disolvente) a cada tubo vacío:

Volumen de
Tubo Nombre de la muestra
disolvente (µL)

1 Hígado 19,0

2 Riñón 19,0

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 53
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación de las diluciones de las muestras

3. Añada el volumen de solución de partida de las muestras requerido (muestra) a cada

tubo vacío:

Volumen de
Tubo Nombre de la muestra
muestra (µL)

1 Hígado 1,0

2 Riñón 1,0

4. Agite cada muestra diluida entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifugue

brevemente los tubos.

5. Coloque las muestras diluidas en hielo hasta que prepare la placa de reacción.

Directrices de Cuando prepare su propio experimento de curva estándar relativa:

preparación • Podría necesitar diluciones de las muestras porque el volumen de las muestras se
limita al 10% del volumen total de la reacción en el software StepOne. Debe realizar
diluciones de las muestras antes de añadir las muestras a la mezcla de reacción final.
• Para conseguir un rendimiento óptimo de los TaqMan® Gene Expression Assays o
los Custom TaqMan® Gene Expression Assays, utilice entre 10 y 100 ng de molde
de cDNA por 20-µL de reacción. Para reactivos tipo rápido, Applied Biosystems
recomienda 10 ng.
• Utilice tampón TE o agua para diluir la muestra.

Para obtener más Para obtener más información acerca de los ensayos de Applied Biosystems, consulte:
información • TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

Notas

54 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación de la dilución seriada

Preparación de la dilución seriada

Prepare la dilución seriada con los volúmenes que ha calculado el software StepOne
(“Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para
el ensayo de c-myc” en la página 35 y “Complete la ficha Reaction Mix Calculations
(Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de GAPDH” en la página 37):

Acerca del Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

experimento de • La concentración del estándar en la solución de partida es de 200 ng/µL.
ejemplo
• Los volúmenes calculados en el software para los ensayos de c-myc y GAPDH son:

Volumen
Volumen
de Volumen Concentración
Solución de
Dilución solución total del estándar
origen disolvente
origen (µL) (ng/µL)
(µL)
(µL)

1 [200] Solución 5,0 5,0 10,0 100,0

origen

2 [20] Dilución 1 1,0 9,0 10,0 10,0

3 [2] Dilución 2 1,0 9,0 10,0 1,0

4 [0.2] Dilución 3 1,0 9,0 10,0 0,1

5 [0.02] Dilución 4 1,0 9,0 10,0 0,01

Materiales • Agua para diluir los estándares

necesarios • Tubos de microcentrífuga
• Pipetas
• Puntas de pipeta
• Solución de partida del estándar
• Agitador
• Centrífuga

Preparación de la 1. Etiquete un tubo de microcentrífuga diferente para cada estándar:

dilución seriada • c-myc Std. 1
para el • c-myc Std. 2
ensayo de c-myc
• c-myc Std. 3
• c-myc Std. 4
• c-myc Std. 5

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 55
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación de la dilución seriada

2. Añada el volumen de agua requerido (disolvente) a cada tubo vacío:

Volumen de
disolvente
Tubo Nombre de estándar
que se debe
añadir (µL)

1 c-myc Std. 1 5,0

2 c-myc Std. 2 9,0

3 c-myc Std. 3 9,0

4 c-myc Std. 4 9,0

5 c-myc Std. 5 9,0

3. Prepare la dilución 1 en el tubo c-myc Std. 1:

a. Agite la solución de partida entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifugue
brevemente el tubo.
b. Con una punta de pipeta nueva, añada 5,0 µL de solución de partida al tubo
c-myc Std. 1.
c. Agite el tubo Std. 1 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo
brevemente.

4. Prepare la dilución 2 en el tubo c-myc Std. 2:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución al tubo c-myc
Std. 2.
b. Agite el tubo Std. 2 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo
brevemente.

5. Prepare la dilución 3 en el tubo c-myc Std. 3:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución al tubo c-myc Std. 3.

b. Agite el tubo Std. 3 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo

brevemente.

6. Prepare la dilución 4 en el tubo c-myc Std. 4:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución al tubo c-myc Std. 4.

b. Agite el tubo Std. 4 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo

brevemente.

7. Prepare la dilución 5 en el tubo c-myc Std. 5:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución al tubo c-myc Std. 5.

b. Agite el tubo Std. 5 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo

brevemente.

8. Coloque los estándares en hielo hasta que prepare la placa de reacción.

Notas

56 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación de la dilución seriada

Preparación de la 1. Etiquete un tubo de microcentrífuga diferente para cada estándar:

dilución seriada • GAPDH Std. 1
para el ensayo de • GAPDH Std. 2
GAPDH
• GAPDH Std. 3
• GAPDH Std. 4
• GAPDH Std. 5

2. Añada el volumen de agua requerido (disolvente) a cada tubo vacío:

Volumen de
disolvente
Tubo Nombre de estándar
que se debe
añadir (µL)

1 GAPDH Std. 1 5,0

2 GAPDH Std. 2 9,0

3 GAPDH Std. 3 9,0

4 GAPDH Std. 4 9,0

5 GAPDH Std. 5 9,0

3. Prepare la dilución 1 en el tubo GAPDH Std. 1:

a. Agite la solución de partida entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifugue
brevemente el tubo.
b. Con una punta de pipeta nueva, añada 5,0 µL de solución de partida al tubo
GAPDH Std. 1.
c. Agite el tubo Std. 1 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo
brevemente.

4. Prepare la dilución 2 en el tubo GAPDH Std. 2:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución al tubo GAPDH Std. 2.

b. Agite el tubo Std. 2 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo

brevemente.

5. Prepare la dilución 3 en el tubo GAPDH Std. 3:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución 2 al tubo GAPDH
Std. 3.
b. Agite el tubo Std. 3 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo
brevemente.

6. Prepare la dilución 4 en el tubo GAPDH Std. 4:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución 3 al tubo GAPDH
Std. 4.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 57
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación de la mezcla de reacción

b. Agite el tubo Std. 4 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo

brevemente.

7. Prepare la dilución 5 en el tubo GAPDH Std. 5:

a. Con una punta de pipeta nueva, añada 1,0 µL de dilución 4 al tubo GAPDH
Std. 5.
b. Agite el tubo Std. 5 entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifúguelo
brevemente.

8. Coloque los estándares en hielo hasta que prepare la placa de reacción.

Directrices de Cuando prepare su propio experimento de curva estándar relativa:

preparación • Los estándares son esenciales para realizar un análisis preciso de los datos de la
reacción.
• Cualquier error o imprecisión a la hora de realizar las diluciones afecta directamente
a la calidad de los resultados.
• La calidad de pipetas y puntas, y el cuidado que se tenga a la hora de medir y
mezclar las diluciones, afecta a la precisión.
• Utilice tampón TE o agua para diluir el estándar.

Preparación de la mezcla de reacción

Prepare la mezcla de reacción con los componentes y volúmenes que ha calculado el
software StepOne (“Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla
de reacción) para el ensayo de c-myc” en la página 35 y “Complete la ficha Reaction Mix
Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de GAPDH” en la
página 37).

Nota: El software calcula todos los componentes de las reacciones de PCR. Sin
embargo, para preparar la mezcla de reacción de esta sección, incluya únicamente la
mezcla maestra, el ensayo y agua. Añada la muestra o el estándar cuando prepare la placa
de la reacción (consulte “Preparación de la placa de reacción” en la página 61).

Acerca del Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

experimento de • Los componentes de la mezcla de reacción son:
ejemplo
– TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕)
– Ensayo de c-myc (20✕)
– Ensayo de GAPDH (20✕)
– Agua

Notas

58 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación de la mezcla de reacción

• Los volúmenes calculados en el software para ambos ensayos diana son:

Volumen (µL) para

Componente
1 reacción

Mezcla maestra (2✕) 10,0

Ensayo (20✕) 1,0

H2O 7,0

Volumen total 18,0

Nota: En este momento, no se añade la muestra ni el estándar.

Materiales • Tubos de microcentrífuga

necesarios • Pipetas
• Puntas de pipeta
• Componentes de la mezcla de reacción (enumerados arriba)
• Centrífuga

Preparación de la ¡IMPORTANTE! Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana por separado.
mezcla de
reacción
1. Etiquete un tubo del tamaño apropiado para cada mezcla de reacción:
• Mezcla de reacción para c-myc
• Mezcla de reacción para GAPDH

2. Para el ensayo de c-myc, añada los volúmenes requeridos de cada componente al

tubo de la mezcla de reacción de c-myc:

Volumen (µL) para

Volumen (µL) para 24 reacciones
Componente
1 reacción (más un exceso del
10%)

TaqMan® Fast Universal PCR 10,0 264,0

Master Mix (2✕)

Ensayo de c-myc (20✕) 1,0 26,4

Agua 7,0 184,8

Volumen total de la mezcla de 18,0 475,2

reacción

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 59
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación de la mezcla de reacción

3. Para el ensayo de GAPDH, añada los volúmenes requeridos de cada componente al

tubo de la mezcla de reacción de GAPDH:

Volumen (µL) para

Volumen (µL) para 24 reacciones
Componente
1 reacción (más un exceso del
10%)

TaqMan® Fast Universal PCR 10,0 264,0

Master Mix (2✕)

Ensayo de GAPDH (20✕) 1,0 26,4

Agua 7,0 184,8

Volumen total de la mezcla de 18,0 475,2

reacción

4. Para mezclar la mezcla de reacción de cada tubo, pipetee suavemente hacia arriba y
hacia abajo y, a continuación, tápelos.

5. Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire.

6. Coloque las mezclas de las reacciones en hielo hasta que prepare la placa de
reacción.

Directrices de Cuando prepare su propio experimento de curva estándar relativa:

preparación • Si el experimento incluye más de un ensayo diana, prepare la mezcla de reacción
para cada ensayo diana de manera separada.
• Incluya un volumen de exceso en los cálculos para compensar la pérdida que se
produce durante las transferencias de reactivos. Applied Biosystems recomienda un
volumen de exceso de al menos el 10%.
• Incluya todos los componentes requeridos.
• Prepare los reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
• Mantenga los ensayos protegidos de la luz, en el refrigerador, hasta que esté listo
para usarlos. Una exposición excesiva a la luz puede afectar a las sondas
fluorescentes.
• Antes de utilizarlo:
– Dé vueltas al bote para mezclar bien la mezcla maestra.
– Agite el ensayo para resuspenderlo y, a continuación, centrifugue brevemente el
tubo.
– Para descongelar las muestras congeladas, colóquelas en hielo. Una vez
descongeladas, agite las muestras para resuspenderlas y, a continuación,
centrifugue los tubos brevemente.

Para obtener más Para obtener más información acerca de la preparación de la mezcla de reacción, consulte
información el protocolo apropiado para los reactivos que está utilizando en las reacciones de PCR:
• TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

Notas

60 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación de la placa de reacción

Preparación de la placa de reacción

Prepare las reacciones para cada grupo de réplicas y, a continuación, transfiéralas a la
placa de reacción. Utilice la disposición de la placa que se muestra en el software
StepOne.

Acerca del Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo:

experimento de • Se utiliza una MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate.
ejemplo
• El volumen de la reacción es de 20 µL/pocillo.
• La placa de reacción contiene:
– 12 pocillos desconocidos
– 30 pocillos estándar
– 6 pocillos de control negativo
– 0 pocillos vacíos
• Se utiliza la disposición de la placa que genera automáticamente el software
StepOne:

Materiales • Tubos de microcentrífuga

necesarios • Pipetas
• Puntas de pipeta
• Mezcla de reacción para c-myc (página 59)
• Mezcla de reacción para GAPDH (página 59)
• Agua
• Estándares de c-myc (página 55)
• Estándares de GAPDH (página 57)
• Muestras (página 53)
• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate
• MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 61
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación de la placa de reacción

• Centrífuga

Preparación de la 1. Para cada gen diana, prepare las reacciones de control negativo:
placa de reacción
a. A un tubo del tamaño apropiado, añada los volúmenes de la mezcla de reacción
y de agua que se indican a continuación.

Volumen de la
Mezcla de Volumen de
Tubo mezcla de
reacción agua (µL)
reacción (µL)

1 Mezcla de reacción 59,4 6,6

para c-myc

2 Mezcla de reacción 59,4 6,6

para GAPDH

b. Para mezclar la reacción, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a

continuación, tape el tubo.
c. Centrifugue brevemente el tubo para quitar las burbujas de aire.

d. Añada 20 µL de la reacción de control negativo a los pocillos apropiados de la

placa de reacción.

2. Por cada grupo de réplicas, prepare las reacciones estándar:

a. A tubos del tamaño adecuado, añada los volúmenes de la mezcla de reacción y
de estándar que se indican a continuación.

Volumen
Volumen
de la
Reacción Mezcla de de
Tubo mezcla de Estándar
estándar reacción estándar
reacción
(µL)
(µL)

1 c-myc Std 1 Mezcla de 59,4 c-myc Std 1 6,6

reacción
para c-myc

2 c-myc Std 2 Mezcla de 59,4 c-myc Std 2 6,6

reacción
para c-myc

3 c-myc Std 3 Mezcla de 59,4 c-myc Std 3 6,6

reacción
para c-myc

4 c-myc Std 4 Mezcla de 59,4 c-myc Std 4 6,6

reacción
para c-myc

5 c-myc Std 5 Mezcla de 59,4 c-myc Std 5 6,6

reacción
para c-myc

Notas

62 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación de la placa de reacción

Volumen
Volumen
de la
Reacción Mezcla de de
Tubo mezcla de Estándar
estándar reacción estándar
reacción
(µL)
(µL)

6 GAPDH Mezcla de 59,4 GAPDH 6,6

Std 1 reacción Std 1
para
GAPDH

7 GAPDH Mezcla de 59,4 GAPDH 6,6

Std 2 reacción Std 2
para
GAPDH

8 GAPDH Mezcla de 59,4 GAPDH 6,6

Std 3 reacción Std 3
para
GAPDH

9 GAPDH Mezcla de 59,4 GAPDH 6,6

Std 4 reacción Std 4
para
GAPDH

10 GAPDH Mezcla de 59,4 GAPDH 6,6

Std 5 reacción Std 5
para
GAPDH

b. Para mezclar las reacciones, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a
continuación, tape los tubos.
c. Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire.

d. Añada 20 µL de la reacción estándar a los pocillos apropiados de la placa de

reacción.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 63
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación de la placa de reacción

3. Por cada grupo de réplicas, prepare las reacciones para los elementos desconocidos
o muestras:
a. A tubos del tamaño adecuado, añada los volúmenes de la mezcla de reacción y
de las muestras que se indican a continuación.

Volumen
de la Volumen
Reacción Mezcla de
Tubo mezcla de Muestra de muestra
desconocida reacción
reacción (µL)
(µL)

1 c-myc en Mezcla de 59,4 Hígado 6,6

hígado reacción
para c-myc

2 c-myc en Mezcla de 59,4 Riñón 6,6

riñón reacción
para c-myc

3 GAPDH en Mezcla de 59,4 Hígado 6,6

hígado reacción
para
GAPDH

4 GAPDH en Mezcla de 59,4 Riñón 6,6

riñón reacción
para
GAPDH

b. Para mezclar las reacciones, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a
continuación, tape los tubos.
c. Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire.

d. Añada 20 µL de la mezcla de reacción desconocida (muestra) a los pocillos

apropiados de la placa de reacción.

4. Selle la placa de reacción con película adhesiva óptica.

5. Centrifugue brevemente la placa de reacción para quitar las burbujas de aire.

6. Hasta que esté preparado para realizar la reacción, coloque la placa de reacción en
hielo en un sitio oscuro.

Directrices de Cuando prepare su propio experimento de curva estándar relativa:

preparación • Procure utilizar los consumibles adecuados.
• Asegúrese de que la colocación de las reacciones de PCR se corresponde con la
disposición de la placa que se muestra en el software StepOne. Puede:
– Aceptar la disposición de la placa que genera automáticamente el software.
o
– Utilizar el flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para
cambiar la disposición de la placa en el software.

Notas

64 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación de la placa de reacción

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La preparación de la placa de reacción, consulte el protocolo apropiado para los
reactivos que está utilizando en las reacciones de PCR:
– TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
– Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
• Los consumibles, consulte “Consumibles admitidos” en la página 3.
• El uso del flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para cambiar
la disposición de la placa, consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup
(Configuración avanzada)” en la página 206.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 65
cuantificación relativa
 Capítulo 3 Preparación de las reacciones de la curva estándar relativa
Preparación de la placa de reacción

Notas

66 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 4

Realización del experimento de curva

estándar relativa
Este capítulo cubre los siguientes temas:
■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
■ Preparación de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
■ (Opcional) Activación de las notificaciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
■ Inicio de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
■ Monitorización de la reacción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
■ Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en
esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o
seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 67
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Resumen del capítulo

Resumen del capítulo

En este capítulo, se explica cómo realizar una reacción en Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System.

Flujo de trabajo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para realizar el experimento de ejemplo
del experimento que se incluye en esta guía de introducción.
de ejemplo
Inicio del experimento


Diseño del experimento (Capítulo 2)


Preparación del experimento (Capítulo 3)


Realización del experimento (Capítulo 4)
1. Prepare el proceso.
2. Active las opciones de notificación.
3. Inicie el proceso.
4. Monitorice el proceso.
5. Descargue el instrumento y transfiera los datos.


Análisis del experimento (Capítulo 5)


Fin del experimento

Notas

68 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Preparación de la reacción

Preparación de la reacción
Para preparar la reacción, abra el experimento y cargue la MicroAmp™ Fast Optical 48-
Well Reaction Plate en el instrumento StepOne™.

Apertura del 1. Si aún no se está ejecutando el software StepOne™, haga doble clic en (acceso
experimento de directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los
ejemplo programas)Applied Biosystems StepOneStepOne v2.0.

2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Open (Abrir).

3. En el cuadro de diálogo Open (Abrir), desplácese hasta la carpeta experiments

(experimentos) (predeterminada).

4. Haga doble clic en Relative Standard Curve Example (Ejemplo de curva estándar
relativa) para abrir el archivo del experimento de ejemplo que ha creado en el
Capítulo 2.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 69
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Preparación de la reacción

Carga de la placa PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Durante el uso del

de reacción instrumento, la temperatura del bloque puede superar los 100 °C. Si el instrumento se ha
utilizado recientemente, mantenga las manos alejadas de él hasta que el bloque alcance la
temperatura ambiente.

¡IMPORTANTE! Lleve guantes sin polvo para manejar la placa de reacción.

1. Abra la bandeja del instrumento.

2. Coloque las reacciones en el bloque.

La colocación de las reacciones depende del tipo de consumible que se utilice:
• Si utiliza una placa de reacción, colóquela con el pocillo A1 en la esquina
posterior izquierda.
• Si utiliza tiras de tubos de reacción, colóquelas en el bloque directamente.

A1

3. Cierre cuidadosamente la bandeja del instrumento.

Notas

70 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
(Opcional) Activación de las notificaciones

(Opcional) Activación de las notificaciones

Active las opciones de notificación para que el software StepOne le avise por correo
electrónico del momento en que el instrumento StepOne comienza y completa el
proceso, o si se produce algún error en el proceso. La activación de la función de
notificación es opcional y no afecta al rendimiento del sistema StepOne™ ni a la duración
de la reacción.

¡IMPORTANTE! La función de notificación sólo está disponible si el ordenador donde

desea recibir la notificación está controlando el instrumento StepOne y está conectado a
una red Ethernet.

Nota: El sistema de notificación también está disponible en los ordenadores que

monitorizan un instrumento StepOne de manera remota. Para obtener más información
acerca de la monitorización remota, consulte “Monitorización remota” en la página 83.

Acerca del En el experimento de ejemplo, el software StepOne está configurado para enviar
experimento de notificaciones a tres usuarios (científico, supervisor y técnico de mycompany.com)
ejemplo cuando el sistema StepOne termina el proceso y si encuentra algún error durante la
operación. El servidor SMTP de ejemplo (www.mycompany.com) está configurado para
el cifrado SSL (Secure Sockets Layer) y, para utilizarlo, se requiere autenticación.

Configuración de 1. En el software StepOne, haga clic en Run (Proceso) en la columna de

las opciones de navegación.
notificación
2. Haga clic en Notification Settings (Opciones de notificación).

3. Seleccione Enable Notifications (Activar notificaciones).

4. Seleccione los eventos que desencadenarán las notificaciones:

a. Seleccione Instrument Error (Error del instrumento).

b. Seleccione Run Completed (Proceso completado).

5. En el campo Enter e-mail addresses for notifications (Escriba las direcciones de

correo electrónico para las notificaciones), escriba: [email protected],
[email protected], [email protected].

6. En el campo Outgoing Mail Server (SMTP) (Servidor de correo saliente (SMTP)),

escriba smtp.mycompany.com.

7. Ajuste las opciones de autenticación:

a. Seleccione No en Server requires authentication (El servidor requiere
autenticación).
b. En el campo User Name (Nombre de usuario), escriba supervisor.

c. En el campo Password (Contraseña), escriba password.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 71
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
(Opcional) Activación de las notificaciones

7a

7b
7c

Directrices de Si configura el sistema StepOne para la notificación automática:

proceso • El sistema StepOne debe estar configurado para su uso en red. Consulte la Guía de
instalación de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System.
• Determine los eventos de los que quiere recibir una notificación:
– Instrument Error (Error del instrumento): el sistema StepOne envía por correo
electrónico a los destinatarios todos los errores que se producen en el instrumento
StepOne durante cada proceso.
– Run Started (Proceso iniciado): el proceso StepOne envía un correo electrónico
a los destinatarios cada vez que el instrumento inicia una reacción.
– Run Completed (Proceso completado): el proceso StepOne envía un correo
electrónico a los destinatarios cada vez que el instrumento completa una
reacción.
• Obtenga las direcciones de correo electrónico en las que desea recibir
notificaciones.

¡IMPORTANTE! Separe las direcciones con una coma ( , ).

• Póngase en contacto con el administrador del sistema o con el departamento de

tecnología de la información para obtener:
– La dirección de red del servidor de protocolo de transferencia de correo simple
(SMTP) en la LAN
– Un nombre de usuario y contraseña para el servidor, si son necesarios para el
acceso
– La configuración de SSL (Secure Sockets Layer) del servidor (activada o
desactivada)

Notas

72 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Inicio de la reacción

Inicio de la reacción
Inicie el proceso de acuerdo con la disposición del instrumento StepOne. La forma en la
que hay que iniciar el proceso depende de la disposición del sistema StepOne:

Disposición Descripción Consulte…

Conectada El cable amarillo del sistema StepOne conecta el “Inicio conectado”

ordenador al instrumento StepOne. más abajo

Autónoma • El ordenador y el instrumento StepOne no están “Inicio autónomo”

conectados, o en la página 74
• El ordenador y el instrumento StepOne están
conectados a la misma red.

Inicio conectado Realice este procedimiento si el ordenador está conectado directamente al instrumento
StepOne por medio del cable del sistema StepOne.

1. En el software StepOne, haga clic en Temperature Plot (Gráfica de

temperatura).

2. Haga clic en START RUN (Iniciar proceso) .

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 73
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Inicio de la reacción

Inicio autónomo Realice este procedimiento si el ordenador y el instrumento StepOne no están

directamente conectados por medio del cable amarillo del sistema StepOne.

1. Si el ordenador y el instrumento StepOne están conectados a la misma red, realice

los pasos 1a a 1f. De lo contrario, vaya al paso 2.
a. En el software StepOne, haga clic en Send Experiment to Instrument
(Enviar experimento al instrumento).
b. En el cuadro de diálogo Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al
instrumento), haga clic en Browse (Examinar), seleccione el archivo Relative
Standard Curve Example.eds y, a continuación, haga clic en Open (Abrir).
c. Seleccione el instrumento StepOne en el menú desplegable Select Instrument
(Seleccionar instrumento).
Si no aparece su instrumento StepOne, configúrelo para la monitorización, tal
y como se explica en la Guía de instalación de Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System.
d. Haga clic en Send Experiment (Enviar experimento) para enviar el
experimento al instrumento StepOne a través de la red.

1b experiments\Relative Standard Curve Example.eds

1c

1d

e. Cuando se le solicite, haga clic en OK (Aceptar) para cerrar el mensaje de

confirmación.
f. Vaya al paso 6.

2. Si el instrumento StepOne no está conectado al ordenador, realice los pasos 2a a 2d

para transferir el experimento utilizando una unidad USB.
a. Conecte la unidad USB a uno de los puertos USB del ordenador.

b. En el software StepOne, seleccione Save (Guardar)Save As (Guardar

como).
c. En el cuadro de diálogo Save (Guardar), desplácese a la unidad USB y, a
continuación, haga clic en Save (Guardar).
d. Extraiga la unidad USB del ordenador y, a continuación, conéctela al puerto
USB del instrumento StepOne.

Notas

74 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Inicio de la reacción

3. Toque la pantalla táctil del instrumento StepOne y, a continuación, toque .

4. En la pantalla del menú principal, toque Browse Experiments (Buscar

experimentos).

5. En la pantalla Browse Methods (Métodos de búsqueda), toque (Folders)

(Carpetas).

6. En la pantalla Choose an Experiment Category (Elija una categoría de

experimento):
• Toque USB si ha transferido el experimento a una unidad USB.
• Toque Default (Predeterminado) si ha enviado el experimento a través de una
conexión de red.

7. En la pantalla Browse USB/Default Experiments (Buscar USB/experimentos

predeterminados):
a. Toque Relative Standard Curve Example (Ejemplo de curva estándar
relativa) para seleccionar el experimento.
b. Toque Start Run (Iniciar proceso).

Ejemplo de curva estándar

7a

7b

8. En la pantalla Run Parameters (Parámetros de proceso):

a. Toque el campo Reaction Volume (Volumen de reacción), utilice el teclado
para escribir 20 µL y, a continuación, toque Done (Finalizado).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 75
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Monitorización de la reacción

b. Toque Start Run (Iniciar proceso).

20
8a

8b

Monitorización de la reacción
Monitorice el progreso desde un ordenador que ejecute el software StepOne o desde la
pantalla táctil del instrumento StepOne. La forma en la que monitorice el proceso
depende de la disposición del sistema StepOne:

Disposición Descripción Consulte…

Conectada El cable del sistema StepOne conecta el “Monitorización

ordenador al instrumento StepOne. conectada” más abajo

Autónoma El ordenador y el instrumento StepOne están “Monitorización remota”

(en red) conectados a la misma red. en la página 83

Autónoma El ordenador y el instrumento StepOne no están “Monitorización

(básica) conectados. autónoma” en la
página 86

Notas

76 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Monitorización de la reacción

Monitorización Si el ordenador está directamente conectado al instrumento StepOne por medio del cable
conectada del sistema StepOne, puede ver el progreso de la reacción a tiempo real de la forma que
se describe a continuación. Durante el proceso, observe periódicamente las tres gráficas
disponibles en el software StepOne para detectar posibles problemas.

