Download the full version of the textbook now at textbookfull.

com

Salivary Gland Development and Regeneration

Advances in Research and Clinical Approaches
to Functional Restoration 1st Edition
Seunghee Cha (Eds.)
https://textbookfull.com/product/salivary-gland-
development-and-regeneration-advances-in-research-
and-clinical-approaches-to-functional-
restoration-1st-edition-seunghee-cha-eds/

Explore and download more textbook at https://textbookfull.com

 Recommended digital products (PDF, EPUB, MOBI) that
you can download immediately if you are interested.

Salivary Gland Cancer From Diagnosis to Tailored Treatment

Lisa Licitra

https://textbookfull.com/product/salivary-gland-cancer-from-diagnosis-
to-tailored-treatment-lisa-licitra/

textbookfull.com

Advances in Periodontal Surgery: A Clinical Guide to

Techniques and Interdisciplinary Approaches Salvador Nares

https://textbookfull.com/product/advances-in-periodontal-surgery-a-
clinical-guide-to-techniques-and-interdisciplinary-approaches-
salvador-nares/
textbookfull.com

Biomaterials in Clinical Practice : Advances in Clinical

Research and Medical Devices 1st Edition Fatima Zivic Et
Al. (Eds.)
https://textbookfull.com/product/biomaterials-in-clinical-practice-
advances-in-clinical-research-and-medical-devices-1st-edition-fatima-
zivic-et-al-eds/
textbookfull.com

Beginning Robotics with Raspberry Pi and Arduino: Using

Python and OpenCV 2nd Edition Jeff Cicolani

https://textbookfull.com/product/beginning-robotics-with-raspberry-pi-
and-arduino-using-python-and-opencv-2nd-edition-jeff-cicolani-2/

textbookfull.com
The political economy of monetary solidarity :
understanding the euro experiment First Edition Waltraud
Schelkle
https://textbookfull.com/product/the-political-economy-of-monetary-
solidarity-understanding-the-euro-experiment-first-edition-waltraud-
schelkle/
textbookfull.com

Chance of Sprinkles (Donut Disturb #3) 1st Edition Melissa

Williams

https://textbookfull.com/product/chance-of-sprinkles-donut-
disturb-3-1st-edition-melissa-williams/

textbookfull.com

Cooking for Geeks Real Science Great Cooks and Good Food
2nd Edition Jeff Potter

https://textbookfull.com/product/cooking-for-geeks-real-science-great-
cooks-and-good-food-2nd-edition-jeff-potter/

textbookfull.com

Fascinating Transitions in Multilingual Newscasts: A

corpus-based investigation of translation in the news Gaia
Aragrande
https://textbookfull.com/product/fascinating-transitions-in-
multilingual-newscasts-a-corpus-based-investigation-of-translation-in-
the-news-gaia-aragrande/
textbookfull.com

Growing Without Schooling Volume 2 GWS The Complete

Collection John Holt

https://textbookfull.com/product/growing-without-schooling-
volume-2-gws-the-complete-collection-john-holt/

textbookfull.com
Nursing and Humanities 1st Edition Graham Mccaffrey

https://textbookfull.com/product/nursing-and-humanities-1st-edition-
graham-mccaffrey/

textbookfull.com
 Seunghee Cha Editor

Salivary Gland
Development and
Regeneration

Advances in Research and

Clinical Approaches to
Functional Restoration

123
Salivary Gland Development
and Regeneration
Seunghee Cha
Editor

Salivary Gland
Development and
Regeneration
Advances in Research and Clinical
Approaches to Functional
Restoration
Editor
Seunghee Cha
Oral and Maxillofacial Diagnostic Sciences
University of Florida
Gainesville, Florida
USA

ISBN 978-3-319-43511-4    ISBN 978-3-319-43513-8 (eBook)

DOI 10.1007/978-3-319-43513-8

Library of Congress Control Number: 2017933465

© Springer International Publishing Switzerland 2017

This work is subject to copyright. All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or
part of the material is concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of
illustrations, recitation, broadcasting, reproduction on microfilms or in any other physical way,
and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation, computer software,
or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this
publication does not imply, even in the absence of a specific statement, that such names are
exempt from the relevant protective laws and regulations and therefore free for general use.
The publisher, the authors and the editors are safe to assume that the advice and information in
this book are believed to be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor
the authors or the editors give a warranty, express or implied, with respect to the material
contained herein or for any errors or omissions that may have been made. The publisher remains
neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

Printed on acid-free paper

This Springer imprint is published by Springer Nature

The registered company is Springer International Publishing AG
The registered company address is: Gewerbestrasse 11, 6330 Cham, Switzerland
Preface

Rome was not built in a day, as the English playwright John Heywood
famously wrote. Innovation and advancement in the field of salivary gland
regeneration is one of the great examples that reflects this sentiment. The first
research article available on this topic through the US National Library of
Medicine dates back to 1950. The article, entitled “Regeneration in the
Submaxillary Gland of the Rat,” by B.B. Milstein in 1950, cites Van
Podwyssozki as the first to describe regeneration of organs of small animals
as long ago as 1886 and regeneration of the salivary glands (Die Regeneration
an den Speicheldrusen) in 1887.
Since the 1950s, an ever-expanding literature and diversified approaches
aimed at functional restorations have mirrored strong interest and attention to
this particular subject of research. Journal articles dealing with autoimmune
Sjögren’s syndrome, effects of radiation, and ductal ligation models in rats
and mice appeared in the early 1980s, followed by research on neural regula-
tion of secretion and effectiveness of epidermal growth factor in wound heal-
ing models and glandular regeneration in the late 1980s through the
mid-1990s.
In 1995, the late Dr. Michael Humphreys published his well-known review
article entitled “Saliva and growth factors: the fountain of youth resides in us
all,” which emphasized the vital importance of growth factors in oral/sys-
temic health and glandular repair/regeneration. Histological analyses of glan-
dular architecture and development were established by Dr. Robert Redman,
the author of Chap. 4 of this volume. With the turn of a new century, molecu-
lar and cellular mechanisms of branching morphogenesis and glandular
development were further investigated and pioneered by Drs. Kenneth
M. Yamada and Matthew P. Hoffman, whose work provided foundations for
the application of tissue engineering concepts and methodologies to salivary
regeneration. Outstanding contributions by Dr. Bruce J. Baum to the field of
tissue engineering and gene therapy have ultimately been solidified in appli-
cations such as clinical trials involving AAV2-mediated human aquaporin-1
delivery in recent years. Investigation of ductal ligation models, irradiation
models, and Sjögren’s syndrome NOD models dominated interest in the field
until around 2010, when stem cell research in vitro and in vivo reignited
research interest and passion in salivary gland regeneration.
In the current era, the authors and coauthors in this book, who are renowned
researchers, dentists, and surgeons in the field, have spearheaded efforts to
discover the underlying pathogenesis of xerostomia and innovative approaches

v
vi Preface

to restore secretory function. I am proud to present their collective efforts and

years of their research outcomes revealed in their book chapters, which will
establish another significant milestone in the history and tradition of studies
on glandular regeneration.
This book begins with the description of fundamental and molecular pro-
cesses occurring during salivary gland organogenesis/branching morphogen-
esis and molecular communications among epithelial, mesenchymal,
endothelial, and neuronal cells for cellular differentiation and organ develop-
ment (Chap. 1, Dr. Lombaert). The importance of understanding the commu-
nications and simulating optimal environments in glandular repair and
regeneration is further discussed under Future Prospects.
With rapidly advancing biotechnology, the application of systems biology
has become an indispensable tool in this field. Chapter 2 discusses the defini-
tion and applications of systems biology for glandular tissues and saliva sam-
ples (Chap. 2, Dr. Larson et al.). Systems biology approaches in conjunction
with traditional approaches unveil the complex molecular, cellular, and phys-
ical processes in development, disease processes, and regenerative medicine
involving the salivary glands.
One of the underappreciated subjects in the field is the important role of a
large family of mucins in oral health. In Chap. 3, the authors summarize the
main structural and functional characteristics of salivary mucins, their expres-
sion patterns during salivary gland development and regeneration, and quali-
tative and quantitative changes in pathological processes in the salivary
glands due to irradiation, autoreactive immune cells, neoplasm, or inflamma-
tion (Chap. 3, Dr. Castro et al.).
Changes due to radiation are not limited to mucin expression profiles but
are also manifested in the parenchymal and stromal structures in the salivary
glands. These changes are detailed in Chap. 4 with photomicrographs and
transmission electron micrographs of rat and human salivary glands (Chap. 4,
Dr. Redman). Understanding the damage occurring in the glands before and
after radiation therapy will expedite the development of intervention strate-
gies to protect the salivary glands from the harmful radiation.
In Chap. 5, Dr. Tran’s group reviews recent advances from the years 2010
to 2015 in the treatment of salivary gland hypofunction with a special empha-
sis on mesenchymal stem cells (Chap. 5, Dr. Tran et al.). This chapter covers
in detail adipose tissue-derived stromal cells, mesenchymal stromal cells
derived from various sources, and finally the authors’ experience with the
soluble contents/factors in bone marrow soup extracted from a whole bone
marrow cell lysate.
As differentiation-inducing factors are crucial for initiating stem cell dif-
ferentiation from the state of quiescence, these extrinsic and intrinsic factors
(transcription factors) involved in pancreas, liver, and salivary gland regen-
eration are further detailed in Chap. 6 with a focus on directed-cell differen-
tiation and transdifferentiation (Chap. 6, Drs. Park and Cha).
Current cell models for bioengineering of the salivary glands are presented
in Chap. 7, along with the pros and cons of utilizing various salivary cell
lines. Practical tips on cell isolation and culture techniques in conjunction
with the use of scaffolds complement the use of stem, progenitor, and acinar
Preface vii

cells for salivary gland regeneration. Current trends in salivary gland bioen-
gineering deliver great promise in functional restoration of the salivary glands
(Chap. 7, Dr. Baker).
To explore further the subject of bioengineering, factors and elements
needed for successful development of a functional salivary gland are dis-
cussed in detail in Chap. 8, emphasizing the dynamic nature of the basement
membrane and the significance of the extracellular matrix and cell polarity
in salivary gland development and reconstruction. In addition, studies utiliz-
ing the salivary-derived stem cells/gland progenitor and three-dimensional
(3D) ­biomimetic scaffolds encompassing decellularization methods, various
matrices, and polymers are summarized for 3D culture technique, which
underpins ­ current knowledge on bioengineering of the salivary glands
(Chap. 8, Martinez et al.).
3D printing technology creates life-size body parts and tissues using living
cells as the ink. This technology has revolutionized the field of regenerative
and reconstructive medicine, enabling customized and personalized thera-
peutic approaches. In Chap. 9, Dr. Choi et al. describe basic principles and
different types of 3D technologies, patient-specific modeling, bioprinting,
and salivary gland regeneration (Chap. 9, Dr. Choi et al.).
A novel bioengineering method involves epithelial and mesenchymal stem
cell manipulation to generate a bioengineered organ germ. In Chap. 10,
Dr. Ogawa explains that the bioengineered glandular germs demonstrated
reciprocal interactions between epithelial and mesenchymal cells in one day
and invagination of epithelial tissue in three days in vitro. Once the germ was
engrafted into the parotid gland duct of salivary gland-defective mice, the
connection between the germ and the duct was established in a month, and
the mice exhibited restored salivary secretion after transplantation. This inno-
vative approach emphasizes that current advancement in the field promises a
therapeutic intervention for patients suffering from xerostomia (Chap. 10,
Drs. Ogawa and Tsuji).
Currently, functional restoration of the salivary glands is still challenging
to accomplish even with successful reconstruction of salivary cellular compo-
nents. Therefore, understanding the mechanisms of saliva secretion becomes
critical for positive clinical outcomes that we desire. Chapter 11 covers con-
siderations for establishing functional secretion by providing information on
stimuli for secretion, neural connection along with neurotransmitters and
receptors, protein secretion, and studies of neural agonists and antagonists.
The chapter also clarifies myths surrounding this topic with recent research
data (Chap. 11, Drs. Carpenter and Carvalho).
Thought-provoking renderings of the past, current, and future of gene
therapy in salivary gland diseases are provided by Dr. Passineau in Chap. 12.
In this chapter, current challenges in the field of salivary gland gene therapy,
along with the author’s proposals to circumvent or overcome the hurdles, are
forthrightly discussed (Chap. 12, Dr. Passineau).
Last, but not least, the chapter on surgical management of salivary gland
disease reveals the critical considerations for glandular regeneration from the
perspectives of otolaryngologists and surgeons (Chap. 13, Drs. Varadarajan
and Dziegielewski). The extensive description in this chapter includes, but is
viii Preface

not limited to, glandular anatomy, pathology, surgical advances for neoplastic
and nonneoplastic diseases of salivary glands, and recent discoveries in the
field such as salivary gland transfer and salivary duct repositioning. The
importance of understanding the expected sequelae in human patients follow-
ing radiation or surgery cannot be overemphasized as none of the existing
laboratory approaches would come to fruition for patients without such
knowledge.
Based on the cutting-edge information offered in this book, it is undoubt-
able that many more innovative strategies for salivary gland regeneration will
emerge in upcoming years. Research that unlocks the complex processes of
organ development would be fundamental to develop such approaches. With
the current enthusiasm and growing interest in the field, it will just be a matter
of time before we build another Rome.

