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Proteomic Profiling Methods and Protocols 1st Edition
Anton Posch (Eds.) Digital Instant Download
Author(s): Anton Posch (eds.)
ISBN(s): 9781493925490, 1493925490
Edition: 1
File Details: PDF, 14.73 MB
Year: 2015
Language: english
Methods in
Molecular Biology 1295

Anton Posch Editor

Proteomic
Profiling
Methods and Protocols
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY

Series Editor
John M. Walker
School of Life and Medical Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, AL10 9AB, UK

For further volumes:

http://www.springer.com/series/7651
Proteomic Profiling
Methods and Protocols

Edited by

Anton Posch
Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany
Editor
Anton Posch
Bio-Rad Laboratories GmbH
Munich, Germany

ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-4939-2549-0 ISBN 978-1-4939-2550-6 (eBook)
DOI 10.1007/978-1-4939-2550-6

Library of Congress Control Number: 2015933382

Springer New York Heidelberg Dordrecht London

© Springer Science+Business Media New York 2015
This work is subject to copyright. All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of the material is
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on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation,
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The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not
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regulations and therefore free for general use.
The publisher, the authors and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to
be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty,
express or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been made.

Printed on acid-free paper

Humana Press is a brand of Springer

Springer Science+Business Media LLC New York is part of Springer Science+Business Media (www.springer.com)
Preface

Sample Preparation Methods and Protein Techniques for Proteomic Profiling

This volume is a comprehensive continuation and extension of a book called “2D PAGE:
Sample Preparation and Fractionation” which was published in 2008.
This book presents the latest developments of the main pillars of protein analysis,
namely sample preparation, separation, and characterization. Individual technologies of
each pillar combined into complementary and robust workflows render proteomic analysis
of complex biological samples even more powerful and are the prerequisite to gain maximum
value from biological samples in a single experiment.
In this volume, basic but important sample preparation protocols are described again,
followed by sophisticated procedures to enrich for specific protein classes and completed by
the detailed description of integrated workflows for comprehensive protein analysis and
characterization. The authors of the individual chapters are well-known protein biochem-
ists, and all of them have set value to provide a detailed representation of their lab work and
to share important tips and tricks for a successful and reproducible employment of their
precious protocols in other laboratories.
This book is for students of Biochemistry, Biomedicine, Biology, and Genomics and
will be an invaluable source for the experienced, practicing scientist, too.

Munich, Germany Anton Posch

v
Contents

Preface. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Contributors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi

1 Mechanical/Physical Methods of Cell Distribution

and Tissue Homogenization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Stanley Goldberg
2 Sample Preservation Through Heat Stabilization of Proteins:
Principles and Examples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Mats Borén
3 Isolating Peripheral Lymphocytes by Density Gradient Centrifugation
and Magnetic Cell Sorting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Frederic Brosseron, Katrin Marcus, and Caroline May
4 Investigating the Adipose Tissue Secretome: A Protocol
to Generate High-Quality Samples Appropriate for Comprehensive
Proteomic Profiling. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
Simon Göddeke, Jorg Kotzka, and Stefan Lehr
5 Methods for Proteomics-Based Analysis of the Human Muscle Secretome
Using an In Vitro Exercise Model . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Mika Scheler, Martin Hrabě de Angelis, Hadi Al-Hasani,
Hans-Ulrich Häring, Cora Weigert, and Stefan Lehr
6 Urinary Pellet Sample Preparation for Shotgun Proteomic Analysis
of Microbial Infection and Host–Pathogen Interactions . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
Yanbao Yu and Rembert Pieper
7 A Protocol for the Parallel Isolation of Intact Mitochondria
from Rat Liver, Kidney, Heart, and Brain . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
Sabine Schulz, Josef Lichtmannegger, Sabine Schmitt, Christin Leitzinger,
Carola Eberhagen, Claudia Einer, Julian Kerth, Michaela Aichler,
and Hans Zischka
8 Isolation of Mitochondria from Cultured Cells and Liver Tissue
Biopsies for Molecular and Biochemical Analyses. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
Sabine Schmitt, Carola Eberhagen, Susanne Weber, Michaela Aichler,
and Hans Zischka
9 Dynamic Range Compression with ProteoMiner™:
Principles and Examples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
Lei Li
10 Qualitative and Quantitative Proteomic Analysis of Formalin-Fixed
Paraffin-Embedded (FFPE) Tissue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
Omid Azimzadeh, Michael J. Atkinson, and Soile Tapio

vii
viii Contents

11 Full-Length Protein Extraction Protocols and Gel-Based Downstream

Applications in Formalin-Fixed Tissue Proteomics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
Alessandro Tanca, Sergio Uzzau, and Maria Filippa Addis
12 Enrichment of Low-Abundant Protein Targets by Immunoprecipitation
Upstream of Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
Barbara Kaboord, Suzanne Smith, Bhavin Patel, and Scott Meier
13 Principles of Protein Labeling Techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153
Christian Obermaier, Anja Griebel, and Reiner Westermeier
14 Isolation of Extracellular Vesicles for Proteomic Profiling . . . . . . . . . . . . . . . . 167
Dong-Sic Choi and Yong Song Gho
15 A Protocol for Exosome Isolation and Characterization: Evaluation
of Ultracentrifugation, Density-Gradient Separation, and Immunoaffinity
Capture Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
David W. Greening, Rong Xu, Hong Ji, Bow J. Tauro,
and Richard J. Simpson
16 Chloroplast Isolation and Affinity Chromatography for Enrichment
of Low-Abundant Proteins in Complex Proteomes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211
Roman G. Bayer, Simon Stael, and Markus Teige
17 Depletion of RuBisCO Protein Using the Protamine Sulfate
Precipitation Method . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
Ravi Gupta and Sun Tae Kim
18 Step-by-Step Preparation of Proteins for Mass Spectrometric Analysis . . . . . . . 235
Thomas Franz and Xinping Li
19 Identification of Protein N-Termini Using TMPP or Dimethyl Labeling
and Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249
Jingjing Deng, Guoan Zhang, Fang-Ke Huang, and Thomas A. Neubert
20 Optimization of Cell Lysis and Protein Digestion Protocols
for Protein Analysis by LC-MS/MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 259
Dominic Winter, Alireza Dehghani, and Hanno Steen
21 Comprehensive Protocol to Simultaneously Study Protein
Phosphorylation, Acetylation, and N-Linked Sialylated Glycosylation . . . . . . . 275
Marcella Nunes Melo-Braga, María Ibáñez-Vea, Martin Røssel Larsen,
and Katarzyna Kulej
22 Protein Profiling and Phosphoprotein Analysis by Isoelectric Focusing . . . . . . 293
Giuseppina Maccarrone and Michaela D. Filiou
23 Principles and Examples of Gel-Based Approaches
for Phosphoprotein Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305
Birgit Steinberger and Corina Mayrhofer
24 Neutral Phosphate-Affinity SDS-PAGE System for Profiling
of Protein Phosphorylation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
Emiko Kinoshita-Kikuta, Eiji Kinoshita, and Tohru Koike
25 Enrichment and Identification of Bacterial Glycopeptides
by Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355
Nichollas E. Scott and Stuart J. Cordwell
 Contents ix

26 In-Gel Peptide IEF Sample Preparation for LC/MS Analysis. . . . . . . . . . . . . . 369

Tom Berkelman, Sricharan Bandhakavi, and Aran Paulus
27 Western Blotting Using In-Gel Protein Labeling as a Normalization
Control: Stain-Free Technology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 381
Jennifer E. Gilda and Aldrin V. Gomes
28 2-D Western Blotting for Evaluation of Antibodies Developed
for Detection of Host Cell Protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393
Tom Berkelman, Adriana Harbers, and Sricharan Bandhakavi
29 Free Flow Electrophoresis for Separation of Native Membrane
Protein Complexes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 415
Lutz Andreas Eichacker, Gerhard Weber, Ute Sukop-Köppel,
and Robert Wildgruber
30 Three-Dimensional Electrophoresis for Quantitative Profiling
of Complex Proteomes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 427
Sergio Mauro, Bertrand Colignon, Marc Dieu, Edouard Delaive,
and Martine Raes
31 A Bead-Based Multiplex Sandwich Immunoassay to Assess
the Abundance and Posttranslational Modification State of β-Catenin . . . . . . . 441
Nicola Groll, Cornelia Sommersdorf, Thomas O. Joos, and Oliver Poetz
32 Identification of SUMO E3 Ligase-Specific Substrates Using the HuProt
Human Proteome Microarray . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 455
Eric Cox, Ijeoma Uzoma, Catherine Guzzo, Jun Seop Jeong,
Michael Matunis, Seth Blackshaw, and Heng Zhu
33 Amyloid-Binding Proteins: Affinity-Based Separation,
Proteomic Identification, and Optical Biosensor Validation . . . . . . . . . . . . . . . 465
Alexei Medvedev, Olga Buneeva, Arthur Kopylov, Oksana Gnedenko,
Alexis Ivanov, Victor Zgoda, and Alexander A. Makarov
34 Proteomic Profiling by Nanomaterials-Based Matrix-Assisted
Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry for High-Resolution
Data and Novel Protein Information Directly from Biological Samples . . . . . . 479
Suresh Kumar Kailasa and Hui-Fen Wu

Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 497
Contributors

MARIA FILIPPA ADDIS • Porto Conte Ricerche, Tramariglio, Alghero(SS), Italy

MICHAELA AICHLER • Research Unit Analytical Pathology–Institute of Pathology,
Helmholtz Center Munich, German Research Center for Environmental Health,
Neuherberg, Germany
HADI AL-HASANI • Institute of Clinical Biochemistry and Pathobiochemistry,
German Diabetes Center, Duesseldorf, Germany; German Center for Diabetes
Research (DZD), Duesseldorf, Germany
MARTIN HRABĚ DE ANGELIS • Institute of Experimental Genetics, Helmholtz Zentrum
München, German Research Center for Environmental Health, Neuherberg, Germany;
Center of Life and Food Sciences Weihenstephan, Technische Universität München,
Freising-Weihenstephan, Germany; German Center for Diabetes
Research (DZD), Duesseldorf, Germany
MICHAEL J. ATKINSON • Institute of Radiation Biology, Helmholtz Zentrum München,
German Research Center for Environmental Health, Neuherberg, Germany; Technical
University of Munich, Munich, Germany
OMID AZIMZADEH • Institute of Radiation Biology, Helmholtz Zentrum München,
German Research Center for Environmental Health, Neuherberg, Germany
SRICHARAN BANDHAKAVI • diaDexus, South San Francisco, CA, USA
ROMAN G. BAYER • Department of Ecogenomics and Systems Biology, University of Vienna,
Vienna, Austria
TOM BERKELMAN • Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA
SETH BLACKSHAW • Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins
University School of Medicine, Baltimore, MD, USA; Institute for Cell Engineering,
Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA; Department
of Ophthalmology, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA;
Center for High-Throughput Biology, Johns Hopkins University School of Medicine,
Baltimore, MD, USA
MATS BORÉN • Denator AB, Gothenburg, Sweden
FREDERIC BROSSERON • Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen (DZNE) e.V.,
Bonn, Germany
OLGA BUNEEVA • Institute of Biomedical Chemistry, Moscow, Russia
DONG-SIC CHOI • Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology,
Pohang, Republic of Korea
BERTRAND COLIGNON • Département Sciences du Vivant, Centre wallon de Recherches
agronomiques, Gembloux, Belgium; URBC-NARILIS, Université de Namur,
Namur, Belgium
STUART J. CORDWELL • School of Molecular Bioscience, The University of Sidney, Sidney,
Australia; Discipline of Pathology, School of Medical Sciences, The University of Sidney,
Sidney, Australia; Charles Perkins Centre, The University of Sidney, Sidney, Australia

xi
xii Contributors

ERIC COX • Biochemistry, Cellular and Molecular Biology Graduate Program, Johns
Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA; Solomon H. Snyder
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore,
MD, USA; Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins
University School of Medicine, Baltimore, MD, USA
ALIREZA DEHGHANI • Institute for Biochemistry and Molecular Biology, University of Bonn,
Bonn, Germany
EDOUARD DELAIVE • URBC-NARILIS, Université de Namur, Namur, Belgium
JINGJING DENG • Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Kimmel
Center for Biology and Medicine at the Skirball Institute, New York University School
of Medicine, New York, NY, USA
MARC DIEU • URBC-NARILIS, Université de Namur, Namur, Belgium
CAROLA EBERHAGEN • Institute of Molecular Toxicology and Pharmacology, Helmholtz Center
Munich, German Research Center for Environmental Health, Neuherberg, Germany
LUTZ ANDREAS EICHACKER • Center of Organelle Research, University of Stavanger,
Stavanger, Norway
CLAUDIA EINER • Institute of Molecular Toxicology and Pharmacology, Helmholtz Center
Munich, German Research Center for Environmental Health, Neuherberg, Germany
MICHAELA D. FILIOU • Max Planck Institute of Psychiatry, Munich, Germany
THOMAS FRANZ • Max Planck Institute for Biology of Ageing, Cologne, Germany
YONG SONG GHO • Department of Life Sciences, Pohang University of Science
and Technology, Pohang, Republic of Korea
JENNIFER E. GILDA • Department of Neurobiology, Physiology, and Behavior, University
of California, Davis, CA, USA
OKSANA GNEDENKO • Institute of Biomedical Chemistry, Moscow, Russia
SIMON GÖDDEKE • Institute of Clinical Biochemistry and Pathobiochemistry, German Diabetes
Center, Leibniz Center for Diabetes Research at Heinrich Heine University, Duesseldorf,
Germany; German Center for Diabetes Research (DZD), Duesseldorf, Germany
STANLEY GOLDBERG • Glen Mills Inc., Clifton, NJ, USA
ALDRIN V. GOMES • Department of Neurobiology, Physiology, and Behavior, University
of California, Davis, CA, USA; Department of Physiology and Membrane Biology,
University of California, Davis, CA, USA
DAVID W. GREENING • Department of Biochemistry, La Trobe Institute for Molecular
Science, La Trobe University, Melbourne, Australia
ANJA GRIEBEL • SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany
NICOLA GROLL • Department of Protein Analytics, NMI Natural and Medical Sciences
Institute at the University of Tuebingen, Reutlingen, Germany
RAVI GUPTA • Department of Plant Bioscience, Pusan National University, Miryang,
Republic of Korea
CATHERINE GUZZO • Department of Biochemistry and Molecular Biology, Bloomberg School
of Public Health, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA
ADRIANA HARBERS • Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA
HANS-ULRICH HÄRING • Division of Endocrinology, Diabetology, Angiology, Nephrology,
Pathobiochemistry and Clinical Chemistry, Department of Internal Medicine, University
of Tübingen, Tübingen, Germany; Institute for Diabetes Research and Metabolic Diseases
of the Helmholtz Zentrum München at the University of Tübingen, Tübingen, Germany;
German Center for Diabetes Research (DZD), Duesseldorf, Germany
 Contributors xiii