# Para... Acción

A Detener el proceso 1. En el software StepOne, haga clic en STOP RUN (Detener

proceso).
2. En el cuadro de diálogo Stop Run (Detener proceso), haga
clic en una de las siguientes opciones:
– Stop Immediately (Detener inmediatamente) para
detener el proceso inmediatamente.
– Stop after Current Cycle/Hold (Detener después de
ciclo actual/espera) para detener el proceso después del
ciclo o la espera actual.
– Cancel (Cancelar) para continuar el proceso.

B Ver los datos de Seleccione Amplification Plot (Gráfica de amplificación).

amplificación a tiempo
Consulte “Acerca de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de
real
amplificación)” en la página 78.

C Ver los datos de la Seleccione Temperature Plot (Gráfica de temperatura).

temperatura de la
Consulte “Acerca de la pantalla Temperature Plot (Gráfica de
reacción a tiempo real
temperatura)” en la página 80.

D Ver el progreso de la Seleccione Run Method (Protocolo de termociclado).

reacción en la pantalla
Consulte “Acerca de la pantalla Run Method (Protocolo de
Run Method (Protocolo
termociclado)” en la página 81.
de termociclado)

E Activar/desactivar las Active o desactive la opción Enable Notifications (Activar

opciones de notificaciones).
notificación

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 77
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Monitorización de la reacción

B E

C
D

Acerca de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación)

La pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) permite ver la amplificación
de las muestras a medida que el instrumento StepOne recoge datos de fluorescencia
durante una reacción. Si se configura un protocolo de recogida de datos a tiempo real, en
la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) aparecen los datos de los
pocillos seleccionados en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa). La
gráfica representa la fluorescencia de los distintos fluorocromos normalizados (∆Rn) y el
número de ciclos. La siguiente figura muestra la pantalla Amplification Plot (Gráfica de
amplificación) durante el experimento de ejemplo.

Notas

78 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Monitorización de la reacción

La pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) es útil para identificar y

examinar amplificaciones anormales. Una amplificación anormal puede incluir lo
siguiente:
• Aumento de la fluorescencia en los pocillos de control negativo.
• Ausencia de fluorescencia detectable en el ciclo esperable (determinada a partir de
experimentos similares anteriores utilizando los mismos reactivos en las mismas
condiciones).
Si se observa una amplificación anormal o una completa ausencia de señal, solucione el
error de la forma que se explica en la ayuda del software StepOne (haga clic en en la
barra de herramientas o seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne)).

Nota: Para ver los datos de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación),
seleccione los pocillos que desea ver en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de
placa).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 79
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Monitorización de la reacción

Acerca de la pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura)

Durante una reacción, la pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura) muestra las
temperaturas del bloque, la cubierta caliente y las muestras (calculadas) a tiempo real. La
siguiente figura muestra la pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura) durante el
experimento de ejemplo.

Para... Acción

A Añadir/quitar gráficas de Seleccione Sample (Muestra), Heated Cover

temperatura (Cubierta caliente) o Sample Block (bloque) para
cambiar la presencia de los datos asociados en la
gráfica.

B Cambiar el tiempo que se muestra Seleccione View (Ver)(duración).

por gráfica

C Restringir el eje Y de la gráfica Seleccione Fixed View (Vista fija).

La pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura) puede ser útil para identificar
averías del hardware. Al monitorizar la pantalla Temperature Plot (Gráfica de
temperatura), observe las gráficas Sample (Muestra), Heated Cover (Cubierta caliente) y
Sample Block (Bloque) para detectar algún comportamiento anormal.
• En general, las gráficas Sample (Muestra) y Block (Bloque) deberían ser más o
menos un espejo la una de la otra. Una desviación significativa de las gráficas puede
indicar un problema.
• La gráfica Heated Cover (Cubierta caliente) debería mantener la temperatura
constante que se especifica en el protocolo de termociclado. Cualquier desviación
de la temperatura puede indicar un problema.

Notas

80 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Monitorización de la reacción

Si observa una gráfica de temperatura anormal, solucione el error de la forma que se

explica en la ayuda del software StepOne (haga clic en en la barra de herramientas o
seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne)).

Nota: La temperatura de las muestras que se indica en el grupo Current Temperatures

(Temperaturas actuales) es un valor estimado.

Acerca de la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado)

Después de comenzar el proceso, el sistema StepOne muestra su progreso en la pantalla
Run Method (Protocolo de termociclado). La vista informa del progreso de la reacción en
referencia con el perfil térmico de la misma. La siguiente figura muestra la pantalla Run
Method (Protocolo de termociclado) durante el experimento de ejemplo.

Para... Acción

A Cambiar el protocolo 1. En el panel de navegación, haga clic en Run Method

de termociclado (Protocolo de termociclado).
(añadir ciclos, una
2. En la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado),
espera o una curva de
haga cualquiera de las siguientes acciones:
disociación)
– Escriba el número de ciclos que se van a aplicar a la fase
cíclica.
– Seleccione Add Melt Curve Stage to End (Añadir curva
de disociación al final) si desea añadir una curva de
disociación al final de la reacción.
– Seleccione Add Holding Stage to End (Añadir fase de
espera al final) si desea añadir una fase de espera al final
de la reacción.
3. Haga clic en Send to Instrument (Enviar al instrumento).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 81
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Monitorización de la reacción

Nota: Si aparece una alerta, haga clic en el error para obtener más información y
solucionar el problema tal y como se explica en la ayuda del software StepOne (haga clic
en en la barra de herramientas o seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de
StepOne)).

Notas

82 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Monitorización de la reacción

Monitorización Si el instrumento StepOne está conectado a una red, puede utilizar la función de
remota monitorización remota del software StepOne para ver el progreso de la reacción a tiempo
real desde cualquier ordenador de la red.

¡IMPORTANTE! Los ordenadores en red no pueden controlar el instrumento StepOne,

sólo monitorizarlo.

# Para... Acción

A Ver los datos de Haga clic en Amplification Plot (Gráfica de amplificación).

amplificación a tiempo
Consulte “Acerca de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de
real
amplificación)” en la página 78.

B Ver los datos de la Haga clic en Temperature Plot (Gráfica de temperatura).

temperatura de la
Consulte “Acerca de la pantalla Temperature Plot (Gráfica de
reacción a tiempo real
temperatura)” en la página 80.

C Ver el progreso de la Haga clic en Run Method (Protocolo de termociclado).

reacción en la pantalla
Consulte “Acerca de la pantalla Run Method (Protocolo de
Run Method (Protocolo
termociclado)” en la página 81.
de termociclado)

D Activar/desactivar las Active o desactive la opción Enable Notifications (Activar

opciones de notificaciones).
notificación
Consulte “(Opcional) Activación de las notificaciones” en la
página 71.

A B C

Para monitorizar el instrumento StepOne de manera remota:

1. En el software StepOne, seleccione Instrument (Instrumento)Remote Monitor

(Supervisor remoto).

2. En la barra de navegación, seleccione el instrumento StepOne.

Si en la barra de navegación no aparece el instrumento StepOne:

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 83
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Monitorización de la reacción

a. Haga clic en Add Instrument (Añadir instrumento).

b. Haga clic en el campo Instrument Name (Nombre de instrumento) y, a

continuación, escriba el nombre del instrumento.
c. Haga clic en el campo Host Name (Nombre de host) y, a continuación,
introduzca la dirección IP del instrumento.
d. Haga clic en Save & Exit (Guardar y salir).

2b

2c

2d

Nota: Para obtener más información acerca de la configuración del instrumento

StepOne para el uso en red o la monitorización remota, consulte la Guía de
instalación de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System.

3. Haga clic en (Start monitoring this instrument) (Comenzar a monitorizar este

instrumento) de su instrumento.

Notas

84 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Monitorización de la reacción

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 85
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Monitorización de la reacción

Monitorización Si ha comenzado la reacción desde el instrumento StepOne, puede ver el progreso de la

autónoma misma desde la pantalla táctil. La pantalla Run Method (Protocolo de termociclado)
muestra el método del experimento y resalta los pasos del perfil térmico a medida que el
instrumento va realizándolos.

# Para... Acción

A Añadir una curva de Toque (Add Dissociation Curve) (Añadir curva de

disociación a la disociación) y, a continuación, toque OK (Aceptar).
reacción

B Ver el tiempo que Toque Display Method Time (Ver tiempo de método) y, a
queda en el proceso continuación, toque para regresar a la pantalla Run Method
(Protocolo de termociclado).

C Detener el proceso Toque Stop (Detener) y, a continuación, toque:

• Stop (Detener) para detener el proceso después de que el
instrumento StepOne complete el ciclo o la espera actual.
• Abort (Abortar) para detener el proceso inmediatamente.
• para continuar el proceso sin ningún cambio.

D Ver información del Toque View Method Information (Ver información del
experimento método) y, a continuación, toque para regresar a la pantalla
Run Method (Protocolo de termociclado).

E Ver el registro de Toque la barra de estado para ver el registro de errores.

errores

D B

A C

Notas

86 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos

Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos

Cuando el instrumento StepOne muestre la pantalla Run History (Historial de la
reacción), descargue la placa de reacción del instrumento StepOne y transfiera los datos
del experimento al ordenador para analizarlos.

Descarga de la PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Durante el uso del

placa de reacción instrumento, la temperatura del bloque puede superar los 100 °C. Mantenga las manos
alejadas hasta que la bandeja de las muestras alcance la temperatura ambiente.

Nota: Cuando el instrumento StepOne complete una reacción, el sistema guardará los
detalles en el historial de reacciones, que permanece en el sistema hasta que el sistema
completa otro proceso.

1. Cuando aparezca la pantalla Run Report (Informe de proceso) en la pantalla táctil

del instrumento StepOne, toque .

2. Abra la bandeja del instrumento.

3. Saque la placa de reacción del bloque.

4. Cierre con cuidado la bandeja del instrumento.

¡IMPORTANTE! No apague el instrumento StepOne después de una reacción. El

instrumento activa automáticamente un modo de hibernación cuando no se está
utilizando.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 87
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos

Selección de un Transfiera el experimento al ordenador para analizarlo, de acuerdo con la disposición del
método de sistema StepOne:
transferencia de
datos Disposición Descripción Consulte…

Conectada El cable del sistema StepOne conecta el “Transferencia de

ordenador al instrumento StepOne. datos conectada” más
abajo

Autónoma El ordenador y el instrumento StepOne están “Transferencia de datos

(en red) conectados a la misma red. remota” en la página 88

Autónoma El ordenador y el instrumento StepOne no “Transferencia de

(básica) están conectados. datos autónoma” en la
página 89

Transferencia de Si el ordenador está conectado directamente al instrumento StepOne por medio del cable
datos conectada del sistema StepOne, no hay que hacer nada. El software StepOne transfiere
automáticamente los datos del experimento al instrumento StepOne después de la
reacción.

Transferencia de Si el ordenador y el instrumento StepOne están conectados a la misma red Ethernet,

datos remota envíe el experimento al instrumento StepOne a través de la red:

1. En el software StepOne, haga clic en Download Experiment from Instrument

(Descargar experimento del instrumento).

2. En el cuadro de diálogo Download Experiment from Instrument (Descargar

experimento del instrumento), seleccione Select Instrument (Seleccionar
instrumento)<su instrumento>.

3. Seleccione Experiment (Experimento)Relative Standard Curve Example

(Ejemplo de curva estándar relativa).

4. En el campo Download File (Descargar archivo), haga clic en Browse (Examinar),

seleccione una carpeta en la que recibir los datos del experimento y, a continuación,
haga clic en Select (Seleccionar).

5. Haga clic en Download Experiment (Descargar experimento) para descargar el

experimento desde el instrumento StepOne al ordenador a través de la red.

2 3
4

6. Cuando se le solicite, haga clic en OK (Aceptar) para cerrar el mensaje de

confirmación.

Notas

88 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos

Transferencia de Si el ordenador no está conectado al instrumento StepOne, utilice la unidad USB para
datos autónoma transferir el experimento al instrumento:

1. Si aún no está conectada al instrumento, conecte una unidad USB al puerto USB.

2. Toque la pantalla táctil del instrumento StepOne para activarla y, a continuación,

toque .

3. En el menú principal, toque Collect Results (Recoger resultados) para guardar los
datos en la unidad USB.
Si el instrumento StepOne no encuentra la unidad USB, toque OK (Aceptar), espere
30 segundos y, a continuación, vuelva a tocar Collect Results (Recoger resultados).

4. Cuando aparezca un mensaje que le informa de que los datos se han transferido
correctamente, toque OK (Aceptar).

5. Extraiga la unidad USB del instrumento StepOne y, a continuación, conéctela al

puerto USB del ordenador.

6. En el escritorio del ordenador, utilice el explorador de Windows para abrir la unidad

USB.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 89
cuantificación relativa
 Capítulo 4 Realización del experimento de curva estándar relativa
Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos

7. Copie el archivo Relative Standard Curve Example.eds en:

<unidad>:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments
donde <unidad> es la unidad del disco duro del ordenador en la que está instalado
el software de StepOne. La unidad de instalación predeterminada del software es la
unidad C.

Notas

90 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5

Análisis del experimento de curva

estándar relativa
Este capítulo cubre los siguientes temas:
■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
■ Sección 5.1 Revisión de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
■ Sección 5.2 Solución de problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en
esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o
seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 91
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Resumen del capítulo

Resumen del capítulo

El software StepOne™ analiza los datos mediante el método de cuantificación de curva
estándar relativa. En la primera sección de este capítulo, se explica cómo revisar los datos
analizados utilizando las pantallas de análisis y cómo presentar los datos. Si los
resultados son cuestionables, en la Sección 2 de este capítulo se explican algunos pasos
para solucionar los problemas.

Nota: El experimento de curva estándar relativa de ejemplo incluye cuatro pocillos

problemáticos que aparecen marcados con un aviso. Los avisos reflejan problemas
comunes que se puede encontrar al realizar sus propios experimentos. Se incluyen
procedimientos para ver los avisos y omitir uno de los pocillos.

Flujo de trabajo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para analizar el experimento de ejemplo
del experimento que se incluye en esta guía de introducción.
de ejemplo
Experimento de curva estándar relativa
Inicio del experimento

Diseño del experimento (Capítulo 2)

Preparación de las reacciones (Capítulo 3)

Realización del experimento (Capítulo 4)

Análisis del experimento (Capítulo 5)
Sección 1. Revisión de los resultados:
1. Analice.
2. Revise la pantalla Standard Curve (Curva estándar).
3. Revise la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación).
4. Revise la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) o
la tabla de pocillos.
5. Presente los datos.
Sección 2. Solución de problemas:
1. Revise las opciones de análisis; ajuste la línea basal y el umbral.
2. Revise la pantalla QC Summary (Resumen QC).
3. Omita pocillos.
4. Revise la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente).
5. Revise la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos).


Fin del experimento

Notas

92 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Sección 5.1 Revisión de los resultados

Sección 5.1 Revisión de los resultados

Esta sección cubre los siguientes temas:

■ Análisis del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
■ Visualización de la curva estándar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
■ Revisión de la gráfica de amplificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
■ Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos . . . . . . . . . . . . 108
■ Presentación de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 93
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Análisis del experimento

Análisis del experimento

El software StepOne analiza el experimento y muestra los resultados en las pantallas de
análisis (por ejemplo, en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), QC
Summary (Resumen QC), etc.)

Acerca del Para el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, utilice el archivo de datos que
experimento de se instala con el software StepOne. Este archivo de datos se ha creado con los mismos
ejemplo parámetros de diseño que se indican en el Capítulo 2 y luego se ha procesado y analizado
en un instrumento StepOne™.
Encontrará el archivo de datos del experimento de ejemplo en su ordenador:
<unidad>:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments\examples
donde <unidad> es la unidad del disco duro del ordenador en la que está instalado el
software StepOne. La unidad de instalación predeterminada del software es la unidad C.

Análisis del 1. Si aún no se está ejecutando el software StepOne, haga doble clic en (acceso
experimento de directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los
ejemplo programas)Applied BiosystemsStepOneStepOne v2.0.

2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Open (Abrir).

3. En el cuadro de diálogo Open (Abrir), desplácese hasta la carpeta examples

(ejemplos).

4. Haga doble clic en Relative Standard Curve Example (Ejemplo de curva estándar
relativa) para abrir el archivo de datos del experimento de ejemplo.

Notas

94 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Análisis del experimento

5. Haga clic en Analyze (Analizar). El software analiza los datos utilizando las
opciones de análisis predeterminadas.

6. Consulte “Elementos del software” más adelante y “Consejos de desplazamiento”

en la página 98 para obtener información acerca de cómo desplazarse por las
pantallas de análisis.

Directrices Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa:

• Inmediatamente después de una reacción, el software StepOne analiza
automáticamente los datos utilizando las opciones de análisis predeterminadas y, a
continuación, muestra la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) en
el ordenador.
• Para volver a analizar los datos, seleccione todos los pocillos de la disposición de la
placa y, a continuación, haga clic en Analyze (Analizar).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 95
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Análisis del experimento

Elementos del A continuación, se ilustran los elementos del software StepOne de las pantallas de
software análisis.

1. Barra de menús: muestra los menús disponibles en el software:

• File (Archivo)
• Edit (Edición)
• Instrument (Instrumento)
• Analysis (Análisis)
• Tools (Herramientas)
• Help (Ayuda)

2. Barra de herramientas: muestra las herramientas disponibles en el software:

• New Experiment (Experimento nuevo)
• Open (Abrir)
• Save (Guardar)
• Close (Cerrar)
• Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al instrumento)
• Download Experiment from Instrument (Descargar experimento del
instrumento)
• Export (Exportar)
• Print Report (Imprimir informe)

3. Cabecera del experimento: indica el nombre del experimento, el tipo de experimento

y los reactivos del experimento abierto.

4. Panel de menús del experimento: incluye vínculos a las siguientes pantallas del
software:
• Pantallas de configuración
• Pantallas del perfil de reacción
• Pantallas de análisis:
–Amplification Plot (Gráfica de amplificación)
–Standard Curve (Curva estándar)
–Gene Expression (Expresión génica)
–Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente)
–Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos)
–QC Summary (Resumen QC)
–Multiple Plots View (Vista de múltiples gráficas)

5. Panel de gráficas: muestra la pantalla de análisis seleccionada para el experimento

abierto.

6. Fichas de visualización: muestra la disposición de la placa o la tabla de pocillos del

experimento abierto.

Notas

96 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Análisis del experimento

7. Fichas del experimento: muestra una ficha por cada experimento abierto.

1
2
3
6

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 97
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Análisis del experimento

Consejos de Cómo seleccionar pocillos

desplazamiento Para ver pocillos específicos en las pantallas de análisis, seleccione los pocillos en la
ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa) de la siguiente manera:

1. Para seleccionar pocillos de un tipo específico, utilice los menús desplegables Select
Wells With (Seleccionar pocillos con): seleccione Sample (Muestra), Target
(Diana) o Task (Tarea) y, a continuación, seleccione el nombre de la muestra, el gen
diana o la tarea.

2. Para seleccionar un solo pocillo, haga clic en él en la disposición de la placa.

3. Para seleccionar varios pocillos, haga clic y arrastre el ratón por encima de los
pocillos deseados, pulse CTRL+clic, o pulse Mayús+clic en la disposición de la
placa.

4. Para seleccionar los 48 pocillos, haga clic en la esquina superior izquierda de la

disposición de la placa.

Notas

98 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Análisis del experimento

Cómo ver múltiples gráficas

Utilice la vista Multiple Plots (Múltiples gráficas) para ver simultáneamente hasta cuatro
gráficas. Para desplazarse por la vista Multiple Plots (Múltiples gráficas):

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Multiple Plots View (Vista de múltiples gráficas).

2. Para ver cuatro gráficas, haga clic en Show plots in a 2 ✕ 2 matrix (Mostrar
gráficas en una matriz de 2 X 2).

3. Para ver dos gráficas en filas, haga clic en Show plots in two rows (Ver gráficas
en dos filas).

4. Para ver dos gráficas en columnas, haga clic en Show plots in two columns
(Ver gráficas en dos columnas).

5. Para ver una gráfica específica, seleccione la gráfica en el menú desplegable situado
encima de la visualización de cada gráfica.

5 2 3

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 99
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Visualización de la curva estándar

Visualización de la curva estándar

La pantalla Standard Curve (Curva estándar) muestra la curva estándar de las muestras
designadas como estándares. El software StepOne calcula la cantidad de un gen diana
desconocido a partir de la curva estándar.

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, se pueden revisar los siguientes
experimento de valores en la pantalla Standard Curve (Curva estándar):
ejemplo • Pendiente/eficiencia de amplificación
• Valor R2 (coeficiente de correlación)
• Valores CT

Visualización de 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

la curva estándar (Análisis) Standard Curve (Curva estándar).

Nota: Si en la pantalla Standard Curve (Curva estándar) no aparece ningún dato,

haga clic en Analyze (Analizar).

2. Para ver los 48 pocillos en la pantalla Standard Curve (Curva estándar), haga clic en
la esquina superior izquierda de la disposición de la placa en la ficha View Plate
Layout (Ver disposición de placa).

3. En el menú desplegable Target (Diana), seleccione All (Todas).

4. En el menú desplegable Plot Color (Color de gráfica), seleccione Default

(Predeterminado).

5. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).

6. Observe los valores que se muestran bajo la curva estándar. En el experimento de

ejemplo, los valores de cada gen diana se encuentran en los rangos aceptables:

Eficiencia de
Diana Pendiente Valor R2 amplificación
(Eff%)

GAPDH −3,438 1 95,363

c-myc −3,236 0,995 103,729

7. Compruebe si todas las muestras están dentro del rango de la curva estándar. En el
experimento de ejemplo, todas las muestras (puntos azules) están dentro de la curva
estándar (puntos rojos).

Notas

100 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Visualización de la curva estándar

3 4

8. Compruebe los valores CT:

a. Haga clic en la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos).

b. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate

(Réplica).
c. Fíjese en los valores de la columna CT. En el experimento de ejemplo, los
valores CT están dentro del rango esperado (>8 y <35).

Nota: Los valores CT de los pocillos D7, D8 y E1 son >35 debido a la poca
cantidad de gen diana. No es necesario omitir los pocillos del análisis.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 101
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Visualización de la curva estándar

8a

8b

8c

Directrices de Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, busque:

análisis • Valores de pendiente/eficiencia de amplificación: la eficiencia de la
amplificación se calcula utilizando la pendiente de la línea de regresión de la curva
estándar. Una pendiente próxima al −3,3 indica una eficiencia de amplificación de
la PCR óptima, es decir, del 100%. Factores que afectan a la eficiencia de la
amplificación:
– Rango de cantidades estándar: para obtener medidas de la eficiencia más exactas,
utilice un amplio rango de cantidades estándar, de 5 a 6 órdenes de magnitud.
– Número de réplicas estándar: para obtener mediciones más precisas de la
eficiencia, incluya réplicas para reducir los efectos de las imprecisiones del
pipeteo.
– Apantalladores de la PCR: los apantalladores de la PCR de la reacción pueden
reducir la eficiencia de la amplificación.
• Valores R2 (coeficiente de correlación): el valor R2 mide cuánto se ajusta la línea
de regresión a los puntos de CT del estándar. El valor 1,00 indica un ajuste perfecto
entre la línea de regresión y los puntos de datos. Es deseable que el valor R2 sea
>0,99.
• Valores CT: el ciclo umbral (CT) es el número de ciclo de PCR en el que la curva de
amplificación corta el umbral. Es deseable que el valor CT sea >8 y <35. Si el valor
CT es <8, eso indica que en la reacción hay demasiado molde. Si el valor CT es >35,
eso indica que en la reacción hay poca cantidad de molde. Cuando los valores CT
son >35, es de esperar que haya una desviación estándar mayor.

Notas

102 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la gráfica de amplificación

Si el experimento no cumple las directrices anteriores, solucione los problemas de la

siguiente forma:
• Omita pocillos (consulte “Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118).
o
• Vuelva a realizar el experimento.

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La pantalla Standard Curve (Curva estándar), acceda a la ayuda del software
StepOne haciendo clic en o pulsando F1.
• La eficiencia de la amplificación, consulte Amplification Efficiency of TaqMan®
Gene Expression Assays Application Note.

Revisión de la gráfica de amplificación

En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), se muestra la amplificación
de todas las muestras de los pocillos seleccionados. Hay disponibles tres gráficas:
• ∆Rn vs Cycle (∆Rn vs ciclo): ∆Rn es la variación de la señal de fluorescencia
normalizada generada en cada ciclo de la reacción de PCR y son los datos a partir de
los cuales se calcula CT. En esta gráfica, ∆Rn se muestra en función del número de
ciclo. La gráfica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares y
para ver los valores del umbral y línea basal de la reacción.
• Rn vs Cycle (Rn vs ciclo): Rn es la fluorescencia de fluorocromo del notificador
normalizada. En esta gráfica, Rn se representa en función del número de ciclo. La
gráfica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares.
• CT vs Well (CT vs pocillo): el ciclo umbral (CT) es el número de ciclo de PCR en el
cual el nivel de fluorescencia corta el umbral. En esta gráfica, CT se representa en
función de la posición del pocillo. La gráfica sirve para localizar amplificaciones
con valores atípicos.
Cada gráfica se puede ver de las siguientes formas: lineal o log10.

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, hay que revisar cada gen diana
experimento de en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) para buscar:
ejemplo • Valores de umbral y línea basal correctos
• Valores atípicos

Revisión de la 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

gráfica de (Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación).
amplificación
Nota: Si en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) no aparece
ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. Observe los pocillos de GAPDH en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de

amplificación):

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 103
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la gráfica de amplificación

a. Haga clic en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa).

b. En los menús desplegables Select Wells With (Seleccionar pocillos con),

seleccione Target (Diana) y, a continuación, GAPDH.

2a 2b

3. En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación):

a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione ∆Rn vs Cycle
(∆Rn vs ciclo).
b. En el menú desplegable Color Plot By (Colorear gráfica por), seleccione Well
(Pocillo).
c. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la
gráfica).