Gainesville Seunghee Cha, DDS, PhD

FL, USA
Contents

Part I Updates on Salivary Gland Development

1 Implications of Salivary Gland Developmental Mechanisms

for the Regeneration of Adult Damaged Tissues. . . . . . . . . . . . . . . 3
Isabelle M.A. Lombaert
2 Systems Biology: Salivary Gland Development, Disease,
and Regenerative Medicine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
Melinda Larsen, Petko Bogdanov, Ravi Sood,
Hae Ryong Kwon, Deirdre A. Nelson, Connor Duffy,
Sarah B. Peters, and Sridar V. Chittur
3 Mucins in Salivary Gland Development,
Regeneration, and Disease. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Isabel Castro, María-José Barrera, Sergio González,
Sergio Aguilera, Ulises Urzúa, Juan Cortés
and María-Julieta González

Part II Glandular Damage and Cell Replacement Therapy

4 Histologic Changes in the Salivary Glands

Following Radiation Therapy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
Robert S. Redman
5 Adult Stem Cell Therapy for Salivary Glands,
with a Special Emphasis on Mesenchymal Stem Cells . . . . . . . . . 93
Simon D Tran, Yoshinori Sumita, Dongdong Fang,
and Shen Hu
6 Directed Cell Differentiation by Inductive Signals
in Salivary Gland Regeneration: Lessons Learned
from Pancreas and Liver Regeneration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
Yun-Jong Park and Seunghee Cha

Part III Bioengineering of Salivary Glands

7 Current Cell Models for Bioengineering Salivary Glands . . . . . 133

Olga J. Baker

ix
x Contents

8 Matrix Biology of the Salivary Gland:

A Guide for Tissue Engineering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
Mariane Martinez, Danielle Wu, Mary C. Farach-­Carson,
and Daniel A. Harrington
9 3D Printing Technology in Craniofacial
Surgery and Salivary Gland Regeneration. . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
Jong Woo Choi, Namkug Kim, and Chang Mo Hwang
10 Functional Salivary Gland Regeneration
by Organ Replacement Therapy. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193
Miho Ogawa and Takashi Tsuji

Part IV Therapeutic Considerations for Restoration of

Salivary Function

11 Regulation of Salivary Secretion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207

Guy Carpenter and Polliane Carvalho
12 Salivary Gland Gene Therapy in Experimental
and Clinical Trials. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217
Michael Passineau
13 Surgical Management of Salivary Gland Disease . . . . . . . . . . . . 229
Varun V. Varadarajan and Peter T. Dziegielewski
Visit https://textbookfull.com
now to explore a rich
collection of eBooks, textbook
and enjoy exciting offers!
Contributors

Sergio Aguilera, MD INDISA Clinic, Santiago, Chile

Olga J. Baker, DDS, PhD School of Dentistry, University of Utah, Salt
Lake City, UT, USA
María-­José Barrera, PhD Institute of Biomedical Sciences, Faculty of
Medicine, University of Chile, Santiago, Chile
Petko Bogdanov, PhD Department of Computer Science, University at
Albany, SUNY, Albany, NY, USA
Guy Carpenter, PhD Mucosal and Salivary Biology Division, King’s
College London Dental Institute, London, UK
Polliane Carvalho, MSc, PhD Mucosal and Salivary Biology Division,
King’s College London Dental Institute, London, UK
Isabel Castro, MSc, PhD Institute of Biomedical Sciences, Faculty of
Medicine, University of Chile, Santiago, Chile
Seunghee Cha, DDS, PhD Department of Oral and Maxillofacial
Diagnostic Sciences, University of Florida College of Dentistry, Gainesville,
USA
Sridar V. Chittur, PhD Center for Functional Genomics, University at
Albany, SUNY, Albany, NY, USA
Jong-Woo Choi, MD, PhD, MMM Department of Plastic and
Reconstructive Surgery, Ulsan University College of Medicine, Asan
Medical Center, Seoul, South Korea
Juan Cortés, PhD Institute of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine,
University of Chile, Santiago, Chile
Connor Duffy Biological Sciences, University at Albany, SUNY, Albany,
NY, USA
Peter T. Dziegielewski, MD, FRCS(C) University of Florida Department
of Otolaryngology, Gainesville, FL, USA
Dongdong Fang, BDS, MSc McGill Craniofacial Tissue Engineering and
Stem Cells Laboratory, Department of Biomedical Sciences, Faculty of
Dentistry, McGill University, Montreal, Quebec, Canada

xi
xii Contributors

Mary C. Farach-Carson, PhD BioScience Research Collaborative,

Department of Biochemistry and Cell Biology, Houston, TX, USA
Departments of BioSciences and Bioengineering, Rice University, Houston,
TX, USA
María-­Julieta González, MSc Institute of Biomedical Sciences, Faculty of
Medicine, University of Chile, Santiago, Chile
Sergio González, MSc Mayor University, Santiago, Chile
Daniel A. Harrington, PhD Departments of BioSciences and
Bioengineering, Rice University, Houston, TX, USA
Shen Hu, PhD, MBA Division of Oral Biology and Medicine, School of
Dentistry, University of California, Los Angeles, CA, USA
Chang Mo Hwang, PhD Biomedical Engineering Research Center,
University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center, Seoul,
South Korea
Namkug Kim, PhD Department of Convergence Medicine, Biomedical
Engineering Research Center, University of Ulsan College of Medicine,
Asan Medical Center, Seoul, South Korea
Hae Ryong Kwon, PhD Biological Sciences, University at Albany, SUNY,
Albany, NY, USA
Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, OK, USA
Melinda Larsen, PhD Biological Sciences, University at Albany, SUNY,
Albany, NY, USA
Isabelle M.A. Lombaert, PhD University of Michigan, School of
Dentistry, Ann Arbor, MI, USA
Biointerfaces Institute, Ann Arbor, MI, USA
Mariane Martinez Department of BioSciences, Rice University, Houston,
TX, USA
Deirdre A. Nelson, PhD Biological Sciences, University at Albany, SUNY,
Albany, NY, USA
Miho Ogawa, PhD Organ Technologies Inc., Tokyo, Japan
Laboratory for Organ Regeneration, RIKEN Center for Developmental
Biology, Kobe, Hyogo, Japan
Yun-Jong Park Department of Pharmacology, The University of North
Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA
Michael Passineau, PhD Gene Therapy Program, Allegheny Health
Network, Pittsburgh, PA, USA
Sarah B. Peters, PhD Biological Sciences, University at Albany, SUNY,
Albany, NY, USA
Department of Cell, Developmental, and Integrative Biology, University of
Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, USA
Contributors xiii

Robert S. Redman, DDS Oral and Maxillofacial Diagnostic Science,

University of Florida, Gainesville, FL, USA
Washington DC VA Medical Center, Washington, DC, USA
Ravi Sood Department of Computer Science, University at Albany, SUNY,
Albany, NY, USA
Yoshinori Sumita, DDS, PhD Department of Regenerative Oral Surgery,
Nagasaki University, Nagasaki, Japan
Simon D. Tran, DMD, PhD McGill Craniofacial Tissue Engineering and
Stem Cells Laboratory, Department of Biomedical Sciences, Faculty of
Dentistry, McGill University, Montreal, Quebec, Canada
Takashi Tsuji, PhD Organ Technologies Inc., Tokyo, Japan
Laboratory for Organ Regeneration, RIKEN Center for Developmental
Biology, Kobe, Hyogo, Japan
Ulises Urzúa, PhD Institute of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine,
University of Chile, Santiago, Chile
Varun V. Varadarajan, MD University of Florida Department of
Otolaryngology, Gainesville, FL, USA
Danielle Wu, PhD Department of BioSciences, Rice University, Houston,
TX, USA
 Part I
Updates on Salivary Gland Development
 Implications of Salivary Gland
Developmental Mechanisms 1
for the Regeneration of Adult
Damaged Tissues

Isabelle M.A. Lombaert

Abstract
The convergence of the fields of tissue engineering and regenerative
medicine provides a potential blueprint to repair damaged tissues.
Accordingly, a range of therapeutic applications have emerged that hold
great potential to regenerate branching organs, such as salivary glands.
This unique saliva-secreting organ is required for proper oral health,
lubrication, immunity, and food digestion but is susceptible to damage
either by co-­irradiation as a side effect of radiotherapy cancer treatment,
autoimmune-­related Sjögren syndrome, disease-related medications, or
surgical resection. This chapter focuses on fundamental cellular and
molecular processes occurring during organ ontogenesis and in develop-
ing branching glands. We cover the growth of the epithelial compart-
ment, which is the major functional component of the gland, but also
how surrounding niches such as mesenchymal, endothelial, and neuronal
cells communicate, intertwine, and influence the formation of glands
and other branching organs. Finally, we highlight how this key informa-
tion has created new regenerative-related approaches and how these
impact future clinical translation.

1.1 Introduction

Increasing our knowledge of how organs develop

has profound implications for the design of thera-
pies to regrow and/or repair injured tissues.
I.M.A. Lombaert, PhD
University of Michigan, School of Dentistry,
Understanding the mechanisms regulating cell
2800 Plymouth Road, Ann Arbor, MI 48109, USA survival, expansion, specification, movement,
Biointerfaces Institute, 2800 Plymouth Road,
communication with neighboring cells, as well as
Ann Arbor, MI 48109, USA how they respond to damage is critical to navigat-
e-mail: [email protected] ing the landscape of future therapy designs.

© Springer International Publishing Switzerland 2017 3

S. Cha (ed.), Salivary Gland Development and Regeneration, DOI 10.1007/978-3-319-43513-8_1
4 I.M.A. Lombaert

In order to appropriately translate informa- o­ utlined in depth in the following chapters. In

tion gathered from studies on organ develop- this review, we focus on different salivary gland
ment, we need to compare molecular and cellular cell types and their supportive environment that
processes during embryonic development with is needed to form the fully functional secretory
adult homeostasis and when repair initiates and/ branching organ. Subsequently, we outline how
or fails after each damaging event. Each of these this knowledge can render future therapeutic
stages correlates with specific cellular responses, implications and/or what potential complications
activation of specific signaling pathways, and might arise.
accumulation of environmental cues. Thus,
developmental-related information is instrumen-
tal to stimulate regrowth within an existing dam- 1.2  pithelial Growth Driven
E
aged in vivo organ or to initiate de novo growth. by Stem Cells
The majority of our current knowledge on
salivary gland organogenesis derives from exper- Branching organs such as salivary, lacrimal, and
imental animal models, primarily mice and rats. mammary glands are comprised of different cell
While rodent biology is not identical to that of types, including epithelial and the surrounding
humans, many processes and pathways are very mesenchymal, endothelial, and neuronal cells
similar. As such, developmental biologists have (Fig. 1.1). Intertwined within these tissues are
been and continue to be a valuable resource to circulating hematopoietic-related blood and
other disciplines such as engineering, oral sur- immune cells. The major component of develop-
gery, and oncology to translate conceptual ideas ing and adult salivary glands (SGs) is the epithe-
into therapeutic designs. lia, which is responsible for saliva secretion and
The advantages of specific biomaterials, gene transportation to the oral cavity. Here, we
therapy, and surgical in vivo approaches are describe how the epithelial compartment of three

a c

Fig. 1.1 Developing salivary glands in mice. (a) Bright (arrow). Confocal image of E-cadherin stained epithelia
field picture represents E13 submandibular (SMG) and and Tubbulin-3 stained PSG. (c) Different niches sur-
sublingual gland (SLG). The epithelial compartment is rounding the epithelium in adult mouse submandibular
comprised of a distal endbud and proximal duct area. (b) gland. Confocal 30 μm projected image of stained SMG
Epithelia (blue) innervated by the parasympathetic with epithelial marker E-cadherin (blue), neuronal
nerves (PSG, red) during embryonic SMG development. marker Tubbulin-3 (red), and endothelial protein CD31
The PSG releases neurotransmitters via varicosities (green)
1 Implications of Salivary Gland Developmental Mechanisms for the Regeneration of Adult Damaged Tissues 5

major glands, which provide 90 % of total saliva, they are not yet fully functional and must still
becomes established by tightly controlled mecha- undergo specific acinar-lineage maturation so that
nisms of cellular interactions. by birth, in both humans and mice, the organ is
comprised of functional secretory compartments.

1.2.1 Morphological Development

of Salivary Glands 1.2.2  ontribution of Stem Cells
C
and Their Differentiating
Salivary glands originate as an invagination of the Progeny
oral epithelium from a placode at embryonic day
(E) 11.5 in mice or Carnegie stage 18 (~44 days, The stem/progenitor cell theory asserts that all
weeks 6–7) in humans. This thickening epithe- salivary gland cells are initiated from and main-
lium arises on the side of the tongue outside of the tained by stem and progenitor cells. By defini-
lamina dentalis at the anlage of the dental arch. tion, these cells are characterized by their ability
Each major gland initiates at slightly different to expand themselves, i.e., self-renew, as well as
locations: the serous parotid gland (PAR) in the to propagate multiple more defined cell types,
labiogingival sulcus, the mucous sublingual such as acinar cells. Stem cells are further clas-
(SLG) in the paralingual sulcus, and seromucous sified as being more potent than progenitor cells
submandibular gland (SMG) in the linguogingival in their self-renewal and differentiation potential.
sulcus. Even though glands arise in the tongue When both these cellular processes are tightly
area, they grow out during development toward controlled, stem/progenitor cells not only give
the back of the mouth below the ears, floor of the rise to tissues but also maintain and repair organ
mouth near the mandibular bone, and the anterior structures during adulthood. Any deregulation in
floor of the mouth. While in mice, SMG, SLG, this regulatory network during development can
and PAR initiate around E11.5, E12, and E13, lead to malformation/absence of the organ and in
respectively, human SLGs initiate later than SMG the adult may cause cancer formation. Over the
and PAR at the ninth embryonic month. More past years, remarkable progress has been made
detailed descriptions on anatomic locations of wherein multiple stem/progenitors have been
human glands have been recently reviewed [41]. classified based on their ability to (1) form mul-
The developmental origin of each gland has not tiple cell types (mouse genetic lineage tracing,
been clear, with some classifying the PAR as ecto- ex vivo culturing), (2) alternate quiescence with
dermal derived and SMG and SLG as endoder- proliferation (BrdU incorporation or genetically
mal, while genetic experiments in mice suggest labeled DNA tracing), and (3) restore radiation-­
they are all ectodermal [87]. induced damaged SGs (in vivo transplantation
Once the epithelial thickening arises, a cell assay). One new consensus gathered from this
population, termed endbud or tip, forms dis- data is that different stem/progenitor cells con-
tally from an elongating stalk (Fig. 1.1a), which tribute to the growing SG and that these cells
developmentally progresses to form major ducts may originate at different time points during
termed Wharton’s (SMG), Bharton’s (SLG), and development. Importantly, this permits the organ
Stensen’s (PAR) ducts. The unique SG branch- to compensate for any losses in specific stem/pro-
ing pattern is created by repetitive clefting of the genitor cells and still allows proper development
initial and subsequently formed endbuds. Ductal [88]. Known stem/progenitors contributing to
structures gradually mature by elongation, lumen SG organogenesis include cells marked by their
formation, and expansion. The clefting endbuds expression of intracellular cytokeratin 5 (CK5,
mature by E16 in mice and 19–24 weeks (7th K5) and CK14 [50, 57], receptors KIT (c-Kit,
month) in humans to form polarized pro-acinar CD117) and FGFR2b [57], and transcription fac-
and pro-myoepithelial cells. While pro-acinar tors SOX2 [3] and ASCL3 [10]. Remarkably,
cells do express some secretory-related proteins, stem/progenitors contributing to development
6 I.M.A. Lombaert

