Visit ebooknice.

com to download the full version and

explore more ebooks or textbooks

(Ebook) MicroRNA Detection and Target

Identification: Methods and Protocols by Tamas
Dalmay (eds.) ISBN 9781493968640, 9781493968664,
1493968645, 1493968661
_____ Click the link below to download _____
https://ebooknice.com/product/microrna-detection-and-target-
identification-methods-and-protocols-5880976

Explore and download more ebooks or textbooks at ebooknice.com

Here are some recommended products that we believe you will be
interested in. You can click the link to download.

(Ebook) MicroRNA Detection and Target Identification: Methods and

Protocols by Tamas Dalmay ISBN 9781071629819, 1071629816

https://ebooknice.com/product/microrna-detection-and-target-
identification-methods-and-protocols-49029162

(Ebook) Biota Grow 2C gather 2C cook by Loucas, Jason; Viles, James

ISBN 9781459699816, 9781743365571, 9781925268492, 1459699815,
1743365578, 1925268497

https://ebooknice.com/product/biota-grow-2c-gather-2c-cook-6661374

(Ebook) SAT II Success MATH 1C and 2C 2002 (Peterson's SAT II Success)

by Peterson's ISBN 9780768906677, 0768906679

https://ebooknice.com/product/sat-ii-success-
math-1c-and-2c-2002-peterson-s-sat-ii-success-1722018

(Ebook) Matematik 5000+ Kurs 2c Lärobok by Lena Alfredsson, Hans

Heikne, Sanna Bodemyr ISBN 9789127456600, 9127456609

https://ebooknice.com/product/matematik-5000-kurs-2c-larobok-23848312
(Ebook) MicroRNAs in Development: Methods and Protocols by Dylan
Sweetman (auth.), Tamas Dalmay (eds.) ISBN 9781617790829, 1617790826

https://ebooknice.com/product/micrornas-in-development-methods-and-
protocols-2120022

(Ebook) Master SAT II Math 1c and 2c 4th ed (Arco Master the SAT
Subject Test: Math Levels 1 & 2) by Arco ISBN 9780768923049,
0768923042

https://ebooknice.com/product/master-sat-ii-math-1c-and-2c-4th-ed-
arco-master-the-sat-subject-test-math-levels-1-2-2326094

(Ebook) Cambridge IGCSE and O Level History Workbook 2C - Depth Study:

the United States, 1919-41 2nd Edition by Benjamin Harrison ISBN
9781398375147, 9781398375048, 1398375144, 1398375047

https://ebooknice.com/product/cambridge-igcse-and-o-level-history-
workbook-2c-depth-study-the-united-states-1919-41-2nd-edition-53538044

(Ebook) MicroRNA Profiling: Methods and Protocols by Sweta Rani ISBN

9781071628225, 1071628224

https://ebooknice.com/product/microrna-profiling-methods-and-
protocols-48692104

(Ebook) MicroRNA Profiling: Methods and Protocols by Sweta Rani ISBN

9781071628225, 1071628224

https://ebooknice.com/product/microrna-profiling-methods-and-
protocols-48692740
Methods in
Molecular Biology 1580

Tamas Dalmay Editor

MicroRNA
Detection
and Target
Identification
Methods and Protocols
Methods in Molecular Biology

Series Editor
John M. Walker
School of Life and Medical Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, AL10 9AB, UK

For further volumes:

http://www.springer.com/series/7651
 MicroRNA Detection
and Target Identification

Methods and Protocols

Edited by

Tamas Dalmay
School of Biological Sciences, University of East Anglia, Norwich, UK
Editor
Tamas Dalmay
School of Biological Sciences
University of East Anglia
Norwich, UK

ISSN 1064-3745     ISSN 1940-6029 (electronic)

Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-4939-6864-0    ISBN 978-1-4939-6866-4 (eBook)
DOI 10.1007/978-1-4939-6866-4