4. Observe los valores de la línea basal:

a. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Linear
(Lineal).
b. Active la casilla de verificación Baseline (Línea basal) para ver los ciclos
inicial y final de la línea basal.
c. Compruebe que la línea basal está ajustada correctamente. En el experimento
del ejemplo, la línea basal termina antes de que se inicie la amplificación.

Notas

104 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la gráfica de amplificación

3a 4a 3b

3c

4b

5. Observe los valores de umbral:

a. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Log
(Registro).
b. En el menú desplegable Target (Diana), seleccione GAPDH.

c. Active la casilla de verificación Threshold (Umbral) para ver el umbral.

d. Compruebe que el umbral está situado correctamente. En el experimento de

ejemplo, el umbral está en la fase exponencial.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 105
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la gráfica de amplificación

5a

5b
5c

6. Busque cualquier valor atípico:

a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione CT vs Well (CT
vs pocillo).
b. Busque pocillos fuera de la curva de amplificación. En el experimento de
ejemplo, no hay ningún valor atípico para GAPDH.

6a

Notas

106 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la gráfica de amplificación

7. Repita los pasos 2 a 6 para los pocillos de c-myc. En el experimento de ejemplo, hay
un valor atípico para el gen c-myc (pocillo D1). Omitirá este pocillo en la sección de
solución de problemas (“Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118).

Directrices de Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, busque:

análisis • Los valores de línea basal y umbral correctos: el software StepOne calcula
automáticamente los valores de línea basal y umbral dando por hecho que los datos
tienen una gráfica de amplificación típica. Una gráfica de amplificación típica
tiene:
a. Una fase de meseta o plateau

b. Una fase lineal

c. Una fase exponencial (geométrica)

d. Un determinado ruido de fondo

e. Una línea basal

a
b
Umbral
c
∆Rn

e
Ciclo

¡IMPORTANTE! Los errores en el experimento (por ejemplo, errores de

contaminación o pipeteo) pueden producir curvas de amplificación atípicas que
pueden derivar a cálculos incorrectos de los valores de línea basal y umbral por
parte del software StepOne. Por lo tanto, Applied Biosystems recomienda examinar
la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) y revisar los valores de
línea basal y umbral asignados a cada pocillo después del análisis.
• Valores atípicos
Si el experimento no cumple las directrices anteriores, solucione los problemas de la
siguiente forma:
• Ajuste manualmente la línea basal y/o el umbral (consulte “Revisión de las opciones
de análisis” en la página 114).
O
• Omita pocillos (consulte “Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 107
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos

Para obtener más Para obtener más información acerca de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de
información amplificación), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando
F1.

Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de

pocillos
La pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) muestra los resultados
de los cálculos de cuantificación relativa a través del perfil de expresión génica. Hay
disponibles dos gráficas:
• RQ vs Target (Cuantificación relativa vs diana): agrupa los valores de
cuantificación relativa (RQ) por diana. Se traza cada muestra para cada gen diana.
• RQ vs Sample (Cuantificación relativa vs muestra): agrupa los valores de
cuantificación relativa (RQ) por muestra. Se traza cada gen diana para cada muestra.
Cada gráfica se puede ver de las siguientes formas: lineal, log10, Ln, log2.
En la tabla de pocillos, se muestran datos de cada pocillo de la placa de reacción,
incluidos:
• El nombre de la muestra, el nombre de el gen diana, la tarea y los fluorocromos
• El ciclo umbral calculado (CT), la fluorescencia normalizada (Rn) y los valores de
cantidades
• Avisos

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, se revisa:

experimento de • Para cada gen diana de la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión
ejemplo génica) para el nivel de expresión (o cambio en número de veces de la expresión) de
la muestra de gen diana en relación con la muestra de referencia.
• La tabla de pocillos para evaluar la precisión de los grupos de réplicas.

Revisión de la 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

gráfica de (Análisis) Gene Expression (Expresión génica).
expresión génica
y la tabla de Nota: Si en la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) no
pocillos aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. En la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica):

a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione RQ vs Sample
(Cuantificación relativa vs Muestra).
b. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Log10.

c. En el menú desplegable Orientation (Orientación), seleccione Vertical Bars

(Barras verticales).

Notas

108 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos

d. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).
En el experimento de ejemplo, se muestra el nivel de expresión de c-myc en el
hígado en relación con su nivel de expresión en la muestra de referencia (riñón).
Dado que la muestra de referencia se compara consigo misma, el nivel de expresión
es 1. Si el resultado se muestra en el tipo de gráfico Log10, el nivel de expresión de
la muestra de referencia aparece como 0 en el gráfico (log10 de 1=0).

2a 2b 2c

2d

3. Revise la tabla de pocillos:

a. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis
(Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación) y, a
continuación, seleccione la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos).
b. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate
(Réplica).
c. Fíjese en la columna CT SD para evaluar la precisión de los grupos de réplicas.
En el experimento de ejemplo, hay un valor atípico (pocillo D1). Este pocillo se
omite en la sección de solución de problemas (“Omisión de pocillos para el
análisis” en la página 118).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 109
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos

3a

3b

3c

3c

Nota: Para mostrar u ocultar columnas en la tabla de pocillos, marque/desmarque el

nombre de columna en el menú desplegable Show in Table (Mostrar en tabla).

Directrices de Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, busque:

análisis • Diferencias en la expresión génica (como un cambio en número de veces de la
expresión) en relación con la muestra de referencia.
• Desviación estándar en los grupos de réplicas (valores CT SD). Si es preciso, omita
los valores atípicos (“Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118).

Para obtener más Para obtener más información acerca de la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de
información expresión génica) o la tabla de pocillos, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo
clic en o pulsando F1.

Notas

110 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Presentación de los datos

Presentación de los datos

Hay distintas formas de presentar los datos del experimento:
• Guardando la gráfica como un archivo de imagen
• Imprimiendo la gráfica
• Imprimiendo la disposición de la placa
• Creando diapositivas
• Imprimiendo un informe
• Exportando datos
Para obtener más información acerca de estos procedimientos, acceda a la ayuda del
software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 111
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Presentación de los datos

Notas

112 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Sección 5.2 Solución de problemas

Sección 5.2 Solución de problemas

Esta sección cubre los siguientes temas:

■ Revisión de las opciones de análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
■ Revisión del resumen QC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
■ Omisión de pocillos para el análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
■ Revisión de la gráfica multicomponente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
■ Revisión de la gráfica de datos brutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 113
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión de las opciones de análisis

Revisión de las opciones de análisis

El cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis) muestra las opciones de
análisis del ciclo umbral (CT), los avisos, la cuantificación relativa y las opciones
avanzadas. Si las opciones de análisis predeterminadas del software StepOne no son
adecuadas para el experimento, puede cambiarlas en el cuadro de diálogo Analysis
Settings (Opciones de análisis) y, a continuación, volver a analizar el experimento.

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, se utilizan las opciones de
experimento de análisis predeterminadas sin ningún cambio.
ejemplo

Revisión de las 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis
opciones de (Análisis).
análisis
2. Haga clic en Analysis Settings (Opciones de análisis) para abrir el cuadro de
diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis).

3. En el experimento de ejemplo, se utilizan opciones de análisis para cada ficha:

• CT Settings (Opciones de CT)
• Flag Settings (Opciones de avisos)
• Relative Quantification Settings (Opciones de cuantificación relativa)
• Advanced Settings (Opciones avanzadas)

Notas

114 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión de las opciones de análisis

Directrices de A menos que ya haya determinado cuál son las opciones óptimas para el experimento,
análisis utilice las opciones de análisis predeterminadas en el software StepOne. Si las opciones
predeterminadas no son adecuadas para el experimento, puede cambiar:
• CT Settings (Opciones de CT): utilice esta ficha para ajustar manualmente el umbral
y la línea basal. Si ajusta manualmente el umbral y la línea basal, Applied
Biosystems recomienda lo siguiente:

Opción Recomendación

Umbral Introduzca un valor para el umbral de manera que:

• Esté por encima del ruido de fondo.
• Esté por debajo de las fases de meseta o plateau y fase lineal de
la curva de amplificación.
• Esté dentro de la fase exponencial de la curva de amplificación.

Línea basal Seleccione los valores Start Cycle (Ciclo inicial) y End Cycle (Ciclo
final) antes de que comience la amplificación.

• Flag Settings (Opciones de avisos): utilice esta ficha para:

– Ajustar la sensibilidad para que se marquen más o menos pocillos.
– Cambiar los parámetros de los avisos que aplica el software StepOne.
• Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa): utilice esta
ficha para:
– Cambiar la muestra de referencia y/o el control endógeno.
– Seleccionar el algoritmo que se debe utilizar para determinar los valores mínimos
y máximos de RQ (nivel de confianza o desviaciones estándar).
• Advanced Settings (Opciones avanzadas): utilice esta ficha para cambiar las
opciones de línea basal pocillo a pocillo.

Para obtener más Para obtener más información acerca de las opciones de análisis, acceda al software
información StepOne pulsando F1 cuando se abra el cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones
de análisis).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 115
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión del resumen QC

Revisión del resumen QC

La pantalla QC Summary (Resumen QC) muestra una lista de avisos del software
StepOne, e incluye la frecuencia y ubicación de los mismos en el experimento abierto.

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, hay que revisar la pantalla QC
experimento de Summary (Resumen QC) para saber si los datos del experimento han desencadenado
ejemplo algún aviso:
• Los pocillos D7, D8 y E1 han producido datos que han desencadenado el aviso
HIGHSD.
• El pocillo D1 ha producido datos que han desencadenado el aviso OUTLIERRG.

Revisión del 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis
resumen QC (Análisis) QC Summary (Resumen QC).

Nota: Si en la pantalla QC Summary (Resumen QC) no aparece ningún dato, haga

clic en Analyze (Analizar).

2. Revise el resumen de avisos. En el experimento de ejemplo, hay 4 pocillos

marcados.

3. En la tabla Flag Details (Detalles de aviso), observe las columnas Frequency

(Frecuencia) y Wells (Pocillos) para determinar qué avisos aparecen en el
experimento. En el experimento de ejemplo:
• El aviso HIGHSD aparece 3 veces, en los pocillos D7, D8 y E1.
• El aviso OUTLIERRG aparece 1 vez en el pocillo D1.

Nota: Un valor 0 en la columna Frequency (Frecuencia) indica que el aviso no

aparece en el experimento.

4. Por cada aviso que aparezca en el experimento, haga clic en la fila de avisos para ver
información detallada acerca del aviso. En el experimento de ejemplo:
a. El aviso HIGHSD (pocillos D7, D8 y E1) indica una gran desviación estándar
en el grupo de réplicas. Esto es lo esperado para los valores CT >35 debido a la
poca cantidad de gen diana. No es necesario omitir los pocillos del análisis.
b. El aviso OUTLIERRG (pocillo D1) indica que en el grupo de réplicas hay un
valor atípico. Vaya a “Omisión de pocillos para el análisis” en la página 118
para quitar el pocillo D1.

Notas

116 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión del resumen QC

2
3

Posibles avisos En los experimentos de curva estándar relativa, los datos del experimento pueden
desencadenar los avisos que se indican a continuación.
Si en el experimento no aparece un aviso, su frecuencia será 0. Si la frecuencia es >0, eso
significa que el aviso aparece en algún lugar del experimento. La posición del pocillo se
indica en la columna Wells (Pocillos).

Aviso Descripción

AMPNC Amplificación en control negativo

BADROX Señal de referencia pasiva incorrecta
BLFAIL Error del algoritmo de línea basal
CTFAIL Error del algoritmo CT
EXPFAIL Error del algoritmo exponencial
HIGHSD Desviación estándar alta en el grupo de réplicas
NOAMP No hay amplificación
NOISE Ruido mayor que otros pocillos en la placa
NOSIGNAL No hay señal en el pocillo
OFFSCALE La fluorescencia está fuera de la escala
OUTLIERRG Valor atípico en el grupo de réplicas
SPIKE Picos de ruido
THOLDFAIL Error en el algoritmo del umbral

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 117
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Omisión de pocillos para el análisis

Directrices de Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa:

análisis • Haga clic en cada aviso de la tabla Flag Details (Detalles de avisos) con una
frecuencia >0 para ver información detallada acerca del aviso. Si es necesario, haga
clic en el vínculo de solución de problemas para saber cómo corregir el aviso.
• Puede cambiar las opciones de los avisos:
– Ajustar la sensibilidad para que se marquen más o menos pocillos.
– Cambiar los parámetros de los avisos que aplica el software StepOne.

Para obtener más Para obtener más información acerca de la pantalla QC Summary (Resumen QC) o de las
información opciones de avisos, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o
pulsando F1.

Omisión de pocillos para el análisis

Los errores de los experimentos pueden causar que algunos pocillos se amplifiquen de
manera insuficiente o no se amplifiquen. Estos pocillos suelen producir valores CT que
difieren significativamente de los valores medios de los pocillos de réplicas asociadas. Si
se incluyen en los cálculos, estos valores atípicos pueden dar lugar a mediciones
erróneas; para garantizar la precisión, omita los valores atípicos del análisis.

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, se utiliza la tabla de pocillos
experimento de para quitar el pocillo D1 del análisis. El pocillo D1 está marcado con el aviso
ejemplo OUTLIERRG (consulte “Revisión del resumen QC” en la página 116).

Omisión de 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

pocillos (Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación).

Nota: Si en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) no aparece

ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), seleccione CT vs Well

(CT vs pocillo) en el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica).

3. Seleccione la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos).

4. En la tabla de pocillos:
a. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate
(Réplica).
b. Fíjese si en el grupo de réplicas hay algún valor atípico (asegúrese de que están
marcados con un aviso). En el experimento de ejemplo, el pocillo D1 es un
valor atípico.
c. Active la casilla de verificación Omit (Omitir) junto al pocillo D1.

Notas

118 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Omisión de pocillos para el análisis

4a
2

Pocillo

4c

5. Haga clic en Analyze (Analizar) para volver a analizar los datos del experimento sin
el pocillo D1.

Directrices de Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, fíjese bien si en los
análisis grupos de réplicas hay valores atípicos. Si es necesario, quite manualmente los valores
atípicos con la tabla de pocillos. Siga el procedimiento “Omisión de pocillos” anterior
para quitar los valores atípicos del experimento.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 119
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la gráfica multicomponente

Para obtener más Para obtener más información acerca de la omisión de pocillos para el análisis, acceda a
información la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. En la ayuda, busque
los temas relacionados con la omisión de pocillos:

1. Haga clic en la ficha Search (Buscar).

2. Escriba omit well (omisión de pocillos).

3. Haga clic en List Topics (Ver temas).

4. Haga doble clic en los temas que desee leer.

Revisión de la gráfica multicomponente

La pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) muestra la contribución
espectral completa de cada fluorocromo de un pocillo seleccionado durante el tiempo que
dura el proceso de PCR.

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, en la pantalla Multicomponent

experimento de Plot (Gráfica multicomponente) hay que fijarse en:
ejemplo • Fluorocromo ROX™ (referencia pasiva)
• Fluorocromo FAM™ (notificador)
• Picos, depresiones y/o cambios repentinos
• Amplificación en pocillos de control negativo

Revisión de la 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

gráfica (Análisis) Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente).
multicomponente
Nota: Si en la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) no aparece
ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. Muestre un solo pocillo a la vez en la pantalla Multicomponente Plot (Gráfica

multicomponente):
a. Haga clic en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa).

b. Seleccione un pocillo en la disposición de la placa; el pocillo se muestra en la

pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente).

3. En el menú desplegable Plot Color (Color de gráfica), seleccione Dye

(Fluorocromo).

4. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).

5. Compruebe la señal del fluorocromo FAM. En el experimento de ejemplo, la señal

del fluorocromo FAM aumenta a lo largo de la reacción de PCR, lo que indica que la
amplificación es normal.

Notas

120 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la gráfica multicomponente

6. Compruebe la señal del fluorocromo ROX. En el experimento de ejemplo, la señal

del fluorocromo ROX permanece constante a lo largo de la reacción de PCR, lo que
indica que los datos son típicos.

3 4 2a

2b

5
6

7. Seleccione de uno en uno los pocillos de control negativo y compruebe la

amplificación. En el experimento de ejemplo, no hay amplificación en los pocillos
de control negativo.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 121
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la gráfica de datos brutos

Directrices de Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, busque:

análisis • Referencia pasiva: el nivel de fluorescencia del fluorocromo de referencia pasiva
debe permanecer relativamente constante a lo largo de la reacción de PCR.
• Fluorocromo del notificador: el nivel de fluorescencia del fluorocromo del
notificador debería presentar una región plana que se corresponde con la línea basal,
seguida por un rápido aumento en la fluorescencia a medida que la amplificación
continúa.
• Cualquier irregularidad de la señal: no debería haber ningún pico, depresión ni
cambio súbito en la señal fluorescente.
• Pocillos de control negativo: no debería haber ninguna amplificación en los pocillos
de control negativo.

Para obtener más Para obtener más información acerca de la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica
información multicomponente), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o
pulsando F1.

Revisión de la gráfica de datos brutos

En la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos), se muestra la señal de
fluorescencia bruta (no normalizada) para cada filtro óptico de los pocillos seleccionados
durante cada ciclo de la PCR a tiempo real.

Acerca del En el experimento de curva estándar relativa de ejemplo, hay que revisar la pantalla Raw
experimento de Data Plot (Gráfica de datos brutos) para comprobar si hay un aumento estable de la señal
ejemplo (que no hay ninguna depresión ni cambio abrupto) a partir del filtro apropiado.

Revisión de la 1. En el panel Experiment Menu (Menú de experimento), seleccione Analysis

gráfica de datos (Análisis) Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos).
brutos
Nota: Si en la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) no aparece ningún
dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. Para ver los 48 pocillos en la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos), haga
clic en la esquina superior izquierda de la disposición de la placa en la ficha View
Plate Layout (Ver disposición de placa).

3. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).

4. Haga clic y arrastre el puntero Show Cycle (Mostrar ciclo) desde el ciclo 1 al 40. En
el experimento de ejemplo, hay un aumento estable en la señal desde el filtro 1, que
se corresponde con el filtro del fluorocromo FAM™.

Notas

122 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la gráfica de datos brutos

Los filtros del sistema StepOne™ son:

Filtro Fluorocromo

1 Fluorocromo FAM™

Fluorocromo SYBR®
Green

2 Fluorocromo JOE™

Fluorocromo VIC®

3 Fluorocromo™ROX

Directrices de Cuando analice su propio experimento de curva estándar relativa, fíjese en lo siguiente
análisis para cada filtro:
• Crecimiento característico de la señal
• Depresiones o cambios abruptos

Para obtener más Para obtener más información acerca de la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos
información brutos), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 123
cuantificación relativa
 Capítulo 5 Análisis del experimento de curva estándar relativa
Revisión de la gráfica de datos brutos

Notas

124 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6

Diseño del experimento de CT

comparativos
Este capítulo cubre los siguientes temas:
■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
■ Creación de un nuevo experimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
■ Definición de las propiedades del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
■ Definición de los métodos y materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
■ Configuración de los genes diana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
■ Configuración de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
■ Configuración de las opciones de cuantificación relativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
■ Configuración del protocolo de termociclado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
■ Revisión de la configuración de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
■ Solicitud de materiales para el experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148
■ Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en
esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o
seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 125
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Resumen del capítulo

Resumen del capítulo

En este capítulo, se explica cómo utilizar el asistente de diseño en el software StepOne™
para configurar el experimento de CT comparativos (∆∆CT). El asistente de diseño le
guiará por los procedimientos óptimos recomendados por Applied Biosystems a medida
que vaya introduciendo los parámetros de diseño del experimento de ejemplo.

Flujo de trabajo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para diseñar el experimento de ejemplo que
del experimento se incluye en esta guía de introducción.
de ejemplo
Nota: Diseñe el experimento de ejemplo con el flujo de trabajo del asistente de diseño
del software StepOne. Cuando diseñe sus propios experimentos, puede seleccionar flujos
de trabajo alternativos (consulte “Uso de esta guía con sus propios experimentos” en la
página 9).

Experimento de CT comparativos (∆∆CT)

Inicio del experimento


Diseño del experimento (Capítulo 6)
1. Cree un nuevo experimento.
2. Defina las propiedades del experimento.
3. Defina los métodos y los materiales.
4. Configure los genes diana.
5. Configure las muestras.
6. Configure la cuantificación relativa.
7. Configure el protocolo de termociclado.
8. Revise la configuración de la reacción.
9. Solicite materiales para el experimento.
10.Finalice el flujo de trabajo del asistente de
diseño.


Preparación de las reacciones (Capítulo 7)


Realización del experimento (Capítulo 8)


Análisis del experimento (Capítulo 9)


Fin del experimento

Notas

126 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Creación de un nuevo experimento

Creación de un nuevo experimento

Cree un experimento nuevo con el asistente de diseño del software StepOne.

Creación de un 1. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start
experimento (Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied Biosystems
StepOneStepOne v2.0.

2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Design Wizard (Asistente de

diseño) para abrir el asistente de diseño.

3. Consulte “Elementos del software” más adelante para obtener información acerca
de la navegación por el asistente de diseño.

Elementos del A continuación, se ilustran los elementos del software StepOne para el asistente de
software diseño.

1. Barra de menús: muestra los menús disponibles en el software:

• File (Archivo)
• Edit (Edición)
• Instrument (Instrumento)
• Analysis (Análisis)
• Tools (Herramientas)
• Help (Ayuda)

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 127
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Creación de un nuevo experimento

2. Barra de herramientas: muestra las herramientas disponibles en el software:

• New Experiment (Experimento nuevo)
• Open (Abrir)
• Close (Cerrar)
• Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al instrumento)
• Download Experiment from Instrument (Descargar experimento del
instrumento)

3. Cabecera del experimento: indica el nombre del experimento, el tipo de experimento

y los reactivos del experimento abierto.

4. Panel de navegación: ofrece enlaces a todas las pantallas del asistente de diseño:
• Experiment Properties (Propiedades del experimento)
• Methods & Materials (Métodos y materiales)
• Targets (Dianas)
• Opciones de cuantificación relativa
• Samples (Muestras)
• Run Method (Protocolo de termociclado)
• Reaction Setup (Configuración de la reacción)
• Materials List (Lista de materiales)

Nota: Inicialmente, el asistente de diseño muestra el tipo de experimento

Quantitation - Standard Curve (Cuantificación: curva estándar). Las pantallas
disponibles de este asistente pueden cambiar si se selecciona otro tipo de
experimento. Por ejemplo, la pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de
cuantificación relativa) no aparece hasta que se selecciona el tipo de experimento de
curva estándar o CT comparativos (∆∆CT).

Notas

128 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Definición de las propiedades del experimento

5. Fichas del experimento: se muestra una ficha por cada experimento abierto.

1
2
3

Definición de las propiedades del experimento

En la pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento), escriba la
información de identificación del experimento y, a continuación, seleccione el tipo de
experimento que desea diseñar.

Acerca del En el experimento de CT comparativos (∆∆CT) de ejemplo:

experimento de • El experimento se identifica como un ejemplo.
ejemplo
• Se utiliza una MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate.
• El tipo de experimento es de cuantificación.

Pantalla 1. Haga clic en el campo Experiment Name (Nombre de experimento) y, a

Experiment continuación, escriba Comparative CT Example (Ejemplo de CT comparativos).
Properties
(Propiedades de Nota: La cabecera del experimento se actualiza con el nombre del experimento que
experimento) acaba de escribir.

2. Haga clic en el campo Barcode (Código de barras) y, a continuación, escriba el

código de barras en la placa de reacción de PCR.

3. Haga clic en el campo User Name (Nombre de usuario) y, a continuación, escriba

Example User (Usuario de ejemplo).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 129
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Definición de las propiedades del experimento

4. Haga clic en el campo Comments (Comentarios) y, a continuación, escriba

Comparative CT Getting Started Guide Example (Ejemplo de la guía de
introducción del CT comparativos).

5. Seleccione Quantitation (Cuantificación) en el tipo de experimento.

6. Haga clic en Next (Siguiente) >.

1
2
3
4

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

diseño • Escriba un nombre para el experimento que sea descriptivo y fácil de recordar. El
nombre del experimento se utiliza como nombre de archivo predeterminado del
experimento. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Experiment Name
(Nombre de experimento).

Nota: No se pueden utilizar los siguientes caracteres en en campo Experiment

Name (Nombre de experimento): barra inclinada hacia delante (/), barra inclinada
hacia atrás (\), signo mayor que (>), signo menor que (<), asterisco (*), signo de
interrogación (?), comillas ("), línea vertical (|), dos puntos (:) o punto y coma (;).

• Utilice MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates, MicroAmp™ Fast 8-Tube
Strips o MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps. Los consumibles tipo rápido se
pueden utilizar con reactivos tipo rápido y estándar.
• (Opcional) Introduzca un código de barras para identificarlo en la placa de reacción
de PCR. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo Barcode (Código de
barras).
• (Opcional) Escriba un nombre de usuario para identificar al propietario del
experimento. Puede introducir hasta 100 caracteres en el campo User Name
(Nombre de usuario).
• (Opcional) Escriba comentarios para describir el experimento. Puede introducir
hasta 1000 caracteres en el campo Comments (Comentarios).

Notas

130 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Definición de los métodos y materiales

• Seleccione Quantitation (Cuantificación) en el tipo de experimento.

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La pantalla Experiment Properties (Propiedades de experimento), acceda a la ayuda
del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.
• Consumibles, consulte “Consumibles admitidos” en la página 3.
• Experimentos de cuantificación, consulte la Guía de reactivos de Applied
Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System.

Definición de los métodos y materiales

En la pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales), seleccione el método de
cuantificación, los reactivos, la velocidad de rampa y el tipo de molde de PCR que se van
a utilizar en el experimento.

Acerca del En el experimento de CT comparativos de ejemplo:

experimento de • Se utiliza el método de cuantificación de CT comparativos.
ejemplo
• Se utilizan reactivos TaqMan®.
• Se utiliza la velocidad de rampa rápida en el proceso del instrumento.
• cDNA (preparado a partir de RNA total aislado de hígado, riñón y cerebro) es el tipo
de molde. Antes de utilizar el molde cDNA, primero hay que realizar una
retrotranscripción para convertir el RNA en cDNA (consulte “Preparación del
molde” en la página 157).

Pantalla Methods 1. Seleccione Comparative CT (∆∆CT) (CT comparativos) como método de

& Materials cuantificación.
(Métodos y
materiales) 2. Seleccione ensayos TaqMan® para los reactivos.

3. Seleccione Fast (~40 minutes to complete a run) (Rápido (40 minutos

aproximadamente para completar una reacción)) para la velocidad de la rampa.