FANG-KE HUANG • Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Kimmel

Center for Biology and Medicine at the Skirball Institute, New York University School
of Medicine, New York, NY, USA
MARÍA IBÁÑEZ-VEA • Department of Biochemistry and Molecular Biology, University
of Southern Denmark, Odense, Denmark
ALEXIS IVANOV • Institute of Biomedical Chemistry, Moscow, Russia
JUN SEOP JEONG • Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins
University School of Medicine, Baltimore, MD, USA
HONG JI • Department of Biochemistry, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe
University, Melbourne, Australia
THOMAS O. JOOS • Department of Protein Analytics, NMI Natural and Medical Sciences
Institute at the University of Tuebingen, Reutlingen, Germany
BARBARA KABOORD • Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA
SURESH K. KAILASA • Department of Applied Chemistry, S. V. National Institute
of Technology, Surat, India
JULIAN KERTH • Institute of Molecular Toxicology and Pharmacology, Helmholtz Center
Munich, German Research Center for Environmental Health, Neuherberg, Germany
SUN TAE KIM • Department of Plant Bioscience, Pusan National University, Miryang,
Republic of Korea
EIJI KINOSHITA • Department of Functional Molecular Science, Graduate School
of Biomedical Sciences, Hiroshima University, Hiroshima, Japan
EMIKO KINOSHITA-KIKUTA • Department of Functional Molecular Science, Institute
of Biomedical and Health Sciences, Hiroshima University, Hiroshima, Japan
TOHRU KOIKE • Department of Functional Molecular Science, Institute of Biomedical
and Health Sciences, Hiroshima University, Hiroshima, Japan
ARTHUR KOPYLOV • Institute of Biomedical Chemistry, Moscow, Russia
JOERG KOTZKA • Institute of Clinical Biochemistry and Pathobiochemistry, German
Diabetes Center, Leibniz Center for Diabetes Research at Heinrich Heine University,
Duesseldorf, Germany; German Center for Diabetes Research (DZD), Duesseldorf,
Germany
KATARZYNA KULEJ • Department of Biochemistry and Molecular Biology, University
of Southern Denmark, Odense, Denmark
MARTIN RØSSEL LARSEN • Department of Biochemistry and Molecular Biology, University
of Southern Denmark, Odense, Denmark
STEFAN LEHR • German Center for Diabetes Research (DZD), Neuherberg, Germany;
Institute of Clinical Biochemistry and Pathobiochemistry, German Diabetes Center,
Duesseldorf, Germany
CHRISTIN LEITZINGER • Institute of Molecular Toxicology and Pharmacology, Helmholtz
Center Munich, German Research Center for Environmental Health, Neuherberg,
Germany
XINPING LI • Max Planck Institute for Biology of Ageing, Cologne, Germany
LEI LI • Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA
JOSEF LICHTMANNEGGER • Institute of Molecular Toxicology and Pharmacology, Helmholtz
Center Munich, German Research Center for Environmental Health, Neuherberg,
Germany
GIUSEPPINA MACCARRONE • Max Planck Institute of Psychiatry, Munich, Germany
ALEXANDER A. MAKAROV • Engelhardt Institute of Molecular Biology of Russian Academy of
Sciences, Moscow, Russia
xiv Contributors

KATRIN MARCUS • Medizinisches Proteom-Center, Ruhr-Universität Bochum, Bochum, Germany

MICHAEL MATUNIS • Department of Biochemistry and Molecular Biology, Bloomberg School
of Public Health, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA
SERGIO MAURO • Département Sciences du Vivant, Centre wallon de Recherches
agronomiques, Gembloux, Belgium
CAROLINE MAY • Medizinisches Proteom-Center, Ruhr-Universität Bochum, Bochum, Germany
CORINA MAYRHOFER • Institute of Animal Breeding and Genetics, University of Veterinary
Medicine, Vienna, Austria; Institute of Biotechnology in Animal Production,
Department for Agrobiotechnology, University of Natural Resources and Applied Life
Sciences Vienna, Tulln, Vienna, Austria
ALEXEI MEDVEDEV • Department of Proteomic Research and Mass Spectrometry,
Institute of Biomedical Chemistry, Moscow, Russia
SCOTT MEIER • Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA
MARCELLA N. MELO-BRAGA • Department of Biochemistry and Molecular Biology,
University of Southern Denmark, Odense, Denmark
THOMAS A. NEUBERT • Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Kimmel
Center for Biology and Medicine at the Skirball Institute, New York University School
of Medicine, New York, NY, USA
CHRISTIAN OBERMAIER • SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany
BHAVIN PATEL • Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA
ARAN PAULUS • Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA
REMBERT PIEPER • The J Craig Venter Institute, Rockville, MD, USA
OLIVER POETZ • Department of Protein Analytics, NMI Natural and Medical Sciences
Institute at the University of Tuebingen, Reutlingen, Germany
MARTINE RAES • URBC-NARILIS, Université de Namur, Namur, Belgium
MIKA SCHELER • Institute of Experimental Genetics, Helmholtz Zentrum München,
German Research Center for Environmental Health, Neuherberg, Germany;
German Center for Diabetes Research (DZD), Duesseldorf, Germany
SABINE SCHMITT • Institute of Molecular Toxicology and Pharmacology, Helmholtz Center
Munich, German Research Center for Environmental Health, Neuherberg, Germany
SABINE SCHULZ • Institute of Molecular Toxicology and Pharmacology, Helmholtz Center
Munich, German Research Center for Environmental Health, Neuherberg, Germany
NICHOLLAS E. SCOTT • School of Molecular Bioscience, The University of Sidney, Sidney,
Australia; Centre for High-Throughput Biology, Department of Biochemistry
and Molecular Biology, The University of British Columbia, Vancouver, Canada
RICHARD J. SIMPSON • Department of Biochemistry, La Trobe Institute for Molecular
Science, La Trobe University, Melbourne, Australia
SUZANNE SMITH • Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA
CORNELIA SOMMERSDORF • Department of Protein Analytics, NMI Natural and Medical
Sciences Institute at the University of Tuebingen, Reutlingen, Germany
SIMON STAEL • Department of Ecogenomics and Systems Biology, University of Vienna, Vienna,
Austria; VIB Department of Plant Systems Biology, Gent University, Gent, Belgium
HANNO STEEN • Department of Pathology, Boston Children’s Hospital and Harvard
Medical School, Boston, MA, USA
BIRGIT STEINBERGER • Institute of Animal Breeding and Genetics, University of Veterinary
Medicine, Vienna, Austria; Department for Agrobiotechnology, Institute of Biotechnology
 Contributors xv

in Animal Production, University of Natural Resources and Applied Life Sciences

Vienna, Tulln, Vienna, Austria
UTE SUKOP-KÖPPEL • FFE Service GmbH, Feldkirchen, Germany
ALESSANDRO TANCA • Porto Conte Ricerche, Tramariglio, Alghero (SS), Italy
SOILE TAPIO • Institute of Radiation Biology, Helmholtz Zentrum München,
German Research Center for Environmental Health, Neuherberg, Germany
BOW J. TAURO • Department of Biochemistry, La Trobe Institute for Molecular Science,
La Trobe University, Melbourne, Australia
MARKUS TEIGE • Department of Ecogenomics and Systems Biology, University of Vienna,
Vienna, Austria; Department of Applied Genetics and Cell Biology, University
of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, Austria
IJEOMA UZOMA • Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins
University School of Medicine, Baltimore, MD, USA
SERGIO UZZAU • Porto Conte Ricerche, Tramariglio, Alghero (SS), Italy
GERHARD WEBER • FFE Service GmbH, Feldkirchen, Germany
SUSANNE WEBER • Institute of Experimental Genetics, Helmholtz Center Munich,
German Research Center for Environmental Health, Neuherberg, Germany
CORA WEIGERT • Division of Endocrinology, Diabetology, Angiology, Nephrology,
Pathobiochemistry and Clinical Chemistry, Department of Internal Medicine,
University of Tübingen, Tübingen, Germany; Institute for Diabetes Research and
Metabolic Diseases of the Helmholtz Zentrum München at the University of Tübingen,
Tübingen, Germany; German Center for Diabetes Research (DZD), Duesseldorf,
Germany
REINER WESTERMEIER • SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany
ROBERT WILDGRUBER • FFE Service GmbH, Feldkirchen, Germany
DOMINIC WINTER • Institute for Biochemistry and Molecular Biology, University of Bonn,
Bonn, Germany; Department of Pathology, Boston Children’s Hospital and Harvard
Medical School, Boston, MA, USA
HUI-FEN WU • Department of Chemistry, Medical Sciences and Nanotechnology,
National Sun Yat-Sen University, Kaohsiung, Taiwan
RONG XU • Department of Biochemistry, La Trobe Institute for Molecular Science,
La Trobe University, Melbourne, Australia
YANBAO YU • The Craig Venter Institute, Rockville, MD, USA
VICTOR ZGODA • Institute of Biomedical Chemistry, Moscow, Russia
GUOAN ZHANG • Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Kimmel
Center for Biology and Medicine at the Skirball Institute, New York University School
of Medicine, New York, NY, USA
HENG ZHU • Department of Pharmacology and Molecular Sciences, Johns Hopkins
University School of Medicine, Baltimore, MD, USA; Center for High-Throughput
Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA
HANS ZISCHKA • Institute of Molecular Toxicology and Pharmacology, Helmholtz Center
Munich, German Research Center for Environmental Health, Neuherberg, Germany
 Chapter 1

Mechanical/Physical Methods of Cell Distribution

and Tissue Homogenization
Stanley Goldberg

Abstract
This chapter covers the various methods of Mechanical Cell Disruption and Tissue Homogenization that
are currently commercially available for processing minute samples (<1 mL) to larger production quantities.
These mechanical methods of lysing do not introduce chemicals or enzymes to the system. However,
the energies needed when using these “harsh” methods can be high and destroy the very proteins
being sought.
The destruction of cell membranes and walls by these “harsh” methods is effected by subjecting the
cells (1) to shearing by liquid flow, (2) to exploding by pressure differences between inside and outside of
cell, (3) to collision forces by impact of beads or paddles, or (4) a combination of these forces. Practical
suggestions to optimize each method, where to acquire such equipment, and links to reference sources
are included.

Key words Cell disruption, Bead mills, BioNeb cell disruption, Cell disruption vessel, Douce tissue
grinder, Dyno-Mill, French Press G-M, Gaulin high-pressure homogenizer, High-pressure homoge-
nizers, Megatron, Microfluidics, Mixer-Mill, Mortar, Pestle, Nitrogen Parr vessel, Opposed jet
homogenization, Parr nitrogen vessel, Polytron, Potter-Elvehjem tissue grinders, Pressure vessel,
Sonicator, Sonitube, Tissue grinders, Tissue homogenization, Ultrasonic processor, Electro Water
Separation

1 Introduction

The need to release cell components without introducing encumbering

chemicals or enzymes suggests the use of mechanical methods of
lysing. The destruction of cell membranes and walls by these
“harsh” methods is effected by subjecting the cells (1) to shearing
by liquid flow, (2) to exploding by pressure differences between
inside and outside of cell, (3) to collision forces by impact of beads
or paddles, or (4) a combination of these forces.
Generally speaking, any of the techniques described here can,
to some degree, disrupt any cells or tissues. For more difficult
materials, just the increase of motivation force or time of exposure
will improve breakage. However, the use of excessive force is

Anton Posch (ed.), Proteomic Profiling: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1295,
DOI 10.1007/978-1-4939-2550-6_1, © Springer Science+Business Media New York 2015

1
2 Stanley Goldberg

limited due to the generation of detrimental heat and/or shear

that can ruin the desired proteins. In addition, excess force will
accelerate wear and ultimately damage the equipment.
By judicious use of the equipment one can select from a gentle
nicking of the cell to release intact organelle up to a vigorous action
to release membrane bound proteins. Some methods are suitable
to handle tissues only, others for free cells only, and some are suitable
for both. Some techniques are capable of processing only small
quantities of material while others are limited to handling larger
amounts.
Tissues that are difficult to break down include heart muscle,
lung, intestine, and skin. On the other hand, some fragile mammalian
cells can be broken by just a moderate shaking of the suspended
cells. Free cells that are difficult to process include those that are
extremely small size (below 0.25 μm) bacteria, and the tough
yeasts and spores. Plant materials and seeds will need higher energy
inputs for proper maceration. Table 1 provides an overview of the

Table 1
Methods overview, trade names, websites

Technique Trade name(s) Websites

Bead Impact—shaking vessel Mixer Mill [1] www.RETSCH.de
Mini Bead Beater™ [2] www.BIOSPEC.com
Bead Impact—agitator shaft DYNO®-MILL [3] www.WAB.ch
www.GLENMILLS.com
Rotor/stator—shear Polytron® [4] www.KINEMATICA.ch
by spinning shaft
Mortar/pestle—shear by Potter-Elvehjem tissue www.WHEATON.com
mechanical pressure grinders [5]
High-pressure batch—liquid French Press G-M® [6] www.GLENMILLS.com
expansion
High-pressure batch—gas Parr® vessel [7] www.PARRINST.com
expansion
High-pressure flow—high APV® Gaulin [8] www.SPX.com
velocity liquid shear
High-pressure—opposed Microfluidizer® [9] www.MICROFLUIDICSCORP.com
liquid streams
Droplet—low pressure BioNeb® [10] www.GLASCOL.com
flow droplet nebulizing
Ultrasonic—shear by Sonicator® [11] www.SONICATOR.com
collapsing bubbles Sonitube® www.GLENMILLS.com
Electromotive force Electro Water www.ORIGINOIL.com
Separation™ [12]
 Mechanical/Physical Cell Disruption Methods 3

Table 2
Suitable subjects and capacity for each method

Yeast,
Algae,
Fungus,
Type of biomaterial to be lysed→ Bacteria Spores Seeds Plants Tissues Capacity
Technique ↓
Bead impact – shaking vessel Y Y Y Y Y S/M
Bead impact – agitator shaft Y Y ? Y Y M/L
Rotor/stator – shear by spinning shaft N N Y Y Y S/M/L
Mortar/pestle – shear Y Y Y Y Y S/M
by mechanical pressure
High-pressure batch – liquid expansion Y Y ? ? ? S/M
High-pressure batch – gas expansion Y N N Y Y S/M
High-pressure flow – high velocity shear Y Y N N N S/M/L
High-pressure flow – opposed Y Y N N N S/M/L
liquid streams
Droplet – low pressure droplet Y Y N N N S/M
nebulizing
Ultrasonic – shear collapsing bubbles Y Y N Y Y S/M/L
Electro water separation N Y N N N M/L
Suitability: Y—general good practice; N—not recommended; ?—not known or marginal success
Quantities: S = small 0.1–25 mL; M = medium 10–500 mL; L = 250 mL to many liters

mechanical methods with at least one example of commercial

equipment and related websites while Table 2 describes suitable
subjects and capacity for each method.

2 Bead Impact Methods: Shaking Vessel

2.1 Theory All bead devices open the cells or homogenize tissues by throwing
the beads (also called “grinding media”) against the cells/tissue.
Also the accelerated beads generate strong shear in the liquid buf-
fer surrounding the cells/tissues, which also pulls then apart. Two
methods to accelerate the grinding media (beads) are (1) by shak-
ing the entire container or (2) by a spinning agitator within a
container (see next section). The shaking container method is
usable for tissues as well as free cells. For extremely small samples
of 0.2 mL to somewhat larger quantities of 50 mL, the shaking of
the vessel is the method of choice. The motion can be of differing
geometries depending upon what equipment is selected. Shaking
can only be done in batch operation thus limiting the amount of
4 Stanley Goldberg

Fig. 1 Bead impact—shaken vessel—Mini Bead Beater-1 equipment

Fig. 2 Bead impact—shaken vessel—inside view—beads moving in jar

materials than can be processed. The equipment is very low cost,

durable, and simple to operate requiring minimal training.
Materials needed to operate any of these shaking include the
cells/tissue, grinding media (beads), liquid phase such as buffer,
the container, and the equipment. Variables include the bead
selection (density, diameter, and quantity), speed of agitation, cell
concentration, and duration of run (Figs. 1 and 2).

2.2 Practical ● Denaturing of proteins due to high temperature or excessive

Aspects shear is to be considered in all mechanical disruption/homog-
enization equipments. Also, the wear of the grinding media
and container into the samples needs to be evaluated.
● Hints for successful temperature control include: (1) Pre-
chilling of samples and containers; (2) Runs of short duration
 Mechanical/Physical Cell Disruption Methods 5

with rest time to allow for re-chilling samples on ice; (3) Use
of fewer beads and/or extra buffer to act a heat sink; (4)
Reduced degree of shaking vigor.
● Detrimental contamination of the batch due to the wear of
either the grinding media or container walls is usually rare due
to the insignificant amounts involved. A hint to mitigate any
contamination problem is to use inert materials of construc-
tion such as using beads and containers of zirconium oxide
stabilized with yttria (95 %/5 %; specific gravity 6.0).
● Beads size: For small diameter cells (e.g. bacteria) use beads of
0.10–0.5 mm diameter. For larger cells (e.g. yeast, algae,
hyphae) use beads of 0.5–1.25 mm. Glass (sp. gr. 2.5) is a
good starting material due to low cost. For homogenizing
plant or animal tissues that have been previously chopped with
a razor, beads of 1.0–5.0 mm diameter are used.
● Bead density: If additional energy is needed to improve break-
age/homogenization of tough cells, then use higher density
materials. These material types include ceramic (zirconium
oxide family) with specific gravities from 3.8 to 6.0, stainless
steel of sp. gr. 7.0+, and tungsten carbide of sp. gr. 14.2+.
Also, the use of larger diameter beads from 2 to 20 mm can
improve breakage. Recently, success has been reported with
SiC grit with its sharp edges, and with stainless steel ballcones
that have a wedged edge at the equator.
● Time savings can be achieved by ganging several samples into
96-well titer plates rather then running one sample at a time.
The larger models can accommodate these plates.
● A simple way to evaluate the suitability of bead shaking can be
done as follows. In a test tube place some glass beads and buff-
ered cells/tissues. Hold the tube against a vortex shaker for
1–3 min. If breakage/homogenization is realized, then bead
shaking has promise. Switching to suitable equipment as
described above will reduce repetitive strain to the technician
holding the test tubes.