Library of Congress Control Number: 2017937361

© Springer Science+Business Media LLC 2017

This work is subject to copyright. All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of the material is
concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction
on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation,
computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not
imply, even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and
regulations and therefore free for general use.
The publisher, the authors and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to
be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty,
express or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been made.
The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

Printed on acid-free paper

This Humana Press imprint is published by Springer Nature

The registered company is Springer Science+Business Media LLC
The registered company address is: 233 Spring Street, New York, NY 10013, U.S.A.
Preface

This book is a follow-up of a previous book in this series; therefore, it is unnecessary to

introduce microRNAs (miRNAs) to any reader who is reading this preface. The previous
book (MicroRNAs in development; published in 2011) described protocols to detect, pro-
file, and manipulate miRNAs in various organisms, as well as how to validate targets of
miRNAs in plants and animals. However, a lot of new techniques have been developed in
the last 5–6 years, which warranted a new book.
Some of the new protocols describe slight but important changes to well-established
techniques that were described in the previous edition, such as Northern blot (Chapter 1)
and preparation of cDNA libraries of small RNAs (Chapter 4). An alternative method to
these two approaches to detect miRNAs is RT-qPCR, and there are two protocols for this
in the book, one describing high-throughput RT-qPCR (Chapter 2) and the other describ-
ing the application of digital PCR for miRNA detection (Chapter 16). In addition, there is
a review chapter on the comparison of next-generation sequencing and RT-qPCR plat-
forms (Chapter 3).
MiRNAs have been increasingly used as biomarkers in cell-free body liquids such as
serum or urine. The amount of miRNAs in these samples is much lower than in samples
containing cells; therefore, there is a need for more sensitive methods. There are a number
of protocols for miRNA detection in this book that are based on completely novel
approaches. These exciting techniques utilize nanotechnology, microfluidics, or other engi-
neering innovations to lower the detection limit (Chapters 5, 6, 8, 16, 17, 18, and 20).
A very important aspect of miRNA research is to identify and validate their target
mRNAs. Identifying targets in plants is relatively straightforward due to the high comple-
mentarity between miRNAs and their targets. This near perfect match results in a cleavage
at a specific position on the mRNA, and these cleavage fragments can be sequenced and
therefore identified. Since that protocol was published in the previous edition, there is no
chapter on plant miRNA target identification in this book. However, there are two new
experimental approaches for miRNA target identification in animals included in this edition
(Chapters 7 and 9).
In addition to wet laboratory protocols, miRNA research hugely relies on bioinformat-
ics approaches, probably more so than most other field of biology. This aspect was com-
pletely missing from the previous edition and we now make up for it. There are seven
chapters describing either specific programs or entire tool kits or reviewing certain aspects
of miRNA bioinformatics. These are chapters 10–15 and 19.

Norwich, UK Tamas Dalmay

v
Contents

Preface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V
Contributors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IX

1 Improved Denaturation of Small RNA Duplexes and Its Application

for Northern Blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
C. Jake Harris, David C. Baulcombe, and Attila Molnar
2 High-Throughput RT-qPCR for the Analysis of Circulating MicroRNAs . . . . . 7
Geok Wee Tan and Lu Ping Tan
3 Genome-Wide Comparison of Next-Generation Sequencing
and qPCR Platforms for microRNA Profiling in Serum . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Thorarinn Blondal, Maurizia Rossana Brunetto, Daniela Cavallone,
Martin Mikkelsen, Michael Thorsen, Yuan Mang, Hazel Pinheiro,
Ferruccio Bonino, and Peter Mouritzen
4 Small RNA Profiling by Next-Generation Sequencing
Using High-Definition Adapters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Martina Billmeier and Ping Xu
5 Surface Acoustic Wave Lysis and Ion-Exchange Membrane Quantification
of Exosomal MicroRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Katherine E. Richards, David B. Go, and Reginald Hill
6 Droplet Microfluidic Device Fabrication and Use for Isothermal
Amplification and Detection of MicroRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Maria Chiara Giuffrida, Roberta D’Agata, and Giuseppe Spoto
7 Interrogation of Functional miRNA–Target Interactions
by CRISPR/Cas9 Genome Engineering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
Yale S. Michaels, Qianxin Wu, and Tudor A. Fulga
8 Cell-Free Urinary MicroRNAs Expression in Small-Scale Experiments . . . . . . . 99
Ludek Zavesky, Eva Jandakova, Radovan Turyna, Daniela Duskova,
Lucie Langmeierova, Vit Weinberger, Lubos Minar, Ales Horinek,
and Milada Kohoutova
9 Peptide-Based Isolation of Argonaute Protein Complexes Using Ago-APP . . . . 107
Judith Hauptmann and Gunter Meister
10 Predicting Functional MicroRNA-mRNA Interactions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
Zixing Wang and Yin Liu
11 Computational and Experimental Identification of Tissue-­Specific
MicroRNA Targets . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
Raheleh Amirkhah, Hojjat Naderi Meshkin, Ali Farazmand,
John E.J. Rasko, and Ulf Schmitz