4. Seleccione cDNA (complementary DNA) (cDNA (DNA complementario)) como

tipo de molde.

5. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 131
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Definición de los métodos y materiales

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

diseño • Seleccione Comparative CT (∆∆CT) (CT comparativos (∆∆CT) como método de
cuantificación. Los experimentos de CT comparativos (∆∆CT) determinan el cambio
de expresión de un gen diana en una muestra en relación con el mismo gen diana en
una muestra de referencia. Para obtener los resultados, se utilizan fórmulas
aritméticas. Para configurar la placa de reacción, el método de CT comparativos
requiere dianas, muestras, una muestra de referencia y un control endógeno.

Nota: Antes de utilizar el método de CT comparativos, Applied Biosystems

recomienda determinar si las eficiencias de PCR del ensayo diana y el ensayo de
control endógeno son aproximadamente iguales. Applied Biosystems TaqMan®
Gene Expression Assays y Custom TaqMan® Gene Expression Assays tienen unas
eficiencias de amplificación equivalentes del 100% (±10%).

• Seleccione los reactivos que desea utilizar:

– Seleccione ensayos TaqMan® si desea utilizar estos reactivos para detectar la
amplificación y cuantificar la cantidad de gen diana en las muestras. Los
reactivos TaqMan se componen de dos cebadores y una sonda TaqMan®. Los
cebadores están diseñados para amplificar el gen diana. La sonda TaqMan está
diseñada para hibridar en el gen diana y generar una señal de fluorescencia
cuando se amplifica el gen diana.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo

TAMRA™ como notificador ni apantallador con el sistema StepOne™.

– Seleccione reactivos SYBR® Green si desea utilizar estos reactivos para

detectar la amplificación y cuantificar la cantidad de gen diana en las muestras.
Los reactivos SYBR Green se componen de dos cebadores y un fluorocromo
SYBR Green. Los cebadores están diseñados para amplificar el gen diana. El

Notas

132 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Definición de los métodos y materiales

fluorocromo SYBR Green genera una señal de fluorescencia cuando se une a

DNA de doble cadena. El fluorocromo SYBR Green suele formar parte de la
mezcla maestra SYBR Green que se añade a la reacción. Si utiliza un
fluorocromo SYBR Green:
Active la casilla de verificación Include Melt Curve (Incluir curva de
disociación) para realizar un análisis de curva de disociación de el gen diana
amplificado.
Seleccione Standard (Estándar) para la velocidad de la rampa. Applied
Biosystems no dispone de una mezcla maestra rápida para reactivos SYBR
Green.

Nota: Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema

StepOne; sin embargo, debe diseñar su experimento con el flujo de trabajo
Advanced Setup (Configuración avanzada) en lugar con el asistente de diseño.
Consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)” en la
página 206.

• Seleccione la velocidad de rampa apropiada para el proceso del instrumento:

– Seleccione Fast (~40 Minutes to Complete a Run) (Rápido (aproximadamente
40 minutos para completar una reacción)) si utiliza reactivos tipo rápido para las
reacciones de PCR.
– Seleccione Standard (~2 Hours to Complete a Run) (Estándar
(aproximadamente 2 horas para completar una reacción)) si utiliza reactivos
estándar para las reacciones de PCR (incluidos reactivos SYBR Green y reactivos
TaqMan estándar).
• Seleccione el molde de PCR apropiado:
– Seleccione cDNA (complementary DNA) (cDNA (DNA complementario)) si va
a realizar una RT-PCR de 2 pasos y ya ha realizado la retrotranscripción para
convertir el RNA en cDNA. Se añade DNA complementario a las reacciones de
PCR.
– Seleccione RNA si va a realizar una RT-PCR de 1 paso. Se añade el RNA o
mRNA total a las reacciones de PCR.
– Seleccione gDNA (genomic DNA) (gDNA (DNA genómico)) si ya ha extraído el
gDNA de un tejido o una muestra. Se añade DNA genómico purificado a las
reacciones de PCR.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 133
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Definición de los métodos y materiales

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La pantalla Methods & Materials (Métodos y materiales), acceda a la ayuda del
software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.
• La determinación de las eficiencias de PCR, acceda a la ayuda del software StepOne
haciendo clic en o pulsando F1. En la ayuda, realice la búsqueda de la siguiente
manera:
a. Haga clic en la ficha Search (Buscar).

b. Escriba PCR efficiency (Eficiencia de PCR).

c. Haga clic en List Topics (Ver temas).

d. Haga doble clic en Determine PCR Efficiency (Determinar la eficiencia de la

PCR).
• Si utiliza el método de cuantificación de curva estándar relativa, consulte los
capítulos 2 - 5 de esta guía.
• El uso del método de cuantificación de curva estándar, consulte la Guía de
introducción a StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de curva
estándar.
• Los reactivos TaqMan y SYBR Green, consulte la Guía de reactivos de Applied
Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System.
• La PCR, incluida la PCR en singleplex y en multiplex, y la RT PCR de 1 y de 2
pasos, consulte la Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time
PCR System.

Notas

134 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Configuración de los genes diana

Configuración de los genes diana

En la pantalla Targets (Dianas), escriba el número de genes diana que desea cuantificar
en la placa de reacción de PCR y, a continuación, configure el ensayo para cada gen
diana.

Acerca del En el experimento de CT comparativos de ejemplo:

experimento de • Se cuantifican dos dianas en la placa de reacción.
ejemplo
• El ensayo Target 1 (Diana 1) está configurado para el gen diana que se está
estudiando. En el experimento de ejemplo, es TP53 (un factor de transcripción que
regula otros genes).
• El ensayo Target 2 (Diana 2) se configura para el control endógeno. Para el
experimento de ejemplo, se trata de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa
(GAPDH) humano. El GAPDH se utiliza como control endógeno, porque sus
niveles de expresión suelen ser relativamente estables.

Pantalla Targets 1. Haga clic en el campo How many targets do you want to quantify in the reaction
(Dianas) plate? (¿Cuántas dianas desea cuantificar en la placa de reacción?) y, a
continuación, escriba 2.

Nota: El número de filas de la tabla de ensayos diana se actualiza con el número

que escriba.

2. Configure el ensayo Target 1 (Diana 1):

a. Haga clic en la celda Enter Target Name (Escribir nombre de gen diana) y, a
continuación, escriba TP53.
b. En el menú desplegable Reporter (Notificador), seleccione FAM
(predeterminado).
c. En el menú desplegable Quencher (Apantallador), seleccione NFQ-MGB
(predeterminado).
d. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

3. Configure el ensayo Target 2 (Diana 2):

a. Haga clic en la celda Enter Target Name (Escribir nombre de gen diana) y, a
continuación, escriba GAPDH.
b. En el menú desplegable Reporter (Notificador), seleccione FAM
(predeterminado).
c. En el menú desplegable Quencher (Apantallador), seleccione NFQ-MGB
(predeterminado).
d. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 135
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Configuración de los genes diana

4. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Nota: En todos los genes diana, deje en blanco el campo (Optional) Enter Gene Name
((Opcional) Escriba el nombre del gen). Puede buscar el identificador del gen/ensayo
para solicitar los materiales (consulte “Solicitud de materiales para el experimento” en la
página 148).

2
3

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

diseño • Identifique cada ensayo diana con un nombre y un color únicos. Puede introducir
hasta 100 caracteres en el campo Target Name (Nombre de gen diana).
• Seleccione un control endógeno para cada muestra. El control endógeno es un gen
diana que está presente en todas las muestras que se están investigando. Se debería
expresar por igual en todos los tipos de muestras, con independencia del tratamiento
o el origen del tejido (ejemplos de controles endógenos: β-actina, GAPDH y RNA
ribosomal 18S [rRNA 18S]). El control endógeno se utiliza para normalizar los
resultados de la PCR; el control endógeno corrige la cantidad de molde, la
eficiencia de extracción del ácido nucleico, la eficiencia de la retrotranscripción y
los errores de calibración de las pipetas. Tenga en cuenta que:
– Cada tipo de muestra (por ejemplo, cada tejido de un estudio en el que se
comparan múltiples tejidos) requiere un control endógeno.
– Si las muestras están distribuidas en múltiples placas, cada placa debe tener un
control endógeno. Asimismo, cada placa debe incluir un control endógeno para
cada tipo de muestra de la placa.
• Seleccione el fluorocromo del notificador utilizado en el ensayo diana:
– Seleccione FAM si el fluorocromo FAM™ está unido al extremo de 5′ de la sonda
TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana.

Notas

136 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Configuración de las muestras

– Seleccione JOE si el fluorocromo JOE™ está unido al extremo de 5′ de la sonda

TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana.
– Seleccione VIC si el fluorocromo VIC® está unido al extremo de 5′ de la sonda
TaqMan que se utiliza para detectar el gen diana.
– Seleccione SYBR si utiliza fluorocromo SYBR® Green para detectar DNA de
doble cadena.
• Seleccione el apantallador utilizado en el ensayo diana:
– Seleccione NFQ-MGB si a la sonda TaqMan de 3′ que está utilizando para
detectar el gen diana hay unido un apantallador no fluorescente de unión al surco
menor de la doble cadena de DNA.
– Seleccione None (Ninguno) si se utiliza fluorocromo SYBR Green.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo

TAMRA™ como notificador ni apantallador con el sistema StepOne™.

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La pantalla Targets (Dianas) , acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic
en o pulsando F1.
• La selección de un control endógeno, consulte la nota de aplicación Using TaqMan®
Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental
Studies.

Configuración de las muestras

En la pantalla Samples (Muestras), escriba el número de muestras, réplicas y controles
negativos que va a incluir en la placa de reacción, escriba los nombres de las muestras y,
a continuación, seleccione las reacciones de muestra/diana que va a configurar.

Acerca del En el experimento de CT comparativos de ejemplo:

experimento de • Se utilizan tres muestras: cDNA preparado a partir de RNA total aislado de hígado,
ejemplo riñón y cerebro. Las muestras contienen cantidades desconocidas de TP53 (diana) y
del gen GAPDH (control endógeno).
• Se utilizan tres réplicas. Las réplicas son reacciones idénticas que contienen
componentes y volúmenes idénticos.
• Se utilizan seis controles negativos. Las reacciones de control negativo contienen
agua en lugar de la muestra y no se deberían amplificar. El software incluye
automáticamente tres controles negativos para cada ensayo diana.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 137
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Configuración de las muestras

Pantalla Samples 1. Haga clic en el campo How many samples do you want to test in the reaction
(Muestras) plate? (Cuántas muestras desea probar en la placa de reacción?) y, a continuación,
escriba 3.

Nota: El número de filas de la tabla de las muestras se actualiza con el número que
escriba.

2. Haga clic en el campo How many replicates do you need? (¿Cuántas réplicas
necesita?) y, a continuación, escriba 3.

3. Configure la muestra 1:
a. Haga clic en el campo Enter Sample Name (Escriba nombre de muestra) y, a
continuación, escriba Liver (Hígado).
b. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

4. Configure la muestra 2:
a. Haga clic en el campo Enter Sample Name (Escriba nombre de muestra) y, a
continuación, escriba Kidney (Riñón).
b. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

5. Configure la muestra 3:
a. Haga clic en el campo Enter Sample Name (Escriba nombre de muestra) y, a
continuación, escriba Brain (Cerebro).
b. Deje la opción predeterminada en el campo Color.

6. Seleccione All Sample/Target Reactions (Todas las reacciones de muestra/diana)

para configurar todos los genes diana de todas las muestras.

7. En el panel Well Count (Número de pocillos), confirme que hay:

• 18 pocillos desconocidos
• 24 pocillos vacíos

Nota: El software incluye automáticamente tres controles negativos para cada

ensayo diana. Los pocillos de control negativo se muestran en la disposición de la
placa (pocillos A1 a A6).

8. En la ficha View Plate Layout (Ver disposición de la placa), en el menú desplegable

Arrange Plate by (Ordenar placa por), seleccione Rows (Filas) (predeterminado).

9. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Notas

138 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Configuración de las muestras

8
1
2

3
4
5

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

diseño • Identifique cada muestra con un nombre y un color únicos. Puede introducir hasta
100 caracteres en el campo Sample Name (Nombre de muestra).
• Escriba el número de reacciones idénticas (réplicas) que desea configurar. Applied
Biosystems recomienda tres réplicas para cada reacción de muestra.
• El software incluye automáticamente tres controles negativos para cada ensayo
diana.
• Seleccione la combinación de reacciones de muestra/diana deseada:
– Seleccione All Sample/Target Reactions (Todas las reacciones de
muestra/diana) para configurar todos los genes diana de todas las muestras.
– Seleccione Specify Sample/Target Reactions (Especifique reacciones de
muestra/diana) para configurar de uno en uno los genes diana que se van a
amplificar en cada muestra.

Nota: En el asistente de diseño, cada reacción de PCR sólo puede contener una
muestra y un ensayo diana.

Para obtener más Para obtener más información acerca de la pantalla Samples (Muestras), acceda a la
información ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 139
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Configuración de las opciones de cuantificación relativa

Configuración de las opciones de cuantificación relativa

En la pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa),
seleccione la muestra de referencia y el control endógeno para realizar la cuantificación
relativa.

Acerca del En el experimento de CT comparativos de ejemplo:

experimento de • El tejido de cerebro se utiliza como muestra de referencia.
ejemplo
• GAPDH se utiliza como control endógeno.

Pantalla Relative 1. En el menú desplegable Which sample do you want to use as the reference sample?
Quantitation (¿Qué muestra desea utilizar como muestra de referencia?), seleccione Brain
Settings (cerebro).
(Opciones de
cuantificación 2. En el menú desplegable Which target do you want to use as the endogenous control?
relativa) (¿Qué diana desea utilizar como control endógeno?), seleccione GAPDH.

3. Haga clic en Next (Siguiente) >.

1
2

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

diseño • Seleccione una muestra de referencia entre las muestras creadas anteriormente
(“Configuración de las muestras” en la página 137). Los resultados de la
amplificación de las muestras se comparan con los resultados de la amplificación de
la muestra de referencia para determinar la expresión relativa.
• Seleccione un control endógeno en los ensayos diana creados previamente
(“Configuración de los genes diana” en la página 135). Los resultados de la
amplificación del control endógeno se utilizan para normalizar los resultados de la
amplificación del gen diana para corregir las diferencias en la cantidad de molde
añadido a cada reacción.

Notas

140 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Configuración del protocolo de termociclado

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La pantalla Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa),
acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.
• Las muestras de referencia (también denominadas calibradores) y los controles
endógenos, consulte User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression.

Configuración del protocolo de termociclado

En la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado), revise el volumen de la reacción
y el perfil térmico del protocolo de termociclado predeterminado. Si es necesario, puede
editar el protocolo de termociclado predeterminado o sustituirlo por otro de la biblioteca
Run Method (Protocolo de termociclado).

Acerca del En el experimento de CT comparativos de ejemplo, se utiliza el protocolo de

experimento de termociclado predeterminado sin modificaciones.
ejemplo

Revisión de la 1. Haga clic en la ficha Graphical View (Vista gráfica) (predeterminada) o Tabular
pantalla Run View (Vista tabular).
Method
(Protocolo de 2. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por
termociclado) pocillo) aparece 20 µL.

3. Asegúrese de que en el perfil térmico aparecen las etapas y los ciclos que se indican
a continuación.

4. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 141
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Revisión de la configuración de la reacción

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

diseño • Escriba un número entre 10 y 30 para el volumen de reacción/pocillo. El sistema
StepOne admite volúmenes de reacción de entre 10 y 30 µL.
• Revise el perfil térmico:
– Asegúrese de que el perfil térmico es apropiado para los reactivos.
– Si va a realizar una RT-PCR de 1 paso, incluya un paso de retrotranscripción.
Si el experimento necesita un perfil térmico diferente, modifique el perfil térmico o
cambie el protocolo de termociclado por otro de la biblioteca Run Method
(Protocolo de termociclado). La biblioteca Run Method (Protocolo de termociclado)
está incluida en el software StepOne.

Para obtener más Para obtener más información acerca de la biblioteca Run Method (Protocolo de
información termociclado) o acerca de la pantalla Run Method (Protocolo de termociclado), acceda a
la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Revisión de la configuración de la reacción

En la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción), seleccione el tipo de ensayo
(si utiliza reactivos TaqMan) y, a continuación, revise los volúmenes calculados para
preparar las reacciones de PCR y las diluciones de las muestras. Si es necesario, puede
editar el volumen de reacción, el volumen de reacción de exceso, las concentraciones de
los reactivos y/o la concentración de las muestras.

¡IMPORTANTE! Realice estos pasos para cada ensayo diana de la placa de reacción.

Acerca del En el experimento de CT comparativos de ejemplo:

experimento de • Se utilizan Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays.
ejemplo
• El volumen de reacción por pocillo es 20 µL.
• El volumen de reacción de exceso es del 10%.
• Los componentes de la reacción son:
– TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕)
– Ensayo de TP53 (20✕)
– Ensayo de GAPDH (20✕)
– Muestra
– Agua
• La concentración de la muestra diluida es de 5,0 ng/µL.
• La concentración de la solución de partida de la muestra es de 100 ng/µL.

Notas

142 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Revisión de la configuración de la reacción

Pantalla Reaction Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para
Setup el ensayo de TP53
(Configuración de
1. Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción)
reacción)
(predeterminada).

2. En el panel Select Target (Seleccionar diana), seleccione TP53.

3. En el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo), seleccione Inventoried/Made

to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido).

4. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por
pocillo) aparece 20 µL.

5. Asegúrese de que en el campo Excess Reaction Volume (Volumen de reacción en

exceso) muestra 10%.

6. En el panel Reactions for TP53 (Reacciones para TP53):

a. Asegúrese de que en el campo Master Mix Concentration (Concentración de
mezcla maestra) aparece 2✕.
b. Asegúrese de que en el campo Assay Mix Concentration (Concentración de
ensayo) aparece 20✕.
c. Revise los componentes y los volúmenes calculados para las reacciones de
PCR:

Componente Volumen (µL) para 1 reacción

Mezcla maestra (2✕) 10,0

Ensayo (20✕) 1,0

Muestra (10✕) 2,0 ‡

H2O 7,0

Volumen total 20,0

‡ El volumen de la muestra se limita al 10% del volumen total de la

reacción.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 143
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Revisión de la configuración de la reacción

3 4 5

2
6a
6b

6c

Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para

el ensayo de GAPDH

1. Seleccione la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción)

(predeterminada).

2. En el panel Select Target (Seleccionar diana), seleccione GAPDH.

3. En el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo), seleccione Inventoried/Made

to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido).

4. Asegúrese de que en el campo Reaction Volume Per Well (Volumen de reacción por
pocillo) aparece 20 µL.

5. Asegúrese de que en el campo Excess Reaction Volume (Volumen de reacción en

exceso) muestra 10%.

6. En el panel Reactions for GAPDH (Reacciones para GAPDH):

a. Asegúrese de que en el campo Master Mix Concentration (Concentración de
mezcla maestra) aparece 2✕.
b. Asegúrese de que en el campo Assay Mix Concentration (Concentración de
ensayo) aparece 20✕.

Notas

144 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Revisión de la configuración de la reacción

c. Revise los componentes y los volúmenes calculados para las reacciones de

PCR:

Componente Volumen (µL) para 1 reacción

Mezcla maestra (2✕) 10,0

Ensayo (20✕) 1,0

Muestra (10✕) 2,0 ‡

H2O 7,0

Volumen total 20,0

‡ El volumen de la muestra se limita al 10% del volumen total de la

reacción.

3 4 5

2
6a
6b

6c

Complete la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de la dilución de muestra)

1. Seleccione la ficha Sample Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de muestra).

2. Haga clic en el campo Diluted Sample Concentration (10✕ for Reaction Mix)
(Concentración de muestra diluida (10X para la mezcla de reacción)) y, a
continuación, escriba 5,0.

3. En el menú desplegable de la unidad, seleccione ng/µL (predeterminado).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 145
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Revisión de la configuración de la reacción

4. Revise los volúmenes calculados para las diluciones de las muestras:

Concentración Volumen de Volumen de Volumen total

Nombre de la
de la solución muestra disolvente de muestra
muestra
origen (ng/µL) (µL) (µL) diluida (µL)

Hígado 100,0 1,0 19,0 20,0

Riñón 100,0 1,0 19,0 20,0

Cerebro 100,0 1,0 19,0 20,0

1
2
3

Imprima las instrucciones de la configuración de la reacción

Imprima las instrucciones detalladas de la configuración de la reacción y, a continuación,
guárdelas para el Capítulo 7, “Preparación de las reacciones de CT comparativos.”

1. Haga clic en Print Reaction Setup (Imprimir configuración de reacción).

2. En el cuadro de diálogo, seleccione:

• Detailed Reaction Setup Instructions (Instrucciones detalladas de la
configuración de la reacción)
• Include Plate Layout (Incluir disposición de la placa)
• Use sample color (Utilizar color de muestra)

Notas

146 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Revisión de la configuración de la reacción

3. Haga clic en Print (Imprimir).

4. En el cuadro de diálogo Print (Imprimir), seleccione la impresora y las opciones de

impresión y, a continuación, haga clic en OK (Aceptar).

5. Haga clic en Next (Siguiente) >.

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

diseño • Si utiliza reactivos TaqMan, seleccione el tipo de ensayo que va a utilizar:
– Seleccione Inventoried/Made to Order (En inventario/Fabricado bajo pedido) si
utiliza Applied Biosystems TaqMan®Gene Expression Assays (en inventario o
fabricados bajo pedido) o Applied Biosystems Custom TaqMan®Gene
Expression Assays.
– Seleccione Custom (Personalizado) si va a diseñar sus propios ensayos con el
software Primer Express®.
• Escriba un número entre 10 y 30 para el volumen de reacción/pocillo. El sistema
StepOne admite volúmenes de reacción de entre 10 y 30 µL.
• Incluya el volumen de reacción en exceso para contabilizar la pérdida que se
produce durante el pipeteo. Applied Biosystems recomienda un volumen de
reacción en exceso de al menos el 10%.
• Revise las concentraciones de la mezcla de reacción para cada gen diana: Si es
necesario:
– Para los reactivos TaqMan, modifique las concentraciones de la mezcla maestra y
el ensayo.
– Para los reactivos SYBR Green, modifique las concentraciones de la mezcla
maestra, el cebador directo y el cebador reverso.
– Para la RT-PCR de 1 paso, modifique la concentración de retrotranscripción.
• Revise los componentes de la mezcla de reacción para cada gen diana:
– Si va a trabajar de modo rápido, asegúrese de utilizar una mezcla maestra rápida
en las reacciones de PCR.
– Si va a realizar reacciones de PCR en modo estándar, asegúrese de utilizar una
mezcla maestra tipo estándar en las reacciones de PCR.
– En la RT-PCR de 1 paso, asegúrese de incluir retrotranscriptasa en las reacciones
de PCR y de utilizar un tampón específico.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 147
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Solicitud de materiales para el experimento

• Revise los cálculos de la dilución de las muestras para cada muestra. Si es necesario,
modifique la concentración de muestra diluida (incluidas las unidades) y la
concentración de la solución de partida.

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción), acceda a la ayuda del
software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.
• Para los ensayos de Applied Biosystems, refiérase a:
– TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
– Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

Solicitud de materiales para el experimento

En la pantalla Materials List (Lista de materiales), revise la lista de materiales que se
recomiendan para preparar para la placa de reacción de PCR.
Opcionalmente, puede solicitar los materiales recomendados a la tienda en línea de
Applied Biosystems. Cree una cesta de la compra, añada productos a la cesta de compra
y, a continuación, inicie la sesión para enviar su pedido. Para acceder a la tienda en línea
de Applied Biosystems, debe tener una conexión a Internet ilimitada.

Nota: El software StepOne recomienda los materiales que debe solicitar de acuerdo con
el diseño del experimento. Se da por hecho que se va a diseñar el experimento, solicitar
los materiales y luego preparar (Capítulo 7) y procesar (Capítulo 8) la placa de reacción
cuando reciba los materiales.

Acerca del En el experimento de CT comparativos de ejemplo, los materiales recomendados son:

experimento de • MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate
ejemplo
• MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film
• TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG
• Ensayo de TP53: Hs00153340_m1 (RefSeq NM_000546.2)
• Ensayo de GAPDH: Kit de control endógeno de GAPDH (GAPDH) humano
(PN 4333764T)

Pantalla Ordering 1. Busque el ensayo diana en la tienda en línea de Applied Biosystems:

Materials
a. Asegúrese de que el ordenador está conectado a Internet.
(Solicitud de
materiales) b. Haga clic en el campo Enter Gene Name (Escriba el nombre del gen), escriba
TP53 y, a continuación, haga clic en Find Assay (Buscar ensayo).
c. En el cuadro de diálogo Find Assay Results (Buscar resultados de ensayo),
seleccione la fila Hs00153340_m1.
d. Haga clic en el campo Enter Gene Name (Escriba el nombre del gen), escriba
GAPDH y, a continuación, haga clic en Find Assay (Buscar ensayo).

Notas

148 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Solicitud de materiales para el experimento

e. En el cuadro de diálogo Find Assay Results (Buscar resultados de ensayo),

seleccione la fila 4333764T.
f. Haga clic en Apply Assay Selection (Aplicar selección de ensayo).

2. Complete el panel Experiment Materials List (Lista de materiales del experimento):

a. En el menú desplegable Display (Visualización), seleccione All Items (Todos
los elementos) (predeterminada) y, a continuación, revise los materiales
recomendados. Si es necesario, utilice la barra de desplazamiento situada a la
derecha para ver todos los elementos.
b. Active la casilla de verificación junto a cada uno de los siguientes elementos:
• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate
• MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film
• TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG
• Ensayo de TP53: Hs00153340_m1 (RefSeq NM_000546.2)
• Ensayo de GAPDH: Kit de control endógeno de GAPDH (GAPDH)
humano (PN 4333764T)

Nota: Para obtener más información acerca de un elemento específico, haga

clic en el vínculo del número de referencia para conectarse a la tienda en línea
de Applied Biosystems. En la página de inicio, escriba el número de referencia
en el campo Search (Búsqueda) y, a continuación, haga clic en Go (Ir).

c. Haga clic en Add Selected Items to Shopping List (Añadir elementos

seleccionados a la cesta de compra).