3 Bead Impact Methods: Stirred Agitated Beads

3.1 Theory For modest sample quantities of 50 mL and scaling up to indus-

trial amounts of several thousand liters, the agitation of the beads
by a turning agitator within the vessel is the method of choice. In
this class of agitated bead mills, the beads and the cell suspension
are loaded into a chamber. Into the mix is placed one or more
spinning discs that accelerate the beads. The beads striking the
cells combined with the shearing by the moving liquid phase will
disrupt the cells.
6 Stanley Goldberg

Fig. 3 Bead impact—agitated beads—Dyno-Mill with 600 mL chamber

equipment

These units are normally used for disruption of free microor-

ganism cells (bacteria, yeasts, hyphae, mycelia) and not for tissue
samples. For lesser quantities, see previous section on shaking con-
tainer method. Materials needed to operate the agitated bead mills
include the cells/tissue, grinding media (beads), liquid phase such
as buffer, cooling ice or jacket fluids, and the mill equipment.
Variables include the bead selection (density, diameter, and quan-
tity), speed of agitation, cell concentration, and duration of run
(Figs. 3 and 4).

3.2 Practical ● Denaturing of proteins due to high temperature or excessive

Aspects shear is to be considered in all mechanical disruption/homog-
enization equipments. Also, the wear of the grinding media
and container into the samples needs to be evaluated.
● Hints for successful temperature control include: (1) Pre-chilling
of samples to below 5 °C. (2) Reduce residence time by
increased feed rates and then do a second pass with inter-stage
cooling. (3) Slower tip speed of Agitator discs to 6 m/s. (4)
Lower the concentration of cells if viscosity increases contribute
to excessive heating.
● Detrimental contamination of the batch due to the wear of
either the grinding media or container walls is usually rare due
to the insignificant amounts involved. A hint to mitigate any
contamination problem is to use inert materials of construc-
tion. For example, when iron would be harmful, do not use
steel beads, switch to glass or ceramics. The least wear is reportedly
seen when using ceramic beads and containers that are fabri-
cated from zirconium oxide stabilized with yttrium (95 %/5 %;
specific gravity 6.0).
 Mechanical/Physical Cell Disruption Methods 7

Fig. 4 Bead impact—agitated stirred beads—inside view—spinning agitators

moving beads against suspended cells. (1) Input, (2) Output, (3) Agitator discs, (4)
Beads, (5) Cooling jacket, (6) Bead screen

● For small diameter cells (e.g. E. coli of 0.25–1.0 μm) use beads
of 0.10–0.5 mm diameter. For larger cells (e.g. yeast, algae,
hyphae) use beads of 0.5–1.25 mm. Glass (sp. gr. 2.5) is a
good starting material due to low cost. If addition energy is
needed to improve breakage/homogenization, then switch to
ceramic (zirconium oxide family) with specific gravities from
3.8 to 6.0.
● A quick preliminary test can be run with standard lab equip-
ment. Load a beaker with the buffered cells/tissue along with
some beads. Place on a magnetic stirrer (or use an overhead
stirrer) and spin the beads. If some breakage is seen then the
bead mill is a good candidate for processing the cells in
question.

4 Rotor–Stator Homogenizer

4.1 Theory Rotor/Stator homogenizers consist of a rapidly spinning paddle

contained within an open-ended tube with slots near the working
end. The turning paddle pushes liquid out the slots, creating a low-
pressure region that draws fresh suspension up from the open end.
As the tissue is pulled up, there is a stretching action. Then, as the
8 Stanley Goldberg

Fig. 5 Rotor–stator—Shear by spinning shaft—Polytron equipment

material is forced between the narrow gaps, there is a cutting

action. The working part of the equipment that contacts the
samples is called the generator.
The Rotor/Stator design consists of two or more coaxial inter-
locking rows of teeth. The internal rotor(s) is driven with a motor
running at speeds between 3,000 rpm for the larger industrial units
to 27,000 rpm for the smaller lab units. The size of the motor is
chosen based on the size of the equipment and application. Rotor
tip speeds of up to 50 m/s can be achieved. Usually the gap
between rotor and stator is around 300–500 μm (Figs. 5 and 6).

4.2 Practical ● Choice of the rotor/stator geometry depending upon the

Aspects application. Some examples of specialized generators include
extended knives to cut into a larger tissue sample, low-foaming
generators, and easy-cleaning units that may be autoclaved.
● Next choose the correct size generator for the sample volume
to be homogenized. Factory tables provide the volume ranges
suitable for each generator thus selecting the correct parts is
quite easy. For example, a sample of size from 0.5 mL to 5 mL
 Mechanical/Physical Cell Disruption Methods 9

Fig. 6 Rotor–stator—shear by spinning shaft—inside view

would be best processed with a generator of 5 mm diameter.

As the quantity of material to be processed at one time
increases, larger sizes of generators and motors are needed.
● Interchangeable generators are designed to fit onto only cer-
tain motors. Therefore, one must decide which motor is the
most suitable for the particular range of applications and then
be sure to select only those generators designed to fit onto
that motor.
● The homogenizers currently available can process sample vol-
umes anywhere from less than 0.5 mL up to 150,000 L. Batch
equipment (e.g. Polytron®) is used for small sample quantities
from less than 0.5 mL though larger units can handle several
hundred liters. For larger industrial in-line system for either
continuous or re-circulation flow, there are single-, double-, or
even triple-stage rotor/stator configurations (Megatron®).

5 Mortar and Pestle Tissue Grinders: Shear by Mechanical Pressure

This class of simple devices disrupts cells and homogenizes tissues

by the pressure and friction generated when a moving pestle
pinches the samples against the wall of the mortar. Though usually
manual, there are electrically driven units available. The previous
equipment class of Rotor/Stator equipment is an alternative design
of this technique. Selection of proper mortar depends upon sam-
ples to be processed. Materials of construction are of glass, stainless
steel, Teflon, and plastics. Some units available include: Wheaton
Potter-Elvehjem Tissue Grinders 2 mL samples and larger.
One practical aspect to use these devices for bacteria is to freeze
the sample with liquid nitrogen.
10 Stanley Goldberg

6 High-Pressure Batch: Expanding Fluids

6.1 Theory There are two widely used cell disruption methods that employ
rapidly expanding fluids from within the cell to explode the cell
membranes. The French Press G-M® uses liquid under pressure,
and the Parr cell disruption vessel uses compressed gases. Since
these are bath operations, they are only suitable for small quantities
of less than about a liter.

6.1.1 The French The French Press G-M design consists of a stainless steel cylinder
Press G-M® (called Pressure Cell) fitted with an exit valve at one end and a
piston/plunger at the other end. Up to 35 mL of suspend-free
cells in buffer are loaded into the pressure cell. With the exit valve
closed the piston is pressed against the liquid by a hydraulic press,
called the French Press G-M. Once a suitable pressure (up to
40 kpsi) is achieved throughout the liquid and within the cell body,
then the outlet valve is opened to allow the cell suspension to drip
out at a slow rate of about 1 mL/min (9–20 drops/min). This
exposure to atmospheric pressure, being much lower than the
pressure that was forced within the microorganism’s body causes
the liquid to rush out, and thereby rupturing the cell membrane.
Normally, bacteria (at 40 kpsi) and yeast (at 20 kpsi) are handled in
the French Press G-M, not tissues, plants, nor seeds (Fig. 7).

6.1.2 The Parr Cell The Parr cell disruption vessel is a pressure vessel into which the
Disruption Vessel sample to be disrupted is placed along with a dip tube fitted with
an exit valve. Suitable gas such as nitrogen at 2 kpsi is forced into
the vessel and dissolved into the cells. When the exit valve is opened
the gas pressure is suddenly released causing the nitrogen to come
out of the solution within the cells as expanding bubbles. This
action stretches the membranes of each cell until they rupture and
releases the contents of the cell. Although sometimes referred to as
“explosive decompression,” nitrogen decompression is actually a
gentle method.
This method is suited for treating mammalian and other
membrane-bound cells, for treating plant cells, for releasing virus
from fertilized eggs, and for treating fragile bacteria. It is not rec-
ommended for untreated bacterial cells, unless using various
pretreatment procedures to weaken the cell wall. Yeast, fungus,
spores, and other materials with tough walls do not respond well
to this method (Figs. 8 and 9).

6.2 Practical ● Keeping the samples cold is achieved by pre-chilling of the

Aspects pressure cell. After the cells exit the valve, immediately cool by
keeping the collection beaker on ice. There are no provisions
6.2.1 French Press G-M®
to chill during the disruption process.
● Removal of air prior to closing the exit valve will minimize the
amount of oxygen degradation of the released proteins.
 Mechanical/Physical Cell Disruption Methods 11

Fig. 7 High-pressure batch—Liquid expansion French Press G-M and pressure

cells (35 mL and 3.7 mL) equipment

Fig. 8 High-pressure batch—gas expansion—Parr vessel equipment

12 Stanley Goldberg

Fig. 9 High-pressure batch—gas expansion—inside view

● During the paced release of materials, the pressure in the

Pressure Cell will drop. This needs to be balanced by periodi-
cally re-pressurizing the system by running the hydraulic press.

6.2.2 Parr Cell ● Individual cells such as lymphocytes, leukocytes, tissue culture
Disruption Vessel cells, or very fragile bacterial cells will not require pretreat-
ment. Tissues must usually be pre-minced to ensure that they
not plug the exit dip tube and discharge valve.
● The intended use of a homogenate generally determines the
composition of the suspending medium. Isotonic solutions are
commonly used. Solutions with higher concentrations will
tend to stabilize the nucleus and organelles. Conversely, very
dilute solutions will pre-stretch the cells by osmotic pressure
and will render them more susceptible to disruption by the
Vessel method.
● Very small quantities of calcium chloride, magnesium acetate,
or magnesium chloride added to the suspending medium will
stabilize the nuclei when differential rupture is desired. Ratios
of approximately 10 mL of suspending medium to 1 g of wet
cells are commonly used to prepare the cell suspension.
● Small sample quantities can be held inside of a smaller test tube or
beaker placed in the vessel. The inner container should be
approximately twice the volume of the suspension to be treated,
and the dip tube adjusted to reach the bottom of the container.
 Mechanical/Physical Cell Disruption Methods 13

● To cool a small inner vessel, it can be floated on ice water

within the vessel. The dip tube will hold it in place. Alternatively,
the entire external unit may be chilled.
● Degree of disruption can be controlled by the amount of gas
pressure introduced. The greater the pressure, the more
homogenization. The use of moderate pressures will reduce
the disruptive forces and thus leave nuclei, active mitochon-
dria, and other organelles intact.

7 High-Pressure Flow: Shear Through a Valve or Tube

7.1 Theory In high-pressure homogenizers, the liquid stream of suspended

cells is forced at high pressure down a narrow channel or across the
small gap of a valve. This accelerates its speed, thereby stretching
and shearing cells. In some designs, the moving stream is subse-
quently and abruptly impacted against an obstacle to further dam-
age the cells’ membrane. Two versions of impact are (1) where the
stream is directed to slam against an impingement wall (trade name
Gaulin®), and (2) where the stream is split into two legs of a “Y”,
and these lines are then directed at one another in an interaction
chamber where they collide, further disrupting the cells (trade
name Microfluidics®). These devices are used for suspended-free
cells, not for tissue samples.

7.1.1 High-Pressure The construction of the high-pressure homogenizer consists of a

Valve with Impingement positive displacement pump, a homogenizing valve, and sometimes
Wall: Gaulin an impingement wall or ring. Though pumps may consist of one,
two, three, or five plungers, most smaller laboratory homogenizers
and those for cell breakage have only one plunger.
Attached to the pump is a homogenizing valve assembly that
may consist of one or two stages. For cell disruption a single-stage
valve is needed, typically consisting of three parts: a seat (bottom
part), a valve (top part), and an impact (wear) wall or ring.
By adjusting the gap or clearance between the valve and seat,
the flow area in the homogenizing valve is controlled. When the
flow area is reduced, pressure within the pump discharge manifold
increases. When the flow area is increased, the pressure is reduced.
The high pressure generated by the pump is converted to fluid
velocity and heat as the fluid is discharged from the restricted area
in the homogenizing valve. For cell disruption, the microorgan-
isms are disrupted due to various mechanisms associated with the
fluid velocity. At 100 MPa, the fluid velocity can be as high as
450 m/s (Figs. 10 and 11).

7.1.2 High-Pressure These processors disrupt cells by applying a combination of shear

Flow Narrow Tubes and impact forces onto the cells. The media that contains the cells
or Opposed Jets: is forced through the narrow channels of the proprietary interac-
Microfluidics tion chamber of the processor. Inside these channels, with typical
14 Stanley Goldberg

Fig. 10 High-pressure flow—liquid shear—SPX equipment

Fig. 11 High-pressure flow—liquid shear—inside view

dimensions of 75–300 μm, the fluid achieves velocities up to

400 m/s. High pressures (up to 275 MPa) are required to gener-
ate the high velocities inside the interaction chamber. The result-
ing shear rates can be up to 10,000,000/s and are the highest
commercially available. An alternative configuration splits the
 Mechanical/Physical Cell Disruption Methods 15

Fig. 12 High-pressure flow-opposed liquid streams—Microfluidizer inside view

stream of pressurized cell suspension fluid into two legs. These are
then directed at one another in an interaction chamber where they
collide, disrupting the cells.
This equipment is suitable for a variety of free cells (bacteria,
yeasts, mammalian cells), but not seeds, tissue samples, nor plant
materials. The design of identical fluid channels in both laboratory-
scale and large-scale units allows for direct scale-up from the small-
est laboratory unit (14 mL batch) directly to large production
units (tens of L/min) (Fig. 12).

7.1.3 Practical Aspects ● To process a small sample size, first a liquid compatible with the
Using High-Pressure Valve continuous phase of the slurry is added to the feed hopper of
with Impingement Wall: the homogenizer. The machine is started and the pressure is set.
Gaulin When the liquid level reaches the very bottom of the feed hop-
per, the cell slurry can be added quickly. The cell slurry will
push the liquid ahead of it. When the slurry is observed in the
discharge, a sample can be taken. In this way, limited sample is
not lost while waiting for pressure to rise to operational levels.
● If the product is very sensitive to heat, then it may be necessary
to cool the equipment prior to introducing cell suspension and
to cool the suspension immediately after it discharges from the
homogenizer. A cooling coil is connected to the discharge
tube of the homogenizer and is immersed in an ice water bath.
Since the homogenizer is a positive displacement pump, there
must be no valves or restrictions in this discharge line that
could potentially shut off flow. Rapid chilling will minimize
16 Stanley Goldberg

losses due to the temperature rise of 2.5 °C per 10 MPa of

pressure generated during the nearly adiabatic heating during
pressurization.
● To improve breakage, higher pressures are used up to the
pump’s limits. High pressure can shorten valve life.

7.1.4 Practical Aspects: ● The material should be fully thawed before processing; ice may
High-Pressure Narrow plug the chambers.
Tubes/Opposed Jets ● Multiple passes decrease the particle artifacts’ size. Purification
methods to be used after cell disruption may determine the
desired particle size.
● Optimization with respect to process pressure and number of
passes may be needed to increase the yield and facilitate subse-
quent purification steps.
● Most models are autoclavable and air driven, though some are
electric-hydraulic systems. In many circumstances, especially when
samples are processed multiple times, the Microfluidizer® proces-
sors require sample cooling before and/or after processing.