vii
viii Contents

12 sRNAtoolboxVM: Small RNA Analysis in a Virtual Machine . . . . . . . . . . . . . . 149

Cristina Gómez-Martín, Ricardo Lebrón, Antonio Rueda, José L. Oliver,
and Michael Hackenberg
13 An Assessment of the Next Generation of Animal miRNA Target
Prediction Algorithms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175
Thomas Bradley and Simon Moxon
14 The UEA Small RNA Workbench: A Suite of Computational Tools
for Small RNA Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193
Irina Mohorianu, Matthew Benedict Stocks, Christopher Steven Applegate,
Leighton Folkes, and Vincent Moulton
15 Prediction of miRNA–mRNA Interactions Using miRGate . . . . . . . . . . . . . . . . 225
Eduardo Andrés-León, Gonzalo Gómez-López, and David G. Pisano
16 Detection of microRNAs Using Chip-Based QuantStudio 3D Digital PCR . . . 239
Cristina Borzi, Linda Calzolari, Davide Conte, Gabriella Sozzi,
and Orazio Fortunato
17 MiRNA Quantitation with Microelectrode Sensors Enabled
by Enzymeless Electrochemical Signal Amplification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249
Tanyu Wang, Gangli Wang, Didier Merlin, and Emilie Viennois
18 A Robust Protocol to Quantify Circulating Cancer
Biomarker MicroRNAs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265
Emma Bell, Hannah L. Watson, Shivani Bailey, Matthew J. Murray,
and Nicholas Coleman
19 MicroRNAs, Regulatory Networks, and Comorbidities:
Decoding Complex Systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281
Francesco Russo, Kirstine Belling, Anders Boeck Jensen, Flavia Scoyni,
Søren Brunak, and Marco Pellegrini
20 Label-Free Direct Detection of MiRNAs with Poly-Silicon
Nanowire Biosensors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297
Jing He, Jianjun Zhu, Bin Jiang, and Yulan Zhao

Erratum to: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E1
Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303
Contributors

Raheleh Amirkhah • Reza Institute of Cancer Bioinformatics and Personalized Medicine,