3. Compruebe si la cesta de compra del experimento contiene los materiales deseados

y que las cantidades son correctas y, a continuación, haga clic en Order Materials
in List (Solicitar materiales de la lista).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 149
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Solicitud de materiales para el experimento

1b,1d

2a
2c

2b

4. En el cuadro de diálogo, Order Materials - Log In (Solicitar materiales – Inicio de

sesión), escriba el nombre de usuario y la contraseña de la tienda en línea de
Applied Biosystems y, a continuación, haga clic en Login and Submit (Iniciar la
sesión y enviar).

Nota: Si no tiene cuenta en la tienda en línea de Applied Biosystems, haga clic en

Register Now (Registrarse ahora) para crear una cuenta.

5. Después de realizar el pedido, haga clic en Finish Designing Experiment (Finalizar

el diseño del experimento).

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

diseño • Confirme que el ordenador tiene una conexión a Internet ilimitada.

Notas

150 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Solicitud de materiales para el experimento

• Applied Biosystems recomienda las siguientes versiones de navegadores y Adobe®

Acrobat® Reader para utilizar el sitio web de Applied Biosystems:

Sistema operativo
Netscape® Microsoft® Adobe® Acrobat®
del pc de
Navigator Internet Explorer Reader
escritorio

Windows® v6.x o posterior v6.x o posterior v4.0 o posterior

98/NT/2000

Macintosh® OS 9 o v6.x o posterior v5.2 o posterior v4.0 o posterior

posterior

Nota: Asegúrese de que se han activado las cookies y Java Script para que el sitio
web funcione correctamente.

• Seleccione todos los materiales que necesite para el experimento y añádalos a la

cesta de compra.

Para obtener más Para obtener más información acerca de la pantalla Materials List (Lista de materiales),
información acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 151
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

Para finalizar el flujo de trabajo del asistente de diseño, revise la disposición de la placa
y, a continuación, seleccione una opción de salida.

Acerca del El software StepOne selecciona automáticamente ubicaciones para los pocillos en la
experimento de placa de reacción. En el experimento de CT comparativos de ejemplo:
ejemplo • Los pocillos se colocan tal y como se muestra a continuación.

• El experimento se guarda tal y como está y se cierra.

Nota: Para el experimento de ejemplo, no realice el proceso en este momento.

Finalización del 1. En la ventana Review Plate for Experiment (Revisar placa para el experimento),
asistente de revise la disposición de la placa. Asegúrese de que hay:
diseño • 18 pocillos desconocidos
• 6 pocillos de control negativo
• 24 pocillos vacíos

Nota: Si la disposición de la placa es incorrecta, haga clic en Return to the Wizard

(Volver al asistente) y compruebe los valores que ha introducido.

2. Haga clic en Save Experiment (Guardar experimento).

Notas

152 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

3. En el cuadro de diálogo Save Experiment (Guardar experimento), haga clic en Save

(Guardar) para aceptar la ubicación y el nombre de archivo predeterminados. El
experimento de ejemplo se guarda y se cierra, y regresa a la pantalla de inicio.

Nota: De manera predeterminada, el experimento de ejemplo se guarda en la

carpeta Applied Biosystems\StepOne System\experiments.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 153
cuantificación relativa
 Capítulo 6 Diseño del experimento de CT comparativos
Finalización del flujo de trabajo del asistente de diseño

Directrices de Cuando diseñe su propio experimento de CT comparativos:

diseño • En la ventana Review Plate for Experiment (Revisar placa para el experimento),
seleccione la opción de salida apropiada:
– Haga clic en Save Experiment (Guardar experimento) si desea guardar y cerrar
el experimento sin realizar ningún otro cambio ni iniciar el proceso.
– Haga clic en Start Run for This Experiment (Iniciar proceso para este
experimento) si desea guardar el experimento e iniciar el proceso. Asegúrese de
que la placa de reacción está cargada en el instrumento.
– Haga clic en Edit Plate Layout (Editar disposición de placa) si desea utilizar el
flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para modificar la
disposición de la placa.
– Haga clic en Create Another Experiment Using the Design Wizard (Crear otro
experimento con el asistente de diseño) si desea guardar y cerrar el experimento
y, a continuación, crear otro experimento con el asistente de diseño.
– Haga clic en Return to the Wizard (Regresar al asistente) si desea regresar al
experimento para realizar cambios con el asistente de diseño.
• De manera predeterminada, los experimentos se guardan en la carpeta Applied
Biosystems\StepOne System\experiments. Para cambiar:
– La ubicación en la que se guarda un experimento específico, desplácese a la
ubicación deseada con el cuadro de diálogo Save Experiment (Guardar
experimento).
– La ubicación en la que se guardan los experimentos de manera predeterminada,
seleccione Tools (Herramientas)Preferences (Preferencias) y, a continuación,
seleccione la ficha General (predeterminada). En el campo Default Data Folder
(Carpeta de datos predeterminada), desplácese a la ubicación deseada.

Para obtener más Para obtener más información acerca del uso del flujo de trabajo Advanced Setup
información (Configuración avanzada), consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración
avanzada)” en la página 206.

Notas

154 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 7

Preparación de las reacciones de CT

comparativos
Este capítulo cubre los siguientes temas:
■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
■ Preparación del molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
■ Preparación de las diluciones de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
■ Preparación de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160
■ Preparación de la placa de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en
esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o
seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 155
cuantificación relativa
 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos
Resumen del capítulo

Resumen del capítulo

En este capítulo, se explica cómo preparar las reacciones de PCR para el experimento de
CT comparativos (∆∆CT) de ejemplo y se ofrecen directrices para preparar las reacciones
de PCR para su propio experimento de CT comparativos.

Flujo de trabajo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para preparar las reacciones de PCR para el
del experimento experimento de ejemplo que se incluye en esta guía de introducción.
de ejemplo
Experimento de CT comparativos (∆∆CT)
Inicio del experimento

Diseño del experimento (Capítulo 6)

Preparación de las reacciones (Capítulo 7)
1. Prepare el molde.
2. Prepare las diluciones de las muestras.
3. Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo
diana.
4. Prepare la placa de reacción.


Realización del experimento (Capítulo 8)


Análisis del experimento (Capítulo 9)

Fin del experimento

Notas

156 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos
Preparación del molde

Preparación del molde

Prepare el molde para las reacciones de PCR con el High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems recomienda utilizar High-Capacity cDNA Reverse

Transcription Kit para realizar una retrotranscripción a partir de RNA total y obtener un
conjunto de cDNA. Los TaqMan® Gene Expression Assays se han diseñado utilizando el
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit; no se han probado otros protocolos para
los TaqMan Gene Expression Assays.

Acerca del Para el experimento de CT comparativos de ejemplo, el molde para las reacciones de PCR
experimento de es cDNA sintetizado a partir de las muestras de RNA total utilizando el High-Capacity
ejemplo cDNA Reverse Transcription Kit.

Materiales • RNA aislado total preparado a partir de tejidos de hígado, riñón y cerebro.
necesarios • Uno de los Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits:

Número de
Kit
referencia

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4368814

(200 reacciones)

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4368813

(1000 reacciones)

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4374966

with RNase Inhibitor (200 reacciones)

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4374967

with RNase Inhibitor (1000 reacciones)

Nota: El High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit se llamaba antiguamente

High-Capacity cDNA Archive Kit.

Preparación del Utilice el High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit para sintetizar cDNA de
molde cadena sencilla a partir de las muestras de RNA total. Siga los procedimientos de Applied
Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol para:

1. Preparar la mezcla maestra de la reacción.

PELIGRO QUÍMICO. El tampón de reacción 10X puede

causar irritación de los ojos, la piel y las vías respiratorias. Consulte la ficha técnica
de seguridad (MSDS) y siga las instrucciones de manipulación indicadas. Use
protectores oculares, vestimenta protectora y guantes apropiados.

2. Prepare las reacciones de cDNA.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 157
cuantificación relativa
 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos
Preparación de las diluciones de las muestras

3. Realice la retrotranscripción en un termociclador.

Directrices de Cuando prepare su propio experimento de CT comparativos (∆∆CT):

preparación • Applied Biosystems recomienda extraer primero el DNA o RNA del tejido o
muestra.
• Applied Biosystems recomienda los siguientes moldes:
– cDNA (cDNA) complementario: cDNA sintetizado a partir de las muestras de
RNA total utilizando un High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.
– RNA: RNA o mRNA total purificado extraído de un tejido o una muestra.
– DNA (gDNA) genómico: gDNA purificado ya extraído de un tejido o una
muestra.

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La preparación de moldes de cDNA, consulte Applied Biosystems High-Capacity
cDNA Reverse Transcription Kits Protocol (PN 4375575). El protocolo no se
incluye en los High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits. Puede descargarlo
desde el sitio web Applied Biosystems Documents on Demand:
http://docs.appliedbiosystems.com/search.taf
• La preparación de moldes de RNA o gDNA, consulte el protocolo de los reactivos
de purificación que haya seleccionado. Para localizar los reactivos de purificación
de Applied Biosystems, visite el sitio web de Applied Biosystems:
http://www.appliedbiosystems.com/

Preparación de las diluciones de las muestras

Realice diluciones de las muestras antes de añadir las muestras a la mezcla de reacción
final. Diluya las muestras con los volúmenes que ha calculado el software StepOne™
(“Complete la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de la dilución de muestra)”
en la página 145).

Acerca del Para el experimento de CT comparativos de ejemplo:

experimento de • Las diluciones de las muestras son necesarias porque el volumen de las muestras se
ejemplo limita al 10% del volumen total de la reacción en el software StepOne. El volumen
total de la reacción es de 20 µL/reacción, por lo que el volumen de las muestras es
de 2 µL/reacción.
• La concentración de la solución de partida es de 100 ng/µL. Después de diluir la
muestra de acuerdo con la tabla Sample Dilutions Calculations (Cálculos de
diluciones de las muestras), la muestra tendrá una concentración de 5,0 ng/µL. Esto
supone una concentración de 10✕ cuando se añaden 2 µL al volumen de mezcla de
reacción final de 20 µL. Hay una concentración de 1✕ en la reacción final.

Notas

158 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos
Preparación de las diluciones de las muestras

• Los volúmenes calculados en el software son:

Concentración Volumen de Volumen de Volumen total

Nombre de la
de la solución muestra disolvente de muestra
muestra
origen (ng/µL) (µL) (µL) diluida (µL)

Hígado 100,0 1,0 19,0 20,0

Riñón 100,0 1,0 19,0 20,0

Cerebro 100,0 1,0 19,0 20,0

Materiales • Agua para diluir la muestra

necesarios • Tubos de microcentrífuga
• Pipetas
• Puntas de pipeta
• Solución de partida de las muestras
• Agitador
• Centrífuga

Preparación de 1. Etiquete un tubo de microcentrífuga diferente para cada muestra diluida:

las diluciones de • Hígado
las muestras • Riñón
• Cerebro

2. Añada el volumen de agua requerido (disolvente) a cada tubo vacío:

Volumen de
Tubo Nombre de la muestra
disolvente (µL)

1 Hígado 19,0

2 Riñón 19,0

3 Cerebro 19,0

3. Añada el volumen de solución de partida de las muestras requerido (disolvente) a

cada tubo vacío:

Volumen de
Tubo Nombre de la muestra
muestra (µL)

1 Hígado 1,0

2 Riñón 1,0

3 Cerebro 1,0

4. Agite cada muestra diluida entre 3 y 5 segundos y, a continuación, centrifugue

brevemente los tubos.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 159
cuantificación relativa
 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos
Preparación de la mezcla de reacción

5. Coloque las muestras diluidas en hielo hasta que prepare la placa de reacción.

Directrices de Cuando prepare su propio experimento de CT comparativos:

preparación • Podría necesitar diluciones de las muestras porque el volumen de las muestras se
limita al 10% del volumen total de la reacción en el software StepOne. Debe realizar
diluciones de las muestras antes de añadir las muestras a la mezcla de reacción final.
• Para conseguir un rendimiento óptimo de los TaqMan® Gene Expression Assays o
los Custom TaqMan® Gene Expression Assays, utilice entre 10 y 100 ng de molde
de cDNA por 20-µL de reacción. Para reactivos tipo rápido, Applied Biosystems
recomienda 10 ng.
• Utilice tampón TE o agua para diluir la muestra.

Para obtener más Para obtener más información acerca de los ensayos de Applied Biosystems, consulte:
información • TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.

Preparación de la mezcla de reacción

Prepare la mezcla de reacción con los componentes y volúmenes que ha calculado el
software StepOne (“Complete la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la mezcla
de reacción) para el ensayo de TP53” en la página 143 y “Complete la ficha Reaction
Mix Calculations (Cálculos de la mezcla de reacción) para el ensayo de GAPDH” en la
página 144).

Nota: El software calcula todos los componentes de las reacciones de PCR. Sin
embargo, para preparar la mezcla de reacción de esta sección, incluya únicamente la
mezcla maestra, el ensayo y agua. Añada la muestra cuando prepare la placa de reacción
(consulte “Preparación de la placa de reacción” en la página 163).

Acerca del Para el experimento de CT comparativos de ejemplo:

experimento de • Los componentes de la mezcla de reacción son:
ejemplo
– TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕)
– Ensayo de TP53 (20✕)
– Ensayo de GAPDH (20✕)
– Agua

Notas

160 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos
Preparación de la mezcla de reacción

• Los volúmenes calculados en el software para ambos ensayos diana son:

Volumen (µL) para

Componente
1 reacción

Mezcla maestra (2✕) 10,0

Ensayo (20✕) 1,0

H2O 7,0

Volumen total 18,0

Nota: En este momento, no se añade la muestra.

Materiales • Tubos de microcentrífuga

necesarios • Pipetas
• Puntas de pipeta
• Componentes de la mezcla de reacción (enumerados arriba)
• Centrífuga

Preparación de la ¡IMPORTANTE! Prepare la mezcla de reacción para cada ensayo diana por separado.
mezcla de
reacción
1. Etiquete un tubo del tamaño apropiado para cada mezcla de reacción:
• Mezcla de reacción para TP53
• Mezcla de reacción para GAPDH

2. Para el ensayo de TP53, añada los volúmenes requeridos de cada componente al

tubo de la mezcla de reacción de TP53:

Volumen (µL) para

Volumen (µL) para 12 reacciones
Componente
1 reacción (más un exceso del
10%)

TaqMan® Fast Universal PCR 10,0 132,0

Master Mix (2✕)

Ensayo de TP53 (20✕) 1,0 13,2

Agua 7,0 92,4

Volumen total de la mezcla de 18,0 237,6

reacción

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 161
cuantificación relativa
 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos
Preparación de la mezcla de reacción

3. Para el ensayo de GAPDH, añada los volúmenes requeridos de cada componente al

tubo de la mezcla de reacción de GAPDH:

Volumen (µL) para

Volumen (µL) para 12 reacciones
Componente
1 reacción (más un exceso del
10%)

TaqMan® Fast Universal PCR 10,0 132,0

Master Mix (2✕)

Ensayo de GAPDH (20✕) 1,0 13,2

Agua 7,0 92,4

Volumen total de la mezcla de 18,0 237,6

reacción

4. Para mezclar la mezcla de reacción de cada tubo, pipetee suavemente hacia arriba y
hacia abajo y, a continuación, tápelos.

5. Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire.

6. Coloque las mezclas de las reacciones en hielo hasta que prepare la placa de
reacción.

Directrices de Cuando prepare su propio experimento de CT comparativos:

preparación • Si el experimento incluye más de un ensayo diana, prepare la mezcla de reacción
para cada ensayo diana de manera separada.
• Incluya un volumen de exceso en los cálculos para compensar la pérdida que se
produce durante las transferencias de reactivos. Applied Biosystems recomienda un
volumen de exceso de al menos el 10%.
• Incluya todos los componentes requeridos.
• Prepare los reactivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
• Mantenga los ensayos protegidos de la luz, en el refrigerador, hasta que esté listo
para usarlos. Una exposición excesiva a la luz puede afectar a las sondas
fluorescentes.
• Antes de utilizarlo:
– Dé vueltas al bote para mezclar bien la mezcla maestra.
– Agite el ensayo para resuspenderlo y, a continuación, centrifugue brevemente el
tubo.
– Para descongelar las muestras congeladas, colóquelas en hielo. Una vez
descongeladas, agite las muestras para resuspenderlas y, a continuación,
centrifugue los tubos brevemente.

Para obtener más Para obtener más información acerca de la preparación de la mezcla de reacción,
información consulte el protocolo apropiado para los reactivos que está utilizando en las reacciones de
PCR:
• TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

Notas

162 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos
Preparación de la placa de reacción

• Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol

Preparación de la placa de reacción

Prepare las reacciones para cada grupo de réplicas y, a continuación, transfiéralas a la placa
de reacción. Utilice la disposición de la placa que se muestra en el software StepOne.

Acerca del Para el experimento de CT comparativos de ejemplo:

experimento de • Se utiliza una MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate.
ejemplo
• El volumen de la reacción es de 20 µL/pocillo.
• La placa de reacción contiene:
– 18 pocillos desconocidos
– 6 pocillos de control negativo
– 24 pocillos vacíos
• Se utiliza la disposición de la placa que genera automáticamente el software
StepOne:

Materiales • Tubos de microcentrífuga

necesarios • Pipetas
• Puntas de pipeta
• Mezcla de reacción para TP53 (página 161)
• Mezcla de reacción para GAPDH (página 161)
• Agua
• Muestras (página 159)
• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate
• MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film
• Centrífuga

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 163
cuantificación relativa
 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos
Preparación de la placa de reacción

Preparación de la 1. Para cada gen diana, prepare las reacciones de control negativo:
placa de reacción
a. A un tubo del tamaño apropiado, añada los volúmenes de la mezcla de reacción
y de agua que se indican a continuación.

Volumen de la
Mezcla de Volumen de
Tubo mezcla de
reacción agua (µL)
reacción (µL)

1 Mezcla de reacción 59,4 6,6

para TP53

2 Mezcla de reacción 59,4 6,6

para GAPDH

b. Para mezclar la reacción, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a

continuación, tape el tubo.
c. Centrifugue brevemente el tubo para quitar las burbujas de aire.

d. Añada 20 µL de la reacción de control negativo a los pocillos apropiados de la

placa de reacción.

2. Por cada grupo de réplicas, prepare las reacciones para los elementos desconocidos
o muestras:
a. A tubos del tamaño adecuado, añada los volúmenes de la mezcla de reacción y
de las muestras que se indican a continuación.

Volumen
de la Volumen
Reacción Mezcla de
Tubo mezcla de Muestra de muestra
desconocida reacción
reacción (µL)
(µL)

1 Hígado TP53 Mezcla de 59,4 Hígado 6,6

reacción
para TP53

2 Riñón TP53 Mezcla de 59,4 Riñón 6,6

reacción
para TP53

3 Cerebro TP53 Mezcla de 59,4 Cerebro 6,6

reacción
para TP53

4 GAPDH en Mezcla de 59,4 Hígado 6,6

hígado reacción
para
GAPDH

5 GAPDH en Mezcla de 59,4 Riñón 6,6

riñón reacción
para
GAPDH

Notas

164 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos
Preparación de la placa de reacción

Volumen
de la Volumen
Reacción Mezcla de
Tubo mezcla de Muestra de muestra
desconocida reacción
reacción (µL)
(µL)

6 Cerebro Mezcla de 59,4 Cerebro 6,6

GAPDH reacción
para
GAPDH

b. Para mezclar las reacciones, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y, a
continuación, tape los tubos.
c. Centrifugue brevemente los tubos para quitar las burbujas de aire.

d. Añada 20 µL de la mezcla de reacción desconocida (muestra) a los pocillos

apropiados de la placa.

3. Selle la placa de reacción con película adhesiva óptica.

4. Centrifugue brevemente la placa de reacción para quitar las burbujas de aire.

5. Hasta que esté preparado para realizar la reacción, coloque la placa de reacción en
hielo en un sitio oscuro.

Directrices de Cuando prepare su propio experimento de CT comparativos:

preparación • Procure utilizar los consumibles adecuados.
• Asegúrese de que la colocación de las reacciones de PCR se corresponde con la
disposición de la placa que se muestra en el software StepOne. Puede:
– Aceptar la disposición de la placa que genera automáticamente el software.
o
– Utilizar el flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para
cambiar la disposición de la placa en el software.

Para obtener más Para obtener más información acerca de:

información • La preparación de la placa de reacción, consulte el protocolo apropiado para los
reactivos que está utilizando en las reacciones de PCR:
– TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
– Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
• Los consumibles, consulte la página 3.
• El uso del flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) para cambiar
la disposición de la placa, consulte “Flujo de trabajo Advanced Setup
(Configuración avanzada)” en la página 206.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 165
cuantificación relativa
 Capítulo 7 Preparación de las reacciones de CT comparativos
Preparación de la placa de reacción

Notas

166 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 8

Realización del experimento de CT

comparativos
Este capítulo cubre los siguientes temas:
■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
■ Preparación de la reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
■ Realización del experimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en
esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o
seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 167
cuantificación relativa
 Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos
Resumen del capítulo

Resumen del capítulo

En este capítulo, se explica cómo realizar una reacción en Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System.

Flujo de trabajo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para realizar el experimento de ejemplo
del experimento que se incluye en esta guía de introducción.
de ejemplo
Inicio del experimento


Diseño del experimento (Capítulo 6)


Preparación del experimento (Capítulo 7)


Realización del experimento (Capítulo 8)
1. Prepare el proceso.
2. Active las opciones de notificación.
3. Inicie el proceso.
4. Monitorice el proceso.
5. Descargue el instrumento y transfiera los datos.


Análisis del experimento (Capítulo 9)


Fin del experimento

Notas

168 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos
Preparación de la reacción

Preparación de la reacción
Para preparar el proceso, abra el experimento y cargue la MicroAmp™ Fast Optical 48-
Well Reaction Plate en el instrumento StepOne™.

Apertura del 1. Si aún no se está ejecutando el software StepOne™, haga doble clic en (acceso
experimento de directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los
ejemplo programas)Applied Biosystems StepOneStepOne v2.0.

2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Open (Abrir).

3. En el cuadro de diálogo Open (Abrir), desplácese hasta la carpeta experiments

(experimentos) (predeterminada).

4. Haga doble clic en Comparative CT Example (Ejemplo de CT comparativos) para

abrir el archivo del experimento de ejemplo que ha creado en el Capítulo 6.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 169
cuantificación relativa
 Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos
Preparación de la reacción

Carga de la placa PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Durante el uso del

de reacción instrumento, la temperatura del bloque puede superar los 100 °C. Si el instrumento se ha
utilizado recientemente, mantenga las manos alejadas de él hasta que el bloque alcance la
temperatura ambiente.

¡IMPORTANTE! Lleve guantes sin polvo para manejar la placa de reacción.

1. Abra la bandeja del instrumento.

2. Coloque las reacciones en el bloque.

La colocación de las reacciones depende del tipo de consumible que se utilice:
• Si utiliza una placa de reacción, colóquela con el pocillo A1 en la esquina
posterior izquierda.
• Si utiliza tiras de tubos de reacción, colóquelas en el bloque directamente.

A1

3. Cierre cuidadosamente la bandeja del instrumento.

Notas

170 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos
Realización del experimento

Realización del experimento

Realice los siguientes procedimientos del capítulo 4:
• “(Opcional) Activación de las notificaciones” en la página 71
• “Inicio de la reacción” en la página 73
• “Monitorización de la reacción” en la página 76
• “Descarga de la placa de reacción y transferencia de datos” en la página 87
Asegúrese de seleccionar el archivo Comparative CT Example.eds en lugar del archivo
Relative Standard Curve Example.eds.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 171
cuantificación relativa
 Capítulo 8 Realización del experimento de CT comparativos
Realización del experimento

Notas

172 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9

Análisis del experimento de CT

comparativos
Este capítulo cubre los siguientes temas:
■ Resumen del capítulo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
■ Sección 9.1 Revisión de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175
■ Sección 9.2 Solución de problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en
esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o
seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 173
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Resumen del capítulo

Resumen del capítulo

El software StepOne™ analiza los datos con el método de cuantificación de CT
comparativos (∆∆CT). En la primera sección de este capítulo, se explica cómo revisar los
datos analizados utilizando las pantallas de análisis y cómo presentar los datos. Si los
resultados son cuestionables, en la Sección 2 de este capítulo se explican algunos pasos
para solucionar los problemas.

Flujo de trabajo A continuación, se muestra el flujo de trabajo para analizar el experimento de ejemplo
del experimento que se incluye en esta guía de introducción.
de ejemplo
Experimento de CT comparativos (∆∆CT)
Inicio del experimento

Diseño del experimento (Capítulo 6)

Preparación de las reacciones (Capítulo 7)

Realización del experimento (Capítulo 8)

Análisis del experimento (Capítulo 9)
Sección 1. Revisión de los resultados:
1. Analice.
2. Revise la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica)
o la tabla de pocillos.
3. Revise la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación).
4. Presente los datos.
Sección 2. Solución de problemas:
1. Revise las opciones de análisis; ajuste la línea basal y el umbral.
2. Revise la pantalla QC Summary (Resumen QC).
3. Omita pocillos.
4. Revise la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente).
5. Revise la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos).


Fin del experimento

Notas

174 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Sección 9.1 Revisión de los resultados

Sección 9.1 Revisión de los resultados

Esta sección cubre los siguientes temas:

■ Análisis del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176
■ Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos . . . . . . . . . . . . 182
■ Revisión de la gráfica de amplificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
■ Presentación de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 175
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Análisis del experimento

Análisis del experimento

El software StepOne analiza el experimento y muestra los resultados en las pantallas de
análisis (por ejemplo, en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), QC
Summary (Resumen QC), etc.)

Acerca del Para el experimento de CT comparativos de ejemplo, utilice el archivo de datos que se
experimento de instala con el software StepOne. Este archivo de datos se ha creado con los mismos
ejemplo parámetros de diseño que se indican en el Capítulo 6 y luego se ha procesado y analizado
en un instrumento StepOne™.
Encontrará el archivo de datos del experimento de ejemplo en su ordenador:
<unidad>:\Applied Biosystems\StepOne System\experiments\examples
donde <unidad> es la unidad del disco duro del ordenador en la que está instalado el
software de StepOne. La unidad de instalación predeterminada del software es la
unidad C.

Análisis del 1. Si aún no se está ejecutando el software StepOne, haga doble clic en (acceso
experimento de directo al software StepOne) o seleccione Start (Inicio)All Programs (Todos los
ejemplo programas)Applied BiosystemsStepOneStepOne v2.0.

2. En la pantalla Home (Inicio), haga clic en Open (Abrir).

3. En el cuadro de diálogo Open (Abrir), desplácese hasta la carpeta examples

(ejemplos).