8 Low Pressure: Shear by Droplet’s Impingement

Invented at Indiana University, the BioNeb® disruption system dis-

rupts cells by a low-pressure droplet method. In the process of
droplet formation, large molecules or cells suspended in the liquid
being nebulized are forcefully distributed from the liquid into the
forming secondary droplet. This creates a transient laminar flow in
the microcapillary “nebulization” channel formed between the
surface of the liquid and the forming secondary droplet. The lami-
nar flow in the capillary channel exerts sufficient shearing forces to
break cells. The shearing force created depends on the gas pressure
applied (10–250 psi), the type of gas (nitrogen, argon, etc.) and
the viscosity of the liquid. By varying these parameters, it is possi-
ble to precisely regulate the magnitude of the force applied during
nebulization (Fig. 13).

9 Ultrasonic Processors: Shear by Collapsing Bubbles

9.1 Theory The use of sound waves in fluids can disrupt cells. The operation
starts with normal electrical current (50 Hz or 60 Hz) being trans-
formed to 20,000 Hz. This electrical signal is fed to a piezo-electric
crystal causing it to oscillation at this high frequency. The vibra-
tions move a titanium metal HORN about 5–15 μm. The shape of
the horn amplifies this motion to 100–150 μm/cycle. By placing
the horn’s end—the tip—into fluid, the tip moves the liquid
 Mechanical/Physical Cell Disruption Methods 17

Fig. 13 Droplet low pressure nebulizer—BioNeb equipment

forward (away) and then retracts (back) quicker than the liquid can
return. During the return stroke, the pressure in the system drops
below the vapor pressure of the liquid so boiling occurs (“cavita-
tion”). As the liquid flows back, the bubbles collapse. This bubble
collapsing imparts the energy needed to disrupt the cells (Fig. 14).

9.2 Practical ● Denaturing of proteins due to high temperature or excessive

Aspects shear is often noted. The equipment has ON–OFF–ON cycle
adjustments available. During the OFF periods, the samples can
cool. Lowered amplitude settings may reduce protein damage.
● Hint to improve bubble formation is to keep the system as cold
as possible.
● Time savings can be achieved by ganging several samples into
96-well titer plates rather then running one sample at a time.
Multi models can accommodate these plates. Also, some mod-
els have several tips fitted on a single horn that can handle
several samples simultaneously.
● Larger quantities up to 100 L/h flow rates can be processed in
the Sonitube. Here the entire pipe for 15 in. (35 cm) oscillates
and ultrasonically processes all fluids pumped through.
18 Stanley Goldberg

Fig. 14 Ultrasonic—shear by collapsing bubbles—Sonicator equipment

10 Extraction Across an Electromotive Field

10.1 Theory Extracting non-polar lipids from microalgae are achieved using a
lipid extraction device having an anode and a cathode that forms a
channel and defines a fluid flow path through which an aqueous
slurry is passed. An electromotive force is applied across the chan-
nel at a gap distance in a range from 0.5 mm to 200 mm to cause
the non-polar lipids to be released from the algae cells (Fig. 15).

10.2 Practical ● The non-polar lipids can be extracted at a high-throughput

Applications rate and with low concentrations of polar lipids such as
phospholipids and chlorophyll.
● Used to concentrate algae and other microorganisms from
aqueous systems for harvesting and concentrating cell masses.
● Still experimental for cell lysing or product extracting.
● Clearing water streams.

Acknowledgements

Superb assistance was rendered by the following people who are

most conversant in their noted equipment areas. Bead Milling
by Tim Hopkins (Biospec Products) and Harald Frommherz
 Mechanical/Physical Cell Disruption Methods 19

Electro Water SeparationTM

The OriginOil Two-Stage Process

Electro-Flotation

Concentrate

Electrical Pulses

Contaminated Clear
Water Water

Electro-Coagulation
Electrical Pulses

Fig. 15 Electro Water Separation

(W. A. Bachofen AG); Rotor-Stator by Roger Munsinger

(Kinematica USA/AG); High pressure flowing liquid by Toni
Parker (SPX) and Steven Mesite (Microfluidics/IDEX); High
pressure batch liquid by Robert Borgon (University of Central
Florida); High pressure batch gas by Kay Frere and Lisa Randolph
(Parr Instruments); Low pressure flowing gas by James Jacso
(Glas-Col); and Ultrasonic processors by Andrea Coppola and
Marc Lusting (QSonica); Electro Water Separation by Devin
Angus and Jean-Louis Kindle (Origin Oil).
My book editor Dr. Anthon Posch has been exceptionally sup-
portive in both technical as well as motivational matters. My wife
Robin and sons Evan and Adam are the sparkle of my life.

References

1. Reinkemeier M, Rocken W, Leitzmann C 4. Lizotte E, Tremblay A, Allen BG, Fiset C

(1996) A rapid mechanical lysing procedure (2005) Isolation and characterization of sub-
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20 Stanley Goldberg

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 Chapter 2

Sample Preservation Through Heat Stabilization

of Proteins: Principles and Examples
Mats Borén

Abstract
Due to post-sampling changes, caused by residual enzyme activity in the sample, levels of analytes can
change from their in vivo levels so that they no longer accurately reflect conditions in the living system.
The Stabilizor™ system accomplishes elimination of enzyme activity through heat-induced denaturation of
enzymes by permanently altering the 3D protein structure of the enzymes. Heat stabilization can be intro-
duced in the workflow either directly after sampling, with the instrument just next to where the sample is
taken, or prior to sample homogenization and extraction, when samples are heat denatured directly from
a frozen state. Initially, heat stabilization was developed to enable mass spectrometric analysis of neuropep-
tides. Heat stabilization has since been further developed and applied to a range of samples and down-
stream protein analysis techniques such as western blot, 2D gels and phosphorylation analysis with LC-MS.

Key words Heat inactivation, Post-sampling change, Phosphorylation, Post-translational modification,

Brain, Neuropeptides

1 Introduction

Biosampling for subsequent analysis of molecular biomarkers is a

corner stone in modern medicine and biological research.
Measured levels of various analytes are the basis for diagnosis and
the overall understanding of biology. It is thus of uttermost
importance that measured levels accurately reflect actual in vivo
levels as close as possible. Due to post-sampling changes, caused
by residual enzyme activity in the sample, levels of analytes can
change from their in vivo levels so that they no longer accurately
reflect conditions in the living system. In the living organism, lev-
els of analytes are tightly controlled by cellular signaling and
homeostasis is maintained. When a sample is removed from its
natural environment, a dramatic signaling cascade is initiated. In the
case of a tissue biopsy the removal results in loss of blood flow, which
subsequently leads to low oxygen levels and a switch to anaerobic
metabolism. This results in low energy levels and a drop in sample pH.

Anton Posch (ed.), Proteomic Profiling: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1295,
DOI 10.1007/978-1-4939-2550-6_2, © Springer Science+Business Media New York 2015

21
22 Mats Borén

All these changes, low oxygen, low ATP and low energy are signals
which are sensed on a cellular and protein level and results in an
active response from the still living cells in the sample. This results
in changes in protein levels as well as post-translational modifica-
tions (PTMs). This is a very fast process which initiates within
seconds of sampling and leads to measurable changes [1]. In addition
to the initial response, primarily an active regulated response,
which takes place from the moment of sampling until stabilization,
by freezing or heat inactivation, there is a second response, mainly
reactive in nature, which occurs during sample preparation due
to residual enzyme activity in the homogenate [2]. During this
phase, enzymes released from their cellular confinement and con-
trols are free to interact with whatever substrates they encounter.
Both phases of enzyme driven change post-sampling must be
adequately addressed and minimized in order to successfully
measure in-vivo relevant levels of analytes.
The standard way of addressing the problem of enzymatically
driven post-sampling changes have been to add chemical inhibitors
and work fast while keep the samples cool during homogenization and
extraction. This is only partly successful as enzyme inhibitors are
selective and reduce enzyme activity rather than eliminate it [3].
A few years ago, an alternative approach, to preserving sample
quality in protein studies, was introduced, the Stabilizor system [3].
The Stabilizor system accomplishes elimination of enzyme activity
through heat-induced denaturation of enzymes by permanently
altering the 3D protein structure of the enzymes. In contrast to
chemical inhibitors, heat-induced enzyme denaturation is a general
principle affecting all protein-modifying enzymes, virtually reduc-
ing their activity to zero in the stabilized sample. Heat stabilization
can be introduced in the workflow either directly after sampling
with the instrument present just next to where the sample is taken
or just prior to sample homogenization and extraction when sam-
ples are heat denatured directly from a frozen state.
Heat stabilization has been applied to a range of samples and
downstream analysis techniques. It has proven itself as a valuable
tool in sample preparation for protein analysis. Initially, heat stabi-
lization was developed to enable mass spectrometric analysis of
neuropeptides. The applicability has since been expanded and it
has been advantageously applied to a diverse array of protein analysis
techniques including western blot with phospho-specific antibodies,
top-down 2D PAGE, bottom-up phospho-shot gun, and MALDI
imaging [4]. As the Stabilizor system induces protein denaturation
and loss of protein 3D structure it is not suitable for sample prepa-
ration prior to analysis of enzyme activity, multi-protein complexes
or formalin-fixed epitopes, e.g. immuno-histochemistry. Using
western blots, stabilization of protein phosphorylation levels has
been shown. Flash-frozen and heat-stabilized samples either frozen
directly or left at room temperature for 30 min were compared.
 Heat Stabilization of Proteins 23

In heat-stabilized samples detected levels of phospho-proteins were

more or less unaffected by 30 min at room temperature, while the
non-treated samples left at room temperature showed markedly
lower phosphorylation levels compared to directly flash-frozen or
heat-stabilized, see Fig. 1 [5]. In a different study, a direct com-
parative analysis of heat-stabilized versus flash-frozen samples was
done using top-down 2D PAGE analysis of proteins. In that study,
a majority of the low molecular spots differentially detected had
a higher intensity in the flash-frozen samples, whereas for the dif-
ferentially detected high molecular weight proteins a majority was
detected with higher levels in the stabilized samples. In many cases,
the low molecular weight proteins detected with higher intensity
in flash-frozen samples was identified as having a higher theoreti-
cal mass as compared to their gel position indicating protein
degradation by protein cleavage and degradation, see Fig. 2 [6].
In another application of the technology using Pro-Q Diamond
staining of phosphorylated proteins separated using 2D PAGE, clear

Fig. 1 Quantitation of phospho-proteins in hippocampal lysates shows that heat-stabilized levels remain
unchanged while frozen tissue levels are decreased with 30 min room temperature incubation. Signals from
replicate Western blots were normalized to actin. Histograms represent average values for each group of
samples relative to 100 % for frozen tissues at 0 min RT (white bars); black bars, stabilized tissues 0 min at
RT; grey bars, frozen tissues 30 min at RT; striped bars, stabilized tissues 30 min at RT. Errors bars are the
standard error of the mean. Statistical significance was determined by the unpaired Student’s t-test. *p < 0.05;
**p < 0.001; ***p < 0.0001. Reprinted from J. Neurosci. Methods, 196(1), 99–106. Ahmed, MM., and Gardiner,
KJ. Preserving protein profiles in tissue samples: differing outcomes with and without heat stabilization (2011),
with permission from Elsevier
24 Mats Borén

Fig. 2 2-DE analysis of differentially expressed proteins from stabilized or snap-frozen mouse cortex. Spots
with differential intensity between the two samples are highlighted in color: higher intensity spots in heat-
stabilized samples (green), higher intensity spots in snap-frozen samples (red and blue). Numbers refer to
protein spots that were subjected to MS analysis. Reprinted from Proteomics, 9(19), 4433–44. Robinson, AA.,
Westbrook, JA., English, JA., et al., Assessing the use of thermal treatment to preserve the intact proteomes of
post-mortem heart and brain tissue. (2009), with permission from Wiley

differences can be seen between the flash-frozen and the stabilized

sample indicating shifts between phosphorylation species of the
same proteins, see Fig. 3 [7]. Large-scale analysis of tyrosine phos-
phorylations using antibody enrichment and LC-MS/MS analysis
have been done to compare phosphorylation levels in heat-
stabilized and flash-frozen samples. A clear trend toward higher
phosphorylations levels in heat-stabilized samples and conse-
quently lower levels in flash-frozen samples was detected. This is
consistent with previous results showing a general decrease in most
phosphorylations post-sampling due to residual phosphatase activ-
ity both prior to freezing and during sample preparation, see Fig. 4.

2 Materials

2.1 The The Stabilizor system consists of the Stabilizor T1 instrument and
Stabilizor System Maintainor® sample cards used to hold the sample during treat-
ment and subsequent storage.
1. The Stabilizor T1 instrument is a bench-top instrument which
at its core holds a conductive heating unit. Besides ordinary
house hold electricity the instrument does not require other
inputs or special considerations.
 Heat Stabilization of Proteins 25

Fig. 3 Phosphorylation states of murine PPIA isoforms in (a) stabilized and (b) unstabilized homogenates and
ATP synthase subunit a in stabilized (c) and unstabilized (d) homogenates, indicate a shift in phosphorylation
levels between isoforms between stabilized (a & c) and unstabilized (b & d) samples. In the unstabilized
sample (d), progressive phosphorylation of ATP synthase subunit a (21) resulted in a 550 % increase in the
higher phosphorylation state (40). The sum of mean spot volumes (62, 66, 79) were nearly identical in stabi-
lized and unstabilized samples, respectively, as well as the sum of the mean volumes for spots 40, 53, and 21
were nearly identical in stabilized and unstabilized samples indicating that there were no preferential loss of
protein from either sample. Experimental pI values are provided on the abscissa. Reprinted from Electrophoresis,
32(16), 2206–2215, Smejkal, GB., Rivas-Morello, C., Chang, JH., et al., Thermal stabilization of tissues and the
preservation of protein phosphorylation states for two-dimensional gel electrophoresis (2011) with permission
from Wiley

2. The Maintainor Tissue sample card has a clam-shell design with

dual rigid plastic frames with thin Teflon-based plastic films.
The sample is enclosed between the plastic films and the card is
closed airtight prior to use in the Stabilizor instrument.

2.2 Solutes Heat denaturation of proteins cause permanent alteration of the

for Resolubilization 3D fold of proteins, which generally results in low solubility in
of Heat-Denatured water-based buffers. Efficient resolubilization of denatured pro-
Samples teins requires denaturing buffers. For proteomic analysis, the pre-
ferred buffers are either SDS- or urea-based (see Note 1).
1. SDS buffer for solubilization of denatured proteins: 1 % SDS.
Add 50 mL ddH2O to a 200 mL beaker. Weigh 1 g of SDS and
transfer to the beaker (see Note 2). Use a bit of water to rinse
weighing boat as SDS tends to stick. Mix until SDS dissolves
and transfer content to a 100 mL graduated cylinder. Fill cyl-
inder with more water to make 100 mL 1 % SDS solution.
Store at +4 °C.
2. Urea buffer for solubilization of denatured proteins: 8 M urea,
50 mM Tris–HCl, pH 7.5. Add 25 mL of 50 mM Tris–HCl,
26 Mats Borén

Fig. 4 Percent distribution of ratios of median intensity of 1,107 peptides with tyrosine phosphorylation
between snap-frozen (SF) and heat-stabilized (Stabilized) samples isolated from mice brain tissue. 34 % of
peptides are detected at intensities at least 50 % higher or only in stabilized samples whereas only 4 % are
detected at intensities at least 50 % higher or only in snap-frozen samples, indicating a preservation of phos-
phorylation levels in stabilized samples. Mice brains were collected in triplicates and either just snap-frozen
or heat-stabilized using the Stabilizor system prior to freezing. Proteins were extracted using a urea-based
extraction buffer with protease and phosphatase inhibitors and turned into peptides using trypsin. Peptides
with tyrosine phosphorylations were affinity-enriched using a tyrosine-specific antibody (Cell Signaling,
#9411). Peptide intensities were analyzed using LC-MS/MS

pH 7.5 to a 100 mL beaker. Weigh 24.1 g of urea and transfer

to the beaker. Mix until dissolved and transfer content to a
100 mL graduated cylinder (see Note 3). Fill cylinder with
more 50 mM Tris–HCl, pH 7.5 buffer to make 50 mL of 8 M
urea, 50 mM Tris–HCl, pH 7.5 solution. Prepare the urea
extraction buffer fresh.

