PROVOST

 &  WALLERT  RESEARCH   GST Tag Purification

Investigating  the  Biochemistry  &  

Cellular  Physiology  of  NHE1   Protocol

EST.  1998    
 
GST  Purification  is  an  affinity  chromatography.    GST  is  a  26  kDa  protein  expressed  in  the  pGEX  plasmid  vector.    Depending  on  the  
vector,  many  have  a  thrombin  or  other  protease  recognition  site.    Depending  on  the  protein  concentration  (typically  high  levels)  
GST  can  dimerize.  Using  1-­‐chloro-­‐2,4-­‐dinitrobenze  (CNDB)  as  a  substrate,  GST  activity  can  be  followed  using  a  simple  colormetric    
assay  with  glutathione.  
 
Protein  expression  can  range  from  1  mg  to  10  mg  per  liter  of  culture.    Average  yields  are  2.5  mg  of  protein  expressed  in  a  1  liter  
culture.    Binding  capacity  for  most  glutathione-­‐sepharose  beads  is  about  25mg  per  ml  of  packed  beads.    The  capacity  is  decreased  
with  higher  flow  rates.    Store  at  2oC  in  20%  ethanol.  
 
Culture  Volume   20  liter   4  liters   500  ml   50  ml  
Possible  Yield   50  mg   10  mg   1.25  mg   0.125  mg  
Lysis  buffer  volume   100  ml   50-­‐100  ml   10-­‐25  ml   2.5  ml  
GST  column  bed  volume   10  ml   2  ml   0.5  ml   25  µl  
Wash  volume  (x3)  **   100  ml   25  ml   5  ml   250  ml  
Elution  buffer  vol  (x5-­‐8)  **   10  ml   4  ml   2    ml    
**  Important  Note:    A  quick  check  of  wash  and  elution  fractions  with  a  bradford  assay  (20  ul  sample  mixed  with  ~1  ml  of  1X  
bradford)  will  inform  you  the  relative  amount  of  protein  in  the  fraction.  
 
Column  Preparation:  Wash  beads  with  10  column  volumes  of  elution  buffer  followed  by  30  column  volumes  of  binding  buffer.  
 
Load  the  column:      
o Batch  Load:  Add  clarified  lysate  (if  frozen,  check  for  ppt  material.    If  there  is  any  clumpy  or  ppt  material  or  if  the  lysate  is  cloudy,  
centrifuge  and  keep  the  supernatant)  to  the  washed  beads.      
§ Pour  the  lysate  onto  a  drained  and  capped  column.    Use  a  spatula  and/or  a  transfer  pipette  to  suspend  the  beads.  
Tightly  cover  with  parafilm  and  incubate  rocker  for  30  min  at  room  temp.      
§ Replace  the  column  on  the  stand  and  allow  most  of  the  beads  settle  then  open  column.  Add  frit  back  to  column.  This  
the  non-­‐binding  protein.    
o Conventional  load  -­‐  run  the  clarified  lysate  through  the  beads.    If  proteolysis  is  an  issue  only  do  one  time  through.    If  the  protein  
poorly  binds  the  beads,  run  the  lysate  through  the  beads  twice  or  use  the  Batch  Load  method.  
 
o Wash  the  column  with  GST  Wash  Buffer.    This  will  remove  some  of  the  weakly  binding  protein.    Continue  to  wash  until  there  is  
no  protein  in  eluate  (use  a  quick  Bradford  analysis).  
o Elute  the  protein    
• Add  one  volume  of  elution  buffer,  allow  the  half  of  the  volume  of  column  (beads)  to  drain  from  column,  collect  as  fraction  
one  and  CAP/STOP  the  column  (this  is  called  a  pulse  elution).    Incubate  the  column  at  room  temp  for  10  min  to  elute  the  
fusion  protein.  
• Open  the  column  and  collect  the  remaining  elution  as  fraction  2.  
• Continue  elution  with  additional  volumes  of  elution  buffer  (no  need  to  pulse  elute).    Save  each  as  a  separate  fraction.    
Continue  until  protein  is  no  longer  eluting  from  the  column.  
 
o Check  each  fraction  for  total  protein  and  determine  purity  by  SDS-­‐PAGE  –  coomasie  stain    
GST  Binding  &  Wash  Buffer:   GST  Elution  Buffer:  
• 50  mM  Tris-­‐Cl  (pH8.0)   • 50  mM  Tris-­‐Cl  (pH8.0)  
• 150  mM  NaCl   • 150  mM  NaCl  
• 0.1  mM  EDTA   • 0.1  mM  EDTA  
  • 10  mM  Reduced  (Free)  glutathione    MAKE  FRESH  avoid  oxidized  GSH.