Mashhad, Iran
Eduardo Andrés-León • Bioinformatics Unit, Instituto de Parasitología y Biomedicina
“López Neyra”, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IPBLN-­CSIC),
PTS Granada, Granada, Spain
Christopher Steven Applegate • School of Computing Sciences, University of East Anglia,
Norwich, UK
Shivani Bailey • Department of Pathology, University of Cambridge, Cambridge, UK
David C. Baulcombe • Department of Plant Sciences, University of Cambridge,
Cambridge, UK
Emma Bell • Department of Pathology, University of Cambridge, Cambridge, UK;
AstraZeneca, Cambridge Science Park, Cambridge, UK
Kirstine Belling • Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Faculty
of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark
Martina Billmeier • School of Biological Sciences, University of East Anglia, Norwich, UK
Thorarinn Blondal • Exiqon A/S, Vedbaek, Denmark
Ferruccio Bonino • Hepatology Unit and Laboratory of Molecular Genetics and Pathology
of Hepatitis Viruses, Reference Center of the Tuscany Region for Chronic Liver Disease
and Cancer, University Hospital of Pisa, Pisa, Italy
Cristina Borzi • Tumor Genomics Unit, Department of Experimental Oncology
and Molecular Medicine, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori,
Milan, Italy
Thomas Bradley • School of Biological Sciences, University of East Anglia, Norwich, UK;
Earlham Institute, Norwich Research Park, Norwich, UK
Søren Brunak • Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Faculty of Health
and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark
Maurizia Rossana Brunetto • Hepatology Unit and Laboratory of Molecular Genetics
and Pathology of Hepatitis Viruses, Reference Center of the Tuscany Region for Chronic
Liver Disease and Cancer, University Hospital of Pisa, Pisa, Italy
Linda Calzolari • Tumor Genomics Unit, Department of Experimental Oncology
and Molecular Medicine, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori,
Milan, Italy
Daniela Cavallone • Hepatology Unit and Laboratory of Molecular Genetics
and Pathology of Hepatitis Viruses, Reference Center of the Tuscany Region
for Chronic Liver Disease and Cancer, University Hospital of Pisa, Pisa, Italy
Nicholas Coleman • Department of Pathology, University of Cambridge, Cambridge,
UK; Department of Histopathology, Addenbrooke’s Hospital, Cambridge, UK
Davide Conte • Tumor Genomics Unit, Department of Experimental Oncology
and Molecular Medicine, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori,
Milan, Italy
Roberta D’Agata • I.N.B.B. Consortium, Rome, Italy
Tamas Dalmay • School of Biological Sciences, University of East Anglia, Norwich, UK

ix
x Contributors

Daniela Duskova • Faculty Transfusion Centre, General University Hospital in Prague,

Prague, Czech Republic
Ali Farazmand • Department of Cell and Molecular Biology, School of Biology, College of
Science, University of Tehran, Tehran, Iran
Leighton Folkes • The Earlham Institute, Norwich, UK
Orazio Fortunato • Tumor Genomics Unit, Department of Experimental Oncology
and Molecular Medicine, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, Milan,
Italy
Tudor A. Fulga • Radcliffe Department of Medicine, Weatherall Institute of Molecular
Medicine, University of Oxford, Oxford, UK
Maria Chiara Giuffrida • I.N.B.B. Consortium, Rome, Italy
David B. Go • Department of Aerospace and Mechanical Engineering, University of Notre
Dame, South Bend, IN, USA; Department of Chemical and Biomolecular Engineering,
University of Notre Dame, South Bend, IN, USA
Cristina Gómez-Martín • Dpto. de Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de
Granada, Granada, Spain
Gonzalo Gómez-López • Bioinformatics Unit (UBio), Structural Biology
and Biocomputing Programme, Spanish National Cancer Research Centre (CNIO),
Madrid, Spain
Michael Hackenberg • Dpto. de Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de
Granada, Granada, Spain; Lab. de Bioinformática, Centro de Investigación Biomédica,
PTS, Instituto de Biotecnología, Granada, Spain
C. Jake Harris • Department of Plant Sciences, University of Cambridge, Cambridge, UK
Judith Hauptmann • University of Regensburg, Regensburg, Germany
Jing He • Shanghai Integrated Circuit Research & Development Center, Shanghai, China;
School of Life Science, East China Normal University, Shanghai, People’s Republic of
China
Reginald Hill • Department of Biological Sciences, Harper Cancer Research Institute,
University of Notre Dame, South Bend, IN, USA
Ales Horinek • First Faculty of Medicine, Institute of Biology and Medical Genetics,
Charles University Prague and General University Hospital in Prague, Prague, Czech
Republic
Eva Jandakova • Institute of Pathology, University Hospital Brno, Brno, Czech Republic
Anders Boeck Jensen • Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Faculty
of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark
Bin Jiang • Shanghai Integrated Circuit Research & Development Center, Shanghai,
China
Milada Kohoutova • First Faculty of Medicine, Institute of Biology and Medical Genetics,
Charles University Prague and General University Hospital in Prague, Prague, Czech
Republic
Lucie Langmeierova • Faculty Transfusion Centre, General University Hospital in
Prague, Prague, Czech Republic
Ricardo Lebrón • Dpto. de Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada,
Granada, Spain; Lab. de Bioinformática, Centro de Investigación Biomédica, PTS,
Instituto de Biotecnología, Granada, Spain
Yin Liu • Department of Neurobiology and Anatomy, University of Texas Health Science
Center at Houston, Houston, TX, USA; University of Texas Graduate School
of Biomedical Science, Houston, TX, USA
Yuan Mang • Exiqon A/S, Vedbaek, Denmark
 Contributors xi