3 Methods

Enzyme inactivation using heat-induced enzyme denaturation is a

preparative step prior to a large range of protein as well as small
molecule analysis techniques. Heat inactivation in the Stabilizor
T1 is performed using a number of predefined programs depend-
ing on the state of the sample, fresh or frozen, as well as the need
to preserve sample morphology. Once the sample has been heat-
stabilized, the use of correct extraction buffers and homogenization
is vital in order to resolubilize proteins and enable analysis. In this
section, the standard ways for using the Stabilizor T1 instrument
will be covered. Special considerations for homogenization and
resolubilization of heat-inactivated samples will be covered in
Subheading 3.3.
 Heat Stabilization of Proteins 27

3.1 Heat In order to minimize enzymatic driven change it is vital that the time
Stabilization of Fresh between sampling and stabilization is kept as short as possible.
Samples Directly When using the Stabilizor T1 instrument with fresh samples the
After Removal instrument should be next to the sample source and focus should
from the Source be on getting the samples heat-stabilized as fast and reproducible
as possible.
1. Prepare all material required during sample extraction, stabili-
zation, and subsequent storage.
2. Start the Stabilizor T1 instrument and select the Auto Fresh
method, if preservation of structural morphology is not needed,
or Fresh (Structural preserve) preservation of structural mor-
phology is needed (see Note 4).
3. Collect samples one at a time.
4. Start the post-mortem clock at the moment of death; if sam-
pling starts with sacrifice (see Note 5).
5. Preferentially sacrifice mice without the use of anesthesia,
which have been shown to affect phosphorylation levels [8]
(see Note 6).
6. Extract sample from source and place in on open Maintainor
Tissue card (see Note 7).
7. Position the Maintainor Tissue card in the sample sledge of the
Stabilizor T1 instrument and press the START button on the
touch screen.
8. When stabilization is complete, the Maintainor Tissue card
with sample is ejected from the instrument.
9. After stabilization, store samples frozen at −80 °C, either in the
card or transfer to storage device of your choice, or proceed
with homogenization and extraction (see Note 8).
10. After heat inactivation proceed with homogenization and
extraction as outlined in Subheading 3.3.

3.2 Heat Already frozen samples can also benefit from heat inactivation as
Stabilization some enzymes reactive during thawing and can induce change during
of Frozen Samples homogenization and after extraction. This can be useful in situations
where it is impossible or unpractical to have the instrument close to
the site of sampling and for already biobanked samples. When using
the Stabilizor T1 instrument with frozen samples it is important that
the samples are kept frozen until they enter the instruments and
brought directly from a frozen state to a denatured state.
1. Start the Stabilizor T1 instrument and select the Auto Frozen
method, if preservation of structural morphology is not
needed, or Frozen (Structural preserve) if preservation of struc-
tural morphology is needed (see Note 9).
2. Keep samples on dry ice or in −20 °C freezer making sure the
samples remain frozen (see Note 10).
28 Mats Borén

3. Place an open Maintainor Tissue card on dry ice or in −20 °C

freezer and let it equilibrate for a few minutes (see Note 7).
4. Using a chilled forceps transfer the frozen sample to the cold
card and close it.
5. Quickly position the Maintainor Tissue card in the sample sledge
of the Stabilizor T1 instrument (see Note 11). Make sure it is
closed and press the START button on the touch screen.
6. When stabilization is complete the Maintainor Tissue card
with sample is ejected from the instrument. After stabilization,
store samples frozen at −80 °C, either in the card or transfer to
storage device of your choice (see Note 8).
7. After heat inactivation proceed with homogenization and
extraction as outlined in Subheading 3.3.

3.3 Homogenization Proteins in heat-stabilized samples will be denatured and this

and Resolubilization requires some special considerations concerning homogenization
of Heat-Stabilized and resolubilization buffers. Heat-treated tissue is generally more
Samples brittle then non-heated tissue so homogenization is generally not
a problem but mechanical homogenization is needed for all tissues
except brain. The choice of extraction buffer is on the other hand
crucial and a strongly denaturing buffer is needed to resolubilize
the denatured proteins in the sample. Amount of buffer to sample
is also vital for good resolubilization.

3.3.1 Denaturing Due to the denatured state of proteins in heat-inactivated samples,

Extraction Buffer a denaturing buffer must be used to efficiently resolubilize proteins
from heat-stabilized samples. Depending on downstream analyti-
cal technique, buffers based on urea and/or SDS have been found
to work well. Buffers based on high, >8 M urea, are ideal for
extracting samples for 2D PAGE and chromatographic workflows
such as LC-MS. On the other hand, SDS, >1 % SDS, based buffers
are suitable for SDS-PAGE and western blot workflows. When
using SDS buffers, it is recommended to maximize their effective-
ness by heating the buffer (>90 °C) before adding it to the sample
and after homogenization as instructed below. Other components
such as detergents and buffering agents can be added as long as the
concentrations of the denaturing agents are not affected.

3.3.2 Buffer To ensure full dispersion of protein–protein complexes formed

to Sample Ratio during cooling after heat stabilization, it is important that suffi-
cient buffer is added to the sample.
1. Weigh samples to be extracted (see Note 12).
2. Calculate the amount of buffer needed to reach a buffer-to-
sample ratio greater than 10 (>10 μl buffer/mg sample).
3. Add buffer to sample and proceed directly with homogenization.
Exploring the Variety of Random
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 —Es el asno de su paternidad, pues su paternidad trae un asno
consigo cargado de nabos podridos.
—Que dejen en paz a ese pobre hombre, ¡por vida de!... —grité con
ira—, y que siga su camino.
Adelanteme y distinguí entre soldados, que de mil modos le
mortificaban, a un bendito cogulla, vestido con el hábito agustino, y
azorado y lloroso.
—¡Señor —decía mirando piadosamente al cielo y con las manos
cruzadas—, que esto sea en descargo de mis culpas!
Su hábito descolorido y lleno de agujeros cuadraba muy bien a la
miserable catadura de un flaquísimo y amarillo rostro, donde el polvo
con lágrimas o sudores amasado, formaba costras parduzcas. Lejos de
revelar aquella miserable persona la holgura y saciedad de los
conventos urbanos, los mejores criaderos de gente que se han
conocido, parecía anacoreta de los desiertos o mendigo de los campos
Cuando se vio menos hostigado, volvió a un lado y otro los ojos
buscando a su desgraciado compañero de infortunio, y como le viese
volver a escape y jadeando, oprimidos los ijares por el poderoso
Rocacha, se apresuró a acudir a su encuentro. En tanto yo miraba a
buen fraile, y cuando le vi volver, tirando ya del cordel de su asno
reconquistado, no pude reprimir una exclamación de sorpresa. Aquella
cara, que al pronto despertó vagos recuerdos en mi mente, reveló a
fin su enigma, y a pesar de la edad transcurrida y de lo injuriada que
estaba por años y penas, la reconocí como perteneciente a una
persona con quien tuve amistad en otro tiempo.
—Sr. Juan de Dios —exclamé deteniendo mi caballo a punto que e
fraile pasaba junto a mí—, ¿es usted o no el que veo dentro de esos
hábitos y detrás de esa capa de polvo?
El agustino me miró sobresaltado, y luego que por buen rato me
contemplara, díjome así con melifluo acento:
—¿De dónde me conoce el señor general? Juan de Dios soy, en
efecto. Doy gracias a su eminencia por haber mandado que me
devolvieran el burro.
—¿Eminencia me llama usted?... —repuse—. Todavía no me han
hecho cardenal.
 —En mi turbación no sé lo que me digo. Si su alteza me da licencia
me retiraré.
—Antes pruebe a ver si me conoce. ¿Mi cara ha variado tanto desde
aquel tiempo en que estábamos juntos en casa de D. Mauro Requejo?
Este nombre hizo estremecer al buen agustino, que fijó en mí sus
ojos calenturientos, y más bien espantado que sorprendido, dijo:
—¿Será posible que el que tengo delante sea Gabriel? ¡Jesús mío
Señor general, ¿es usted Gabriel, el que en abril de 1808...? Lo
recuerdo bien... Deme usted a besar sus pies... ¿Conque es Gabriel en
persona?
—El mismo soy. ¡Cuánto me alegro de que nos hayamos
encontrado! Usted hecho un frailito...
—Para servir a Dios y salvar mi alma. Hace tiempo que abracé esta
vida tan trabajosa para el cuerpo como saludable para el alma. ¿Y tú
Gabriel?... ¿Y usted, Sr. D. Gabriel, se dedicó a la milicia? También es
honrosa la vida de las armas, y Dios premia a los buenos soldados
algunos de los cuales santos han sido.
—A eso voy, padre, y usted parece que ya lo consiguió, porque su
pobreza no miente, y su cara de mortificación me dice que ayuna los
siete reviernes.
—Yo soy un humildísimo siervo de Dios —dijo bajando los ojos—, y
hago lo poco que está en mi miserable poder. Ahora, señor general
experimento mucho gozo en ver a usted... y en reconocer al generoso
mancebo que fue mi amigo; y con esto y su venia me retiro, pues este
ejército va sierra adentro, y yo busco el camino real.
—No permito que nos separemos tan pronto, amigo mío. Usted está
fatigado, y además no tiene cara de haber cumplido aquel precepto
que manda empiece la caridad por uno mismo. En ese pueblo
descansará el regimiento. Vamos a comer lo que haya, y usted me
acompañará para que hablemos un poco, refrescando viejas memorias
—Si el señor general me lo manda, obedeceré, porque mi destino es
obedecer —dijo marchando junto a mí en dirección al pueblo.
—Veo que el asno tiene mejor pelaje que su dueño, y no se
mortifica tanto con ayunos y vigilias. Le llevará a usted como una
pluma, porque parece una pieza de buena andadura.
 —Yo no monto nunca en él —me respondió sin alzar los ojos de
suelo—. Voy siempre a pie.
—Eso es demasiado.
—Llevo conmigo este bondadoso animal para que me ayude a
cargar las limosnas y los enfermos que recojo en los pueblos para
llevarlos al hospital.
—¿Al hospital?
—Sí, señor. Yo pertenezco a la Orden Hospitalaria que fundó en
Granada nuestro santo padre y patrono mío el gran San Juan de Dios
hace doscientos y setenta años poco más o menos. Seguimos en
nuestros estatutos la regla del gran San Agustín, y tenemos hospitales
en varios pueblos de España. Recogemos los mendigos de los caminos
visitamos las casas de los pobres para cuidar a los enfermos que no
quieren ir a la nuestra, y vivimos de limosnas.
—¡Admirable vida, hermano! —dije bajando del caballo y
encaminándome con otros oficiales y el bendito Juan a un bosquecillo
que a la vera del pueblo estaba, donde, a la grata sombra de algunos
corpulentos y frescos árboles, nos prepararon nuestros asistentes una
frugal comida.
—Ate usted su burro en el tronco de un árbol, y acomódese sobre
este césped junto a mí, para que demos al cuerpo alguna cosa, que
todo no ha de ser para el alma.
—Haré compañía al Sr. D. Gabriel —dijo Juan de Dios humildemente
luego que ató la cabalgadura—. Yo no como.
—¿Que no come? ¿Por ventura manda Dios que no se coma? ¿Y
cómo ha de estar dispuesto a servir al prójimo un cuerpo vacío?
Vamos, Sr. Juan de Dios, deje a un lado esa cortedad.
—Yo no como viandas aderezadas en cocina, ni nada caliente y
compuesto que tenga olor a gastronomía.
—¿Llama gastronomía a este carnero fiambre y seco, a este pan
más duro que roca?
—Yo no puedo probar eso —repuso sonriendo—. Me alimento tan
solo con yerbas del campo y raíces silvestres.
—Hombre, lo admiro; pero francamente... Al menos beberá usted
un trago. Es de Rueda.
—No bebo más que agua.
 —¡Hombre... agua y yerbecitas del campo! Lindo comistrajo es ese
En fin, si de tal modo se salva uno...
—Ya hace tiempo que hice voto firmísimo de vivir de esa manera, y
hasta hoy, D. Gabriel mío, aunque no limpio de pecados, tengo la
satisfacción de no haber cometido el de faltar a mi voto una sola vez.
—Pues no insisto, amigo. No se vaya usted a condenar por culpa
mía. La verdad es que tengo un hambre... Pobre Sr. Juan de Dios..
¡Quién había de decir que nos encontraríamos después de tantos
años...! ¿No es verdad?
—Sí, señor.
—Yo creí que usted había pasado a mejor vida. Como desapareció...
—Entré en la Orden en enero del año 9. Acabé mis primeros
ejercicios en marzo, y recibí las primeras órdenes el año último
Todavía no soy fraile profeso.
—¡Cuántas cosas han pasado desde que no nos vemos!
—¡Sí, señor, cuántas!
—Usted, retirado del mundo, vive de un modo beatífico sin penas n
alegrías, contento de su estado...
Juan de Dios exhaló un suspiro profundísimo, y después bajó los
ojos. Observándole bien, advertí las señales que en su extenuado
rostro patentizaban no ser jactancia de beato aquello de las
campestres yerbecitas y agua de los arroyos cristalinos. Bordeaba sus
ojos un cerco violáceo muy intenso, que hacía más vivo el brillo de sus
pupilas, y marcándosele los huesos de la cara bajo la estirada y
amarillenta piel. Su expresión era la de las almas exaltadas por una
piedad que igualmente hace sus efectos en el espíritu y en el sistema
nervioso. Misticismo y enfermedad al mismo tiempo, es una devoción
singular que ha llevado hermosísimas figuras al cielo de las grandezas
humanas. Si en un principio creí ver en Juan de Dios un poco de
artificio e hipocresía, muy luego convencime de lo contrario, y aque
santo varón, arrojado por las tempestades mundanas a la vida
contemplativa y austera, vivía inflamado por un fervor tan ardiente
como sincero. Se le veía quemarse; se observaba la combustión de
aquel cuerpo, que poco a poco se convertía en ceniza, calcinado por la
llama de la espiritual calentura; se veía que aquel hombre apenas a la
tierra tocaba, apenas al mundo de los vivos, y que la miserable arcilla
que aún mantenía el noble espíritu con endeble atadura, se iba
descomponiendo y desmenuzándose grano a grano.
—Es admirable, amigo mío —le dije—, que haya llegado a tan
lisonjero estado de santidad un hombre que no se vio libre ciertamente
de las pasiones mundanas.
La fisonomía de Fr. Juan de Dios contrájose con ligero temblor. Pero
serenándose al punto su rostro, me dijo:
—¿No sabe usted qué ha sido de aquellos benditos señores de
Requejo? Sentiría que les hubiese pasado alguna desgracia.
—No he vuelto a saber de ellos. Estarán cada vez más ricos, porque
los pícaros hacen fortuna.
El fraile no hizo gesto alguno de asentimiento.
—Pero Dios les habrá castigado al fin —continué— por los martirios
que hicieron padecer a aquella infeliz joven...
Al decir esto, advertí que en las venas de aquel miserable cuerpo
humano, que la tumba pedía para sí, quedaba todavía un resto de
sangre. Bajo la piel de la cara se traslucieron por un instante las
hinchadas venas azules, y un ligero tinte amoratado encendió la
austera frente. No me hubiera sorprendido más ver una imagen de
madera sonrojándose al contacto del beso de las devotas.
—Dios sabrá lo que tiene que hacer con los señores de Requejo po
esa conducta —me contestó.
—Creo que no le será indiferente a usted saber el fin que ha tenido
aquella desgraciada joven.
—¿Indiferente? No —repuso poniéndose como un cadáver.
—¡Oh! Las personas destinadas a padecer... —dije observando
atentamente la impresión que en el santo producían mis palabras—
Aquella pobre joven tan buena, tan bonita, tan modesta...
—¿Qué?
—Ha muerto.
Yo creí que Juan de Dios se conmovería al oír esto; pero con gran
sorpresa vi su rostro resplandeciente de serenidad y beatitud. M
asombro llegó a su colmo cuando, en tono de convicción profundísima
dijo:
—Ya lo sabía. Murió en el convento de Córdoba, donde la encerró su
familia en junio de 1808.
 —¿Y cómo sabe usted eso? —pregunté, respetando el engaño de
pobre agustino.
—Nosotros tenemos visiones singulares. Dios permite que por un
estado especial de nuestro espíritu, sepamos algunos hechos ocurridos
en país lejano, sin que nadie nos los cuente. Inés murió. Yo la he visto
repetidas veces en mis éxtasis, y es indudable que solo se nos
presenta la imagen de las personas que han tenido la suerte de
abandonar para siempre este ruin y miserable mundo.
—Así debe ser.
—Así es, aunque los torpes ojos del cuerpo crean otra cosa. ¡Ay! Los
del alma son los que no se engañan nunca, porque hay siempre en
ellos un rayo de eterna luz. La corporal vista es un órgano de quien
dispone a su antojo el demonio para atormentarnos. Lo que vemos en
ella es muchas veces ilusorio y fantástico. Yo, Sr. D. Gabriel, padezco
tormentos muy horrorosos por las continuas pruebas a que sujeta m
espíritu el Señor de cielo y tierra, y por los pérfidos amaños del espíritu
maligno, que, anhelando perderme, juega con mis débiles sentidos, y
se burla de esta desgraciada criatura.
—Querido amigo, cuénteme usted lo que pasa. Yo también sirvo a
veces de juguete y mofa a ese señor demonio, y puedo dar a usted
algún buen consejo sobre el modo de vencerle y burlarse de él en vez
de ser burlado.
 V