Fig. 1.2 Signaling

pathways influencing
epithelial growth. Cartoon
represents known signaling
pathways that influence SG
epithelial cell survival,
proliferation, expansion,
and differentiation. Green:
expressed by epithelial
cells; orange: expressed by
mesenchyme; red:
expressed by neuronal
cells; black: expression by
multiple compartments

might not serve a similar role during adult to ­significantly increased saliva levels [58, 62, 72,
homeostasis. Recent studies observed active pro- 103]. This does not, however, exclude the poten-
liferation of cells within specific compartments, tial of other SG-specific epithelial cells, non-SG
such as acini and intercalated, striated, and excre- specific cells, and/or their bioactive cell lysate to
tory ducts, wherein these cells self-duplicate to contribute to the repair of damaged SGs. These
replenish their own entity, as reviewed in [4]. To options will be surveyed in following chapters,
what extent these adult compartmental “reser- and their impact on when to use them in different
voir” cells contribute to recovery after injury is damaging situations has been recently reviewed
a focus of ongoing research. At least after severe [61]. In this chapter, we will further outline our
radiation-induced damage, which leads to irre- current understanding of how SGs are structur-
versible hyposalivation, there is no active repair ally built by various cell types (Fig. 1.1b, c) and
initiated by remaining SG cells. This is often a how their continuous interactions are informing
combinatorial result of (a) drastic loss of acinar the design of current and future therapies.
and duct “reservoir” cells or stem/progenitor
cells, (b) decrease in signaling pathways required
to activate surviving “reservoir” or stem/pro- 1.2.3  essons from Developmental
L
genitor cells, and/or (c) severely damaged cells Regulatory Mechanisms
that can no longer contribute to self-duplication Guiding the Epithelium
or differentiation. In such cases, multiple strat-
egies ranging from constructing a new gland to Often disorders in humans and genetic rodent
gene therapy and stem/progenitor cell transplan- model systems can provide critical information
tations may aid in restoring the functional and on what signaling pathways are essential for epi-
morphological components of the gland. Thus thelial cell survival, proliferation, differentiation,
far, transplantations of cells selected for their and movement (Fig. 1.2). Major examples are
expression of receptor KIT, EPCAM, CD24, and/ Fgf10−/− and Fgfr2b−/− mice, which are related to
or CD29 (Integrin β1, ITGβ1) were shown to human loss-of-function mutations in FGF10 and
restore acinar and ductal compartments, leading FGFR2 that result in hereditary diseases ­including
1 Implications of Salivary Gland Developmental Mechanisms for the Regeneration of Adult Damaged Tissues 7

lacrimal and SG-related aplasia of lacrimal and branching via epithelial ITGβ1 [84]. MMPs also
salivary glands (ALSG), lacrimo-auriculo-­dento- cleave pro-HB-EGF into an N-terminal and
digital (LADD) syndrome, and lung-­ related C-terminal fragment at the membrane so that the
chronic obstructive pulmonary disease (COPD). latter fragment can move to the nucleus to acti-
In these conditions, SG development is stalled, as vate cell proliferation via cyclin A [95].
FGFR2b+ epithelium no longer receives survival Conversely, another member of the EGF family,
and proliferative cues from the surrounding neuregulin (NRG), binds ERBB3 on endbuds to
FGF10-producing mesenchyme [80]. Thus, when aid in their local expansion [70]. NRG1 is further
invading oral epithelial cells at gland ontogenesis essential for innervation as Nrg1−/− mice are
receive FGF10, they initiate an endbud and duct devoid of nerves and show aberrant duct forma-
formation. From then on, FGFR2b signaling tion and lumenization [73].
expands KIT+ progenitors in the continuously Similar to FGF10, Fgf8 hypomorphic and
clefting endbuds in combination with stem cell Fgfr2c heterozygous mice exhibit hypoplastic
factor (SCF)/KIT signaling [57]. As FGF10 has a glands due to reduced communication between
heparan-binding (HB) core, it evokes and expands FGF8-producing epithelia and FGFR2c-receiving
more rapid responses once it is bound to specific mesenchyme. In both FGF-deficient mice, initial
3-O-sulfated heparin sulfate (3-O-HS). This HS epithelial invagination occurs, but subsequent SG
belongs to a group of heparan sulfate proteogly- growth does not occur. To date, FGF8 has been
cans (HSPGs) located in the basement membrane described as a potential target of the EDA path-
or at cell surfaces. Interestingly, KIT+ endbud way. Human mutations in ectodysplasin-A
progenitors highly express HS3ST3, the 3-O-HS- (EDA) or its receptor EDAR result in hypohi-
specific modifying enzyme 3-O-sulfotransferase, drotic ectodermal dysplasia (HED). Defects in
to rapidly increase their expansion during devel- teeth, hair, sweat, and salivary glands are notice-
opment [80]. A similar function remains during able due to reduced cell proliferation and differ-
adult homeostasis. Regulating this FGFR2b sig- entiation [45, 74]. In SGs, EDA and downstream
naling pathway is of crucial importance so that target NF-kB aid in ductal lumenization and end-
every epithelial cell does not undergo extensive bud branching, presumably by inducing ductal
proliferation. Ductal cells therefore express FGF maturation within the center of endbuds. Early
antagonists, Sprouty 1 and 2, to lower FGFR2b on, mesenchyme-produced EDA is downstream
signaling and upregulate WNT [48]. Both canon- of mesenchymal WNT and upstream of epithelial
ical WNT/β-catenin and noncanonical WNT5b SHH (sonic hedgehog) signaling. As such, SHH
pathways drive ductal formation via upregulation treatment can rescue SGs deprived of EDA [100].
of Tfcp2l1 while inhibiting endbud development. After E13, EDA does not seem to correlate with
In turn, endbuds repress duct development by WNT anymore, based on their different expres-
FGF-mediated Wnt5b repression and secretion of sion pattern located in the epithelial or mesen-
WNT ­ligand-­sequestering protein SFRP1 [78]. chymal compartment [31, 78]. SHH’s important
Evidently, a tight FGF-WNT gradient allows for role in SG development has been confirmed, as
KIT+ progenitor expansion in endbuds, while SHH-deficient SGs are hypoplastic with unpolar-
ductal cells prepare for upcoming lumenization ized epithelial cells and underdeveloped lumen
and maturation. In this process, ERBB1 (EGFR)+ formation [36, 43]. SHH is also linked to FGF8
ductal K5+ progenitors proliferate in response to as both can upregulate each other [43]. Therefore,
HB-EGF to give rise to maturing K19+ cells [50]. FGF8 is able to rescue Hedgehog inhibition but
One mechanism of action is via induction of surprisingly not EDA deficiency [43]. As such,
membrane-type-2 matrix metalloproteinase EDA-FGF8’s precise signaling interaction still
(MT2-MMP) and FGFR expression in epithelial needs to be determined.
cells. MT2-MMP is crucial to release bioactive FGF signaling, in particular via FGFR1 (vari-
NC1 domains from extracellular matrix (ECM) ant b in the epithelium and c in the mesenchyme),
protein collagen IV, which in turn promotes can also upregulate bone morphogenetic protein
8 I.M.A. Lombaert

(BMP) ligands. BMPs are part of the TGFβ sig- spatial proliferation, differentiation, and clefting.
naling family and signal via BMP receptors. Initiation of some of those embryonic signaling
FGFR1 signaling regulates BMP7 directly and pathways has been observed in active repair situ-
BMP4 indirectly to regulate epithelial growth. ations, such as ductal ligation settings where aci-
BMP4, which is mesenchyme specific, inhibits nar atrophy and hyposalivation is temporarily
epithelial branching, while BMP7, released by induced by restricting salivary flow from the
both epithelium and mesenchyme, increases it major duct [17]. We can thereby try to manipu-
[90]. The role of another member of the TGF late the activation and/or repression of specific
family, TGFβ1, is still inconclusive. While developmental pathways to stimulate in vivo
TGFβ1-deficient mice have normal SGs, over- repair of damaged SGs, as is outlined further in
stimulation of TGFβ1 results in acinar loss, elon- this chapter.
gated ducts, and/or fibrosis [35, 42].
Additionally, ECM and epithelial integrin cell
interactions are just as essential for branching 1.3 Environmental Cues
morphogenesis. These ECM molecules line up Patterning Epithelial
the basement membrane (BM) separating the epi- Branching and Maturation
thelium from mesenchyme. Interestingly, iso-
lated epithelial cells can easily grow without the SGs are highly vascularized and innervated, all of
physical presence of mesenchymal cells but not which integrate within a condensed mesenchyme.
without ECM component(s), such as laminin, Developmentally, SG epithelia invade a con-
fibronectin, perlecan, collagen, or mouse densed mesenchymal placode already containing
sarcoma-­ derived reconstituted BM “Matrigel.” a complex endothelial network and parasympa-
Deposition of unique ECM components along thetic neuronal bodies awaiting cues for innerva-
the clefting endbuds and elongating ducts plays a tion [48]. Both signals for epithelial invasion into
role in correct branching. Impairing these con- the mesenchyme and subsequent branching are
nections will lead to reduced clefting, endbud transmitted via direct cell-cell contact and/or
number, cell movement, and/or growth. Detailed indirect paracrine signaling pathways, which are
descriptions of disruptive ECM cell outcomes discussed below.
were recently reviewed in [79].
Finally, an underexplored area contributing to
SG formation are microRNAs (miRNAs), which 1.3.1 Guiding Neurons
are small, noncoding RNAs that specifically tar-
get mRNAs to globally regulate gene expression. Different cranial nerves innervate the pre- and
Epithelial endbud progenitors highly express postnatal SG where they exert different func-
miR200c to reduce FGFR-dependent prolifera- tions. While the autonomic nervous system regu-
tion. miR200c downregulates the autocrine ree- lates the SG at an unconscious level and in stress
lin/very low-density lipoprotein receptor conditions, sensory neurons respond to mechani-
(VLDLR) pathway, which positively regulates cal, thermic, and light signals.
FGFR signaling [83]. Additionally, it was found For decades, both the parasympathetic and
that EGF can specifically induce mesenchymal sympathetic nervous system have been acknowl-
production of miR-21, which decreases multiple edged as the driving stimulant to release saliva
target mRNA candidates. One of these, RECK, from acinar cells into ducts. While parasympa-
inhibits MMPs, which subsequently influences thetic stimulation results in serous secretion and
ECM degradation to enhance SG branching [37]. ion release, sympathetic activation stimulates
In conclusion, various signaling pathways mucous or protein-containing saliva and can also
instruct different cell types within the epithelial play role in local inflammation and blood flow
compartment and not surprisingly interact with [23, 67]. Both parasympathetic and sympathetic
and regulate each other to safeguard temporal-­ nerves are part of the autonomic nervous system,
Visit https://textbookfull.com
now to explore a rich
collection of eBooks, textbook
and enjoy exciting offers!
1 Implications of Salivary Gland Developmental Mechanisms for the Regeneration of Adult Damaged Tissues 9

Fig. 1.3 Signaling

pathways driving neuronal
survival and innervations.
Illustrated signaling
pathways for
parasympathetic nervous
system were demonstrated
in prenatal glands,
sympathetic nervous system
in postnatal SGs. Green:
expressed by epithelial
cells; red: expressed by
neuronal cells; blue:
expressed by endothelial
cells; black: undefined
which compartment takes
part in it

and their neuronal guidance is ensured by axons initiating SG epithelia to localize into ganglia
that sprout along unique paths within the tissue. around the primary duct and send out axons
While the former innervates along the epithelia, toward the endbuds [48]. Sympathetic nerves
the latter follows the vasculature. This directional innervate SGs along the blood vessels during
guidance is driven by neurotrophic factors, later stages of development when final epithelial
secreted by cells in the periphery, as well as the maturation is needed. As such, developmental
presence of specific receptors on the axons that experiments can clearly dissect the role of neu-
allow or block their adhesion to the adjacent rotransmitters and neurotrophic factors affecting
ECM. The most notable trophic molecules include the PSG. It is now well appreciated that the PSG
neurotrophins (e.g., NGF, BDNF, NT-3), netrins, establishes a communication loop with specific
semaphorins, ephrins, and myelin inhibitors. epithelial cells to allow outgrowth of both com-
Similarly, axons secrete neurotransmitters in their partments. When the PSG is absent, the pool of
proximity, exerting a variety of effects through K5-expressing epithelial progenitors is signifi-
specific receptors on their target cells (Fig. 1.3). cantly reduced [50], which influences down-
Parasympathetic nerves signal via the cholinergic stream K19+ ductal luminal differentiation and
acetylcholine (ACh) pathway, targeting musca- subsequent epithelial outgrowth. This is medi-
rinic receptors on neighboring cells, as well as ated via a loss in ACh-CHRM1 (muscarinic
water channels such as aquaporin 5 (AQP5). In receptor 1) signaling from the PSG to K5+ cells
contrast, sympathetic nerves release epinephrine and resulting in a subsequent reduction of
and norepinephrine (i.e., noradrenaline, NA) that HB-EGF/EGFR pathway signaling that initiates
bind to β-adrenergic receptors (adrenoceptors) on maintenance and differentiation of K5+ progeni-
acini. Other non-ACh, non-­NA neurotransmitters tors. Lumenization, which marks further ductal
can be produced by both parasympathetic and maturation, is also coordinated by the PSG but
sympathetic nerves and may include vasoactive not via the ACh pathway. The neurotransmitter
intestinal peptide (VIP), substance P (SP), neuro- VIP activates a cAMP/protein kinase A (PKA)
peptide Y (NPY), neurokinin A, pituitary adenyl- pathway to induce epithelial duct cell prolifera-
ate cyclase-activating peptide (PACAP), and tion and formation of a single lumen by the fusion
calcitonin gene-related peptide (CGRP). of multiple microlumens. After initial lumen for-
Developmentally, parasympathetic ganglia mation, VIP remains essential to expand the
(PSG) neuron cell bodies migrate along the lumen size via the cystic fibrosis transmembrane
branches of mandibular arteries [91] to cues from (CFTR) pathway [73].
10 I.M.A. Lombaert