Gunter Meister • University of Regensburg, Regensburg, Germany

Didier Merlin • Department of Chemistry, Georgia State University, Atlanta, GA, USA
Hojjat Naderi Meshkin • Stem Cells and Regenerative Medicine Research Group,
Academic Center for Education, Culture Research (ACECR), Mashhad, Iran
Yale S. Michaels • Radcliffe Department of Medicine, Weatherall Institute of Molecular
Medicine, University of Oxford, Oxford, UK
Martin Mikkelsen • Exiqon A/S, Vedbaek, Denmark
Lubos Minar • Department of Obstetrics and Gynaecology, University Hospital Brno, Brno,
Czech Republic
Irina Mohorianu • School of Biological Sciences, University of East Anglia, Norwich, UK;
School of Computing Sciences, University of East Anglia, Norwich, UK
Attila Molnar • School of Biological Sciences, University of Edinburgh, Edinburgh, UK
Vincent Moulton • School of Computing Sciences, University of East Anglia, Norwich,
UK
Peter Mouritzen • Exiqon A/S, Vedbaek, Denmark
Simon Moxon • School of Biological Sciences, University of East Anglia, Norwich, UK;
Earlham Institute, Norwich Research Park, Norwich, UK
Matthew J. Murray • Department of Pathology, University of Cambridge, Cambridge,
UK; Department of Paediatrics, Haematology and Oncology, Addenbrooke’s Hospital,
Cambridge, UK; Department of Paediatrics, University of Cambridge, Addenbrooke’s
Hospital, Cambridge, UK
José L. Oliver • Dpto. de Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada,
Granada, Spain; Lab. de Bioinformática, Centro de Investigación Biomédica, PTS,
Instituto de Biotecnología, Granada, Spain
Marco Pellegrini • Institute of Informatics and Telematics, National Research Council
(CNR), Pisa, Italy
Hazel Pinheiro • Exiqon A/S, Vedbaek, Denmark
David G. Pisano • Bioinformatics Unit (UBio), Structural Biology and Biocomputing
Programme, Spanish National Cancer Research Centre (CNIO), Madrid, Spain
John E.J. Rasko • Gene & Stem Cell Therapy Program, Centenary Institute, Camperdown,
Sydney Medical School, University of Sydney, Camperdown, NSW, Australia
Katherine E. Richards • Department of Biological Sciences, Harper Cancer Research
Institute, University of Notre Dame, South Bend, IN, USA
Antonio Rueda • Queen Mary University of London, London, UK
Francesco Russo • Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Faculty of
Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark
Ulf Schmitz • Gene & Stem Cell Therapy Program, Centenary Institute, Camperdown,
Sydney Medical School, University of Sydney, Camperdown, NSW, Australia
Flavia Scoyni • Biotech Research & Innovation Centre (BRIC), University of Copenhagen,
Copenhagen, Denmark
Gabriella Sozzi • Tumor Genomics Unit, Department of Experimental Oncology and
Molecular Medicine, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, Milan, Italy
Giuseppe Spoto • I.N.B.B. Consortium, Rome, Italy; Dipartimento di Scienze Chimiche,
Università di Catania, Catania, Italy
Matthew Benedict Stocks • School of Computing Sciences, University of East Anglia,
Norwich, UK
xii Contributors