—Puesto que usted ha nombrado a una persona que tanta parte ha

tenido en que yo abandonase el perverso siglo, y puesto que usted
conoció entonces mis secretos, nada debo ocultarle. Cuando Dios me
crió dispuso que padeciese, y he padecido como ningún otro morta
sobre la tierra. Antes de sentir en mi alma el rayo divino de la eterna
gracia, que me alumbró el sendero de esta nueva vida, una pasión
mundana me hizo desgraciado. Después que me abracé a la santa cruz
para salvarme, las turbaciones, debilidades y agonías de mi espíritu
han sido tales, que pienso es esto disposición de Dios para que
conozca en vida infierno y purgatorio antes de subir a la morada de los
justos... Amé a una mujer, mas con tanta exaltación, que mi naturaleza
quedó en aquel trance trastornada. Cuando comprendí que todo había
concluido, yo no tenía ya entendimiento, memoria ni voluntad. Era una
máquina, señor oficial, una máquina estúpida: mis sentidos estaban
muertos. Vivía en las tinieblas, pues nada veía, y en una especie de
letargoso asombro. Varias veces he pensado después si, como aque
estupor mío, será el limbo a donde van los que apenas han nacido.
—Justo. Así debe ser.
—Cuando volví en mí, querido señor, formé el proyecto de hacerme
fraile. Yo había concluido para el mundo. Me confesé con grandísimo
fervor. El padre Busto aprobó con entusiasmo mi propósito de
consagrar a la religión el resto de mis tristes días, y como yo
manifestara deseo de entrar en la Orden más pobre y donde más
trabajase el cuerpo y más apartada de mundanales atractivos
estuviese el ánima, señalome esta regla de hermanos hospitalarios
¡Ay!, mi alma recibió un consuelo inexplicable. Buscaba los sitios
solitarios para meditar, y meditando sentía rodeada mi cabeza de
celestial atmósfera. ¡Qué luz tan pura! ¡Qué dulzura y suave silencio en
el aire!
—¿Y después?
—¡Ay! Después empezaron nuevamente mis infortunios bajo otra
forma. Dios decretó que yo padeciese y padeciendo estoy... Óigame
usted un momento más. Comencé mis estudios y las prácticas
religiosas para ingresar en la Orden. Recibiéronme una mañana en e
convento, donde vestí el traje de lego. Di aquel día mis lecciones más
contento que nunca; asistí como fámulo a los pobres de la enfermería
y por la tarde, tomando el segundo tomo de Los nombres de Cristo
por el maestro Fr. Luis de León, libro que me agradaba en extremo
fuime a la huerta, y en el sitio más secreto y callado de ella, entregué
mi espíritu a las delicias de la lectura. No había acabado el capítulo
hermosísimo que se titula Descripción de la miseria humana y origen
de su fragilidad, cuando sentí un calofrío muy intenso en todo m
cuerpo, una gran turbación, una zozobra muy viva, pues toda la sangre
agolpose en mi pecho, y experimenté una sensación que no puedo
decir si era gozo profundísimo o dolor agudo. Una extraña figura, bulto
o sombra, impresionó mi vista; miré, y la vi: era ella misma, sentada
en el banco de piedra junto a mí.
—¿Quién?
—¿Necesito decir su nombre?
—Ya.
—El libro se me cayó de las manos; observé la asombrosa visión
pues visión era, y el mundano amor renació violentamente en m
pecho como la explosión de una mina. Quedé absorto, señor, mudo y
entre suspendido y aterrado. Era ella misma, y me miraba con sus
dulces ojos, trastornándome. Separábala de mí una distancia como de
media vara; mas no hice movimiento alguno para acercarme a ella
porque el mismo estupor, la admiración que tal prodigio de belleza me
producía, el mismo fuego amoroso que quemaba mi ser, teníanme
arrobado y sin movimiento. Estaba vestida con riquísima túnica de una
blanca y sutil tela, la cual, así como las nubes ocultan el sol sin
esconderlo, ocultaba su hermoso cuerpo, antes empañándolo que
cubriéndolo. Bajo la falda asomaba desnudo uno de sus delicados pies
sus cabellos, ensortijados con arte incomparable, le caían en hermosas
guedejas a un lado y otro de la cara, entre sartas de orientales perlas
y en la mano derecha sostenía un pequeño ramillete de olorosas flores
cuya esencia llegaba hasta mí embriagándome el sentido.
—En verdad, Sr. Juan de Dios, que nunca he visto a la señorita Inés
en semejante traje, no muy propio por cierto para pasear en jardines.
—¿Que había usted de verla, si aquella imagen no era forma
corporal y tangible, sino una fábrica engañosa del demonio, que desde
aquel día me escogió para víctima de sus abominables experimentos?
—¿Y la joven del pie desnudo y el ramo de flores, no dijo alguna
palabrilla?
—Ni media, hermano.
—¿Y usted no le dijo nada, ni traspasó el espacio de media vara que
había entre los dos?
—No podía hablar. Acerqueme, sí, a ella, y en el mismo momento
desapareció.
—¡Qué picardía! Pero el demonio es así, amigo mío: ofrece y no da.
—Mucho tardé en reponerme de la horrible sensación que aquello
dejó en mi alma. Al fin recogí el libro, y dirigí mis pensamientos a Dios
¡Ay, qué extraña sensación! Tan extraña es, que no puedo explicarla
Figuraos, querido señor, que mis pensamientos, al remontarse al cielo
tomando forma material, fueran detenidos y rechazados por una mano
poderosa. Esto ni más ni menos era lo que yo sentía. Quería pensar y
no tenía espíritu más que para sentir. Por mi cuerpo corrían, a modo de
relámpagos del movimiento, unas convulsiones ardientes... ¡Ay! no, no
puedo de modo alguno explicar esto... En mi cuerpo chisporroteaba
algo, cual mechas que se van apagando, y cuyas pavesas, mitad fuego
mitad ceniza, caen al suelo... Levanteme; quise entrar en la iglesia
pero... ¿creerá usted que no podía? No, no podía. Alguien me tiraba de
la cola del hábito hacia afuera. Corrí a la celda que me habían
destinado, y arrojándome en el suelo, puse la frente sobre mis manos
y mis manos sobre los ladrillos. Así estuve toda la noche orando y
pidiendo a Dios que me librara de aquellas horribles tentaciones
diciéndole que yo no quería pecar, sino servirle; que yo quería se
bueno y puro y santo.
—¿Por qué no contó usted el caso a otros frailes experimentados en
cosas de visiones y tentaciones?
 —Así lo hice al punto. Consulté aquella misma tarde con el padre
Rafael de los Ángeles, varón muy pío y que me mostraba gran cariño
el cual me dijo que no tuviese cuidado, pues para desnudar e
entendimiento (así mismo lo dijo) de tales aprensiones imaginarias y
naturales, bastaba una piedad constante, una mortificación infatigable
y una humildad sin límites. Añadiome que él, en los primeros años de
vida monástica, había experimentado iguales aprietos y compromisos
mas que al fin, con las rudas penitencias y lecturas místicas, había
convencido al demonio de la inutilidad de sus esfuerzos para
pervertirlo, con lo cual le dejó tranquilo. Aconsejóme que entrase en la
vida activa de la Orden; que marchase en pos de las miserias y
lástimas del mundo, recogiendo enfermos por los pueblos para traerlos
a los hospitales; que vagase por los campos, haciendo corpora
ejercicio y alimentándome con yerbas y raíces, para que el miserable y
torpe cuerpo, privado de todo regalo, adquiriese la sequedad y rigidez
que ahuyentan la concupiscencia. Encargome, además, que durmiese
poco, y jamás sobre blanduras, sino más bien encima de duras rocas o
picudas zarzas, siempre que pudiere; que asimismo me apartase de
toda sociedad de amigos, esquivando coloquios sobre negocios
mundanos, no mostrando afición a persona alguna, sino huyendo de
todos para no pensar más que en la perfección de mi alma.
—Y haciéndolo así, ha conseguido usted...
—Así lo he hecho, hermano; mas poco o nada he conseguido. Cerca
de tres años de mortificaciones, de ejercicios, de penitencias, de
vigilias, de rigores, de dormir en campo raso y comer berraza y
jaramagos crudos, si han fortalecido mi espíritu, librándome de
aquellas vaguedades voluptuosas que al principio ponían al borde de
precipicio mi santidad, no me han librado de los continuos asaltos de
ángel infernal, que un día y otro, señor, en el campo y bajo techo, en
la dulce oscuridad de la alta y triste noche, lo mismo que a la luz
deslumbradora del sol, me pone ante los ojos la imagen de la persona
que adoré en el siglo. ¡Ay! en aquel tiempo, cuando estábamos en la
tienda, yo blasfemé, sí... me acuerdo que un día entré en la iglesia y
arrodillándome delante del Santísimo Sacramento, dije: «Señor, te
aborreceré, te negaré, si no me la das, para que nuestras almas y
nuestros cuerpos estén siempre unidos en la vida, en la sepultura y en
la eternidad.» Dios me castiga por haberle amenazado.
—De modo que siempre...
—Sí, siempre, siempre la veo, unas veces en esta, otras en la otra
forma, aunque por temporadas el demonio me permite descansar y no
veo nada. Esta funesta desgracia mía me ha impedido hasta ahora
recibir los últimos y más sublimes grados del sacramento del Orden
pues me creo indigno de que Dios baje a mis manos. ¡Es terrible
sentirse uno con el corazón y el espíritu todo dispuesto a la santidad, y
no poder conseguir el perfecto estado! Yo me desespero y lloro en
silencio, al ver cuán felices son otros frailes de mi Orden, los cuales
disfrutan, con la paz más pura, las delicias de visiones santas que son
el más regalado manjar del espíritu. Unos, en sus meditaciones, ven
ante sí la imagen de Cristo crucificado, mirándoles con ojos
amorosísimos; otros se deleitan contemplando la celestial figura de
Niño Dios; a otros les embelesa la presencia de Santa Catalina de
Siena o Santa Rosa de Viterbo, cuya castísima imagen y compuestos
ademanes incitan a la oración y a la austeridad; pero yo ¡desgraciado
de mí! yo, pecador abominable que sentí quemadas mis entrañas po
el mundano amor, y me alimenté con aquel rocío divino de la pasión, y
empapé el alma en mil liviandades inspiradas por la fantasía, me he
enfermado para siempre de impureza, me he derretido y moldeado en
un desconocido crisol que me dejó para siempre en aquella ruin forma
primera. No puedo ser santo, no puedo arrojar de mí esta segunda
persona que me acompaña sin cesar. ¡Oh, maldita lengua mía! Yo
había dicho: «Quiero unirme a ella en la vida, en la sepultura y en la
eternidad», y así está sucediendo.
Fr. Juan de Dios bajó la cabeza y permaneció largo rato meditando.
 VI

—¿En qué nuevas formas se ha presentado? —le pregunté.