Organ development also requires proper bidi- does lead to ­hypoplasia of the gland [82] and
rectional communication. Feedback signaling thus must involve a direct or indirect role for
from epithelial cells toward the PSG stimulates sympathetic nerves in either epithelial cell main-
cell survival, migration, and innervation. At SG tenance or maturation. In the adult gland, RET
ontogenesis, WNT-producing epithelia, particu- signaling is also known to be essential for sym-
larly K5+ progenitors, maintain PSG neuron sur- pathetic neuron survival, but likely via the ligand
vival and proliferation [48]. At later stages of artemin instead of NRTN. SGs also produce high
branching morphogenesis, the neurotrophic fac- amounts of NGF and genetic ablation of NGF or
tor neurturin (NRTN), which is mainly secreted its TrkA receptor leads to defective sympathetic
by endbud progenitors, not only promotes neuro- innervation, indicating its crucial role in sympa-
nal survival via GFRα2/RET but also maintains thetic neuron survival [22, 27]. Depletion of non-
axon outgrowth along ducts toward the endbuds canonical WNT5a in WNT1-derived neural crest
[49]. In the developing lung, there also appears to cells further leads to incomplete sympathetic
be a link between nerves and blood vessels. innervation and branching in prenatal SGs. While
Denervation, in this case via physical cell abla- the authors suggest this is due to an autocrine
tion, resulted in reduced endothelial prolifera- WNT5a/retinoid-related orphan receptor (ROR)
tion, leading to hypo-vascularized lungs [9]. It is pathway in sympathetic neurons, it doesn’t rule
unclear whether this is a direct or indirect out that epithelial WNT5a-producing cells might
neuronal-­endothelial effect and whether similari- be stimulating sympathetic neurons as well [89].
ties exist within the developing SG. Similarly, endothelial-released endothelin 3
Detailed anatomical descriptions of nerves in (EDN3) is also suggested to be a cue for a sub-
adult SGs are outlined in a recent review [40]. It set of EDN receptor A+ sympathetic neurons to
is assumed that similar communication between innervate the prenatal SG along the nascent exter-
nerves and epithelium persists into adulthood as nal carotid arteries [63]. The specific role of other
denervation of SGs, via ductal ligation or neurec- neurotransmitters from the GDNF and NPY fam-
tomy, reduces epithelial content that regenerates ily as well as other neurotrophic factors are still
after ligation removal if the nerve is intact or being explored. While semaphorins are involved
reconnected [46, 55, 65]. A morphological differ- in axon pruning and neuronal migration in the
ence of early development with later stages and central nervous system, they also appear to have a
adulthood is that smaller ganglia are found dis- role in developing SGs. Semaphorin (SEMA) 3A
persed within adult tissue [40], presumably to and 3C bind co-receptors neuropilin and plexin.
reach their target cells more easily as distances Neuropilin is expressed by epithelial endbuds
are much larger compared to embryonic and by activation with SEMA3A and 3C cleft
development. formation is induced without changing prolifera-
Even though tyrosine hydroxylase (TH)- tion and, most likely, by affecting cell movement
expressing sympathetic ganglia are presumed [15]. However, additional FGF7/10 growth-pro-
not to be present at SG ontogenesis, some moting signals from surrounding mesenchyme
mRNA expression levels of its unique recep- were required to mediate this cleft formation.
tor neuropeptide Y receptor 2 (NPY2R) were Whether additional participation of SEMAs on
detected early during development at low levels receptive nerves is required for cleft formation or
that increase before birth [23]. Since NPY2R is SG development still remains unclear.
also present on endothelial cells, some, if not At adulthood, it remains to be determined how
all, of the mRNA expression could be related to sensitive sympathetic nerves are to injuries such
blood vessel formation within the SG. However, as radiation. In rodents, sympathetic nerve func-
TH-expressing neuronal cells were detectable tion was retained after radiation [52], and
by E16.5, which might indicate there is a pre- increased levels of TH as well as NGF/NGFR and
natal presence of sympathetic ganglia [89]. adrenergic receptor 2 (ADRA2B) were detected
Nevertheless, postnatal sympathetic denervation in radiated human SMGs [49]. Whether a
1 Implications of Salivary Gland Developmental Mechanisms for the Regeneration of Adult Damaged Tissues 11

r­ eestablishment of the balance between parasym-

pathetic and sympathetic nervous system is nec-
essary for regeneration is not known.
Furthermore, it is assumed that sensory neuro-
nal cells are present along the sympathetic and
parasympathetic nerve tracks in adult SGs [51],
although they have not yet been studied in detail.
While sensory neurons can be defined into mul-
tiple subtypes based on different criteria such as
their origin and molecular expression patterns,
they often are loosely classified as unmyelinated
capsaicin-sensitive TRPV1+ receptor expressing
neurons or myelinated glutamate receptor-­
expressing neurons. Upon activation, sensory
nerves can secrete various neuropeptides, such as
Substance P and CGRP. At least in the lung and
pancreas, literature indicates that sensory neu-
rons release neurotransmitters in the periphery to
Fig. 1.4 Potential communications initiated by and to
serve as direct mediators for recruiting and acti- endothelial cells. Described pathways were majorly found
vating inflammatory cells [68, 86]. Whether a in other branching organs. Whether they exist in SGs
similar mechanism occurs in salivary glands is needs to be determined. Green: expressed by epithelial
not known. cells; orange: expressed by mesenchyme; blue: expressed
by endothelial cells
In conclusion, innervation plays an essential
role for organ development, homeostasis, and
repair after injury. Studies on SG biogenesis have lial secretory factors, termed angiocrines, which
been highly informative for defining the involve- impact organ development (Fig. 1.4). While
ment of the PSG in branching morphogenesis, research on blood vessels in SGs remains limited,
not only of SGs but also other organs such as much can be learned from other branching organs.
prostate and lungs. The existence and/or loss of Overall, complex cross-communication between
bidirectional communication with epithelial epithelial and endothelial cells appears to regu-
stem/progenitor cells have been reported to occur late both epithelial differentiation and angiogen-
in rodent and human SG homeostasis and postra- esis. The initial cues to form an endothelial cell
diation. The inhibition of parasympathetic neuro- plexus around a condensed mesenchyme do not
nal function influences adult epithelial K5+ require epithelia. This is observed in Fgf10−/−
progenitors [49] but it is not known yet whether mice that don’t form initial SMG epithelia but
postradiation regeneration due to epithelial stem/ where the placode of mesenchyme, blood ves-
progenitor transplantation repairs neuronal func- sels, and neuronal bodies are present [48]. After
tion, even though morphological repair has been SG ontogenesis, however, epithelial-­ derived
suggested [71]. angiogenic factors, such as VEGF-A, do play a
role as null mutations in Vegf-A or its endothelial-­
expressed receptor (Vegfr) show v­ ascular defects
1.3.2 The Role of Blood Vessels in tissues, reduced epithelial budding, and ulti-
mately embryonic lethality [13, 107]. Another
The vasculature in branching organs develops in epithelial-induced angiogenic mechanism may
close proximity to the epithelia, although its spa- include the vitamin D pathway. The enzymes
tial pattern differs from parasympathetic nerves. CYP27B1/24A1 that activate and catabolize
Not only are endothelia important for mediating vitamin D are highly upregulated just before
gas exchange but also as a source of endothe- birth and in postnatal lung. Exogenous vitamin
12 I.M.A. Lombaert

D positively influences lung growth by inducing ­laminins. These components in turn served as
maturation in vitamin D receptor-­expressing epi- scaffolds for increased axon outgrowth.
thelial cells (VDR) [64]. As VDR is also present In addition to blood vessels, we must not for-
on endothelial cells, this enhanced growth might get the circulating cells within them. White blood
be due to direct effects of vitamin D on endothe- cell monocyte-derived macrophages and den-
lial cells and/or indirect effects from epithelia to dritic cells arise from the bone marrow and colo-
endothelia. Nevertheless, it is clear that epithe- nize tissues via blood vessels to phagocytose
lial-endothelial communication requires a tight cellular debris and help in the innate non-specific
balance as any hyper-­vascularization inhibits epi- and specific adaptive immune defense. While
thelial growth [14]. macrophages normally develop in the bone mar-
Apart from endothelial-epithelial cross-­ row via granulocyte-macrophage colony-­
communication, there is also endothelial-­ stimulating factor (GM-CSF), mesenchymal
mesenchymal communication, as recently cells in tissues can also release GM-CSF to
reviewed [94]. The early endothelial cells pro- induce a similar differentiation effect on circulat-
mote survival of pancreatic mesenchymal cells, ing monocytes. While it is clear that both macro-
which in turn have a pivotal role in organ devel- phages and dendritic cells may be involved in
opment. A similar complex paracrine signaling organ morphogenesis, their exact functions are
network was also found in the lung. Retinoic not always fully understood. Also in adult tissues,
acid (RA), which is produced by endothelial for example, in the lung, there is conflicting data
cells, induces VEGF-A expression in lung epi- on their specific role: antigen-sensing dendritic
thelia. Evidently, endothelial cells are recruited cells might induce different immune responses
via VEGF-A, and thus angiogenesis is stimu- depending on their physical location in the tissue
lated via this endothelial-epithelial communica- while surrounding different epithelial cell types
tion loop. Furthermore, endothelial-released RA [54]. Similarly, various macrophages invade the
also stimulated mesenchymal cells to produce mesenchyme where they can interact with den-
more FGF18 and ECM component elastin, thus dritic cells, lymphocytes, and epithelia to regu-
increasing epithelial alveolar formation [108]. late immunity. Macrophages suppress immune
Other organ-specific angiocrine factors that may responses by inhibiting both dendritic-mediated
follow this paracrine loop include HGF, WNT, T-cell activation and inactive TGFβ production.
NOTCH, and BMP ligands. Mesenchymal cells Subsequent activation of this inactive TGFβ into
also signal back to endothelial cells to stimulate bioactive TGFβ by lung epithelia is essential in
survival, proliferation, migration, and autoph- order to prevent spontaneous inflammation after
agy via production of ECM components, such acute injury. Lung alveolar cells in turn secrete
as the perlecan/heparan sulfate proteoglycan various ligands to receptive macrophages to
(HSPG2) fragment endorepellin, decorin, and ensure this prevention of inflammatory responses.
endostatin [18, 75]. Whether a similar action or disruption in this
While blood vessels and nerves can indepen- communication is occurring in adult SGs after
dently respond to their own set of signaling fac- radiation remains to be determined.
tors, there also seems to be a paracrine connection Apart from immune regulators, macrophages
via epithelial-released VEGF. Even though further shape the branching patterning of organs
VEGFR is absent on nerves and not required for by remodeling the ECM around the ducts to
innervation, VEGF overexpression in pancreas allow outgrowth as well as survival of endbud
not only led to hyper-vascularization but also to stem/progenitor cells [11, 102]. They also regu-
hyper-innervation [85]. Interestingly, endothelial late angiogenesis by instructing endothelial cells
cells did not produce any known neurotrophic to undergo apoptosis via WNT signaling, coun-
factors, but the effect appeared to be related to terbalancing a pro-survival factor produced by
their upregulated expression of basement mem- pericytes, which wrap around endothelial cells to
brane components, such as collagens and influence functions such as blood flow [2].
1 Implications of Salivary Gland Developmental Mechanisms for the Regeneration of Adult Damaged Tissues 13

Fig. 1.5 Described

signaling interactions with
the SG mesenchyme. Most
known communications
are between the SG
mesenchyme and
epithelium. Green:
expressed by epithelial
cells; orange: expressed by
mesenchyme; blue:
expressed by endothelial
cells; black: undefined
which compartment takes
part in it

In sum, blood vessels play important roles 29, 99]. This indicated that SG mesenchyme has
during development in other branching tissues strong and unique multicomponent instructional
not only for oxygen supply but also to maintain properties. One of them is the high production of
essential communication signaling pathways FGF10, which is also essential for lung, lacrimal,
with epithelia and surrounding mesenchyme. The and mammary gland initiation. Notably, non-SG
bone marrow-derived cells circulating in the epithelia only adapted SG-like branching patterns
blood vessels also aid in tissue branching mor- when they were placed in close vicinity to high
phogenesis and evoke or suppress immune FGF10-expressing mesenchymal tissue, confirm-
responses after injury. Whether similar mecha- ing the importance of FGF10’s spatiotemporal
nisms exist in the developing and adult SGs dosage [99]. With this in mind, it is important to
remains to be determined. understand that the SG mesenchymal component
in these experimental conditions contains mesen-
chymal cells as well as ganglia and blood vessels
1.3.3 Supporting Mesenchymal albeit disconnected from the rest of the body. It
Cells can therefore not be excluded that SG-specific
neuronal cells and/or blood vessels may have addi-
Embryonic SG mesenchymal cells are WNT1+ tional contributions to this specific SG patterning.
neural crest-derived cells [44, 105] and provide Interestingly, early-stage E11.5–12.5 SG epithe-
supportive cues such as growth factors, proteases, lia, but not later stages, are able to instruct E10.5
and ECM proteins to guide and activate epithelial, mesenchyme from different sources to produce
neuronal, and endothelial cells (Fig. 1.5). In vitro FGF10. However, not every mesenchyme is as
recombination experiments show that the SG mes- competent to receive this signal as only SG and pha-
enchyme induces an SG-like branching pattern in ryngeal second arch mesenchyme responded and
various epithelia such as a pancreatic, mammary, limb mesenchyme, for example, did not. This indi-
and pituitary gland [96]. This property, however, is cates that this initial signal is exclusively located
not found in mesenchyme from non-SG tissues, as within specific regions of the embryo, likely to
E11.5–13 SG epithelium does not properly branch restrict specific organ outgrowth to the correct loca-
unless it is recombined with SG mesenchyme [28, tion in the body. What this initial epithelial signal is
Random documents with unrelated
content Scribd suggests to you:
 »Mutta minähän olen sinun, Thandar», intti tyttö. »Sinä olet
mieheni — olet sanonut rakastavasi minua, ja minä olen vastannut
tahtovani olla puolisosi — kukapa voisi antaa meidät toisillemme
paremmin kuin itse voimme?»