Geok Wee Tan • Molecular Pathology Unit, Cancer Research Centre, Institute for Medical
Research, Jalan Pahang, Kuala Lumpur, Malaysia
Lu Ping Tan • Molecular Pathology Unit, Cancer Research Centre, Institute for Medical
Research, Jalan Pahang, Kuala Lumpur, Malaysia
Michael Thorsen • Exiqon A/S, Vedbaek, Denmark
Radovan Turyna • Institute for the Care of Mother and Child, Prague, Czech Republic
Emilie Viennois • Department of Chemistry, Georgia State University, Atlanta, GA, USA
Gangli Wang • Department of Chemistry, Georgia State University, Atlanta, GA, USA
Tanyu Wang • Department of Chemistry, Georgia State University, Atlanta, GA, USA
Zixing Wang • University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA
Hannah L. Watson • Department of Pathology, University of Cambridge, Cambridge, UK
Vit Weinberger • Department of Obstetrics and Gynaecology, University Hospital Brno,
Brno, Czech Republic
Qianxin Wu • Radcliffe Department of Medicine, Weatherall Institute of Molecular
Medicine, University of Oxford, Oxford, UK
Ping Xu • School of Biological Sciences, University of East Anglia, Norwich, UK
Ludek Zavesky • First Faculty of Medicine, Institute of Biology and Medical Genetics,
Charles University Prague and General University Hospital in Prague, Prague,
Czech Republic
Yulan Zhao • School of Life Science, East China Normal University, Shanghai, China
Jianjun Zhu • Shanghai Integrated Circuit Research & Development Center, Shanghai,
China
 Chapter 1

Improved Denaturation of Small RNA Duplexes

and Its Application for Northern Blotting
C. Jake Harris, David C. Baulcombe, and Attila Molnar

Abstract
Small RNAs (sRNAs) are short (18–30 nucleotide) noncoding RNA molecules, which control gene
expression and pathogen response in eukaryotes. They are associated with and guide nucleases to target
nucleic acids by nucleotide base pairing. We found that current techniques for small RNA detection are
adversely affected by the presence of complementary RNA. Thus we established FDF-PAGE (fully dena-
turing formaldehyde polyacrylamide gel electrophoresis), which dramatically improves denaturation
­efficiency and subsequently the detection of sequestered sRNAs.

Key words Small RNA, Sequestration, Polyacrylamide gel electrophoresis, Denaturation, Improved
detection

1 Introduction

Since their discovery as the mediators of gene silencing [1, 2], small
RNAs have been implicated in an ever expanding repertoire of cel-
lular processes, from gene regulation, to the maintenance of genome
integrity. The main method of small RNA detection is by small RNA
Northern blotting, whereby total RNA is separated on a high per-
centage polyacrylamide gel, transferred to a membrane and visual-
ized using radioactively labeled complementary probes [1, 3]. This
technique is similar to long RNA Northern blotting, used for detec-
tion of mRNAs and higher molecular weight transcripts [4]. There
are two main differences between long and small RNA Northern
blotting techniques. First, small RNA Northerns employ 15% poly-
acrylamide gels for separation of total RNA, while long RNA
Northerns use agarose gels. This is because agarose gels are insuffi-
cient to resolve RNA molecules of 18–30 nt in length. The second
difference is that, due to the propensity of long RNA molecules to
form secondary structures, long RNA Northerns proceed in highly
denaturing formaldehyde gels, while small RNA Northerns typically
employ only 7M urea for denaturation through electrophoresis.

Tamas Dalmay (ed.), MicroRNA Detection and Target Identification: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology,
vol. 1580, DOI 10.1007/978-1-4939-6866-4_1, © Springer Science+Business Media LLC 2017

1
2 C. Jake Harris et al.