—Una mañana iba yo por el campo, y abrasado por la sed, busqué
un arroyo en que apagarla. Al fin, bajo unos frondosos álamos que
entre peñas negruzcas erguían sus viejos troncos, vi una corriente
cristalina que convidaba a beber. Después que bebí senteme en una
peña, y en el mismo instante cogiome la singular zozobra que me
anuncia siempre la influencia del ángel del mal. A corta distancia de m
estaba una pastora; ella misma, señor, hermosa como los querubines.
—¿Y guardaba algún rebaño de vacas o carneros?
—No, señor: estaba sola, sentada como yo sobre una peña, y con
los nevados pies dentro del agua, que movía ruidosamente haciendo
saltar frías gotas, las cuales salpicando me mojaron el rostro. Había
desatado los negros cabellos y se los peinaba. No puedo recordar bien
todas las partes de su vestido; pero sí que no era un vestido que la
vestía mucho. Mirábame sonriendo. Quise hablar y no pude. Di un paso
hacia ella y desapareció.
—¿Y después?
—La volví a ver en distintos puntos. Yo me encontraba dentro de
Ciudad-Rodrigo cuando la asaltó el Lord en enero de este mismo año
Hallábame sirviendo en el hospital cuando comenzó el cerco, y
entonces otros buenos padres y yo salimos a asistir a los muchos
heridos franceses que caían en la muralla. Yo estaba aterrado, pues
nunca había visto mortandad semejante, e invocaba sin cesar a la
divina Madre de Nuestro Señor para que por su intercesión se
amansase la furia de los anglo-portugueses. El día 18 el arrabal, donde
yo estaba, diome idea de cómo es el Infierno. Deshacíase en mi
pedazos el convento de San Francisco, donde íbamos colocando los
heridos... Los franceses burlábanse de mí, y como a los frailes nos
tenían mucha ojeriza por creernos autores de la resistencia que se les
hace, me maltrataron de palabra y obra... ¡Ay! cuando entraron los
aliados en la plaza, yo estaba herido, no por las balas de los sitiadores
sino por los golpes de los sitiados. Los ingleses, españoles y
portugueses entraron por la brecha. Al oír aquel laberinto de
imprecaciones victoriosas, pronunciadas en tres idiomas distintos, sent
gran espanto. Unos y otros se destrozaban como fieras... yo, exánime
y moribundo, yacía en tierra en un charco de sangre y fango, y
rodeado de cuerpos humanos. Abrasábame una sed rabiosa; una sed
querido señor mío, tan ardiente como si mis venas estuviesen llenas de
fuego, y la boca, lengua y paladar fuesen, en vez de carne viva y
húmeda, estopa inerte y seca. ¡Qué tormento! Yo dije para mí
«Gracias a ti, Señor, que te has dignado llevarme a tu seno. Ha llegado
la hora de mi muerte.» No había acabado de decirlo, mejor dicho de
pensarlo, cuando sentí en mis labios el celeste contacto del agua
fresca. Suspiré, y mi espíritu sacudió su fúnebre sopor. Abrí los ojos, y
vi pegada a mis ardientes labios una blanca mano, en cuya palma
ahuecada brillaba el cristalino licor tan fresco y puro como al manar de
la rústica fuente.
—¿Y en qué traza venía entonces la señorita Inés?
—Venía de monja.
—¿Y las monjas daban de beber en el hueco de la mano?
—Aquella sí. Pintar a usted cuán hermosa estaba su cara entre las
blancas tocas y cuán bien le sentaba la austeridad de la pobre
estameña del traje, me sería imposible. Apenas la miré cuando voló de
súbito, dejándome más sediento que antes.
—Una cosa me ocurre, Sr. Juan de Dios —dije condolido en extremo
de la extraña enfermedad del desgraciado hospitalario—, y es que
siendo esa persona un artificio del más malo, del más pícaro y
desvergonzado espíritu creado por Dios, y habiendo ocasionado a
usted tantos disgustos, congojas, mortales ansias y acalorados
paroxismos, parecía natural que la tomase usted en aborrecimiento, y
que viese en ella más bien una espantable y horrenda fealdad que ese
portento de hermosura, que con tanto deleite encarece.
Fr. Juan de Dios suspiró tristemente y me dijo:
 —El Malo no presenta jamás a nuestros ojos cosas aborrecibles n
repugnantes, sino antes bien hermosas, odoríferas, gratas al paladar, a
olfato, al tacto y al oído. Bien sabe él lo que se hace. Si ha leído usted
la vida de la madre Santa Teresa de Jesús, habrá visto que alguna vez
el demonio le pintó delante la imagen de Nuestro Señor Jesucristo para
engañarla. Ella misma dice que el Malo es gran pintor, y añade que
cuando vemos una imagen muy buena, aunque supiésemos la ha
pintado un mal hombre, no dejaríamos de estimarla.
—Eso está muy bien dicho... Se me ocurre otra cosa. Si yo hubiera
sido atormentado de esa ruin manera por el espíritu maligno, el cual
según voy viendo, es un redomado tunante, habría tratado de
perseguir la imagen, de tocarla, de hablarle, para ver si efectivamente
era vana ilusión o materia corpórea.
—Yo lo he hecho, querido señor y amigo mío —repuso e
hospitalario con acento ya debilitado por el mucho hablar—, y nunca
he podido poner mis manos sobre ella, habiendo conseguido tan solo
una vez tocar el halda de su vestido. Puedo asegurar a usted que a la
vista su figura se me ha representado siempre como una criatura
humana con su natural espesor, corpulencia, y el brillo y la dulzura de
los ojos, el dulce aliento de la boca, y la añadidura del vestido flotando
al viento; en fin, todo en tal manera fabricado, que es imposible no
creerla persona viva y como las demás de nuestra especie.
—¿Y siempre se presenta sola?
—No, señor, que algunas veces la he visto en compañía de otras
muchachas, como, por ejemplo, en Sevilla el año pasado. Todas eran
obra vana de la infernal industria, pues desaparecieron con ella como
multitud de luces que se apagan de un solo soplo.
—¿Y siempre desaparecen así como luz que se apaga?
—No, señor, que a veces corre delante de mí, y la sigo, y se pierde
entre la multitud, o avanza tanto en su camino que no puedo
alcanzarla. Un día la vi en una soberbia cabalgadura que corría más
que el viento, y ayer la vi en un carro.
—¿Que corría también como el viento?
—No, señor, pues apenas corría como un mal carro. La visión de
ayer ofrece para mí una particularidad aterradora, y que me prueba
cierta recrudescencia y gravedad del mal que padezco.
 —¿Por qué?
—Porque ayer me habló.
—¿Cómo? —dije sonriendo, mas no asombrado del extremo a que
llegaban las locuras de mi amigo—. ¿Habló al fin la señorita del pie
desnudo, la pastorcita, la monja de Ciudad-Rodrigo?
—Sí, señor. Iba en un carro en compañía de unos cómicos que
venían al parecer de Extremadura.
—¡En un carro!... ¡Con unos cómicos!... ¡De Extremadura!
—Sí, señor: veo que se asombra usted, y lo comprendo, porque e
caso no es para menos. Delante iban algunos hombres a caballo; luego
seguía un carro con dos mujeres, y después otro carro con
decoraciones y trebejos de teatro, todos quemados y hechos pedazos.
—Hermano, usted se burla de mí —dije levantándome de súbito y
volviéndome a sentar, impulsado por ardiente desasosiego.
—Cuando la vi, señor mío, experimenté aquel calofrío, aquella
sensación entre placentera y dolorosa que acompaña a mis terribles
crisis.
—¿Y cómo iba?
—Triste, arropada en un manto negro.
—¿Y la otra mujer?
—Engañosa imaginación también, sin duda, la acompañaba en
silencio.
—¿Y los hombres que iban a caballo?
—Eran cinco, y uno de ellos vestía de juglar con calzón de tres
colores y montera de picos. Disputaban, y otro de ellos, que parecía
mandar a todos, era una persona de buena apostura y presencia, con
barba picuda como la del demonio.
—¿No sintió usted olor de azufre?
—Nada de eso, señor. Aquellos hombres hablaban con animación, y
nombraron a unos soldados que les habían quemado sus infernales
cachivaches.
—Sospecho, querido hermano Juan —dije con turbación—, que ya
no es usted solo el endemoniado, sino que yo lo estoy también, pues
esos cómicos, y esas mujeres, y esos carros, y esos trastos escénicos
son reales y efectivos, y aunque no los vi, sé que estuvieron en
Santibáñez de Valvaneda. ¿Sería que alguna de las cómicas se le
antojó a usted ser la misma persona de marras, sin que en esto
hubiese la más ligera picardía por parte de la majestad infernal?
—Bien he dicho yo —continuó el fraile con candor— que esta
aparición de hoy es la más extraordinaria y asombrosa que he tenido
en mi vida, pues en ella la demoniaca hechura ha presentado tales
síntomas, señales y vislumbres de realidad, que al más licurgo y
despreocupado engañaría. Esta es también la primera vez que la
imagen querida, además de tomar cuerpo macizo de mujer, ha
remedado la humana voz.
—¿Ha hablado?
—Sí, señor: ha hablado —afirmó el hospitalario con terror—. Su voz
no es la misma que aún resuena en mis oídos, desde que la oí en casa
de Requejo, así como su figura en el día de hoy me ha parecido más
hermosa, más robusta, más completa y más formada. Tal como la vi en
el convento, en el bosque, en la iglesia y en Ciudad-Rodrigo era cas
una niña, y hoy...
—Pero si habló, ¿qué dijo?
—Yo me acerqué al carro, la miré, mirome ella también... Sus ojos
eran rayos que me quemaban cuerpo y alma. Luego pareció
asombrada, muy asombrada... ¡Ay! sus labios se movieron y
pronunciaron mi propio nombre. «Sr. Juan de Dios —dijo—, ¿se ha
hecho usted fraile?...» Que me moría en aquel mismo momento. Quise
hablar y no pude. Ella hizo ademán de darme una limosna, y de pronto
el hombre que parecía mandar a todos, como advirtiera mi presencia
junto al carro de las cómicas, detuvo el caballo, y volviéndose me dijo
con voz fiera: «Largo de aquí, holgazán pancista.» Ella dijo entonces
«Es un pobre mendicante que pide limosna.» El hombre alzó el palo
para pegarme, y ella dijo: «Padre, no le hagas daño.»
—¿Está usted seguro de que dijo eso?
—Sí, seguro estoy; mas el infame, como criatura infernal que era
enemigo natural de Dios, llamome de nuevo holgazán, y recibí a
mismo tiempo tal porrazo en la cabeza, que caí sin sentido.
—Sr. Juan de Dios —le dije después de reflexionar un poco sobre lo
extraño de aquella aventura—, júreme usted que es verdad cuanto ha
dicho, y que no es su ánimo burlarse de mí.
 —¡Yo burlarme, señor oficial de mi alma! —exclamó el hospitalario
que estuvo a punto de llorar viendo que se ponía en duda su veracidad
—. Cierto es lo que he dicho. Tan evidente es que hay demonio en e
infierno, como que hay Dios en el cielo, pues infinito es en el mundo e
número de casos de obsesión, y todos los días oímos contar nuevas
tropelías y estupendas gatadas del mortificador del linaje humano.
—¿Y no puede usted precisar el sitio en que ocurrió eso del carro de
comediantes?
—Pasado Santibáñez de Valvaneda, como a tres leguas. Iban a buen
paso camino de Salamanca.
El infeliz hospitalario no podía mentir, y en cuanto a la endemoniada
catadura de las cosas y personas referidas, yo tenía mis razones para
creer que entre los primeros y el último encuentro del fraile había
alguna diferencia.
De nuevo le insté para que tomase alguna cosa, y segunda vez se
resistió a dar a su cuerpo regalo alguno. Ya nos disponíamos a
marchar, cuando le vi palidecer, si es que cabía mayor grado de
amarillez en su amojamada carne; le vi aterrado, con los ojos medio
salidos del casco, el labio inferior trémulo, y toda su persona
desasosegada. Miraba a un punto fijo detrás de mí, y como yo
rápidamente me volviese y nada hallase que pudiera motivar aque
espanto, le pregunté la causa de sus terrores, y si allí entre tantos
soldados se atrevía Satanás a hacer de las suyas.
—Ya se ha desvanecido —dijo con voz débil y dejando cae
desmayadamente los brazos.
—¿Pues qué, otra vez ha estado aquí?
—Sí, en aquel grupo donde bailan los soldados... ¿Ve usted que hay
allí unas mozas de San Esteban?
—Es cierto; pero o yo he olvidado la cara de la señora Inés, o no
está entre ellas —repuse sin poder contener la risa—. Si estuviera, bien
se le podían decir cuatro frescas por ponerse a bailar con los soldados.
—Pues dude usted de que ahora es de día, señor mío —afirmó no
repuesto aún de la emoción—; pero no dude usted de que estaba allí
Veo que el demonio recrudece sus tentaciones y aumenta el rigor de
sus ataques contra los reductos de mi fortaleza, y esto lo hace porque
estoy pecando...
 —¿Pecando ahora; pecando por hablar con un antiguo amigo?
—Sí, señor, pues pecar es entregar sin freno el espíritu a los deleites
de la conversación con gente seglar. Además, he estado aqu
descansando más de hora y media, cosa que en tres años no he
hecho, y he gustado de la fresca sombra de estos árboles. ¡Alma mía
—añadió con exaltado fervor—, arriba!... no duermas, vigila sin cesa
al enemigo que te acecha, no te entregues al corruptor deleite de la
amistad, ni desmayes un solo momento, ni pruebes las dulzuras de
reposo. Alerta, alerta siempre.
—¿Se marcha usted ya? —dije al ver que desataba al buen jumento
—. Vamos, no rechazará usted este pedazo de pan para el camino.
Tomolo, y poniéndoselo en la boca al pacífico asno, que no estaba
sin duda por cenobíticas abstinencias, cogió él para sí un puñado de
yerba y la guardó en el seno.
«O es un farsante —dije para mí—, o el más puro y candoroso
beato que ciñe el cíngulo monacal.»
—Buenas tardes, Sr. D. Gabriel —dijo con humilde acento—. Me voy
a Béjar para seguir mañana a Candelario, donde tenemos un hospital
¿Y usted, a dónde marcha?
—¿Yo? A donde me lleven: tal vez a conquistar a Salamanca, que
está en poder de Marmont.
—Adiós, hermano y querido señor mío —repuso—. Gracias, mi
gracias por tantas bondades.
Y tirando del ronzal, partió, con el burro tras sí. Cuando su enjuta
figura negruzca se alejó al bajar un cerro, pareciome ver en él un
cuerpo que melancólicamente buscaba su perdida sepultura sin pode
encontrarla.
 VII

Dos días después, más allá de Dios-le-guarde, un gran

acontecimiento turbó la monotonía de nuestra marcha. Y fue que a eso
de la madrugada, nuestras tropas avanzadas prorrumpieron en
exclamaciones de júbilo; mandose formar, dando a las compañías e
marcial concierto y la buena apariencia que han menester para
presentarse ante un militar inteligente, y algunos acudieron por orden
del general a cortar ramos a los vecinos carrascales para tejer no sé s
coronas, cenefas o triunfales arcos. Al llegar al camino de Ciudad
Rodrigo, vimos que apareció falange numerosa de hombres vestidos de
encarnado y caballeros en ligerísimos corceles, y verlos y exclama
todos en alegre concierto: «¡Viva el Lord!» fue todo uno.
—Es la caballería de Cotton, de la división del general Graham —dijo
D. Carlos España—. Señores, cuidado no hagamos alguna gansada
Los ingleses son muy ceremoniosos, y se paran mucho en las formas
Si se coge bastante carrasca haremos un arquito de triunfo para que
pase por él el vencedor de Ciudad-Rodrigo, y yo le echaré un discurso
que traigo preparado, elogiando su pericia en el arte de la guerra y la
Constitución de Cádiz, cosas ambas bonísimas, y a las cuales
deberemos el triunfo al fin y a la postre.
—No es el señor Lord muy amigo de la Constitución de Cádiz —dijo
D. Julián Sánchez, que a derecha mano de D. Carlos estaba—; pero a
nosotros, ¿qué nos va ni qué nos viene en esto? Derrotemos a
Marmont y vivan todos los milores.
Los jinetes rojos llegaron hasta nosotros, y su jefe, que hablaba
español como Dios quería, cumplimentó a nuestro brigadier, diciéndole
que Su Excelencia el señor Duque de Ciudad-Rodrigo no tardaría en
llegar a Sancti Spíritus.
 Al punto comenzamos a levantar el arco con ramajes y palitroques a
la entrada de dicho pueblo, y viérais allí que un dómine del país
apareció trayendo unos al modo de tarjetones de lienzo con sendos
letreros y versos que él mismo había sacado de su cabeza, y en las
cuales piezas poéticas se encomiaban hasta más allá de los cuernos de
la luna las virtudes del moderno Fabio, o sea el Sr. D. Arturo Wellesley
Lord Vizconde de Wellington de Talavera, Duque de Ciudad-Rodrigo
Grande de España y Par de Inglaterra.
Iban llegando unos tras otros numerosos cuerpos de ejército, que se
desparramaban por aquellos contornos ocupando los pueblos
inmediatos, y al fin, entre los más brillantes soldados escoceses
ingleses y españoles, apareció una silla de postas, recibida con
aclamaciones y vítores por las tropas situadas a un lado y otro de
camino. Dentro de ella vi una nariz larga y roja, bajo la cual lucieron
unos dientes blanquísimos. Con la rapidez de la marcha apenas pude
distinguir otra cosa que lo indicado, y una sonrisa de benevolencia y
cortesía que desde el fondo del carruaje saludó a las tropas.
No debo pasar en silencio, aunque esto concuerda mal con la
gravedad de la Historia, que al pasar el coche bajo el arco triunfal
como este no lo habían construido ingenieros ni artífices romanos, con
la sacudida y golpe que recibiera de una de las ruedas, hizo como s
quisiera venirse abajo, y al fin se vino, cayendo no pocas ramas y
lienzos sobre la cabeza del dómine que tuviera parte tan importante en
su malhadada fábrica. Como no hubo que lamentar desgracia alguna
celebrose con risas la extraña ruina. Los chicos apoderáronse al punto
de los tarjetones, que eran como de tres cuartas de diámetro, y
abriéndoles en el centro un agujero y metiendo por él la cabeza se
pasearon delante de Wellington con aquella valona o flamenca golilla.
Entre tanto, D. Carlos España desembuchaba su discurso delante de
Lord, y luego que concluyera, presentose el dómine con el amenazado
proyecto de hablar también. Consintiolo el general, que como persona
finísima disimulaba su cansancio, y oyendo las pedanterías del orador
movía la cabeza, acompañando sus gestos de la especial sonrisa
inglesa, que hace creer en la existencia de algún cordón
intermandibular, del cual tiran para plegar la boca como si fuera una
cortina.
 —Mi comandante —me dijo con cara de júbilo mi asistente cuando
me aparté de los generales para ocuparme del alojamiento—, ¿no ha
visto usía el otro ejército que viene detrás?
—Serán los portugueses.
—¡Qué portugueses ni qué garambainas! Son mujeres, un ejército
de mujeres. Esto se llama darse buena vida. Los ingleses, en vez de
impedimenta, llevan la faldamenta. Así da gusto de hacer la guerra.
Miré y vi veinte, ¿qué digo veinte? cuarenta y aun cincuenta carros
coches y vehículos de distintas formas, llenos todos de mujeres, unas
al parecer de alta, otras de baja calidad, y de distinta belleza y edad
aunque por lo general, dicho sea esto imparcialmente, predominaba e
género feo. Al punto que pararon los vehículos entre nubes de polvo
viérais descender con presteza a las señoras viajeras, y resonar una de
las más discordes algarabías que pueden oírse. Por un lado chillaban
ellas llamando a sus consortes, y ellos por otro penetraban en la
femenil multitud gritando: Anna, Fanny, Mathilda, Elisabeth. En un
instante formáronse alegres parejas, y un tumultuoso concierto de
voces guturales y de inflexiones agudas y de articulaciones líquidas
llenó los aires.
Pero como la división aliada que acababa de llegar no podía
pernoctar entera en aquel pueblo, una parte de ella siguió el camino
adelante hacia Aldehuela de Yeltes. Tornaron a montar en sus
carricoches muchas de las hembras, formando parte del convoy de
víveres y municiones, y otras quedaron en Sancti Spíritus. El día pasó
ocupándonos todos en buscar el mejor alojamiento posible; pero como
éramos tantos, al caer de la tarde no habíamos resuelto la cuestión. En
cuanto a mí, me creía obligado a dormir en campo raso. Tribaldos me
notificó que el dómine del lugar tenía sumo placer en cederme su
habitación. Después de visitar a mi honrado patrono, salí a
desempeñar varias obligaciones militares, y ya me retiraba a casa
cuando junto al camino sentí gritos y voces de alarma. Corrí a donde
sonaban, y no era más sino que por el camino adelante venía un
cochecillo, cuyo caballo le arrastraba dando tan terribles tumbos y
saltos, que cada instante parecía iba a deshacerse en pedazos mil
Cuando con rapidez inmensa pasaba por delante de nosotros, un grito
de mujer hirió mis oídos.
 —En ese coche va una mujer, Tribaldos —grité a mi asistente que se
había unido a mí.
—Es una inglesa, señor, que se quedó rezagada y detrás de las
demás inglesas.
—¡Pobre mujer!... ¿Y no hay entre tantos hombres uno solo que se
atreva a detener el caballo y salvar a esa desgraciada?... Parece que no
va desbocado... Detiene el paso... Corramos allá.
—El coche se ha salido del camino —dijo Tribaldos con espanto—, y
ha parado en un sitio muy peligroso.
Al instante vi que el carricoche estaba a punto de despeñarse
Habiéndose enredado el caballo entre unas jaras, se había ido al suelo
quedando como reventado a consecuencia del fuerte choque que
recibiera. Pero como la pendiente era grande, la gravedad lo atraía
hacia lo hondo del barranco.
Imposible que yo viera la situación terrible de la viajera infeliz sin
acudir pronto a su socorro. Había caído el coche sin romperse; mas lo
peligroso estaba en el sitio. Corrí allá solo; bajé tropezando a cada
paso, despegando con mi planta piedrecillas que rodaban con ruido
siniestro, y llegué al fin a donde se había detenido el vehículo. Una
mujer lanzaba desde el interior lastimeras voces.
—Señora —grité—, allá voy. No tenga usted cuidado. No caerá a
barranco.
El caballo pataleaba en el suelo, pugnando por levantarse, y con sus
movimientos de dolor y desesperación arrastraba el coche hacia e
abismo. Un momento más y todo se perdía.
Apoyeme en una enorme piedra fija, y con ambas manos detuve e
coche que se inclinaba.
—Señora —grité con afán—, procure usted salir. Agárrese usted a m
cuello... sin miedo. Si salta usted en tierra, no hay que temer.
—No puedo, no puedo, caballero —exclamó con dolor.
—¿Se ha roto usted alguna pierna?
—No, caballero... veré si puedo salir.
—Un esfuerzo... Si tardamos un instante, los dos caeremos abajo.
No puedo describir los prodigios de mecánica que ambos hicimos
Ello es que en casos tan apurados, el cuerpo humano, por maravilloso
instinto, imprime a sus miembros una fuerza que no tiene en instantes
ordinarios, y realiza una serie de admirables movimientos que después
no pueden recordarse ni repetirse. Lo que sé es que como Dios me dio
a entender, y no sin algún riesgo mío, saqué a la desconocida de aque
grave compromiso en que se encontraba, y logré al fin verla en tierra
Asido a las piedras la sostuve, y no hubo más remedio que llevarla en
brazos al camino.
—Eh, Tribaldos, cobarde, holgazán —grité a mi asistente que había
acudido en mi auxilio—, ayúdame a salir de aquí.
Tribaldos y otros soldados, que no me habían prestado socorro
hasta entonces, me ayudaron a salir; porque es condición de ciertas
gentes no arrimarse al peligro que amenaza, sino al peligro vencido, lo
cual es cómodo y de gran provecho en la vida.
Una vez arriba, la desconocida dio algunos pasos.
—Caballero, os debo la vida —dijo recobrando el perdido color y e
brillo de sus ojos.
Era como de veintitrés años, alta y esbelta. Su airosa figura, su
acento dulce, su hermoso rostro, aquel tratamiento de vos que
ceremoniosa me daba, sin duda por poseer a medias el castellano, me
hicieron honda y duradera impresión.
 VIII