Waldo koetti parhaansa mukaan selittää tytölle oman maailmansa

avioliittotapoja ja -menoja, mutta Nadaran oli vaikea käsittää, miten
outo ihminen, jota kumpikaan heistä ei mahdollisesti ollut
milloinkaan nähnyt, saattoi antaa hänelle oikeuden rakastaa hänen
omaa Thandariaan ja miten hän voisi menetellä väärin rakastaessaan
Thandaria ilman oudon ihmisen lupaa.

Thandarista näytti tulevaisuus perin synkältä ja toivottomalta.

Samalla kun hän äkkiä oli päättänyt viedä Nadaran oman kansansa
keskuuteen, oli hänet vallannut jäytävä koti-ikävä.

Nyt hän oivalsi, että hänen entinen haluttomuutensa, kun hän

ajatteli Bostoniin palaamista, oli johtunut yksinomaan siitä, että hän
muisteli Bostonia sellaisena kuin hän oli sen tuntenut — Bostonia
ilman Nadaraa. Mutta kun Nadaran nyt piti lähteä hänen mukaansa,
tuntui Boston koko maailman viehättävimmältä paikalta. Istuessaan
miettimässä onnettomia tapahtumia, jotka olivat viivyttäneet heitä
siinä määrin, että pursi oli ennättänyt poistua, ennenkuin he
ennättivät rannalle, hän myöskin pohti suunnitelmia lievittääksensä
heidän pettymystään.

Jäädä iäksi asumaan tälle raakalais-saarelle ei tuntunut niin

kammottavalta kuin vuosi takaperin — mutta silloin hän ei ollutkaan
tajunnut rakastavansa vierellänsä olevaa nuorta, villiä olentoa. Jospa
tyttö vain voisi tulla hänen vaimokseen, niin hänen maanpakonsa
täällä olisi pikemminkin onnellinen kuin murheellinen kohtalo.
 Entäpä jos hän itsekin olisi syntynyt täällä? Se ajatus herätti
toisen, joka näytti tarjoavan hänelle keinon selviytyä pulmasta. Jos
hänkin olisi ollut tämän saaren syntyperäinen asukas, niin miten hän
olisi ottanut Nadaran puolisokseen?

Niin, noudattamalla oman kansansa menoja tietenkin. Ja jos

kerran miehet ja naiset menivät täällä avioliittoon sillä tavoin ja elivät
uskollisina toisilleen koko elämänsä, niin voisiko sivistysmaailma
tarjota sen pyhempää liittoa?

Hän ponnahti pystyyn.

»Tule, Nadara!» huudahti hän. »Palaamme sinun kansasi pariin, ja

siellä sinusta tulee vaimoni.»

Nadara oli ymmällä, mutta ei huomauttanut mitään, tyytyen

yksinkertaisesti jättämään tulevaisuuden järjestämisen herransa ja
isäntänsä huoleksi, noudattamaan sellaista menettelyä, joka tekisi
Thandarin onnellisemmaksi.

Nadaran heimon asuinsijoille palaaminen vaati kolme

unohtumatonta päivää.

Kuinka toisenlainen oli tämä matka kuin heidän vuosi sitten

taivaltamansa? Silloin oli luolatyttö opastanut kauhun painamaa
Waldo Emersonia pakenemaan ilkeän kansan luota hänestä yhtä
kammottavaa kohtaloa kohti, Korthin ja Lättäjalan käsiin.

Silloin olivat metsän aukeamat kumahdelleet raivoisten petojen

käpälistä ja alastomien, inhimillisten hirmuolentojen hiipivistä
askelista. Jokainen risahtanut oksa oli ennustanut pikaista ja hirveätä
kuolemaa.
 Nyt Korth ja Lättäjalka olivat saaneet surmansa muuttuneen
Waldon kädestä. Kiusaava yskä oli poissa. Hän oli otellut ilkeiden
miesten ja muiden heidän vertaistensa kanssa sekä selviytynyt
kamppailusta kunniakkaasti. Ei edes Nagoola, kamalien öiden
kiiltävän sileä, musta hornankissa, enää vähääkään värisyttänyt
hänen vahvistuneita hermojaan.

Eikö Thandarin olkapäitä ja lanteita verhonnut Nagoolan talja,

jonka hän oli hankkinut ottelemalla käsikähmässä pelätyn pedon
kanssa?

Verkkaisesti he astelivat jättiläispuiden varjossa, miellyttävien

purojen partailla tai lakeissa laaksoissa, joissa kasvoi polvenkorkuista
ruohoa ja heidän paljaat jalkansa avasivat polun lukemattomien,
tuoksuavien, villien kukkien keskelle.

Yöt he nukkuivat siellä, missä ilta heidät yllätti, milloin jonkun

eläimen hyljätyssä luolassa, milloin rehevän puun oksilla kyhättyään
karkeatekoisen lavan samansuuntaisten oksien varaan.

Ja perin huolekkaasti Thandar aina varasi Nadaran vuoteeseen

mitä pehmeimpiä heiniä ja sijoitti omansa vähän matkan päähän
siitä, sellaiseen asemaan, että hän parhaiten voi suojella tyttöä
saalistavilta pedoilta.

Taaskin Nadara oli ymmällä, mutta vieläkään hän ei virkkanut

mitään.
Vihdoin he saapuivat kylään.

Useita nuoria miehiä tuli heitä vastaan, mutta kun he tunsivat

miehen
Korthin surmaajaksi, hillitsivät he röyhkeyttään, kaikki muut paitsi
Isonyrkki, joka oli ruvennut kuninkaaksi Lättäjalan poistuttua.

»Minä saatan tappaa sinut», ilmoitti hän tervehdykseksi, »sillä

olen Isonyrkki ja kuningas Lättäjalan paluuseen saakka — ja kenties
myöhemminkin, sillä kerran vielä surmaan Lättäjalan».

»En halua tapella kanssasi», vastasi Thandar. »Olen jo tappanut

Korthin, eikä Lättäjalka enää palaa, sillä hänetkin olen tappanut. Ja
pystyn surmaamaan Isonyrkinkin, mutta mitäpä se hyödyttäisi?
Minkä tähden meidän pitäisi otella? Olkaamme ystävyksiä, sillä
meidän on elettävä yhdessä, ja jollemme surmaa toisiamme, on
meitä enemmän torjumassa ja tappamassa ilkeitä miehiä, jos he
tulisivat meitä hätyyttämään.»

Kuultuansa, että Lättäjalka oli saanut surmansa tämän

muukalaisen kädestä, ei Isonyrkki enää niin kovasti himoinnut päästä
mittelemään voimiansa tulokkaan kanssa. Hän huomasi toisen
tarjoaman peräytymistien ja koetti kerkeästi vetäytyä takaisin, mutta
kunniakkaasti.

»No niin», virkkoi hän, »minä en tapa sinua — sinun ei tarvitse

pelätä. Mutta sinun on tiedettävä, että minä olen kuningas, ja
tehtävä niinkuin minä käsken.»

»'Pelätä'», kertasi Thandar nauraen. »Saat olla kuningas, mutta

mitä tulee siihen, että tottelisin käskyjäsi —» Taaskin hän naurahti.

Waldo Emerson Smith-Jones oli nyt kokonaan toisenlainen kuin se

olento, jonka meri oli heittänyt helmastaan kaksitoista kuukautta
aikaisemmin.
TOINEN LUKU

Kuningas Thandar

Kylään saavuttuaan Thandar ensi töikseen etsi käsiinsä Nadaran

isän.

He tapasivat vanhuksen kallioseinämän kehnoimmassa ja

huonoimmin suojatussa luolassa alttiina kaikkien saalistavien
raatelijain ja hiipiväin vihollisten hyökkäyksille.

Hän oli sairas, eikä häntä hoivaamassa ollut ketään, mutta hän ei
valittanut. Sellainen oli hänen kansansa tapa. Kun ihminen tuli liian
vanhaksi kyetäkseen hyödyttämään yhdyskuntaa, oli hänen paras
kuolla, eikä välttämätöntä lopputulosta senvuoksi pyritty millään
tavoin hidastuttamaan. Kun joku muuttui kokonaan heimolaistensa
taakaksi, oli tapana jouduttaa loppua — tarkasti tähdätty, raskaalla
kivellä sivallettu isku oli omiaan nopeasti huojentamaan
yhdyskunnan taakkaa ja toimintakyvyttömän yksilön kärsimyksiä.

Thandar ja Nadara astuivat sisälle ja istuutuivat hänen viereensä.

Ukko näytti ilostuvan heidät nähdessään.
 »Minä olen Thandar», alkoi nuori mies puhua. »Tahtoisin ottaa
tyttäresi puolisokseni.»

Vanhus silmäili häntä kysyvästi vähän aikaa.

»Olet surmannut Korthin ja Lättäjalan — kukapa voisi estää sinua

ottamasta Nadaraa?»

»Tahtoisin solmita hänen kanssaan avioliiton sinun

suostumuksellasi, noudattaen kansanne avioliittomenoja”, sanoi
Thandar.

Vanhus ravisti päätään.

»En ymmärrä sinua», virkkoi hän vihdoin. »Täällä on useita

mainioita luolia, joissa ei ole asukkaita — jos haluat vielä paremman,
on sinun vain surmattava sen nykyiset asukkaat, jolleivät he
laittaudu sieltä pois sinun käskystäsi — mutta luultavasti he lähtevät,
kun Korthin ja Lättäjalan surmaaja käskee.»

»Luola ei minua huoleta», vastasi Thandar. »Mutta selitähän,

miten teidän keskuudessanne miehet ottavat vaimon itselleen!»

»Jollei nainen tule mielisuosiolla, tartumme hänen tukkaansa ja

kiskomme hänet mukaamme», selitti Nadaran isä. »Minun puolisoni
ei tahtonut tulla», jatkoi hän, »ja vielä sittenkin, kun olin ottanut
hänet kiinni ja raahannut hänet luolaani, riistäytyi hän irti ja karkasi
luotani. Mutta saavutin hänet uudelleen, sillä silloin kun olin nuori, ei
kukaan jaksanut juosta nopeammin kuin minä. Ja sitten tein, kuten
minun olisi pitänyt tehdä jo ensi kerralla — löin häntä päähän,
kunnes hän vaipui uneen. Herätessään hän oli luolassani, ja oli yö,
eikä hän enää senjälkeen yrittänytkään karata.»
 Kauan aikaa Thandar istui aatoksissaan. Sitten hän äkkiä puhkesi
puhumaan, kääntyen Nadaran puoleen.

»Minun maassani ei vaimoja oteta sillä tavoin, enkä minäkään ota

sinua siten. Meidän on mentävä oikeaan avioliittoon sivistyskansojen
tapojen ja lakien mukaisesti.»

Nadara ei vastannut mitään. Hänestä tuntui, että Thandar piti

hänestä kovin vähän — muulla tavoin hänen oli miltei mahdoton
selittää miehen kummallista käytöstä. Se teki hänet murheelliseksi.
Ja sitten toiset naiset nauraisivat — siitä hän oli ihan varma, ja sekin
tuntui hänestä varsin ilkeältä — he näkisivät, ettei Thandar haluaisi
häntä omakseen.

Takkuisesta, likaisesta ruohosta kyhätyllä, kurjalla vuoteellaan

viruva vanhus oli kuullut keskustelun. Hän oli yhtä ymmällä kuin
Nadarakin. Vihdoin hän alkoi puhua — nyt hänen äänensä oli hyvin
heikko, sillä kuolema lähestyi nopein askelin.

»Olen hyvin vanha mies», sanoi hän Thandarille. »Minulla ei ole

kauan
elonaikaa jälellä. Ennen kuolemaani tahtoisin mielelläni tietää, että
Nadaralla on puoliso, joka suojelee häntä. Rakastan häntä, vaikka
—»
Hän epäröi.

»Vaikka mitä?» kehoitti Thandar.

»En ole koskaan hiiskunut siitä kenellekään», supatti ukko.

»Puolisoni ei sitä sallinut, mutta kun nyt olen kuolemaisillani, ei siitä
voi koitua mitään pahaa. Nadara ei ole minun tyttäreni.»
 Tyttö ponnahti pystyyn.

»Enkö sinun tyttäresi? Kuka sitten olen?»

»En tiedä, kuka olet; sen vain tiedän, ettet ole edes meidän
kansaamme. Kerron teille kaikki tietoni nyt ennen kuolemaani.
Tulkaa likelleni, sillä ääneni heikkenee nopeammin kuin ruumiini!»

Nuori mies ja tyttö siirtyivät lähemmäksi häntä ja kyyköttivät

kumartuneina hänen puoleensa erottaakseen jokaisen hiljaa
lausutun tavun.

»Puolisoni ja minä», alkoi ukko, »olimme lapsettomia, vaikka kuu

oli kiertänyt monta kertaa, senjälkeen kun otin hänet luolaani. Hän
kaipasi pienokaista, sillä vain siten saavat naiset jonkun, jolle voivat
tuhlata rakkauttaan.