However, recent reports suggested that high molecular weight

RNA—present in endogenous total RNA samples—might seques-
ter complementary small RNAs from detection, thus implying that
methods for small RNA Northern blotting are not fully denaturing
[5]. We recently validated this result, finding that both small RNA
and high molecular weight RNAs are able to sequester complemen-
tary small RNAs of interest, masking them from detection by small
RNA Northern blotting [6]. We therefore developed a method that
employs formaldehyde to efficiently denature total RNA prior to
entry into a 7 M urea polyacrylamide gel, the so-­called FDF-PAGE
(fully denaturing formaldehyde polyacrylamide gel electrophoresis)
[6]. We found that this technique releases small RNAs from seques-
tration even in the presence of one thousand fold molar excess com-
plementary RNA. FDF-PAGE combines the denaturation efficiency
of long RNA Northern blotting with the relative ease of small RNA
Northerns, because we have found that incubation of total RNA in
formaldehyde is sufficient for full small RNA denaturation, while
long RNA Northerns require the relatively toxic formaldehyde to
be present within the agarose gel itself through electrophoresis.
Critically, this improved method for small RNA detection also
retains the ability to resolve small RNAs of 18–30 nt in length.
We describe here FDF-PAGE as an improved method for small
RNA Northern blotting, which should provide a more accurate
representation of small RNA abundance in the sample. To obtain
an improved global picture of small RNA levels, FDF-PAGE can
also be adapted to generate small RNA libraries. Here, small RNAs
are cut out from the polyacrylamide gel after electrophoresis, puri-
fied and then used as input for a small RNA library preparation
protocols (as described in [6]).

2 Materials

Prepare all solutions using ultrapure autoclaved water (prepared by

purifying deionized water to attain a sensitivity of 18 MΩ cm at
25 °C) and analytical grade reagents. Store all reagents at room
temperature (unless indicated otherwise). Strictly follow local
waste disposal regulations when disposing of waste materials.

2.1 Denaturing 1. MOPS buffer (10×): 200 mM MOPS, 50 mM NaOAc,

Polyacrylamide Gel 10 mM EDTA, pH to 7.0. Store at room temperature in a
Components bottle wrapped with aluminum foil.
2. Acrylamide–bis-acrylamide solution: 40% (w/v) 19:1. Store
at 4 °C.
3. Ammonium persulfate (SIGMA, A3678): 10% solution in
water.
4. N,N,N′,N′-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED). Store at
4 °C.
 Improved Denaturation of Small RNAs 3

5. Formaldehyde (37–40%).
6. Formamide (deionized).
7. Running buffer: 0.5× MOPS buffer diluted in ultrapure auto-
claved water.
8. 10× loading dye: dissolve 5 mg xylene cyanol FF and 5 mg
bromophenol blue in 10 mL water. Store at 4 °C.

2.2 Capillary Blotting 1. Transfer buffer (TB): 20× SSC.

Components 2. Membrane: Hybond-N, NX, N+, or ZetaProbe GT.

2.3 Labeling 1. 10× Polynucleotide kinase buffer.

and Hybridization 2. T4 Polynucleotide kinase, 10 (unit/μL).
Components
3. Hybridization Solution: 0.25 M sodium phosphate buffer
pH 7.2 [7] and 7% SDS.
4. Washing buffer (WB): 2× SSC, 0.1% SDS.
5. Microspin G-25 column.
6. 0.5 M EDTA, pH 7.0.
7. 10 μM of ssDNA oligo complementary to small RNA of
interest.
8. γ32P-ATP.

3 Methods

Carry out all procedures at room temperature unless otherwise

specified.