4. Haga doble clic en Comparative CT Example (Ejemplo de CT comparativos) para

abrir el archivo de datos del experimento de ejemplo.

Notas

176 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Análisis del experimento

3
4

5. Haga clic en Analyze (Analizar). El software analiza los datos utilizando las
opciones de análisis predeterminadas.

6. Consulte “Elementos del software” más adelante y “Consejos de desplazamiento”

en la página 179 para obtener información acerca de cómo desplazarse por las
pantallas de análisis.

Directrices Cuando analice su propio experimento de CT comparativos:

• Inmediatamente después de una reacción, el software StepOne analiza
automáticamente los datos utilizando las opciones de análisis predeterminadas y, a
continuación, muestra la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) en
el ordenador.
• Para volver a analizar los datos, seleccione todos los pocillos de la disposición de la
placa y, a continuación, haga clic en Analyze (Analizar).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 177
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Análisis del experimento

Elementos del A continuación, se ilustran los elementos del software StepOne de las pantallas de
software análisis.

1. Barra de menús: muestra los menús disponibles en el software:

• File (Archivo)
• Edit (Edición)
• Instrument (Instrumento)
• Analysis (Análisis)
• Tools (Herramientas)
• Help (Ayuda)

2. Barra de herramientas: muestra las herramientas disponibles en el software:

• New Experiment (Experimento nuevo)
• Open (Abrir)
• Save (Guardar)
• Close (Cerrar)
• Send Experiment to Instrument (Enviar experimento al instrumento)
• Download Experiment from Instrument (Descargar experimento del
instrumento)
• Export (Exportar)
• Print Report (Imprimir informe)

3. Cabecera del experimento: indica el nombre del experimento, el tipo de experimento

y los reactivos del experimento abierto.

4. Panel de menús del experimento: incluye vínculos a las siguientes pantallas del
software:
• Pantallas de configuración
• Pantallas del perfil de reacción
• Pantallas de análisis:
–Amplification Plot (Gráfica de amplificación)
–Gene Expression (Expresión génica)
–Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente)
–Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos)
–QC Summary (Resumen QC)
–Multiple Plots View (Vista de múltiples gráficas)

5. Panel de gráficas: muestra la pantalla de análisis seleccionada para el experimento

abierto.

6. Fichas de visualización: muestra la disposición de la placa o la tabla de pocillos del

experimento abierto.

Notas

178 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Análisis del experimento

7. Fichas del experimento: muestra una ficha por cada experimento abierto.

1
2
3
6

Consejos de Cómo seleccionar pocillos

desplazamiento Para ver pocillos específicos en las pantallas de análisis, seleccione los pocillos en la
ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa) de la siguiente manera:

1. Para seleccionar pocillos de un tipo específico, utilice los menús desplegables Select
Wells With (Seleccionar pocillos con): seleccione Sample (Muestra), Target
(Diana) o Task (Tarea) y, a continuación, seleccione el nombre de la muestra, el gen
diana o la tarea.

2. Para seleccionar un solo pocillo, haga clic en él en la disposición de la placa.

3. Para seleccionar varios pocillos, haga clic y arrastre el ratón por encima de los
pocillos deseados, pulse CTRL+clic, o pulse Mayús+clic en la disposición de la
placa.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 179
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Análisis del experimento

4. Para seleccionar los 48 pocillos, haga clic en la esquina superior izquierda de la

disposición de la placa.

Cómo ver múltiples gráficas

Utilice la vista Multiple Plots (Múltiples gráficas) para ver simultáneamente hasta cuatro
gráficas. Para desplazarse por la vista Multiple Plots (Múltiples gráficas):

1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Multiple Plots View (Vista de múltiples gráficas).

2. Para ver cuatro gráficas, haga clic en Show plots in a 2 ✕ 2 matrix (Mostrar
gráficas en una matriz de 2 X 2).

3. Para ver dos gráficas en filas, haga clic en Show plots in two rows (Ver gráficas
en dos filas).

4. Para ver dos gráficas en columnas, haga clic en Show plots in two columns
(Ver gráficas en dos columnas).

Notas

180 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Análisis del experimento

5. Para ver una gráfica específica, seleccione la gráfica en el menú desplegable situado
encima de la visualización de cada gráfica.

5 2 3

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 181
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos

Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de

pocillos
La pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) muestra los resultados
de los cálculos de cuantificación relativa a través del perfil de expresión génica. Hay
disponibles dos gráficas:
• RQ vs Target (Cuantificación relativa vs diana): agrupa los valores de
cuantificación relativa (RQ) por diana. Se traza cada muestra para cada gen diana.
• RQ vs Sample (Cuantificación relativa vs muestra): agrupa los valores de
cuantificación relativa (RQ) por muestra. Se traza cada gen diana para cada muestra.
Cada gráfica se puede ver de las siguientes formas: lineal, log10, Ln, log2.
En la tabla de pocillos, se muestran datos de cada pocillo de la placa de reacción,
incluidos:
• El nombre de la muestra, el nombre de el gen diana, la tarea y los fluorocromos
• El ciclo umbral calculado (CT), la fluorescencia normalizada (Rn) y los valores de
cantidades
• Avisos

Acerca del En el experimento de CT comparativos de ejemplo, se revisa:

experimento de • Cada gen diana de la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica)
ejemplo para el nivel de expresión (o cambio en número de veces de la expresión) de la
muestra de gen diana en relación con la muestra de referencia.
• La tabla de pocillos para evaluar la precisión de los grupos de réplicas.

Revisión de la 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

gráfica de (Análisis) Gene Expression (Expresión génica).
expresión génica
y la tabla de Nota: Si en la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica) no
pocillos aparece ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. En la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión génica):

a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione RQ vs Sample
(Cuantificación relativa vs Muestra).
b. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Log10.

c. En el menú desplegable Orientation (Orientación), seleccione Vertical Bars

(Barras verticales).

Notas

182 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos

d. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).
En el experimento de ejemplo, se muestra el nivel de expresión de TP53 en el
hígado y el riñón en relación con su nivel de expresión en la muestra de referencia
(cerebro). Dado que la muestra de referencia se compara consigo misma, el nivel de
expresión es 1. Si el resultado se muestra en el tipo de gráfico Log10, el nivel de
expresión de la muestra de referencia aparece como 0 en el gráfico (log10 de 1=0).

2a 2b 2c

2d

3. Revise la tabla de pocillos:

a. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis
(Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación) y, a
continuación, seleccione la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos).
b. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate
(Réplica).
c. Fíjese en la columna CT SD para evaluar la precisión de los grupos de réplicas.
En el experimento de ejemplo, no hay ningún valor atípico.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 183
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de la gráfica de expresión génica y la tabla de pocillos

3a

3b

3c

Nota: Para mostrar u ocultar columnas en la tabla de pocillos, marque/desmarque el

nombre de columna en el menú desplegable Show in Table (Mostrar en tabla).

Directrices de Cuando analice su propio experimento de CT comparativos, busque:

análisis • Diferencias en la expresión génica (como un cambio en número de veces de la
expresión) en relación con la muestra de referencia.
• Desviación estándar en los grupos de réplicas (valores CT SD). Si es preciso, omita
los valores atípicos (consulte “Omisión de pocillos para el análisis” en la
página 197).

Para obtener más Para obtener más información acerca de la pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de
información expresión génica) o la tabla de pocillos, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo
clic en o pulsando F1.

Notas

184 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de la gráfica de amplificación

Revisión de la gráfica de amplificación

En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), se muestra la amplificación
de todas las muestras de los pocillos seleccionados. Hay disponibles tres gráficas:
• ∆Rn vs Cycle (∆Rn vs ciclo): ∆Rn es la variación de la señal de fluorescencia
normalizada generada en cada ciclo de la reacción de PCR y son los datos a partir de
los cuales se calcula CT. En esta gráfica, ∆Rn se muestra en función del número de
ciclo. La gráfica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares y
para ver los valores del umbral y línea basal de la reacción.
• Rn vs Cycle (Rn vs ciclo): Rn es la fluorescencia de fluorocromo del notificador
normalizada. En esta gráfica, Rn se muestra en función del número de ciclo. La
gráfica sirve para identificar y examinar las amplificaciones irregulares.
• CT vs Well (CT vs pocillo): el ciclo umbral (CT) es el número de ciclo de PCR en el
cual el nivel de fluorescencia corta el umbral. En esta gráfica, CT se muestra en
función de la posición del pocillo. La gráfica sirve para localizar amplificaciones
con valores atípicos.
Cada gráfica se puede ver de las siguientes formas: lineal o log10.

Acerca del En el experimento de CT comparativos de ejemplo, hay que revisar cada gen diana en la
experimento de pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) para buscar:
ejemplo • Valores de umbral y línea basal correctos
• Valores atípicos

Revisión de la 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

gráfica de (Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación).
amplificación
Nota: Si en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) no aparece
ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 185
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de la gráfica de amplificación

2. Observe los pocillos de GAPDH en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de

amplificación):
a. Haga clic en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa).

b. En los menús desplegables Select Wells With (Seleccionar pocillos con),

seleccione Target (Diana) y, a continuación, GAPDH.

2a 2b

3. En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación):

a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione ∆Rn vs Cycle
(∆Rn vs ciclo).
b. En el menú desplegable Color Plot By (Colorear gráfica por), seleccione Well
(Pocillo).
c. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la
gráfica).

Notas

186 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de la gráfica de amplificación

4. Observe los valores de la línea basal:

a. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Linear
(Lineal).
b. Active la casilla de verificación Baseline (Línea basal) para ver los ciclos
inicial y final de la línea basal.
c. Compruebe que la línea basal está ajustada correctamente. En el experimento
del ejemplo, la línea basal termina antes de que se inicie la amplificación.

3a 4a 3b

3c

4b

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 187
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de la gráfica de amplificación

5. Observe los valores de umbral:

a. En el menú desplegable Graph Type (Tipo de gráfica), seleccione Log
(Registro).
b. En el menú desplegable Target (Diana), seleccione GAPDH.

c. Active la casilla de verificación Threshold (Umbral) para ver el umbral.

d. Compruebe que el umbral está situado correctamente. En el experimento de

ejemplo, el umbral está en la fase exponencial.

5a

5b
5c

Notas

188 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de la gráfica de amplificación

6. Busque cualquier valor atípico:

a. En el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica), seleccione CT vs Well
(CT vs pocillo).
b. Busque pocillos fuera de la curva de amplificación. En el experimento de
ejemplo, no hay ningún valor atípico para GAPDH.

6a

7. Repita los pasos 2 a 6 para los pocillos de TP53. En el experimento de ejemplo, no

hay ningún valor atípico para TP53.

Directrices de Cuando analice su propio experimento de CT comparativos, busque:

análisis • Los valores de línea basal y umbral correctos: el software StepOne calcula
automáticamente los valores de línea basal y umbral dando por hecho que los datos
tienen una gráfica de amplificación típica. Una gráfica de amplificación típica
tiene:
a. Una fase de meseta o plateau

b. Una fase lineal

c. Una fase exponencial (geométrica)

d. Un determinado ruido de fondo

e. Una línea basal

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 189
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de la gráfica de amplificación

a
b
Umbral
c
∆Rn

e
Ciclo

¡IMPORTANTE! Los errores en el experimento (por ejemplo, errores de

contaminación o pipeteo) pueden producir curvas de amplificación atípicas que
pueden derivar a cálculos incorrectos de los valores de línea basal y umbral por
parte del software StepOne. Por lo tanto, Applied Biosystems recomienda examinar
la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) y revisar los valores de
línea basal y umbral asignados a cada pocillo después del análisis.

• Valores atípicos
Si el experimento no cumple las directrices anteriores, solucione los problemas de la
siguiente forma:
• Ajuste manualmente la línea basal y/o el umbral (consulte “Revisión de las opciones
de análisis” en la página 194).
O
• Omita pocillos (consulte “Omisión de pocillos para el análisis” en la página 197).

Para obtener más Para obtener más información acerca de la pantalla Amplification Plot (Gráfica de
información amplificación), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Notas

190 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Presentación de los datos

Presentación de los datos

Hay distintas formas de presentar los datos del experimento:
• Guardando la gráfica como un archivo de imagen
• Imprimiendo la gráfica
• Imprimiendo la disposición de la placa
• Creando diapositivas
• Imprimiendo un informe
• Exportando datos
Para obtener más información acerca de estos procedimientos, acceda a la ayuda del
software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 191
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Presentación de los datos

Notas

192 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Sección 9.2 Solución de problemas

Sección 9.2 Solución de problemas

Esta sección cubre los siguientes temas:

■ Revisión de las opciones de análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
■ Revisión del resumen QC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
■ Omisión de pocillos para el análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
■ Revisión de la gráfica multicomponente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200
■ Revisión de la gráfica de datos brutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 193
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de las opciones de análisis

Revisión de las opciones de análisis

El cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis) muestra las opciones de
análisis del ciclo umbral (CT), los avisos, la cuantificación relativa y las opciones
avanzadas. Si las opciones de análisis predeterminadas del software StepOne no son
adecuadas para el experimento, puede cambiarlas en el cuadro de diálogo Analysis
Settings (Opciones de análisis) y, a continuación, volver a analizar el experimento.

Acerca del En el experimento de CT comparativos de ejemplo, se utilizan las opciones de análisis

experimento de predeterminadas sin ningún cambio.
ejemplo

Revisión de las 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis
opciones de (Análisis).
análisis
2. Haga clic en Analysis Settings (Opciones de análisis) para abrir el cuadro de
diálogo Analysis Settings (Opciones de análisis).

3. En el experimento de ejemplo, se utilizan opciones de análisis para cada ficha:

• CT Settings (Opciones de CT)
• Flag Settings (Opciones de avisos)
• Opciones de cuantificación relativa
• Advanced Settings (Opciones avanzadas)

Notas

194 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de las opciones de análisis

Directrices de A menos que ya haya determinado cuál son las opciones óptimas para el experimento,
análisis utilice las opciones de análisis predeterminadas en el software StepOne. Si las opciones
predeterminadas no son adecuadas para el experimento, puede cambiar:
• CT Settings (Opciones de CT): utilice esta ficha para ajustar manualmente el umbral
y la línea basal. Si ajusta manualmente el umbral y la línea basal, Applied
Biosystems recomienda lo siguiente:

Opción Recomendación

Umbral Introduzca un valor para el umbral de manera que:

• Esté por encima del ruido de fondo.
• Esté por debajo de las fases de meseta o plateau y fase lineal de
la curva de amplificación.
• Esté dentro de la fase exponencial de la curva de amplificación.

Línea basal Seleccione los valores Start Cycle (Ciclo inicial) y End Cycle (Ciclo
final) antes de que comience la amplificación.

• Flag Settings (Opciones de avisos): utilice esta ficha para:

– Ajustar la sensibilidad para que se marquen más o menos pocillos.
– Cambiar los parámetros de los avisos que aplica el software StepOne.
• Relative Quantitation Settings (Opciones de cuantificación relativa): utilice esta
ficha para:
– Cambiar la muestra de referencia y/o el control endógeno.
– Seleccionar el algoritmo que se debe utilizar para determinar los valores mínimos
y máximos de RQ (nivel de confianza o desviaciones estándar).
• Advanced Settings (Opciones avanzadas): utilice esta ficha para cambiar las
opciones de línea basal pocillo a pocillo.

Para obtener más Para obtener más información acerca de las opciones de análisis, acceda al software
información StepOne pulsando F1 cuando se abra el cuadro de diálogo Analysis Settings (Opciones
de análisis).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 195
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión del resumen QC

Revisión del resumen QC

La pantalla QC Summary (Resumen QC) muestra una lista de avisos del software
StepOne, e incluye la frecuencia y ubicación de los mismos en el experimento abierto.

Acerca del En el experimento de CT comparativos de ejemplo, hay que revisar la pantalla QC

experimento de Summary (Resumen QC) para saber si los datos del experimento han desencadenado
ejemplo algún aviso. En el experimento de ejemplo, no se ha desencadenado ningún aviso.

Revisión del 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis
resumen QC (Análisis) QC Summary (Resumen QC).

Nota: Si en la pantalla QC Summary (Resumen QC) no aparece ningún dato, haga

clic en Analyze (Analizar).

2. Revise el resumen de avisos. En el experimento de ejemplo, hay 0 pocillos

marcados.

3. En la tabla Flag Details (Detalles de aviso), observe las columnas Frequency

(Frecuencia) y Wells (Pocillos) para determinar qué avisos aparecen en el
experimento. En el experimento de ejemplo, en la columna Frequency (Frecuencia)
se muestra 0 en todas las columnas.

Nota: Un valor 0 en la columna Frequency (Frecuencia) indica que el aviso no

aparece en el experimento.

4. (Opcional) Haga clic en cada fila de avisos para ver información detallada acerca
del aviso.

2
3
4

Notas

196 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Omisión de pocillos para el análisis

Posibles avisos En los experimentos de CT comparativos, los datos del experimento pueden
desencadenar los avisos que se indican a continuación.
Si en el experimento no aparece un aviso, su frecuencia será 0. Si la frecuencia es >0, eso
significa que el aviso aparece en algún lugar del experimento. La posición del pocillo se
indica en la columna Wells (Pocillos).

Aviso Descripción

AMPNC Amplificación en control negativo

BADROX Señal de referencia pasiva incorrecta
BLFAIL Error del algoritmo de línea basal
CTFAIL Error del algoritmo CT
EXPFAIL Error del algoritmo exponencial
HIGHSD Desviación estándar alta en el grupo de réplicas
NOAMP No hay amplificación
NOISE Ruido mayor que otros pocillos en la placa
NOSIGNAL No hay señal en el pocillo
OFFSCALE La fluorescencia está fuera de la escala
OUTLIERRG Valor atípico en el grupo de réplicas
SPIKE Picos de ruido
THOLDFAIL Error en el algoritmo del umbral

Directrices de Cuando analice su propio experimento de CT comparativos:

análisis • Haga clic en cada aviso de la tabla Flag Details (Detalles de avisos) con una
frecuencia >0 para ver información detallada acerca del aviso. Si es necesario, haga
clic en el vínculo de solución de problemas para saber cómo corregir el aviso.
• Puede cambiar las opciones de los avisos:
– Ajustar la sensibilidad para que se marquen más o menos pocillos.
– Cambiar los parámetros de los avisos que aplica el software StepOne.

Para obtener más Para obtener más información acerca de la pantalla QC Summary (Resumen QC) o de las
información opciones de avisos, acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o
pulsando F1.

Omisión de pocillos para el análisis

Los errores de los experimentos pueden causar que algunos pocillos se amplifiquen de
manera insuficiente o no se amplifiquen. Estos pocillos suelen producir valores CT que
difieren significativamente de los valores medios de los pocillos de réplicas asociadas. Si
se incluyen en los cálculos, estos valores atípicos pueden dar lugar a mediciones
erróneas; para garantizar la precisión, omita los valores atípicos del análisis.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 197
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Omisión de pocillos para el análisis

Acerca del En el experimento de CT comparativos de ejemplo, no hay valores atípicos; no es

experimento de necesario omitir ningún pocillo del análisis.
ejemplo

Omisión de 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

pocillos (Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación).

Nota: Si en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) no aparece

ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), seleccione CT vs Well

(CT vs pocillo) en el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica).

3. Seleccione la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos).

Notas

198 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Omisión de pocillos para el análisis

4. En la tabla de pocillos:
a. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate
(Réplica).
b. Fíjese si en el grupo de réplicas hay algún valor atípico (asegúrese de que están
marcados con un aviso). En el experimento de ejemplo, no hay ningún valor
atípico.

4a

Directrices de Cuando analice su propio experimento de CT comparativos, fíjese bien si en los grupos
análisis de réplicas hay valores atípicos. Si es necesario, quite manualmente los valores atípicos
con la tabla de pocillos:

1. En el panel Experiment Menu (Menú de experimento), seleccione Analysis

(Análisis) Amplification Plot (Gráfica de amplificación).

Nota: Si en la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación) no aparece

ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. En la pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación), seleccione CT vs Well

(CT vs pocillo) en el menú desplegable Plot Type (Tipo de gráfica).

3. Seleccione la ficha View Well Table (Ver tabla de pocillos).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 199
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de la gráfica multicomponente

4. En la tabla de pocillos:
a. En el menú desplegable Group By (Agrupar por), seleccione Replicate
(Réplica).
b. Fíjese si en el grupo de réplicas hay algún valor atípico (asegúrese de que están
marcados).
c. Active la casilla de verificación Omit (Omitir) que hay junto a los pocillos con
valores atípicos.

5. Haga clic en Analyze (Analizar) para volver a analizar los datos del experimento sin
los pocillos con valores atípicos.

Para obtener más Para obtener más información acerca de la omisión de pocillos para el análisis, acceda a
información la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1. En la ayuda, busque
los temas relacionados con la omisión de pocillos:

1. Haga clic en la ficha Search (Buscar).

2. Escriba omit well (omisión de pocillos).

3. Haga clic en List Topics (Ver temas).

4. Haga doble clic en los temas que desee leer.

Revisión de la gráfica multicomponente

La pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) muestra la contribución
espectral completa de cada fluorocromo de un pocillo seleccionado durante el tiempo que
dura el proceso de PCR.

Acerca del En el experimento de CT comparativos de ejemplo, en la pantalla Multicomponent Plot

experimento de (Gráfica multicomponente) hay que fijarse en:
ejemplo • Fluorocromo ROX™ (referencia pasiva)
• Fluorocromo FAM™ (notificador)
• Picos, depresiones y/o cambios repentinos
• Amplificación en pocillos de control negativo

Revisión de la 1. En el panel Experiment Menu (Menú del experimento), seleccione Analysis

gráfica (Análisis) Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente).
multicomponente
Nota: Si en la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente) no aparece
ningún dato, haga clic en Analyze (Analizar).

Notas

200 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de la gráfica multicomponente

2. Muestre un solo pocillo a la vez en la pantalla Multicomponente Plot (Gráfica

multicomponente):
a. Haga clic en la ficha View Plate Layout (Ver disposición de placa).

b. Seleccione un pocillo en la disposición de la placa; el pocillo se muestra en la

pantalla Multicomponent Plot (Gráfica multicomponente).

3. En el menú desplegable Plot Color (Color de gráfica), seleccione Dye

(Fluorocromo).

4. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).

5. Compruebe la señal del fluorocromo FAM. En el experimento de ejemplo, la señal

del fluorocromo FAM aumenta a lo largo de la reacción de PCR, lo que indica que la
amplificación es normal.

6. Compruebe la señal del fluorocromo ROX. En el experimento de ejemplo, la señal

del fluorocromo ROX permanece constante a lo largo de la reacción de PCR, lo que
indica que los datos son típicos.

3 4 2a

2b

5
6

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 201
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de la gráfica multicomponente

7. Seleccione de uno en uno los pocillos de control negativo y compruebe la

amplificación. En el experimento de ejemplo, no hay amplificación en los pocillos
de control negativo.

Directrices de Cuando analice su propio experimento de CT comparativos, busque:

análisis • Referencia pasiva: el nivel de fluorescencia del fluorocromo de referencia pasiva
debe permanecer relativamente constante a lo largo de la reacción de PCR.
• Fluorocromo del notificador: el nivel de fluorescencia del fluorocromo del
notificador debería indicar una región plana que se corresponde con la línea basal,
seguida por un rápido aumento en la fluorescencia a medida que la amplificación
continúa.
• Cualquier irregularidad de la señal: no debería haber ningún pico, depresión ni
cambio súbito en la señal fluorescente.
• Pocillos de control negativo: no debería haber ninguna amplificación en los pocillos
de control negativo.

Para obtener más Para obtener más información acerca de la pantalla Multicomponent Plot (Gráfica
información multicomponente), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o
pulsando F1.

Notas

202 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de la gráfica de datos brutos

Revisión de la gráfica de datos brutos

En la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos), se muestra la señal de
fluorescencia bruta (no normalizada) para cada filtro óptico de los pocillos seleccionados
durante cada ciclo de la PCR a tiempo real.

Acerca del En el experimento de CT comparativos de ejemplo, hay que revisar la pantalla Raw Data
experimento de Plot (Gráfica de datos brutos) para comprobar si hay un aumento estable de la señal (que
ejemplo no hay ninguna depresión ni cambio abrupto) a partir del filtro apropiado.

Revisión de la 1. En el panel Experiment Menu (Menú de experimento), seleccione Analysis

gráfica de datos (Análisis) Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos).
brutos
Nota: Si en la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) no aparece ningún
dato, haga clic en Analyze (Analizar).

2. Para ver los 48 pocillos en la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos), haga
clic en la esquina superior izquierda de la disposición de la placa en la ficha View
Plate Layout (Ver disposición de placa).

3. Haga clic en Show/Hide the plot legend (Mostrar/ocultar la leyenda de la

gráfica).

4. Haga clic y arrastre el puntero Show Cycle (Mostrar ciclo) desde el ciclo 1 al 40. En
el experimento de ejemplo, hay un aumento estable en la señal a partir del filtro 1,
que se corresponde con el filtro del fluorocromo FAM™.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 203
cuantificación relativa
 Capítulo 9 Análisis del experimento de CT comparativos
Revisión de la gráfica de datos brutos

Los filtros del sistema StepOne™ son:

Filtro Fluorocromo

1 Fluorocromo FAM™

Fluorocromo SYBR®
Green

2 Fluorocromo JOE™

Fluorocromo VIC®

3 Fluorocromo ROX™

Directrices de Cuando analice su propio experimento de CT comparativos, fíjese en lo siguiente para

análisis cada filtro:
• Crecimiento característico de la señal
• Depresiones o cambios abruptos

Para obtener más Para obtener más información acerca de la pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos
información brutos), acceda a la ayuda del software StepOne haciendo clic en o pulsando F1.

Notas

204 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Apéndice A

Flujos de trabajo alternativos para el

experimento
Este apéndice cubre los siguientes temas:
■ Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) . . . . . . . . . . . . . . . . 206
■ Flujo de trabajo QuickStart (Inicio rápido) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207
■ Flujo de trabajo de molde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
■ Flujo de trabajo de exportación/importación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209

Nota: Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en
esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o
seleccionando Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 205
cuantificación relativa
 Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento
Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)

Flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada)

Si crea un experimento de curva estándar relativa o CT comparativos (∆∆CT) con el flujo
de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada) del software StepOne™, puede
configurar el experimento de acuerdo con su criterio.