— Olimme olleet kahden kesken useita päiviä metsästämässä

kaukana kylästä, sillä nuorena ollessani olin suuri metsästäjä —
kansamme keskuudessa ei ole milloinkaan elänyt minua suurempaa.

— Ja eräänä päivänä saavuimme laajan veden äärelle ja vähän

matkan päässä rannasta näimme kummallisen, veden pinnalla
kelluvan esineen, ja kun tuuli ajoi sen lähemmäksi, näimme, että se
oli ontto ja että siinä oli kaksi ihmistä — mies ja nainen. Molemmat
näyttivät kuolleilta.

— Vihdoin kahlasin esineen luokse ja vedin sen rantaan, ja

totisesti siinä oli mies ja nainen, ja mies oli kuollut — ihan kuollut.
Hän oli varmaankin kuollut jo aikoja sitten; mutta nainen ei ollut
kuollut.
 — Hän oli hyvin kaunis, vaikka hänen silmänsä ja hiuksensa olivat
mustat. Kannoimme hänet maihin, ja sinä yönä syntyi hänelle pieni
tyttö, mutta nainen itse kuoli ennen aamua.

—- Panimme hänet takaisin kummalliseen esineeseen, joka hänet

oli tuonut — hänet ja hänen kanssansa tulleen kuolleen miehen — ja
sysäsimme sen laajan veden pinnalle, jossa yöllä kääntynyt tuuli ja
kahdesti vuorokaudessa maalta päin virtaava vesi veivät sen pois
näkyvistä, emmekä sitten enää koskaan heitä nähneet.

— Mutta ennenkuin työnsimme heidät ulapalle, otti vaimoni naisen

omituiset verhot ja pienen, nahkaisen pussin. Siinä oli useita
erivärisiä, säihkyviä kiviä ja keltaisesta ja valkoisesta metallista
muovattuja esineitä, joiden tarkoitusta emme osanneet arvata.

— Ilmeisesti nainen oli tullut jostakin oudosta maasta, sillä hän ja

kaikki hänen vehkeensä olivat kokonaan toisenlaisia kuin kaikki, mitä
milloinkaan olimme nähneet. Hän itse oli toisenlainen, kuten
Nadarakin on toisenlainen — Nadara on äitinsä näköinen, sillä
Nadara on se lapsi, joka sinä yönä syntyi.

— Toimme hänet kuukauden kuluttua oman kansamme pariin,

väittäen häntä puolisoni lapseksi. Mutta eräs nainen tunsi asian
oikean laidan, sillä nähtävästi hän oli tähyillyt meitä, kun löysimme
veneen, ollessansa pakoilemassa miestä, joka tahtoi häntä
puolisokseen.

— Mutta puolisoni ei suvainnut kenenkään sanovan, että Nadara ei

ollut hänen lapsensa, siliä lapsettomuus on, kuten tiedätte, suuri
häpeä naiselle, ja niinpä hän oli useita kertoja vähällä tappaa sen
naisen, joka tiesi asian, estääkseen hänet ilmaisemasta totuutta koko
kylälle.
 — Mutta minä rakastan Nadaraa, ikäänkuin hän olisi oma lapseni,
ja sen vuoksi toivoisin näkeväni, että hänellä on hyvä puoliso,
ennenkuin kuolen.»

Thandar oli käynyt kalpeaksi kuunnellessaan kertomusta Nadaran

syntymästä. Hän jaksoi hädintuskin hillitä haluaan laskeutua
polvilleen ja kiittää Jumalaa siitä, että oli kuunnellut sivistysolojen
mukaisen koulutuksensa ääntä eikä ollut noudattanut helpompaa
menettelytapaa, joka tämän alkeellisen, eläimellisen heimon parissa
oli käytännössä. Sallimus, ajatteli hän, oli varmastikin lähettänyt
hänet tänne tytön pelastajaksi.

Vanhus kääntyi karkealla vuoteellaan ja suuntasi

kuoppaanpainuneet silmänsä kysyvästi Thandariin. Myöskin Nadara
odotti huulet raollaan, että hän alkaisi puhua.

Ukko haukkoi henkeään — hänen kurkustaan lähti omituinen,

koriseva ääni.

Thandar kumartui hänen puoleensa ja kohotti hieman hänen

päätään ja hartioitaan. Nuori mies ei ollut koskaan ennen kuullut
sellaista ääntä, mutta nyt sen kuullessaan hän ei tarvinnut selitystä.

Hankaamalla jaloillaan siipiänsä heinäsirkka saattaa säikäyttää

kokemattoman henkilön luulemaan, että polulla väijyy piilossa oleva
kalkkarokäärme. Mutta kun iso mustaselkä antaa varoituksensa
kuulua, ei kukaan erehdy luuleman sitä heinäsirkan ääneksi.

Samanlainen on kuoleman korina ihmisen kurkussa.

Thandar tunsi, että loppu oli käsissä. Hän näki, kuinka ankarasti
vanhus ponnisteli koettaessaan torjua luotaan heltymätöntä
niittomiestä voidakseen vielä puhua. Kuolevan silmissä oli kysyvä ja
vetoava ilme. Thandar ei voinut ymmärtää sitä väärin.

Hän ojensi kätensä ja tarttui Nadaran käteen.

»Minun maassani tulee meistä aviopuolisot», lausui hän. »Kukaan

muu ei saa Nadaraa omakseen, ja merkiksi siitä, että hän on
Thandarin, on hänen aina pidettävä tätä sormessaan.» Hän irroitti
sormestaan uhkean timanttisormuksen ja pujotti sen Nadaran
vasemman käden nimettömään sormeen.

Vanhus näki sen. Hänen kasvoilleen levisi hymyilyä muistuttava

huojennuksen ja tyytyväisyyden ilme, kun hän ähkäisten huoahti ja
vaipui hervottomana Thandarin käsivarsille — kuolleena.

Saman päivän iltapuolella kantoivat nuoret miehet Nadaran

kasvatusisän ruumiin kallion laelle lähes kilometrin päähän luolista.
Mitään juhlallisia menoja ei ollut. Silloin Waldo Emerson kuitenkin
näki ihmisten alkuperäisen hautajaissaattueen — yksinkertaisen,
järjen ja tarpeen vaatimusten mukaisen —- josta ihmisrotu on
taantunut käyttämään nykyisten sivistyskansojen komeilevia,
naurettavia, tartuntaa levittäviä hautajaisia.

Isonyrkin määräyksen mukaan nuoret miehet veivät arvottoman

ruumiin sopivan välimatkan päähän luolista ja jättivät sen sinne,
missä petoeläimet ja -linnut pitivät huolta sen nopeasta
hajoamisesta.

Nadara itki hiljaa. Vanhahko nainen, jonka suussa oli yksi ainoa
hammas, huomasi hänet ja alkoi valittaa myötätunnosta. Valittelun
houkuttelemina liittyi heidän seuraansa pian muita naisia, joihin
tarttui naissukupuolen perinnöllinen, kummallinen hysteria, niin että
he alkoivat säestää hampaattoman voivotuksia.

Omien ääniensä kiihdyttäminä he pian kirkuivat ja parkuivat

kamalana kuorona. Sitten saapui Isonyrkki ja hänen seurassansa
muita miehiä. Melu kiusasi heitä, ja he kävivät murehtijain kimppuun
nyrkkeineen ja hampaineen, hajoittaen heidät eri suunnille. Siten
päättyi juhlatilaisuus.

Tai se olisi päättynyt, jollei Isonyrkki olisi tehnyt kovaonnista

virhettä ja tähdännyt iskua Nadaraan. Thandar oli seisonut
läheisyydessä, kummissaan katsellen omituista näkyä.

Hän oli pannut merkille nuoren tytön hiljaisen surun — se oli

todellista surua — ja »murehtijain» monenlaiset hysterian ilmaisut.
Nekään eivät olleet valhesurua, koska he eivät olleetkaan
murehtivinaan, vaan pyrkivät ainoastaan aiheuttamaan hälyä. Ja
koska hornamainen pauhu oli ärsyttänyt Waldon omia hermoja, ei
häntä lainkaan ihmetyttänyt, että Isonyrkki ja muut miehet ryhtyivät
meteliä vaimentamaan.

Naispuoliset puolieläimet olivat heidän, ja Waldo Emerson oli siksi

suuressa määrin sopeutunut alkeelliseen ympäristöönsä, ettei hän
lainkaan tuntenut halua sekautua toisten asioihin. Mutta Nadara ei
ollut heidän — Nadara ei ollut heidän heimoaan, ja vaikka tyttö ei
olisikaan ollut hänen omansa, olisi amerikkalainen tuntenut
velvollisuudekseen astua hänen ja noiden villien olentojen väliin,
joiden pariin kohtalo oli hänet heittänyt. Mutta kun tyttö oli hänen,
valtasi hänet surmaajan kuuma verenhimo, kun hän syöksähti
estämään tytön kimppuun karkaavaa Isonyrkkiä.
 Waldo Emerson Smith-Jones ei ollut oppinut miehekkään
itsepuolustustaidon aakkosiakaan aikaisemman, kaikelta karkealta ja
raa'alta visusti varjellun elämänsä aikana. Se oli onneton seikka,
koska se taito olisi tarjonnut hänelle paljon etua hänen otellessaan
raakalaista vastaan. Yksi ainoa, hyvin tähdätty sivallus suojattomaan
leukaan olisi lopettanut tappelun heti; mutta Thandarilla ei ollut
aavistustakaan iskuista, ei sivalluksista eikä muista
nyrkkeilytempuista.

Tosin hän käytti karkeatekoisia aseitaan, mutta muutoin hän

taisteli samaan alkeelliseen tapaan kuin hänen alkuperäinen
ihmisenkaltainen esi-isänsä ja unohti hyvin usein kokonaan
miekkansa, puukkonsa, jousensa ja nuolensa sekä keihäänsä
kyyristyessään puolittain kumaraan asemaan ottamaan vastaan
vihollisensa hyökkäystä.

Nyt hän karkasi tavoittamaan Isonyrkin karvaista kurkkua. Kuului

kumea tömähdys, kun miehet törmäsivät yhteen, ja kieriskellen,
purren ja repien he rimpuilivat sinne tänne kivisellä maaperällä
kallion juurella.

Muut miehet herkesivät ahdistamasta naisia. Naiset keskeyttivät

äänekkään murehtimisensa. Kaikki sijoittuivat kamppailijain ympärille
pieneen piiriin, joka siirtyi sinne tänne ottelijain liikkuessa, niin että
he aina olivat sen keskellä.

Nadara tunkeutui katselijain välitse etualalle. Hän tahtoi olla likellä

Thandaria. Hänen kädessään oli rosoinen graniittikappale — olihan
mahdoton etukäteen arvata, miten kävisi.

Isonyrkki oli vanttera — tukeva kuin vuori — mutta Thandar oli

voimakaslihaksinen kuin Nagoola, musta pantteri. Hänen kaikki
liikkeensä olivat sulavia ja nopeita, mutta niin vastustamattomia.
Äkillinen, odottamaton isku Isonyrkin ohimoon keikautti hänen
pallomaista päätänsä sivullepäin niin rajusti, että kaula oli vähällä
nyrjähtää sijoiltaan.

Isonyrkki parkaisi sen tuottamasta kivusta. Riemuissaan

sattumalta sivaltamansa iskun tuloksesta Thandar uudisti sen.
Isonyrkki mylvi tuskissaan. Viimeisen kerran hän pinnisti voimiaan
äärimmilleen ja yritti päästä käsiksi ketterään vastustajaansa, ja se
onnistui. Hänen hampaansa tavoittivat Thandarin kurkkua, mutta
samalla hänen oma henkitorvensa joutui likelle Thandarin
leukapieliä.

Waldo Emerson Smith-Jonesin vahvat, valkeat hampaat puristuivat

siihen niin luonnollisesti kuin ei olisikaan vierinyt lukemattomia
hitaita ajanjaksoja sen jälkeen kun joku hänen esi-isänsä oli viimeksi
upottanut torahampaansa vastustajansa pehmeään lihaan.

Hukkaan kuluneet ajanjaksot! Alkeellisesta ja eläimellisestä on

niiden vieriessä pyritty nykyaikaiseen ja inhimilliseen — mutta
lyhyessä hetkisessä raukeaa kaikki se työ tyhjiin, aikakausien silaus
rapisee pois jonkun alkuaikaisen intohimon kuumuudessa, ja
alkeellinen ja eläimellinen tulee jälleen näkyviin alastomana ja
kainostelemattomana.

Kalpeana uhkaavan kuoleman herättämästä kauhusta koetti

Isonyrkki nyt kiskoutua irti. Thandar puri hampaansa sitäkin
syvemmälle. Äkkiä purskahti hänen kasvoilleen verta, joka salpasi
hänen hengityksensä. Isonyrkki herpaantui ja jäi virumaan
hievahtamatta.
 Hurmeen punaamana Thandar nousi pystyyn. Hänen edessänsä
maassa viruva kookas ruho vavahti suonenvedontapaisesti kerran tai
pari elinnesteen tulviessa katkenneesta kaulavaltimosta. Silmät
pyörähtivät ylöspäin ja jäykistyivät, ruumis värähti viimeisen kerran,
ja Isonyrkki oli kuollut.

Thandar kääntyi viehättyneiden katselijain puoleen ja valitsi

heidän joukostaan neljä vankkaa miestä.

»Viekää Isonyrkki kallion laelle!» komensi hän. »Teidän

palattuanne valitsemme kuninkaan.»

Miehet tottelivat. He eivät ollenkaan ymmärtäneet, mitä Thandar

tarkoitti kuninkaan valitsemisella. Surmattuaan Isonyrkin Thandar oli
kuningas, jollei joku kunnianhimoinen mies halunnut vastustaa
hänen hallitusoikeuttansa. Mutta kaikki olivat nähneet hänen
surmaavan Isonyrkin ja tiesivät hänen tappaneen Korthin ja
Lättäjalan, ja kukapa sitten olisi rohjennut käydä kiistelemään hänen
kanssaan kuninkuudesta?