Apoyose en mí, quiso dar algunos pasos; mas al punto sus piernas
desmayadas se negaron a sostenerla. Sin decir nada la tomé en
brazos, y dije a Tribaldos:
—Ayúdame; vamos a llevarla a nuestro alojamiento.
Por fortuna este no estaba lejos, y bien pronto llegamos a él. En la
puerta la inglesa movió la cabeza, abrió los ojos y me dijo:
—No quiero molestaros más, caballero. Podré subir sola. Dadme e
brazo.
En el mismo momento apareció presuroso y sofocado un oficia
inglés, llamado Sir Tomás Parr, a quien yo había conocido en Cádiz, y
enterado brevemente de la lamentable ocurrencia, habló con su
compatriota en inglés.
—¿Pero habrá aquí una habitación confortable para la señora? —me
dijo después.
—Puede descansar en mi propia habitación —dijo el dómine, que
había bajado oficiosamente al sentir el ruido.
—Bien —dijo el inglés—. Esta señorita se detuvo en Ciudad-Rodrigo
más de lo necesario, y ha querido alcanzarnos. Su temeridad nos ha
dado ya muchos disgustos. Subámosla. Haré venir al médico mayor de
ejército.
—No quiero médicos —dijo la desconocida—. No tengo herida
grave: una ligera contusión en la frente y otra en el brazo izquierdo.
Esto lo decía subiendo apoyada en mi brazo. Al llegar arriba, dejose
caer en un sillón que en la primera estancia había, y respiró con
expansivo desahogo.
—A este caballero debo la vida —dijo señalándome—. Parece
milagro.
 —Mucho gusto tengo en ver a usted, mi querido Sr. Araceli —me
dijo el inglés—. Desde el año pasado no nos habíamos visto. ¿Se
acuerda usted de mí... en Cádiz?
—Me acuerdo perfectamente.
—Usted se embarcó con la expedición de Blake. No pudimos vernos
porque usted se ocultó después del duelo en que dio la muerte a Lord
Gray.
La inglesa me miró con profundo interés y curiosidad.
—Este caballero... —murmuró.
—Es el mismo de quien os he hablado hace días... —contestó Parr.
—¡Si el libertino que ha hecho desgraciadas a tantas familias de
Inglaterra y España, hubiese tropezado siempre con hombres como
vos...! Según me han dicho, Lord Gray se atrevió a mirar a una
persona que os amaba... La energía, la severidad y la nobleza de
vuestra conducta son superiores a estos tiempos.
—Para conocer bien aquel suceso —dije yo, no ciertamente
orgulloso de mi acción— sería preciso que yo explicase algunos
antecedentes...
—Puedo aseguraros que antes de conoceros, antes de que me
prestaseis el servicio que acabo de recibir, sentía hacia vos una grande
admiración.
Dije entonces todo lo que la modestia y el buen parecer exigían.
—¿De modo que esta señora se alojará aquí? —me dijo Parr—
Donde yo estoy es imposible. Dormimos siete en una sola habitación.
—He dicho que le cederé la mía, la cual es digna del mismo Si
Arturo —dijo Forfolleda, pues este era el nombre del dómine.
—Entonces estará bien aquí.
Sir Tomás Parr habló largamente en inglés con la bella desconocida
y después se despidió. No dejaba de causarme sorpresa que sus
compatriotas abandonasen a aquella hermosa mujer, que sin duda
debía de tener esposo o hermanos en el ejército; pero dije para mí
«Será que las costumbres inglesas lo ordenan de este modo.»
En tanto, la señora de Forfolleda (pues Forfolleda tenía señora)
bizmó el brazo de la desconocida, y restañó la sangre de la rozadura
que recibiera en la cabeza, con cuya operación dimos por concluidos
los cuidados quirúrgicos, y pensamos en arreglar a la señora cuarto y
cama en que pasar la noche.
Un momento después, el precioso cuerpo de la dama inglesa
descansaba sobre un lecho algo más blando que una roca, al cual tuve
que conducirla en mis brazos, porque la acometió nuevamente aque
desmayo primero que la imposibilitaba toda acción corporal. Ella me
dio las gracias en silencio volviendo hacia mí sus hermosos ojos azules
que dulcemente y con la encantadora vaguedad y extravío que sigue a
los desmayos, se fijaron primero en mi persona y después en las
paredes de la habitación. Más la miraba yo, y más hermosa me parecía
a cada momento. No puedo dar idea de la extremada belleza de sus
ojos azules. Todas las facciones de su rostro distinguíanse por la más
pura corrección y finura. Los cabellos rubios hacían verosímil la imagen
de las trenzas de oro tan usada por los poetas, y acompañaban la boca
los más lindos y blancos dientes que pueden verse. Su cuerpo
atormentado bajo las ballenas de un apretado jubón, del cual pendían
faldas de amazona, era delgadísimo; mas no carecía de las redondeces
y elegantes contornos y desigualdades que distinguen a una mujer de
un palo torneado.
—Gracias, caballero —me dijo con acento melancólico y usando
siempre el vos—. Si no temiera molestaros, os suplicaría que me
dieseis algún alimento.
—¿Quiere la señora un pedazo de pierna de carnero —dijo
Forfolleda, que arreglaba los trastos de la habitación—, unas sopas de
ajo, chocolate, o quizás un poco de salmorejo con guindilla? También
tengo abadejo. Dicen que al Sr. D. Arturo le gusta mucho el abadejo.
—Gracias —repuso la inglesa con mal humor—, no puedo come
eso. Que me hagan un poco de té.
Fui a la cocina, donde la señora de Forfolleda me dijo que allí no
había té ni cosa que lo pareciese, añadiendo que si ella probara tan
solo un buche de tal enjuagadero de tripas, arrojaría por la boca
juntamente con los hígados, la primer leche que mamó. Luego se puso
a reprender a su esposo por admitir en la casa a herejes luteranos y
calvinistas, cuales eran los ingleses; mas el dómine refutó
victoriosamente el ataque, afirmando que, merced a la ayuda de los
herejes calvinistas y luteranos, la católica España triunfaría de
Napoleón, lo cual no significaba más sino que Dios se vale del mal para
producir el bien.
—Vete a cualquier casa donde haya ingleses —dije a Tribaldos— y
trae té. ¿Sabes lo que es?
—Unas hojas arrugaditas y negras. Ya sé... todas las noches lo
tomaba la mujer del capitán.
Volví al lado de la inglesa, que me dijo no podía comer cosa alguna
de nuestra cocina; y habiéndome pedido pan, se lo di mientras llegaba
el anhelado té.
Al poco rato entró Tribaldos trayendo una ancha taza que despedía
un olor extraño.
—¿Qué es esto? —dijo la dama con espanto, cuando los vapores de
condenado licor llegaron a su nariz.
—¿Qué menjurje has puesto aquí, maldito? —exclamé amenazando
al aturdido mozo.
—Señor, no he puesto nada, nada más que las hojas arrugaditas
con un poco de canela y de clavo. La señora de Forfolleda dijo que as
se hacía, y que lo había compuesto muchas veces para unos ingleses
que fueron a Salamanca a ver la catedral vieja.
La inglesa prorrumpió en risas.
—Señora, perdone usted a este animal, que no sabe lo que hace
Voy yo mismo a la cocina y beberá usted té.
Poco después volví con mi obra, que debió satisfacer a la
interesada, pues la aceptó con gozo.
—Ahora, señora mía, me retiraré, para que usted descanse —le dije
—. Deme usted órdenes para mañana o para esta noche misma. S
quiere usted que avise a su esposo... o es que se halla en la división de
Picton, que no está en este pueblo...
—Señor oficial —dijo solemnemente bebiendo su té—, yo no tengo
esposo; yo soy soltera.
Esto puso el límite a mi asombro, y vacilante al principio en mis
ideas, no supe contestarle con medias palabras.
«¡Buena pieza será esta que se ha colgado de mi brazo! —dije para
mí—. Los franceses traen consigo mujeres de mala vida; pero de los
ingleses no sabía que...»
 —Soltera, sí —añadió con aplomo y apartando la taza de sus labios
—. Os asombráis de ver una señorita como yo en un campo de batalla
en tierra extranjera y lejos, muy lejos de su familia y de su patria
Sabed que vine a España con mi hermano, oficial de ingenieros de la
división de Hill, el cual hermano mío pereció en la sangrienta batalla de
la Albuera. El dolor y la desesperación tuviéronme por algunos días
enferma y en peligro de muerte; pero me reanimó la conciencia de los
deberes que en aquel trance tenía que cumplir, y consagreme a busca
el cuerpo del pobre soldado para enviarle a Inglaterra al panteón de
nuestra familia. En poco tiempo cumplí esta triste misión, y hallándome
sola traté de volver a mi país. Pero al mismo tiempo me cautivaban de
tal modo la historia, las tradiciones, las costumbres, la literatura, las
artes, las ruinas, la música popular, los bailes, los trajes de esta nación
tan grande en otro tiempo y otra vez grandísima en la época presente
que formé el proyecto de quedarme aquí para estudiarlo todo, y previa
licencia de mis padres, así lo he hecho.
«Sabe Dios qué casta de pájaro serás tú» —dije para mi capote; y
luego, en voz alta, añadí sosteniendo fijamente la dulce mirada de sus
ojos de cielo:
—¡Y los padres de usted consintieron, sin reparar en los continuos y
graves peligros a que está expuesta una tierna doncella sola y sin
amparo en país extranjero, en medio de un ejército! Señora, por amo
de Dios...
—¡Ah, no conocéis sin duda que nosotras, las hijas de Inglaterra
estamos protegidas por las leyes de tal manera y con tanto rigor que
ningún hombre se atreve a faltarnos al respeto!
—Sí, así dicen que pasa en Inglaterra. Y parece que allá salen las
señoritas solas a paseo, y viajan solas o acompañadas de cualquie
galancete.
—Aunque fuera su novio, no importa —dijo la inglesa.
—¡Pero estamos en España, señora, en España! Usted no sabe bien
en qué país se ha metido.
—Pero sigo al ejército aliado y estoy al amparo de las leyes inglesas
—dijo sonriendo—. Caballero, faltad al pudor si os parece; intentad
galantearme de una manera menos decorosa que la que empleáis para
amar a esa Dulcinea que fue causa de la muerte de Gray, y Lord
Wellington os mandará fusilar si no os casáis conmigo.
—Me casaría, señora.
—Caballero, veo que quizás sin malicia principiáis a faltar a
comedimiento.
—Pues no me casaría, señora, no me casaría... Permítame usted
que me retire.
—Podéis hacerlo —me dijo levantándose penosamente para cerra
por dentro la puerta—. Os agradeceré que mañana hagáis traer m
maleta. Felizmente no la traía conmigo. Está en el convoy.
—Se traerá la maleta. Buenas noches, señora.
 IX

Fuera de la estancia sentí el ruido de los cerrojos que corría po

dentro la hermosa inglesa, y me retiré a mi aposento, que era el rincón
de un oscuro pasillo, donde Tribaldos me había arreglado un lecho con
mantas y capotes. Tendime sobre aquellas durezas, y en buena parte
de la noche no pude conciliar el sueño; de tal modo se había encajado
dentro de mi cerebro la extraña señora inglesa, con su caída, sus
desmayos, su té y su acabada hermosura. Pero al fin, rendido por e
gran cansancio, me dormí sosegadamente. Por la mañana, díjome la
señora de Forfolleda que la señorita rubia estaba mejor; que había
pedido agua y té y pan, ofreciendo dinero abundante por cualquie
servicio que se le prestara. Como manifestase deseos de entrar a
saludarla, añadió la Forfolleda que no era conveniente, por estar la
señorita arreglándose y componiéndose, a pesar de las heridas leves
de su brazo.
Al salir a mis quehaceres, que fueron muchísimos y me ocuparon
casi todo el día, encontré a Sir Tomás Parr, a quien encargué lo de la
maleta.
Por la tarde, después del gran trabajo de aquel día que me hizo
poner un tanto en olvido a la interesante dama, regresé a casa de
Forfolleda, y vi a gran número de ingleses que entraban y salían, como
diligentes amigos que iban a informarse de la salud de su compatriota
Entré a saludarla; la reducida estancia estaba llena de casacas rojas
pertenecientes a otros tantos hombres rubios que hablaban con
animación. La joven inglesa reía y bromeaba, y habíase puesto tan
linda, sin cambiar de traje, que no parecía la misma persona
demacrada, melancólica y nerviosa de la noche anterior. La contusión
del brazo entorpecía algo sus graciosos movimientos.