1. Configure un nuevo experimento:

a. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start
(Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied Biosystems
StepOneStepOne v2.0.
b. En la columna Set Up (Configurar), haga clic en Advanced Setup
(Configuración avanzada).
c. En el panel de navegación, haga clic en Experiment Properties
(Propiedades del experimento) (predeterminado) y, a continuación, escriba las
propiedades del experimento de ejemplo.
d. En el panel de navegación, haga clic en Plate Setup (Configuración de
placa) y, a continuación, asigne los genes diana, los estándares (sólo en
experimentos de curva estándar relativa) y las muestras.
e. En el panel de navegación, haga clic en Run Method (Protocolo de
termociclado) y, a continuación, escriba el volumen de la reacción y cambie el
perfil térmico según convenga
f. En el panel de navegación, haga clic en Reaction Setup (Configuración
de reacción) y, a continuación, revise los volúmenes calculados para las
reacciones de PCR, la dilución seriada (sólo en experimentos de curva estándar
relativa) y las diluciones de las muestras. Edítelos si es preciso.
g. (Opcional) En el panel de navegación, haga clic en Materials List (Lista
de materiales) y, a continuación, seleccione y compre los materiales que
necesite para el experimento.

2. Prepare las reacciones de PCR:

a. Prepare el molde.

b. Prepare las diluciones de las muestras.

c. Prepare la dilución seriada (sólo en experimentos de curva estándar relativa).

d. Prepare la mezcla de reacción.

e. Prepare la placa de reacción.

Notas

206 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento
Flujo de trabajo QuickStart (Inicio rápido)

3. Realice el experimento:
a. Cargue el instrumento.

b. Inicie el proceso

c. Descargue el instrumento.

4. Analice los datos.

Flujo de trabajo QuickStart (Inicio rápido)

Si crea un experimento de curva estándar relativa o CT comparativos con el flujo de
trabajo QuickStart (Inicio rápido), puede procesar las reacciones en el instrumento sin
ninguna información sobre la configuración de la placa.

1. Prepare las reacciones de PCR:

a. Prepare el molde.

b. Prepare las diluciones de las muestras.

c. Prepare la dilución seriada (sólo en experimentos de curva estándar relativa).

d. Prepare la mezcla de reacción.

e. Prepare la placa de reacción.

2. Inicie rápidamente el experimento:

a. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start
(Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied
BiosystemsStepOneStepOne v2.0.
b. En la pantalla Run (Proceso), haga clic en QuickStart (Inicio rápido).
c. Seleccione la ficha Experiment Properties (Propiedades del experimento) y, a
continuación, escriba las propiedades del experimento.
d. Seleccione la ficha Run Method (Protocolo de termociclado) y, a
continuación, escriba el volumen de la reacción y cambie el perfil térmico
según convenga

3. Realice el experimento:
a. Cargue el instrumento.

b. Inicie el proceso.

c. Descargue el instrumento.

4. Complete la configuración de la placa.

5. Analice los datos.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 207
cuantificación relativa
 Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento
Flujo de trabajo de molde

Flujo de trabajo de molde

Si crea un molde para un experimento de curva estándar relativa o CT comparativos,
puede configurar muchos experimentos con la misma información de configuración.

1. Cree un molde:
a. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start
(Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied Biosystems
StepOneStepOne v2.0.
b. Abra un experimento existente o cree uno nuevo tal y como se describe en el
Capítulo 2 o Capítulo 6.
c. Seleccione File (Archivo)Save As Template (Guardar como molde).

d. En el cuadro de diálogo Save As Template (Guardar como molde), escriba un

nombre de archivo y, a continuación, haga clic en Save (Guardar) para guardar
el molde.
e. Haga clic en Close (Cerrar).

2. Cree un experimento utilizando el molde:

a. Si aún no está en la pantalla Home (Inicio), haga clic en Home (Inicio).

b. En la columna Set Up (Configurar), haga clic en Template (Molde).

c. En el cuadro de diálogo Open (Abrir), seleccione el molde que ha creado en el
paso 1.
d. Modifique el experimento con las herramientas del flujo de trabajo Advanced
Setup (Configuración avanzada).
e. Haga clic en Save (Guardar), escriba un nombre de archivo y, a
continuación, haga clic en Save (Guardar) para guardar el experimento.

3. Prepare las reacciones de PCR:

a. Prepare el molde.

b. Prepare las diluciones de las muestras.

c. Prepare la dilución seriada (sólo en experimentos de curva estándar relativa).

d. Prepare la mezcla de reacción.

e. Prepare la placa de reacción.

Notas

208 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento
Flujo de trabajo de exportación/importación

4. Realice el experimento:
a. Cargue el instrumento.

b. Inicie el proceso.

c. Descargue el instrumento.

5. Analice los datos.

Flujo de trabajo de exportación/importación

Si crea un experimento de curva estándar relativa o CT comparativos con el flujo de
trabajo de exportación/importación, puede configurar un experimento nuevo con los
datos exportados desde otros experimentos.

1. Haga doble clic en (acceso directo al software StepOne) o seleccione Start

(Inicio)All Programs (Todos los programas)Applied Biosystems
StepOneStepOne v2.0.

2. Abra un experimento existente o cree uno nuevo tal y como se describe en el

Capítulo 2 o el Capítulo 6.

3. Mientras el experimento está abierto, exporte la información de configuración:

a. Seleccione File (Archivo)Export (Exportar).

b. En la ficha Export Properties (Propiedades de exportación), seleccione Setup

(Configuración).
c. Seleccione One File (Un archivo) en el menú desplegable.

d. Seleccione (*.txt) en el menú desplegable File Type (Tipo de archivo).

e. Seleccione Open file(s) when export is complete (Abrir archivos cuando
termine la exportación).
f. Haga clic en Start Export (Iniciar exportación) y, a continuación, haga clic en
Close Export Tool (Cerrar herramienta de exportación) cuando se le solicite.

Notas

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 209
cuantificación relativa
 Apéndice A Flujos de trabajo alternativos para el experimento
Flujo de trabajo de exportación/importación

4. Utilice el archivo exportado como molde y cree la configuración de placa deseada:

a. Con una aplicación de hojas de cálculo (por ejemplo, el software Microsoft®
Excel), abra el archivo de texto exportado.
b. Sustituya los parámetros del archivo de texto según convenga Cuando haya
terminado, guarde el archivo en un formato de texto delimitado por
tabuladores.

¡IMPORTANTE! El archivo de texto debe tener el formato correspondiente al

formato de la disposición de la placa del software StepOne. Para obtener más
información acerca del formato de disposición de la placa, acceda a la ayuda
haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionando Help
(Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

5. Si aún no está en la pantalla Home (Inicio), haga clic en Home (Inicio).

6. En la columna Set Up (Configurar), haga clic en Advanced Setup

(Configuración avanzada).

7. Información de configuración de la importación:

a. Seleccione File (Archivo)Import (Importar).

b. Haga clic en Browse (Examinar), seleccione el archivo *.txt que ha creado en

el paso 4 y, a continuación, haga clic en Select (Seleccionar).
c. Haga clic en Start Import (Iniciar importación).

8. Prepare las reacciones de PCR:

a. Prepare el molde.

b. Prepare las diluciones de las muestras.

c. Prepare la dilución seriada (sólo en experimentos de curva estándar relativa).

d. Prepare la mezcla de reacción.

e. Prepare la placa de reacción.

9. Realice el experimento:
a. Cargue el instrumento.

b. Inicie el proceso.

c. Descargue el instrumento.

10. Analice los datos.

Notas

210 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Bibliografía

Kwok, S. and Higuchi, R. 1989. Avoiding false positives with PCR. Nature
339:237–238.
Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of β-globin
genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science 230:1350–1354.

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 211
cuantificación relativa
Bibliografía

212 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Glosario

AIF Abreviatura de archivo de información de ensayo (Assay Information File).

alelo Para unun gen dianaa diana determinado, cualquiera de las diferentes secuencias que
aparecen en la población.

amplicón Segmento de DNA amplificado durante la PCR.

amplificación Etapa del protocolo de termociclado, durante el cual se produce la generación del
amplicón. En los experimentos de cuantificación, los datos de fluorescencia recogidos
durante la amplificación se muestran en una gráfica de amplificación y se utilizan para
calcular los resultados. Si la amplificación está incluida en el proceso del instrumento
StepOne™ para experimentos de genotipado o presencia/ausencia, los datos de
fluorescencia recogidos durante la amplificación se muestran en una gráfica de
amplificación y se pueden utilizar para solucionar problemas.

apantallador Molécula unida al extremo de 3′ de las sondas TaqMan® para evitar que el notificador
emita una señal de fluorescencia mientras la sonda está intacta. Con los reactivos
TaqMan®, se puede utilizar un apantallador no fluorescente de unión al surco menor de la
doble hélice del DNA (NFQ-MGB). Con reactivos SYBR Green, no se utiliza ningún
apantallador.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA™

como notificador o apantallador con el sistema StepOne™.

apantallador no Moléculas que están unidas al extremo de 3′ de las sondas TaqMan®. Si la sonda está
fluorescente de intacta, el apantallador no fluorescente (NFQ) evita que el fluorocromo del notificador
unión al surco emita una señal de fluorescencia. Dado que el NFQ no emite ninguna fluorescencia,
menor de cadena produce señales de fondo más bajas, lo que se deriva en una mayor precisión en la
de DNA (NFQ-MGB) cuantificación. El ligando de unión de surco menor (MGB) aumenta la temperatura de
desnaturalización (Tm) sin aumentar la longitud de la sonda. También permite el diseño
de sondas más cortas.

archivo de Archivo de datos del CD que se incluye con cada pedido de ensayo. El nombre de archivo
información de incluye el número del código de barras de la placa. La información del AIF se incluye en
ensayo (AIF) un formato delimitado por tabuladores.

asistente de diseño Función del software StepOne™ que le ayuda a configurar el experimento guiándole a
través de los procedimientos óptimos para comenzar el diseño del experimento.

DNA de muestra Componente de reacción que se muestra en la pantalla Reaction Setup (Configuración de
(10✕) la reacción). El software asume que el DNA de muestra que se añade a la mezcla de
reacción está en una concentración del 10✕. Por ejemplo, si el volumen de la reacción es
de 20 µL, el volumen calculado de la muestra de la reacción 1 es 2 µL.

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 213
cuantificación relativa
Glosario

Auto∆ Opción para aumentar o reducir la temperatura y/o el tiempo en los ciclos subsiguientes
de la reacción de PCR. Cuando Auto∆ está habilitado, las opciones se indican por medio
de un icono en el perfil térmico:
• Auto∆ activado:
• Auto∆ desactivado:

biblioteca de Recogida de ensayos SNP en el software StepOne™.

ensayos SNP

biblioteca de genes Recogida de genes diana en el software StepOne™.

diana

biblioteca de Recogida de las muestras en el software StepOne™. La biblioteca de muestras contiene el

muestras nombre de la muestra y el color de la muestra.

calibración espacial Tipo de calibración del sistema StepOne™ en el que el sistema asigna las posiciones de
los pocillos en el bloque. Los datos de la calibración espacial se utilizan para que el
software pueda asociar aumentos de la fluorescencia durante una reacción con pocillos
específicos de la placa de reacción.

calibrador Véase muestra de referencia.

cantidad En los experimentos de cuantificación, la cantidad de gen diana en las muestras. La

cantidad absoluta puede referirse al número de copias, la masa, la molaridad o la carga
viral. La cantidad relativa se refiere a la diferencia entre la cantidad de gen diana
normalizada en la muestra y la cantidad de gen diana normalizada en la muestra de
referencia.

cantidad estándar Cantidad conocida de la reacción de PCR.

• En los experimentos de curva estándar, la muestra de concentración conocida de
gen diana. Las unidades de la cantidad estándar pueden ser la masa, el número de
copias, la carga viral u otras unidades para medir la cantidad del gen diana.
• En los experimentos de curvas estándar relativas, la muestra de concentración
conocida en el estándar. Por ejemplo, la cantidad estándar puede referirse a la
cantidad de cDNA o la cantidad de solución de partida. Las unidades no son
relevantes en los experimentos de curvas estándar relativas, porque se compensan o
simplifican en los cálculos.

cantidad inicial Cuando se define una curva estándar o una dilución seriada, se corresponde con la
cantidad mayor o menor de partida.

cantidad Cantidad de gen diana dividida por la cantidad de control endógeno.

normalizada

cebador directo Oligonucleótido que flanquea el extremo de 5′ del gen diana. El cebador reverso y el
cebador directo se utilizan juntos en las reacciones de PCR para amplificar el gen diana.

cebador reverso Oligonucleótido que flanquea el extremo de 3′ del gen diana. El cebador reverso y el
cebador directo se utilizan juntos en las reacciones de PCR para amplificar el gen diana.

214 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Glosario

ciclo umbral (CT) Número del ciclo de la PCR en el que ∆Rn corta el umbral en la gráfica de amplificación.

coeficientes de Valores calculados a partir de la línea de regresión de las curvas estándar, incluido el valor
regresión R2, la pendiente y el punto de intersección y. Los valores del coeficiente de regresión se
pueden utilizar para evaluar la calidad de los resultados a partir de los estándares. Véase
también curva estándar.

color de gen diana Color asignado a un gen diana para identificarlo en la disposición de la placa y las
gráficas de análisis.

Concentración de Campo del software que aparece en la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de
muestra diluida dilución de las muestras) de la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción). En
(10X para la mezcla este campo, escriba la concentración de la muestra que desea utilizar para añadir a la
de reacción) mezcla de reacción de todas las muestras del experimento. "10✕ for Reaction Mix" (10X
para la mezcla de reacción) significa que el software asume que la muestra o el
componente estándar de la mezcla de reacción tiene una concentración del 10✕. Por
ejemplo, si la concentración de las muestras diluidas es 50,0 ng/µL (10✕), la
concentración de la muestra final de la reacción es 5 ng/µL (1✕).

configuración Función del software StepOne™ que permite configurar el experimento de acuerdo con el
avanzada diseño de dicho experimento.

control endógeno Diana que debería tener un nivel de expresión similar en todas las muestras que se están
probando. Se utiliza en experimentos de curva estándar relativa y CT comparativos (∆∆CT)
para normalizar las señales de fluorescencia del gen diana que se está cuantificando.
También se conoce como gen de mantenimiento.

control interno En los experimentos de presencia/ausencia, un molde de DNA sintético corto que se
positivo (IPC) añade a las reacciones de PCR. Se puede utilizar el IPC para distinguir los falsos negativos
en las reacciones afectadas por los apantalladores de PCR, una configuración incorrecta
del ensayo o un fallo del reactivo o del instrumento.

control negativo En los experimentos del sistema StepOne™, tarea asignada a los genes diana o los ensayos
(NTC) de SNP en los pocillos que contienen agua o tampones en lugar de un molde de las
muestras. En los pocillos de control negativo, no se debería producir ninguna
amplificación del gen diana.

control positivo En los experimentos de genotipado, la tarea del ensayo de SNP en pocillos que contienen
una muestra con un genotipo conocido.

CT Abreviatura de ciclo umbral (Threshold Cycle).

CT automático Opción de análisis en la que el software calcula de manera automática el umbral y la línea
basal de la gráfica de amplificación. El software utiliza la línea basal y el umbral para
calcular el ciclo umbral (CT).

CT manual Opción de análisis en la que se introduce el valor del umbral y se selecciona si se desean
utilizar cálculos de línea basal automáticos o manuales. El software utiliza el valor del
umbral que se introduce y la línea basal para calcular el ciclo umbral (CT).

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 215
cuantificación relativa
Glosario

curva de Visualización de los datos recogidos durante la fase de la curva de disociación. Los picos
disociación de la curva de disociación pueden indicar la temperatura de desnaturalización (Tm) del
gen diana o pueden identificar la presencia de amplificaciones no específicas. La curva
de disociación se puede ver como fluorescencia del notificador normalizado (Rn) y la
temperatura o como la derivada de la fluorescencia del notificador normalizada (−Rn′) vs
la temperatura.

curva estándar En los experimentos de curva estándar y curva estándar relativa:

• La línea con un ajuste óptimo que resulta al representar los valores CT frente a las
cantidades conocidas del estándar. Véase también línea de regresión.
• Conjunto de estándares que contiene una serie de cantidades conocidas. Los datos
de las reacciones de la curva estándar se utilizan para generar la curva estándar. La
curva estándar se define por el número de puntos de la serie, el número de réplicas
estándar, la cantidad inicial y el factor de dilución. Véase también dilución seriada
del estándar.

delta Rn (∆Rn) Abreviatura de notificador normalizado con línea basal corregida (baseline-corrected
normalized reporter).

desconocidos En los experimentos de cuantificación, la tarea del gen diana en pocillos que contienen
una muestra con cantidades de gen diana desconocidas.
En los experimentos de genotipado, la tarea del ensayo de SNP en pocillos que contienen
una muestra con un genotipo desconocido.
En los experimentos de presencia/ausencia, la tarea del gen diana en pocillos que
contienen una muestra en la que no se conoce la presencia del gen diana.

diana La secuencia de ácido nucleico que se desea amplificar y detectar.

dilución seriada En los experimentos de curvas estándar y curvas estándar relativas, conjunto de normas
que contienen una serie de cantidades conocidas. La dilución seriada se prepara por medio
de estándares de dilución en serie. Por ejemplo, la solución de partida estándar se utiliza
para preparar el primer punto de dilución, el primer punto de dilución se utiliza para
preparar el segundo punto de dilución, etc. Los volúmenes necesarios para preparar una
dilución seriada se calculan mediante el número de puntos de dilución, el número de
réplicas estándar, la cantidad inicial, el factor de dilución y la concentración del estándar
en la solución de partida. Véase también curva estándar.

disolvente Reactivo utilizado para diluir una muestra o estándar antes de añadirlo a la reacción de
PCR. El disolvente puede ser agua o un tampón.

disposición de Ilustración de la rejilla de 6 × 8 pocillos y contenido asignado a la placa de reacción. En

placa el software, puede utilizar la disposición de la placa como una herramienta de selección
para asignar el contenido de los pocillos, ver las asignaciones de los pocillos y ver los
resultados. La disposición de la placa se muestra en las pantallas Design Wizard
(Asistente de diseño), Advanced Setup (Configuración avanzada), de reacción y de
análisis. La disposición de la placa se puede imprimir, incluir en un informe, exportar y
guardar como una diapositiva para una presentación.

216 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Glosario

disposición Disposición del sistema en la que el instrumento StepOne™ no está conectado a un

autónoma ordenador por medio del cable amarillo del sistema StepOne™. En su lugar, se utiliza una
unidad USB ( ) para transferir datos entre los componentes del sistema StepOne™. En
esta disposición, el instrumento StepOne™ se controla por medio de la pantalla táctil del
instrumento.

disposición Disposición del sistema en la que el instrumento StepOne™ está conectado directamente
conectada a un ordenador conectado por medio del cable del sistema StepOne™ amarillo. En esta
disposición, el instrumento StepOne™ está controlado por medio del software StepOne™
del ordenador conectado.

EFF% Véase eficiencia de amplificación (EFF%).

eficiencia de Cálculo de la eficiencia de la amplificación de la PCR. La eficiencia de la amplificación

amplificación se calcula utilizando la pendiente de la línea de regresión de la curva estándar. Una
(EFF%) pendiente próxima al −3,3 indica una eficiencia de amplificación de la PCR óptima del
100%. Factores que afectan a la eficiencia de la amplificación:
• Rango de cantidades estándar: para obtener medidas de la eficiencia más exactas
y precisas, utilice un amplio rango de cantidades estándar, de 5 a 6 órdenes de
magnitud (multiplicado por 105 a 106).
• Número de réplicas estándar: para obtener mediciones de la eficiencia más
precisas, incluya réplicas para reducir los efectos de las imprecisiones del pipeteo.
• Apantalladores de la PCR: los apantalladores de la PCR en la reacción pueden
reducir la eficiencia de la amplificación.

ensayo En el sistema StepOne™, reacción de PCR que contiene cebadores para amplificar un gen
diana y una sonda para detectar el gen diana amplificado.

mezcla de ensayos Componente de reacción de PCR de los Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression
Assays y los TaqMan® SNP Genotyping Assays que consta de cebadores diseñados para
amplificar un gen diana y una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación del
gen diana.

ensayo SNP Se utiliza en los experimentos de genotipado. Es una reacción de PCR que contiene
cebadores para amplificar el SNP y dos sondas para detectar diferentes alelos.

ensayos bajo Los ensayos TaqMan® que se fabrican cuando se solicitan. Sólo se envían los ensayos que
pedido cumplen las especificaciones de control de calidad de la fabricación.

ensayos en Ensayos TaqMan® fabricados previamente, que cumplen las especificaciones de control
inventario de calidad y que se guardan en el inventario.

estándar Muestra que contiene cantidades estándar conocidas. Las reacciones estándar se utilizan
en experimentos de cuantificación para generar curvas estándar. Véase también curva
estándar y dilución seriada del estándar.

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 217
cuantificación relativa
Glosario

experimento Se refiere al proceso completo de realización de una reacción con el sistema StepOne™,
incluida la configuración, el proceso y el análisis. Tipos de experimentos que se pueden
realizar con el sistema StepOne™:
• Cuantificación : curva estándar
• Cuantificación : curva estándar relativa
• Cuantificación: CT comparativos (∆∆CT)
• Curva de disociación
• Genotipado
• Presencia/ausencia

experimento de Experimento en el que los datos de fluorescencia que se recogen en una lectura a punto
punto final final se utilizan para calcular resultados para experimentos de genotipado o
presencia/ausencia.

factor de dilución Valor numérico que define la secuencia de cantidades en la curva estándar. El factor de
dilución y la cantidad inicial sirven para calcular la cantidad estándar de cada punto de la
curva estándar. Por ejemplo, si la curva estándar se define con un factor de dilución de
1:10 o 10, la diferencia entre 2 puntos adyacentes cualquiera en la curva se multiplica por
10.

fase Componente del perfil térmico. Una fase consta de uno o varios pasos.

fase cíclica Fase del perfil térmico que se repite. Si la fase cíclica se utiliza para realizar la PCR, se
denomina fase de amplificación.

fase de curva de Fase del perfil térmico con un incremento de temperatura para generar una curva de
disociación disociación.

fase de espera Fase del perfil térmico que incluye uno o varios pasos. Por ejemplo, puede añadir una fase
de espera al perfil térmico para activar enzimas, para desactivar enzimas o para incubar
una reacción.

fluorocromo del Fluorocromo fabricado por Applied Biosystems y precalibrado en el sistema StepOne™.
sistema Fluorocromos del sistema:
• Fluorocromo FAM™
• Fluorocromo JOE™
• Fluorocromo ROX™
• Fluorocromo SYBR® Green
• Fluorocromo VIC®

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA™

como notificador o apantallador con el sistema StepOne™.

218 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Glosario

fluorocromo Fluorocromo que no fabrica Applied Biosystems. Puede utilizar fluorocromos

personalizado personalizados para realizar experimentos de PCR a tiempo real en el sistema StepOne™.
Antes de utilizar fluorocromos personalizados, realice una calibración del fluorocromo
personalizado.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA™

como notificador o apantallador con el sistema StepOne™.

fluorocromo puro Reactivo que contiene el fluorocromo fluorescente. Los fluorocromos puros se utilizan
para realizar una calibración de fluorocromo puro en el sistema StepOne™. Véase también
fluorocromo del sistema.

gen de Véase control endógeno.

mantenimiento

gráfica de Visualización de los datos recogidos durante la fase cíclica de la amplificación de la PCR.
amplificación Se puede ver como:
• Notificador normalizado con línea basal corregida (∆Rn) frente al ciclo
• Notificador normalizado (Rn) frente al ciclo
• Ciclo umbral (CT) frente al pocillo

gráfica de datos Visualización del incremento de la fluorescencia de los pocillos seleccionados de todos
brutos los filtros. Muestra el incremento de la fluorescencia de todos los puntos de recogida de
datos de la reacción.

gráfica de Visualización de los datos recogidos durante la lectura a punto final. La gráfica de
discriminación de discriminación de alelos es una gráfica de la señal del notificador normalizada procedente
alelos de la sonda del alelo 1 que se ha trazado a partir de la señal del notificador normalizada
procedente de la sonda del alelo 2.

gráfica de Visualización de temperaturas de la muestra, la cubierta del instrumento y el bloque de

temperatura instrumento durante el proceso del instrumento.

gráfica Visualización de los datos recogidos durante la fase cíclica de la PCR a tiempo real. La
multicomponente gráfica multicomponente muestra la fluorescencia de todos los ciclos de la reacción.

grupo de réplicas Conjunto de reacciones idénticas de un experimento.

identificador de Valor o código asignado por Applied Biosystems a los TaqMan® Gene Expression Assays
ensayo y los TaqMan® SNP Genotyping Assays.

identificador Número que identifica el identificador de agrupamiento de SNP (refSNP) de referencia.

refSNP Lo genera dbSNP (Single Nucleotide Polymorphism Database of Nucleotide Sequence
Variation o Base de datos de polimorfismos nucleótidos únicos de variación de secuencia
nucleótida). Se puede utilizar para buscar en el almacén de Applied Biosystems un
Applied Biosystems SNP Genotyping Assay. También se denomina número rs.

inhibidor del IPC Reactivo añadido a las reacciones de PCR para bloquear la amplificación del control
positivo interno (IPC).

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 219
cuantificación relativa
Glosario

intersección y Coeficiente de regresión calculado a partir de la línea de regresión de la curva estándar. La

intersección y indica el ciclo umbral esperado (CT) para una muestra con una cantidad
igual a 1 (por ejemplo, 1 ng/µL).

IPC Abreviatura de control positivo interno (Internal Positive Control). Además, en los
experimentos de presencia/ausencia, es la tarea del gen diana de IPC en pocillos que
contiene el molde de IPC.

IPC bloqueado En los experimentos de presencia/ausencia, tarea asignada al gen diana de IPC en los
pocillos que contienen un agente de bloqueo de IPC en lugar de una muestra. Véase
también pocillos de IPC bloqueados por control negativo.