Ruumiin viejien palattua kylään Thandar kokosi heimon miehet

lähellä kallion juurta kasvavan ison puun juurelle. Sinne he
sijoittuivat kyykkysilleen karkeapiirteiseen ympyrään. Heidän
takanaan seisoivat naiset ja lapset silmät levällään uteliaisuudesta.

»Valitkaamme kuningas!» ehdotti Thandar, kun kaikki olivat

ehtineet saapuville.

Syntyi pitkä äänettömyys. Sitten puhkesi muuan vanhemmista

miehistä puhumaan.
 »Olen iäkäs mies. Olen nähnyt monta kuningasta. He tulevat
surmaamalla. He poistuvat surmaamalla. Thandar on surmannut
kaksi kuningasta. Nyt hän on kuningas Kuka haluaa surmata
Thandarin, ja tulla kuninkaaksi?»

Vastausta ei kuulunut.

Vanhus nousi pystyyn.

»Oli typerää tulla tänne valitsemaan kuningasta», lausui hän,

»koska meillä jo on kuningas».

»Malttakaahan!» komensi Thandar. »Valitkaamme kuningas oikein

kunnollisesti. Se, että olen tappanut Lättäjalan ja Isonyrkin, ei
todista, että minusta tulee hyvä kuningas. Oliko Lättäjalka hyvä
kuningas?»

»Hän oli paha mies», vastasi ukko.

»Onko teillä koskaan ollut hyvää miestä kuninkaana?» tiedusti

Thandar.

Vanhus rypisti miettivästi otsaansa.

»Ei pitkään aikaan», myönsi hän.

»Syynä on se, että aina sallitte öykkärin ja raakalaisen hallita

itseänne», selitti Thandar. »Se ei ole oikea tapa kuningasta valitessa.
Teidän pitäisi mieluummin kokoontua yhteen, kuten nyt olemme
tehneet, pohtimaan heimon tarpeita, ja sitten kun olette saaneet
selville, mitkä toimenpiteet ovat parhaat heimon jäsenten
menestykseksi, pitäisi teidän valita kuninkaaksenne mies, joka
parhaiten pystyy toteuttamaan suunnitelmianne. Se on parempi
kuninkaan valitsemisen tapa.»

Vanhus purskahti nauramaan.

»Ja sitten», huomautti hän, »tulisi joku Isonyrkki tai Lättäjalka ja

tappaisi kuninkaamme päästäkseen kuninkaaksi hänen sijaansa».

»Oletteko koskaan nähnyt miestä, joka jaksaisi voittaa heimon

kaikki miehet yhtä aikaa?»

Ukko näytti joutuvan ymmälle.

»Se on vastaukseni väitteeseesi», virkkoi Thandar. »Kuninkaan

valitsijat voivat suojella häntä hänen vihamiehiään vastaan. Niin
kauan kun hän on hyvä kuningas, pitäisi heidän se tehdä, mutta kun
hän muuttuu huonoksi, voivat he valita uuden, ja jos paha kuningas
ei alistu tottelemaan uutta, on useiden miesten yhdessä helppo
surmata hänet tai karkoittaa hänet tiehensä, olipa hän kuinka uljas
taistelija tahansa.»

Monet miehistä nyökkäsivät ymmärtämyksen merkiksi.

»Se ei ole johtunut mieleemme», tuumivat he. »Onpa Thandar

tosiaankin viisas.»

»Nyt siis», jatkoi amerikkalainen, »valitkaamme kuninkaaksi se

mies, jota enemmistö kannattaa, ja niin kauan kun hän pysyy
hyvänä kuninkaana, on meistä enemmistön taisteltava hänen
puolestaan ja suojeltava häntä. Valitkaamme mies, jonka tiedämme
hyväksi, katsomatta siihen, pystyykö hän tappamaan
kumppaneitaan, sillä jos heimon enemmistö ottelee hänen
puolestansa, niin miksipä hänen tarvitsisi itsensä otella? Me
tarvitsemme viisasta miestä — joka osaisi opastaa heimon
hedelmälliseen seutuun ja riistaisille metsästysmaille ja sodan aikana
johtaa taistelua älykkäästi. Lättäjalalla ja Isonyrkillä ei ollut kylliksi
järkeä; he osasivat vain ryöstää muiden miesten puolisoita. Sellaista
ei kuningas saisi tehdä. Kuninkaan pitäisi suojella puolisoitanne
Lättäjalan tapaisilta olennoilta ja rangaista niitä, jotka mielivät
ryöstää vaimojanne.»

»Mutta miten hän kaiken sen tekee», kysyi eräs nuori mies, »jollei
hän ole koko heimon paras taistelija?»

»Enkö ole sitä teille jo osoittanut?» huomautti Thandar. »Me, jotka

teemme hänet kuninkaaksi, olemme hänen taistelijoitansa — hänen
ei tarvitse otella omin käsin.»

Taaskin syntyi pitkä äänettömyys. Sitten alkoi ukko jälleen puhua.

»Thandarin sanoissa piilee viisautta. Valitkaamme kuningas, jonka

on oltava meitä kohtaan hyvä, jos hänen on mieli pysyä kuninkaana.
Meidän on kovin paha olla, jos meillä on kuningas, jota pelkäämme.»

»Minä puolestani», sanoi nuori mies, joka oli aikaisemminkin

puhunut, »en halua hallitsijakseni kuningasta, joka ei pysty
voittamaan minua taistelussa. Jos minä voitan hänet, niin minusta
pitää tulla kuningas.»

Ja niin miehet jakautuivat puolueiksi, mutta sopivat lopulta niin,

että valitsisivat kuninkaaksi miehen, jonka he tiesivät olevan viisaan
ja samalla mainion taistelijan. Siksi he valitsivat kuninkaaksensa
Thandarin.
 »Kerran viikossa», julisti uusi kuningas, »kokoonnumme tänne
keskustelemaan, miten heimon hyvinvointia parhaiten edistettäisiin,
ja minkä enemmistö hyväksi näkee, se tehdään. Heimo ilmoittaa
kuninkaalle, mitä on tehtävä — kuningas panee sen toimeen. Ja
kaikkien on taisteltava, kun kuningas käskee taistelemaan, ja
kaikkien on oltava työssä, kun kuningas käskee tekemään työtä, sillä
kaikki taistelemme ja työskentelemme koko heimon hyväksi, ja minä,
Thandar, kuninkaanne, taistelen ja uurastan ankarammin kuin
kukaan teistä.»

Se oli heistä uusi katsantokanta ja saattoi kuninkuuden kokonaan

toisenlaiseen valoon kuin he aikaisemmin olivat tottuneet näkemään.
Että he tarvitsisivat kauan aikaa todella sulattaakseen sen
ajatustavan, sen Thandar oivalsi ja oli hyvillään siitä, että heillä oli
murrosaikana sellainen kuningas, joka kykeni vaatimaan heiltä
kunnioitusta heidän entisen mittapuunsa mukaisesti.

Ja häntä hymyilytti, kun hän ajatteli, kuinka paljon hän oli

muuttunut siitä ajasta, jolloin hän oli vapisten, itkien ja köhien
istunut autiolla rannalla kammottavan metsän liepeellä.
KOLMAS LUKU

Suuri N a g o o la

Waldo Emerson Smith-Jones oli ilomielin tarttunut sattuman

tarjoamaan tilaisuuteen ja ruvennut pienen luolalaisheimon
kuninkaaksi. Ensiksikin takasi hänen uusi asemansa paremmin
Nadaran turvallisuuden, ja toiseksi se antoi laajemmat
toimintamahdollisuudet hänen äsken heränneelle aloitekyvyllensä.

Aikaisemmin hän oli kaihtanut vastuunalaisuutta, mutta nyt hän

ilomielin otti sen niskoilleen. Nyt hän kaipasi toimintaa, kun hän taas
aikaisemmin oli tyytynyt ainoastaan lukemaan muiden saavutuksista.

Harmikseen hän pian kuitenkin huomasi, että klassillinen kasvatus,

jolle hänen varhaisempi elämänsä oli omistettu hellivän ja
ylettömästi hienostuneen äidin ohjatessa, osoittautui perin kehnoksi
perustaksi, kun hän alkoi käytännöllisesti suunnitella oman elämänsä
ja heimonsa elämän järjestelyä.

Hän tahtoi opettaa kansaansa rakentamaan pysyviä ja mukavia

taloja, mutta hän ei jaksanut muistaa ainoatakaan Ovidiukselta
saamaansa käytännöllistä vihjausta kirvesmiehen ammatissa.
 Hänen kansansa hankki ravintonsa metsästämällä pieniä
nakertajia, tyhjentelemällä linnunpesiä ja noukkimalla villejä
hedelmiä ja vihanneksia. Thandar halusi panna alkuun jonkunlaisen
yhteiskunnallisen maanviljelyksen, mutta klassillisten runoilijain
teokset, joihin hän oli oikein hyvin tutustunut, tarjosivat kovin vähän
käytännöllisesti arvokkaita tietoja maanviljelyksestä. Hän oli
pahoillaan siitä, että hän ei ollut kirjoittautunut jonkun Alleghany-
vuorten länsipuolella sijaitsevan maanviljelyslukion luetteloihin, vaan
mennyt Harvardin yliopistoon opiskelemaan.

Hän päätti kuitenkin puristaa mahdollisimman paljon hyötyä

niukoista käytännöllisistä tiedoistaan, jotka melkein supistuivatkin
siihen, että hän osasi määritellä »maanviljelys»-sanan merkityksen.

Mutta olihan sekin itu, sillä se edellytti hänen tuntevan ne tulokset,

joita maanviljelyksellä voitiin saavuttaa.

Niinpä Thandar olikin askeleen edellä aikaisimmista

esivanhemmistaan, kun viimemainitut olivat ryhtyneet
tarkoituksellisesti istuttamaan viljaa, jota luonto oli siihen saakka
umpimähkään siroitellut tuulen, lintujen ja muiden eläinten
välityksellä, mutta vain askeleen verran heistä edellä.

Hän käsitti, että hänellä oli hyvin merkillinen asema aikakausien

asteikossa. Hän oli tuntenut, nähnyt ja käyttänyt hyväkseen
kivikauden ja kahdennenkymmenennen vuosisadan välisinä
ajanjaksoina saavutetun kehityksen kuluessa kasautuneita tietoja, ja
nyt oli kohtalo äkkiä viskannut hänet kivikauteen tai kenties
muutamia ajanjaksoja kauemmaksi ajassa vain osoittaaksensa
hänelle, että kaikki hänen muiden ihmisten tiedoista haalimansa
tiedot olivat kerrassaan arvottomia kivikaudella.
 Hän oli asunut puusta ja tiilistä rakennetuissa taloissa ja katsellut
lasi-ikkunoista. Hän oli lukenut kaasun ja sähkön valossa, ja hänellä
oli aavistus kynttilöistäkin. Mutta hän ei kyennyt valmistamaan
työkaluja rakentaakseen talon, hän ei olisi osannut tehdä tiiltä,
vaikka henki olisi ollut kysymyksessä, lasista oli äkkiä hänen
mielestään tullut yksi maailman ihmeistä, ja kaasu, sähkö ja kynttilät
taas olivat muuttuneet samanlaisiksi kuin Sfinksin salaperäinen
arvoitus.

Hän osasi kirjoittaa runosäkeitä loistavalla kreikankielellä, mutta

enää hän ei siitä ylpeillyt. Hän olisi paljoa mieluummin toivonut
pystyvänsä parkitsemaan vuotia tai virittämään tulen ilman
tulitikkuja. Waldo Emerson Smith-Jones oli vuosi sitten ollut erittäin
ylpeä älystään ja korkeasta opistaan, mutta vuoden kuluttua oli
hänen itserakkautensa kutistunut, niin että hän nyt piti itseänsä
maailman surkeimpana ja mitättömimpänä miehenä.

»Olen rikollisen tietämätön», sanoi hän Nadaralle, »sillä olen

sysännyt luotani kokonaisen elämäniän mahdollisuudet omistamalla
sen hyödyttömän opin kasaamiseen, vaikka olisin voinut hankkia
hyödyllisiä, käytännöllisiä tietoja, jotka ovat nostaneet maailman
mustasta raakalaisuudesta nykyaikaisen edistyksen valoon — en
ainoastaan olisi voinut tehdä sitä, vaan sitäpaitsi jonkun verran lisätä
ihmiskunnan kunniaa ja hyvinvointia. Olen kelvoton olento, Nadara
— pahempi kuin hyödytön.»

Tyttö kosketti hyväillen hänen voimakasta, ruskeata kättään ja

katseli ylpeillen häntä silmiin.

»Minusta olet suorastaan ihmeellinen, Thandar», kehui hän.

»Paljain käsin olet tappanut Nagoolan, maailman hirvittävämmän
pedon, ja Korth, Lättäjalka ja Isonyrkki viruvat voimiesi rusentamina
korppikotkien raadeltavina — yksin sinä olet surmannut heidät kaikki,
kolme kammottavaa miestä. Niin, Thandarini on suurin kaikista
miehistä.».

Eikä Waldo Emerson jaksanut tukahduttaa voimakasta ylpeyden

aaltoa, joka tulvahti hänen mieleensä, kun hänen rakastamansa tyttö
luetteli hänen urotöitään. Enää ei hän pitänyt saavutuksiaan
»raakana ruumiillisena urhoollisuutena ja kuntona». Entinen Waldo
Emerson, jonka ruumiinlämpö oli kohonnut säännöllisesti joka päivä
kello kolme iltapuolella, jonka surkean laihaa ruumista yskiminen oli
vaivannut alituisesti, ja jonka silmiin oli sekä yöllä että päivällä tullut
kauhunilme hänen kuullessaan kuivien lehtien kahinaa, oli kuollut.

Hänen sijallansa oli roteva, verevä mies, ruskeaihoinen ja

teräsjänteinen, peloton, itseensäluottava, melkeinpä raaka ylpeänä
voimastaan — Thandar, luolamies.