IPC+ Llamada de presencia/ausencia cuando el control interno positivo (IPC) es correcto.

lectura a punto final Se utiliza en los experimentos de genotipado y presencia/ausencia. Es la parte del proceso
del instrumento que se produce después de la amplificación. En los experimentos de
genotipado, los datos de fluorescencia que se recogen durante la lectura a punto final se
muestran en la gráfica de discriminación de alelos y se utilizan para asignar genotipos. En
los experimentos de presencia/ausencia, los datos de fluorescencia que se recogen durante
la lectura a punto final se muestran en la gráfica de presencia/ausencia, y se utilizan para
detectar la presencia o ausencia de la diana.

lectura previa a la Se utiliza en los experimentos de genotipado y presencia/ausencia. Es la parte del proceso
PCR del instrumento que se produce antes de la amplificación. Los datos de fluorescencia que
se recogen durante la lectura previa a la PCR se utilizan para normalizar los datos de
fluorescencia a tiempo final.

línea basal En la gráfica de amplificación, línea ajustada a los niveles de fluorescencia de un rango
de ciclos definido. Si se utiliza una opción de análisis de línea basal manual, Applied
Biosystems recomienda seleccionar los primeros ciclos de la PCR para determinar la línea
basal.

línea basal Opción de análisis en la que el software calcula los ciclos inicial y final de la línea basal
automática para la gráfica de amplificación. El software utiliza la línea basal y el umbral para calcular
el ciclo umbral (CT).

línea basal manual Opción de análisis en la que se introducen los ciclos inicial y final de la línea basal para
la gráfica de amplificación. El software utiliza la línea basal y el umbral para calcular
valores CT.

línea de regresión En los experimentos de curva estándar y curva estándar relativa, la línea que mejor se
ajusta a partir de la curva estándar. Fórmula de la línea de regresión:
CT = m [registro (Cant)] + b
donde m es la pendiente, b es el punto de intersección y, y Cant es la cantidad estándar.
Véase también coeficientes de regresión.

método CT Método de cuantificación para experimentos de cuantificación. Con el método CT

comparativos comparativos (∆∆CT), se utilizan los resultados de una muestra de referencia y un control
(∆∆CT) endógeno para determinar cantidades relativas de un gen diana en las muestras.

220 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Glosario

método de En los experimentos de cuantificación, el método que se utiliza para determinar la

cuantificación cantidad de gen diana en las muestras. En los experimentos de cuantificación, hay tres
tipos de métodos de cuantificación disponibles: curva estándar, CT comparativos (∆∆CT)
y curva estándar relativa.

método de curva Método de cuantificación para experimentos de cuantificación. Con el método de curva
estándar estándar, los resultados de los estándares se utilizan para determinar cantidades absolutas
de un gen diana en las muestras.

método de la curva Método de cuantificación para experimentos de cuantificación. Con el método de la curva
estándar relativa estándar relativa, se utilizan los resultados de los estándares, una muestra de referencia y
un control endógeno para determinar las cantidades relativas de un gen diana en las
muestras.

mezcla de cebador Componente de reacción de PCR que contiene el cebador directo y el cebador reverso
diseñados para amplificar el gen diana.

mezcla de Componente de reacción de PCR que consta de cebadores diseñados para amplificar el
cebador/sonda gen diana y una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación del gen diana.

mezcla de reacción Solución que contiene todos los componentes necesarios para procesar la reacción de
PCR, excepto el molde (de muestra, estándar o de control).

mezcla de sondas Componente de reacción de PCR que contiene una sonda TaqMan® diseñada para detectar
la amplificación del gen diana.

molde Tipo de ácido nucleico que se añade a la reacción de PCR. El molde recomendado varía
en función del tipo de experimento.

monitorización Función del software que permite ver el estado de un instrumento en red, enviar
remota experimentos al instrumento y descargar experimentos del instrumento en el ordenador.

muestra El molde que se está amplificando.

muestra de En experimentos de curva estándar relativa y CT comparativos (∆∆CT), la muestra a la que

referencia se refieren los resultados cuantitativos relativos. También se denomina calibrador.

Muestra estándar Componente de reacción que se muestra en la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos
(10✕) de la muestra de reacción) de la pantalla Reaction Setup (Configuración de la reacción).
El software asume que la muestra o el estándar que se añade a la mezcla de reacción está
en una concentración del 10✕. Por ejemplo, si el volumen de la reacción es de 20 µL, el
volumen calculado de la muestra o estándar de la reacción 1 es 2 µL.

nombre de Introducido durante la configuración del experimento, es el nombre que se utiliza para
experimento identificar el experimento. Los nombres de los experimentos no pueden superar los 100
caracteres y no pueden incluir ninguno de los siguientes caracteres: barra inclinada hacia
delante (/), barra inclinada hacia atrás (\), signo mayor que (>), signo menor que (<),
asterisco (*), signo de interrogación (?), comillas ("), línea vertical (|), dos puntos (:) o
punto y coma (;).

notificador Fluorocromo fluorescente que se utiliza para detectar la amplificación. Si se utilizan

reactivos TaqMan®, el fluorocromo del notificador se une al extremo de 5′. Si se utilizan
reactivos SYBR® Green, el fluorocromo del notificador es SYBR® Green.

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 221
cuantificación relativa
Glosario

notificador Se muestra en el eje y de la curva de disociación. La señal del notificador derivado es el

derivado (−Rn′) opuesto de la primera derivada de la fluorescencia normalizada del notificador.

notificador Señal de fluorescencia que emite el fluorocromo del notificador normalizado a la señal
normalizado (Rn) de fluorescencia de la referencia pasiva.

notificador La magnitud de la señal de fluorescencia normalizada que genera el notificador durante

normalizado con la amplificación de la PCR.
línea basal
∆Rn = Rn (punto final) − Rn (línea basal), donde Rn = notificador normalizado.
corregida (∆Rn)

número rs Véase identificador refSNP.

omitir pocillo Acción que se realiza después del análisis para omitir uno o varios pocillos de todos los
análisis antes de volver a analizar los datos.

pantalla táctil Visor del instrumento que se toca para controlarlo.

paso Componente del perfil térmico. Los pasos se definen por la temperatura, el tiempo, la
rampa y el estado de recogida de datos. En los ciclos, los pasos también se definen por
medio del estado Auto∆.

PCR a tiempo real Proceso de recogida de datos de fluorescencia durante la amplificación de la PCR. Los
datos de la PCR a tiempo real sirven para calcular los resultados de los experimentos de
cuantificación o para solucionar los problemas de los resultados de los experimentos de
genotipado o presencia/ausencia.

pendiente Coeficiente de regresión calculado a partir de la línea de regresión de la curva estándar.

La pendiente indica la eficiencia de la amplificación de la PCR para el ensayo. Una
pendiente de −3,3 indica una eficiencia de amplificación del 100%. Véase también
eficiencia de amplificación (EFF%).

perfil térmico Parte de un protocolo de termociclado que especifica la temperatura, el tiempo, la rampa
y los puntos de recogida de datos de todos los pasos y fases del proceso del instrumento.

pocillos de IPC de En los experimentos de presencia/ausencia, pocillos que contienen un molde de IPC y un
control negativo tampón o agua en lugar de una muestra en la reacción de PCR. El molde de IPC es lo único
que se debería amplificar en los pocillos de IPC de control negativo, porque la reacción
no contiene ninguna muestra. Véase también IPC+.

pocillos de IPC de En los experimentos de presencia/ausencia, pocillos que contienen un agente de bloqueo
control negativo del IPC en lugar de una muestra en la reacción de PCR. No se debería producir ninguna
bloqueado amplificación en los pocillos de IPC de control negativo bloqueado, porque la reacción no
contiene ninguna muestra y la amplificación del IPC está bloqueada. También se
denomina "sin control de amplificación” (NAC).

protocolo de Definición del volumen de reacción y el perfil térmico del proceso del instrumento.
termociclado

punto Un estándar en una curva estándar. La cantidad estándar de cada punto de la curva
estándar se calcula en base a la cantidad inicial y el factor de dilución.

222 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Glosario

QuickStart (Inicio Función del sistema StepOne™ que permite realizar el experimento sin introducir la
rápido) información de configuración de la placa.

química Véase reactivos.

rampa La velocidad a la que cambia la temperatura durante el proceso del instrumento. Excepto
en el caso del paso de la curva de disociación, la rampa se define como un porcentaje. En
el caso del paso de la curva de disociación, la rampa se define como un incremento de la
temperatura. En el gráfico del perfil térmico, la rampa se indica por medio de una línea
diagonal.

reacción de la Combinación de la muestra y el ensayo diana en una reacción de PCR. En el asistente de

muestra/diana diseño, cada reacción de PCR sólo puede contener una muestra y un ensayo diana.

reacción del ensayo Combinación de la muestra y el ensayo SNP en una reacción de PCR. Cada reacción de
SNP/muestra PCR sólo puede contener una muestra y un ensayo SNP.

reactivos Los componentes de la reacción de PCR que se está utilizando para amplificar el gen
diana y detectar la amplificación. Tipos de reactivos utilizados en el sistema StepOne™:
• Reactivos TaqMan®
• Reactivos SYBR® Green
• Otros reactivos

reactivos SYBR® Componente de reacción de PCR que consta de dos cebadores que están diseñados para
Green amplificar el gen diana y el fluorocromo SYBR® Green para detectar DNA de doble
cadena.

reactivos TaqMan® Componentes de reacción de PCR que constan de cebadores diseñados para amplificar el
gen diana y una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación del gen diana.

rechazar pocillo Acción que realiza el software durante el análisis para quitar uno o varios pocillos de un
análisis posterior si se aplica un aviso específico al pocillo.

recogida de datos Proceso durante la utilización del instrumento en el que un componente del instrumento
detecta datos de fluorescencia en cada pocillo de la placa de reacción. El instrumento
transforma la señal en datos electrónicos y los datos se guardan en el archivo del
experimento. Los puntos de recogida de datos se indican por medio de un icono en el
perfil térmico:
• Recogida de datos activada:
• Recogida de datos desactivada:

referencia pasiva Fluorocromo que produce una señal de fluorescencia. Dado que la señal de referencia
pasiva debería ser uniforme en todos los posillos, se utiliza para normalizar la señal del
fluorocromo del notificador para justificar las fluctuaciones de fluorescencias causadas
por diferencias menores entre pocillos en concentraciones o en volumen. La
normalización de la señal de referencia pasiva permite obtener datos de gran precisión.

réplicas Número total de reacciones idénticas que contienen componentes idénticos y volúmenes
idénticos.

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 223
cuantificación relativa
Glosario

retrotranscriptasa Componente de reacción de PCR que convierte el RNA en cDNA. La retrotranscriptasa

se añade a la reacción de PCR para realizar un RT-PCR de 1 paso.

Rn Abreviatura de notificador normalizado (Normalized Reporter).

serie Véase dilución seriada.

sin control de Véase también pocillos de IPC de control negativo bloqueado.

amplificación (NAC)

sin control de Véase control negativo (NTC).

molde (NTC)

SNP Abreviatura de polimorfismo de nucleótido único (Single Nucleotide Polymorphism). El

SNP puede constar de una diferencia base o una indel (inserción/deleción).

tarea Tipo de reacción realizada en el pocillo para el gen diana o el ensayo SNP. Tareas
disponibles en los experimentos del sistema StepOne™:
• Desconocida
• Control negativo
• Estándar (experimentos de curvas estándar y curvas estándar relativas)
• Control positivo (experimentos de genotipado)
• IPC (experimentos de presencia/ausencia)
• IPC bloqueado (experimentos de presencia/ausencia)

temperatura de Punto en la curva de disociación en el que se produce un pico en los niveles de

desnaturalización fluorescencia que sirve para indicar que el DNA de doble cadena amplificado se disocia
(Tm) en DNA de cadena sencilla.

tipo de experimento El tipo de experimento que se realiza con el sistema StepOne™:

• Curva estándar
• CT comparativos (∆∆CT)
• Curva estándar relativa
• Curva de disociación (no disponible en el asistente de diseño)
• Genotipado
• Presencia/ausencia
El tipo de experimento que seleccione afecta a las pantallas de configuración, perfil de
reacción y análisis.

Tm Abreviatura de temperatura de desnaturalización (Tm o Melting Temperature).

umbral Nivel de fluorescencia por encima de la línea basal y dentro de la región de crecimiento
exponencial de la gráfica de amplificación. El umbral se puede determinar
automáticamente (véase CT automático) o se puede ajustar manualmente (véase CT
manual).

umbral del ciclo Véase ciclo umbral (CT).

224 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Glosario

valor atípico Para un conjunto de datos, un punto de dato que es significativamente más pequeño o
grande que los demás.

valor R2 Coeficiente de regresión calculado a partir de la línea de regresión de la curva estándar.

El valor R2 indica la proximidad del ajuste entre la línea de regresión de la curva estándar
y los puntos de datos CT individuales de las reacciones estándar. El valor 1,00 indica un
ajuste perfecto entre la línea de regresión y los puntos de datos.

velocidad de la Velocidad a la que se produce la rampa de temperatura durante el proceso del instrumento.
rampa Las velocidades de rampa disponibles son rápida y estándar.

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 225
cuantificación relativa
Glosario

226 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Índice

A ver múltiples gráficas 99, 180

consumibles 21, 130
ADVERTENCIA, descripción xi
admitidos 3
analizar experimento Véase también materiales necesarios. 3
analizar 94, 176
control endógeno
directrices 95, 102, 107, 110, 115, 118, 119, 122,
componente de experimento 5
123, 177, 184, 189, 195, 197, 199, 202, 204
pantalla Relative Quantification Settings (Opciones
flujo de trabajo 92, 174
de cuantificación relativa) 32, 140
omitir pocillos 118, 197
seleccionar 27, 136
para obtener más información 103, 108, 110, 115,
118, 120, 122, 123, 184, 190, 195, 197, control negativo, componente de experimento 5, 6
200, 202, 204 convenciones utilizadas en esta guía vii
publicar los datos 111, 191 crear nuevo experimento 17, 127
ver opciones de análisis 114, 194
ver pantalla Amplification Plot (Gráfica de
amplificación) 103, 185 D
ver pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de datos
expresión de genes) 108, 182 acerca de la recopilación de datos 2
ver pantalla Multicomponent Plot (Gráfica experimento de ejemplo 9, 12, 94, 176
multicomponente) 120, 200 publicar 111, 191
ver pantalla Multiple Plots transferir 87
(Múltiples gráficas) 99, 180 descargar placa de reacción 87
ver pantalla QC Summary (Resumen QC) 116, 196 Design Wizard (Asistente de diseño)
ver pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos elementos del software 127
brutos) 122, 203 finalizar 46, 152
ver pantalla Standard Curve (Curva estándar) 100 pantalla Experiment Properties (Propiedades de
ver tabla de pocillos 108, 182 experimento) 20, 129
Applied Biosystems pantalla Materials List (Lista de materiales) 43, 148
asistencia técnica x pantalla Methods & Materials (Métodos y
comentarios del cliente acerca de la materiales) 22, 131
documentación ix pantalla Reaction Setup (Configuración de
contacto x reacción) 35, 142
Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System. pantalla Relative Quantification Settings (Opciones
Véase sistema StepOne. cuantificación relativa) 140
asistencia técnica, contacto x pantalla Relative Quantification Settings (Opciones
ayuda en línea. Consulte Sistema de ayuda de cuantificación relativa) 32
pantalla Run Method (Método de proceso) 33, 141
pantalla Samples (Muestras) 30, 137
B pantalla Standards (Estándares) 28
biblioteca 34, 142 pantalla Targets (Dianas) 25, 135
biblioteca Run Method (Método de proceso) 34, 142 dianas
configurar 25, 135
directrices de diseño 26, 136
C dilución seriada de estándar
cargar placa de reacción 70, 170 componente de experimento 5
categoría de instalación xx preparar 55
categoría de sobretensión (potencia) xx volúmenes calculados 36, 39
comentarios del cliente, acerca de los documentos de diluciones de muestras
Applied Biosystems ix preparar 53, 158
volúmenes calculados 40, 53, 146, 159
consejos de desplazamiento
seleccionar pocillos 98, 179

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 227
cuantificación relativa
Índice

directrices componente de experimento 5

análisis 95, 102, 107, 110, 115, 118, 119, 122, 123, configurar 28
177, 184, 189, 195, 197, 199, 202, 204 diluir 55
diseño 21, 23, 26, 29, 32, 33, 34, 41, 45, 48, 130, directrices de diseño 29
132, 136, 139, 140, 142, 147, 150, 154 EMC xxiii
eliminación de residuos químicos xix reacciones estándar 62
preparación 54, 58, 60, 64, 158, 160, 162, 165 seguridad xxiii
proceso 72 estándares de compatibilidad electromagnética.
seguridad de residuos químicos xix ConsulteEstándares EMC
seguridad química xvii estándares de seguridad xxiii
diseñar experimento estándares EMC xxiii
configurar dianas 25, 135
etiquetas de seguridad, en instrumentos xiv
configurar estándares 28
configurar método de proceso 33, 141 experimento de CT comparativo de ejemplo
configurar muestras 30, 137 analizar 174
configurar opciones cuantificación relativa 140 datos 12
configurar opciones de cuantificación relativa 32 descripción 11
crear nuevo 17, 127 diseño 126
definir métodos y materiales 22, 131 flujo de trabajo 13
definir propiedades del experimento 20, 129 nombre 129
directrices 21, 23, 26, 29, 32, 33, 34, 41, 45, 48, preparar 156
130, 132, 136, 139, 140, 142, 147, 150, 154 proceso 168
elementos del software 127 experimento de curva estándar relativa de ejemplo
finalizar flujo de trabajo del asistente de diseño 46, analizar 92
152 datos 12
flujo de trabajo 16, 126 descripción 10
para obtener más información 22, 24, 27, 30, 32, 33, diseño 16
34, 42, 45, 48, 131, 134, 137, 139, 141, flujo de trabajo 13
142, 148, 151, 154 nombre 20
revisar configuración de reacción 35, 142 preparar 50
solicitar materiales 43, 148 proceso 68
disposición conectada experimento de DDCT. Véase experimento de CT
inicio 73 comparativo
supervisión 77 experimentos de CT comparativo
transferir datos 88 acerca de 5
distribución autónoma comparados con experimentos de curva estándar
inicio 74 relativa 6
supervisión 86 experimentos de curva estándar relativa
supervisión remota 83 acerca de 4
transferencia de datos remota 88 comparados con experimentos de CT comparativo 6
transferir datos 89
documentación, relacionada viii F
flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración
E avanzada) 9, 10, 24, 48, 64, 133, 154, 165,
eficiencia de amplificación 29, 30, 102, 103 206
elementos del software flujo de trabajo de exportación/importación 10, 209
Design Wizard (Asistente de diseño) 127 flujo de trabajo de inicio rápido 10, 207
pantallas de análisis 96, 178 flujo de trabajo de plantilla 10, 208
eliminación de residuos, directrices xx flujos de trabajo
ensayos en inventario 41, 147 Advanced Setup (Configuración avanzada) 206
ensayos fabricados bajo pedido 41, 147 experimento de ejemplo 13
ensayos personalizados 41, 147 Exportación/importación 10, 209
Plantilla 10, 208
ergonomía, seguridad xxii
QuickStart (Inicio rápido) 10, 207
estación de trabajo xxii
flujos de trabajo alternativos del experimento. Véase
estándares flujos de trabajo.
casilla de verificación Set Up Standards (Configurar
formación, información acerca de x
estándares) 25, 26

228 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Índice

G pantalla Relative Quantification Settings (Opciones

de cuantificación relativa) 32, 140
gráfica de amplificación, típica 107, 189
muestras
componente de experimento 4, 5
H configurar 30, 137
High-Capacity cDNA Reverse Transcription diluciones 53, 158
Kits 51, 157 directrices de diseño 32, 139
preparar plantilla 51, 157
reacciones de muestras (desconocidas) 64, 164
I
iconos de peligro. Consulte símbolos de peligro, en O
instrumentos
omitir pocillos 118, 197
imprimir instrucciones de la configuración de la
reacción 40, 146 opciones de análisis
avanzadas 115, 195
indicador BADROX 117, 197
CT 115, 195
indicador NOAMP 117, 197 cuantificación relativa 115, 195
indicador NOISE 117, 197 línea basal 115, 195
indicador NOSIGNAL 117, 197 marcador 115, 195
indicador OFFSCALE 117, 197 umbral 115, 195
ver 114, 194
indicador OUTLIERRG 117, 197
opciones de notificación 71
indicador SPIKE 117, 197
otros reactivos basados en fluorescencia 9
indicador THOLDFAIL 117, 197
iniciar proceso
disposición conectada 73 P
distribución autónoma 74 palabras de aviso para el usuario, descripción viii
pantalla Amplification Plot (Gráfica de amplificación)
L supervisión durante un proceso 78
ver después de proceso 103, 185
línea basal
ajustar manualmente 115, 195 pantalla Experiment Properties (Propiedades de
valores correctos 107, 189 experimento) 20, 129
pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión de
genes) 108, 182
M pantalla Materials List (Lista de materiales) 43, 148
marcador AMPNC 117, 197 pantalla Methods & Materials (Métodos y
marcador BLFAIL 117, 197 materiales) 22, 131
marcador CTFAIL 117, 197 pantalla Multicomponent Plot (Gráfica
marcador EXPFAIL 117, 197 multicomponente) 120, 200
marcador HIGHSD 117, 197 pantalla Multiple Plots (Múltiples gráficas) 99, 180
marcadores pantalla QC Summary (Resumen QC) 116, 196
en experimentos de CT comparativo 197 pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos brutos) 122,
en experimentos de curva estándar relativa 117 203
opciones de análisis 115, 195 pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) 35,
materiales necesarios 51, 53, 55, 59, 61, 157, 159, 161, 142
163 pantalla Relative Quantification Settings (Opciones
mezcla de reacción cuantificación relativa) 140
volúmenes 59, 161 pantalla Relative Quantification Settings (Opciones de
volúmenes calculados 36, 38, 143, 145 cuantificación relativa) 32
movimiento repetitivo, seguridad xxii pantalla Run Method (Método de proceso) 33, 141
movimiento y levantamiento, seguridad xvi supervisión durante un proceso 81
MSDS pantalla Samples (Muestras) 30, 137
descripción xvii pantalla Standards (Estándares) 28
obtención xviii
pantalla Targets (Dianas) 25, 135
MSDS, obtener x
pantalla Temperature Plot (Gráfica de temperatura) 80
muestra de referencia
componente de experimento 5

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 229
cuantificación relativa
Índice

pantallas de análisis reactivos TaqMan 8, 23, 24, 27, 41, 123, 132, 134, 136,
consejos de desplazamiento 98, 179 147, 204
elementos del software 96, 178 realizar experimento
pantalla Amplification Plot (Gráfica de activar opciones de notificaciones 71
amplificación) 103, 185 alertas 82
pantalla Gene Expression Plot (Gráfica de expresión directrices 72
de genes) 108, 182 flujo de trabajo 68
pantalla Multicomponent Plot (Gráfica iniciar 73
multicomponente) 120, 200 para obtener más información 71, 82, 84
pantalla Multiple Plots (Múltiples gráficas) 99, 180 preparar 69, 169
pantalla QC Summary (Resumen QC) 116, 196 supervisar 76
pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos transferir datos 87
brutos) 122, 203 réplica, componente de experimento 5, 6
pantalla Standard Curve (Curva estándar) 100
residuos biológicos peligrosos, manipulación xx
tabla de pocillos 108, 182
residuos radioactivos, manipulación xx
PCR multiplexada 7, 25, 134
resultados, interpretar 93, 175
PCR uniplexada 7, 25, 134
RT-PCR de 1 pasos 7, 24, 25, 34, 41, 133, 134, 142,
Peligro xxi
147
PELIGRO, descripción xi
RT-PCR de 2 pasos 7, 11, 12, 24, 25, 133, 134
peligros. Consulte seguridad
perfiles de residuos, descripción xx
placa de reacción
S
cargar 70, 170 seguridad
descargar 87 antes de usar el instrumento xvi
disposición 46, 152 convenciones xi
preparar 61, 163 directrices xvii, xix, xx
plantilla. Véase muestras. eléctrica xx
ergonomía xxii
pocillos
estación de trabajo xxii
control negativo 31, 46, 61, 138, 152, 163
estándares xxiii
desconocidos 31, 46, 61, 138, 152, 163
mover y levantar el instrumento xvi
estándar 31, 46, 61, 138, 152, 163
mover/levantar xvi
omitir 118, 197
movimiento repetitivo xxii
seleccionar 98, 179
peligros biológicos xxi
PRECAUCIÓN, descripción xi química xvii
preparar el proceso 69, 169 residuo químico
preparar experimento residuos químicos xix
dilución seriada de estándar 55 uso del instrumento xvi
diluciones de muestras 53, 158 seguridad de residuos químicos xix
directrices 54, 58, 60, 64, 158, 160, 162, 165 seguridad eléctrica xx
flujo de trabajo 50, 156
seguridad química xvii
mezcla de reacción
preparar 58, 160 seleccionar pocillos 98, 179
para obtener más información 52, 54, 60, 65, 158, símbolos de peligro. Consulte símbolos de peligro, en
160, 162, 165 instrumentos
placa de reacción 61, 163 símbolos de peligro. Consulte símbolos de seguridad, en
plantilla 51, 157 instrumentos
publicar datos 111, 191 símbolos de seguridad, en instrumentos xiii
símbolos, seguridad xiii
R sistema de ayuda, acceso ix
reactivos sistema StepOne
otros basados en fluorescencia 9 consumibles 3
SYBR Green 8 distribuciones 73, 76, 88
TaqMan 8 filtros 123, 204
reactivos 8
reactivos SYBR Green 8, 23, 24, 27, 41, 123, 132, 134,
recopilación de datos 2
136, 147, 204
solicitar materiales 43, 148

230 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Índice

solución de problemas
ajustar línea basal 115, 195
ajustar umbral 115, 195
marcadores 117, 197
omitir pocillos 118, 197
ver opciones de análisis 114, 194
ver pantalla Multicomponent Plot (Gráfica
multicomponente) 120, 200
ver pantalla QC Summary (Resumen QC) 116, 196
ver pantalla Raw Data Plot (Gráfica de datos
brutos) 122, 203
supervisar proceso
disposición conectada 77
distribución autónoma 86
distribución autónoma (remota) 83
pantalla Amplification Plot (Gráfica de
amplificación) 78
pantalla Run Method (Método de proceso) 81
pantalla Temperature Plot (Gráfica de
temperatura) 80
suposiciones de uso de esta guía vii

T
tabla de pocillos 108, 182
transferir datos 87

U
umbral
ajustar manualmente 115, 195
valores correctos 107, 189
usar esta guía
como tutorial 9
con sus propios experimentos 9
uso del instrumento, seguridad xvi

V
valores atípicos. Véase omitir pocillos.
velocidad de la rampa 22, 24, 131, 133

Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de 231
cuantificación relativa
Índice

232 Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de
cuantificación relativa
 Worldwide Sales and Support

Applied Biosystems vast distribution and

service network, composed of highly trained
support and applications personnel,
reaches 150 countries on six continents.
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06/2010

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