Ne kuukaudet, jotka kuluivat Thandarin johtaessa kansaansa

luola-aukkojen täyttämältä kallioseinämältä toiselle etsiessään
sopivaa paikkaa pysyvää kylää varten, olivat Nadaran ja kuninkaan
onnenaikaa.

Tytön onnea häiritsi hieman se seikka, ettei Thandar vaatinut

häntä omakseen. Hän ei vielä oikein jaksanut käsittää heitä erottavia
siveyssääntöjä. Thandar koetti selittämistään selittää hänelle, että he
kerran palaisivat hänen maailmaansa ja ettei se maailma ottaisi
häntä vastaan, jollei heidän liittoaan olisi vahvistettu siellä voimassa
olevien säädösten ja menojen mukaisesti.

»Saavatko ne avioliittomenot, joista puhut, sinut rakastamaan

minua enemmän?» kysyi Nadara.
 Thandar purskahti nauramaan ja otti hänet syliinsä.

»En voisi rakastaa sinua enempää», vastasi hän.

»No, mitä hyötyä niistä sitten on?»

Thandar pudisti päätään.

»Sitä on vaikea selittää, erittäinkin sellaiselle herttaiselle pikku

pakanalle kuin Nadarani on. Sinun on tyydyttävä tietämään — usko
minun vakuutustani — että meidän on odotettava juuri siksi, että
minä rakastan sinua.»

Nyt oli tytön vuoro ravistaa päätään.

»En jaksa sitä käsittää», virkkoi hän. »Minun kansani miehet

ottavat puolisonsa mielensä mukaan, ja he ovat tyytyväisiä, ja kaikki
ovat tyytyväisiä, ja kaikki on hyvin. Mutta heidän kuninkaansa, joka
saa ottaa puolisokseen kenet vain haluaa, odottaa, kunnes mies, jota
hän ei tunne ja joka asuu laajan veden takana — jonne ehkä emme
koskaan pääse — antaa hänelle luvan ottaa puolisoksensa naisen,
joka rakastaa häntä — jota hän sanoo rakastavansa.»

Thandar pani merkille, että Nadara korosti sanaa »sanoo».

»Tuonnempana», vastasi hän, »kun olemme saapuneet minun

maailmaani, ymmärrät minun olevan oikeassa ja kiität minua. Siihen
saakka, Nadara, sinun täytyy luottaa minuun, ja», lisäsi hän
puolittain itsekseen, »olen ansainnut luottamuksesi, vaikka sinä et
sitä tiedäkään».

Ja niinpä Nadara oli uskovinaan ja olevinaan tyytyväinen, mutta

sydämensä sisimmässä hän yhä pelkäsi, ettei Thandar rakastanut
häntä oikein todenteolla, eivätkä naisten puolittain verhotut
huomautukset suinkaan olleet omiaan rauhoittamaan hänen
mieltään.

Ollessansa hänen seurassaan oli Thandar koko ajan opettanut

hänelle omaa kieltään, sillä hän toivoi sydämensä pohjasta voivansa
viedä tytön kotiinsa ja toivoi hänen olevan niin kypsyneen
esiteltäväksi Bostonissa ja sivistysmaailmassa, kuin hän, Waldo,
suinkin saattoi hänet tehdä.

Thandar tahtoi etsiä kylälle sopivan paikan meren näkyvissä

voidakseen aina tähyillä laivoja. Vihdoin sellainen löytyikin —•
tasainen ruohikko matalalla ylängöllä, josta näkyi merelle.

Hän oli osunut sinne vaellellessaan yksiksensä useiden kilometrien

päässä niistä väliaikaisista kallioasumuksista, joissa heimo silloin
majaili. Maata kaivaessaan hän huomasi mullan meheväksi ja
mustaksi. Toisella laidalla kasvoi tukkipuita, ja toisella oli jyrkkiä
kallioita pehmeätä kalkkikiveä.

Thandarin suunnitelman mukaan oli kylä rakennettava osittain

hirsistä kallioseinämän viereen ja koverrettava asumuksien taakse
lisäkammioita sikäli kuin kukin perhe tarvitsi.

Luolat yksinkin olisivat tarjonneet kylliksi suojaa, mutta Waldo

toivoi pakottamalla kansansa rakentamaan osan majoista hirsistä
saavansa kussakin perheessä herätetyksi jonkunlaista
omistajantunnetta ja ylpeyttä mieskohtaisesta omaisuudesta, joten
heidän ei enää olisi yhtä helppo luopua majapaikoistaan kuin ennen,
jolloin heidän oli tarvinnut vain siirtyä jollekin toiselle kalliolle
löytääkseen ihan yhtä mukavia luolia kuin ne olivat, jotka he olivat
niin kevein mielin hylänneet.
 Toisin sanoen hän toivoi voivansa antaa heille sanan, jota heidän
sanastossaan ei ollut siihen saakka ollut — sanan »koti».

Olisiko se onnistunut vai eikö, sitä emme saa koskaan tietää, sillä
viimeisellä hetkellä astui väliin kohtalo, pyyhkäisten yhdellä vedolla
pois hänen kaikki suunnitelmansa ja pyrkimyksensä.

Hänen palatessaan sinä iltana kansansa pariin, uhkuen

toiveittensa virittämää innostusta, hiipi tanakka, karvainen olento
varovasti hänen jälessään. Kun Thandar ilmestyi lähelle sitä
kallioseinämää ulottuvasta pensaikosta, johon väliaikainen leiri oli
sijoitettu, juoksi odottamassa ollut Nadara häntä vastaan.

Thandarin jälessä hiipivä hahmo seisahtui pensaikon laitaan. Kun

hänen lähekkäin olevien silmiensä katse osui tyttöön, värähtelivät
hänen veltot huulensa nopeasta hengityksestä, ja hänen punaiset
luomensa painuivat puolittain umpeen, tehden hänet kavalan ja
himokkaan näköiseksi.

Muutamia minuutteja hän tarkkaili miestä ja neitoa, kun he

verkkaisesti astelivat kalliolle edellisen käsivarsi toisen ruskeiden
hartioitten ympärillä. Sitten hän kääntyi ja häipyi takanaan olevien
sekavien oksien sekaan.

Sinä iltana Thandar kokosi heimon jäsenet ympärilleen kallion

juurelle. He istuivat komean nuotion ympärillä, sillä aikaa kun
Thandar, heidän kuninkaansa, pienimpiä yksityiskohtia myöten
selosti heille tulevaisuutta, jonka hän oli heitä varten suunnitellut.

Jotkut vanhukset ravistelivat päätään, sillä tämä oli

ennenkuulumatonta ja poikkesi heidän totutusta
elämänjärjestyksestään, eivätkä he hevillä mielineet alistua
muutokseen, siitä ehkä koituvista eduista huolimatta.

Mutta suurin osa kansaa riemastui kuullessansa esityksen

mukavista ja pysyvistä asumuksista, vaikka Thandar arvelikin heidän
etukäteen iloitsevan lapsellisen kiihkoisina ajatellessaan saavansa
jotakin uutta ja entisestä poikkeavaa. Oli kokonaan toinen kysymys,
kestäisikö heidän innostuksensa, kun he joutuisivat tekemään
lisätyötä, jota uusi elämä varmasti vaatisi.

Niinpä Thandar laati uudet lait, joiden oli siitä alkaen oltava hänen
kansansa ohjenuorana. Miesten oli valmistettava kaikki tarve-esineet
ja aseet, sillä hän oli jo opettanut heidät käyttämään jousta ja nuolia
sekä keihästä. Naisten oli pidettävä kaikki teräaseet terävinä.
Miesten oli kaadettava tukit ja rakennettava talot — naisten
valmistettava vaatteukset, keitettävä ja paistettava ruoka sekä
pidettävä talot järjestyksessä.

Miesten oli muokattava maa, naisten kylvettävä siemenet ja

hoidettava kasvava vilja, joka sitten myöhemmin oli kaikkien
korjattava yhdessä.

Metsästäminen ja taisteleminen olivat miesten velvollisuus, mutta

taisteleminen oli rajoitettava heimon vihollisiin. Mies, joka tappoi
jonkun muun heimonsa jäsenen muutoin kuin puolustaessaan
kotiansa tai itseänsä, oli surmattava.

Hän laati muitakin lakeja — hyviä lakeja — joita nämäkin

kehittymättömät ihmiset pitivät hyvinä. Vasta hyvin myöhällä ryömi
viimeinen heistä epämukavaan luolaansa, uneksimaan ilmavista,
metsän puista rakennetuista huoneista, hyvästä ravinnosta, jota riitti
yllin kyllin yhtä hyvin ennen sadeaikaa kuin sen jälkeenkin,
turvallisuudesta »ilkeiden miesten» säännöllisesti toistuvien
hyökkäysten varalta.

Thandar ja Nadara poistuivat viimeiseksi. Istuen kapealla

kielekkeellä Nadaran luolan edustalla kuutamon valaistessa heidän
alastomia, välkkyviä olkapäitään he yhdessä keskustelivat ja
haaveilivat tulevaisuudesta.

Thandar oli puhunut ihmeellisistä suunnitelmistaan, jotka näyttivät

vallanneen koko hänen mielensä — heimon tulevaisuudesta —
pitkästä askeleesta sivistysoloja kohti, jonka heimon jäsenet
astuisivat muutamissa lyhyissä hetkissä, jos he vain noudattaisivat
hänen mielessään väikkyviä yksinkertaisia suunnitelmia.

»Niin», sanoi hän, »kymmenessä vuodessa he olisivat taivaltaneet

matkan, joka meidän esivanhemmiltamme on varmasti vaatinut
pitkiä ajanjaksoja».

»Ja suunnitelmasi tähtäävät kymmenen vuotta eteenpäin,

Thandar», huomautti tyttö, »vaikka vasta eilen mainitsit, että meren
rannalle päästyämme toivoit meidän ennen pitkää näkevän
ohitsemme purjehtivan aluksen, joka veisi meidät sinun
sivistysmaailmaasi. Täytyykö meidän odottaa kymmenen vuotta,
Thandar?»

»Suunnittelen heimoa varten», vastasi mies. »Kenties emme me

ole täällä näkemässä muutosta; mutta tahtoisin saattaa heimon
jäsenet taipaleelle ja lähtiessämme pidän kyllä huolta siitä, että
valitaan kuningas, jolla on rohkeutta ja tahtoa toteuttaa
suunnitelmani.
 — Mutta», lisäsi hän aatoksissaan, »olisi mainiota, jos voisimme
palata täydentämään työmme. En koskaan, Nadara, ole suorittanut
ainoatakaan rakentavaa tekoa lähimmäisteni hyväksi, mutta nyt
minulla on tilaisuus tehdä jotakin, niin vähäiseltä kuin se näyttääkin,
tämän — mitäs se oli?»

Lännestä päin kuului matalaa, uhkaavaa jyminää. Se kuulosti

syvältä ja pahaenteiseltä, mutta oli niin hiljainen, ettei se herättänyt
ainoatakaan heimon nukkuvaa jäsentä.

Ennenkuin kumpikaan ennätti virkkaa mitään, vavahteli maa hiljaa

heidän allaan, niin hiljaa, että sitä tuskin olisi huomannut, jollei sitä
ennen olisi maan uumenista kuulunut kaukaista jymyä.

Kuutamoisella kallionulkonemalla istuva pari hypähti pystyyn, ja

Nadara painautui likelle Thandaria, joka suojelevasti kiersi kätensä
hänen hartioittensa ympärille.

»Suuri Nagoola», kuiskasi tyttö. »Taaskin se yrittää vapautua.»

»Mitä tarkoitat?» tiedusti Thandar. »Se on maanjäristys —

kaukainen ja ihan vaaraton meille.»

»Ei; se on suuri Nagoola», intti Nadara. »Kauan sitten, kun

isäimme isät eivät vielä olleet syntyneet, kuljeskeli suuri Nagoola
maan päällä, ahmien kaikki, jotka osuivat sen tielle — ihmiset,
eläimet, linnut, kaikki.

— Eräänä päivänä tapasi kansamme sen nukkumassa syvässä

rotkossa kahden vuoren välissä. Siihen aikaan olivat miehet väkeviä,
ja kun he näkivät suuren vainolaisensa nukkuvan rotkossa, meni
heistä toinen puoli toiselle ja toinen toiselle puolelle, ja he työnsivät
molemmat vuoret rotkossa nukkuvan pedon päälle, vangiten sen
sinne.

— Se on varmasti totta, sillä äitini oli kuullut sen äidiltänsä, joka

taas oli kuullut sen omalta äidiltään — siten oli sitä
totuudenmukaisesti kerrottu polvesta polveen siitä alkaen, kun se
kauan sitten tapahtui.

- Ja vielä tähän päivään saakka on kuultu silloin tällöin suuren

Nagoolan murisevan raivoissaan, ja maa tärähtelee ja vapisee, kun
se koettaa syvällä, hyvin syvällä maan alla pudistaa vuoria päältänsä
ja riistäytyä vapaaksi. Etkö sinä kuullut sen ääntä ja tuntenut kallion
huojuvan?»

Thandar naurahti.

»No niin, sitten meillä ei ole hätääkään», huudahti hän, »sillä kun
sen päällä on kaksi vuorta yhdessä röykkiössä, ei se pääse
karkaamaan».

»Kenpä tietää?» tuumi Nadara. »Se on iso, yhtä iso kuin pieni
vuori. Jonakin päivänä väitetään sen reutoutuvan irti, ja sitten ei
mikään pysty vaimentamaan sen vimmaa, ennenkuin se on tuhonnut
kaikki elävät olennot maan päältä.»

»Älä ole siitä huolissasi, pikku tyttöni!» lohdutti Thandar. »Suuren

Nagoolan on muristava äänekkäämmin ja rimpuiltava rajummin,
ennenkuin se saa sysätyksi vuoret niskoiltaan. Nytkin se on jälleen
hiljaa. Juokse senvuoksi luolaasi, armas, äläkä vaivaa somaa päätäsi
tarpeettomilla huolilla! On aika kaikkien kunnon ihmisten nukkua.»
Hän kumartui suutelemaan poistuvaa tyttöä.