3.1 15% Denaturing 1. Mix 4.2 g urea, 0.5 mL of 10× MOPS buffer, 3.75 mL of
Polyacrylamide Gel acrylamide:bis-acrylamide solution, and 2.5 mL of ultrapure
Electrophoresis water with a magnetic stirrer in a 50 mL conical flask until the
with 7 M Urea urea is completely dissolved (see Notes 1 and 2). Add 70 μL of
ammonium persulphate (see Note 3) and 3.5 μL of TEMED,
mix thoroughly and cast gel with a 0.75 mm spacer. Insert a
10-well gel comb immediately without introducing air bub-
bles and let it polymerize for 30 min (see Note 4).
2. Assemble electrophoresis equipment and fill with running
buffer according to the manufacturer’s instruction. Remove
gel comb, rinse wells (see Note 5) with running buffer, and
pre-run the gel at 100 Volts for 30 min.
3. In the meantime, prepare RNA samples on ice in the fume
hood. For each gel lane add V μL of RNA (see Note 6),
2.75 μL of formaldehyde, 7.5 μL of formamide, 0.75 μL of
MOPS buffer, and 4-V μL of nuclease free water (15 μL
­volume total) in a 1.5 mL eppendorf tube (see Note 7).
4 C. Jake Harris et al.

Mix and incubate the samples at 55 °C for 15 min. Add 2 μL

of 10x loading dye, mix sample, rinse wells, then load imme-
diately into gel.
4. Electrophorese at 50 Volts until the sample has entered the gel
and then continue at 150 Volts until the dye front (from the
BPB dye in the samples) has reached the bottom of the gel.

3.2 Small RNA 1. Following electrophoresis, pry the gel plates open with a
Transfer by Capillary spatula. Pour 50 mL of TB into a squared petri dish. Transfer
Blotting the gel to TB and soak for 10 min with gentle agitation.
2. Cut a membrane to the size of the gel and equilibrate it in
distilled water in a squared petri dish for 1 min. Pour off water,
add 20 mL of TB, and equilibrate for 5 min.
3. Set up the capillary blot (Fig. 1), and transfer the RNA
overnight.
4. Dismantle the capillary blot and dry the membrane with the
RNA side up for 3 min on Whatman 3MM paper. Cross-link
the RNA to the membrane with UV at 120,000 μJ (Stratagene,
UV Stratalinker 2400) (see Note 8).

3.3 Hybridization 1. Transfer the membrane into a hybridization tube with the
with a Radioactively RNA side facing the center of tube. Add 5–10 mL of hybrid-
Labeled Oligoprobe ization solution and incubate at 40 °C for 30 min with slow
rotation (pre-hybridization step).

8.

7.

6.

5.

4.
3.
2.
1.

Fig. 1 Capillary blotting with 20× SSC without reservoir. Set up the system fol-
lowing the numbers. Transfer the RNA overnight. 1. Clean glass plate; 2. Soaked
gel; 3. Pre-wet membrane; 4. Three layers of pre-wet 3MM Whatman paper; 5.
10 mL of 20× SSC; 6. Five centimeter thick pile of roll paper; 7. Glass plate; 8.
weight (0.5 kg)
 Improved Denaturation of Small RNAs 5

2. Mix 2 μL of 10 μM single-stranded DNA (ssDNA) oligo (21–

24 nucleotide, reverse complement to the small RNA you
would like to detect) with 10 μL of sterile distilled water in an
eppendorf tube and incubate at 90 °C for 5 min. Chill the
tube on ice for 3 min and add 2 μL of PNK buffer, 5 μL of
γ32P-ATP, and 1 μL of T4 PNK.
3. Mix by pipetting 5 times and incubate the reaction mixture at
37 °C for 10–15 min.
4. Separate the labeled DNA from unincorporated nucleotides
on a Microspin G-25 column according to the manufacturer’s
instruction. 1 μL of separated probe should count
500–2000 cps.
5. Add 2 μL of 0.5 M EDTA to the radioactive probe, mix by
pipetting 5 times and denature by placing the tube at 90 °C
for 5 min, then transfer the tube on ice.
6. Pour off the pre-hybridization solution. Mix the denatured
ssDNA probe with 5 mL of fresh hybridization solution in a
15 mL Falcon tube and add to the hybridization tube.
7. Incubate at 40 °C overnight by slowly rotating the hybridiza-
tion tube.
8. Pour off the hybridization solution and wash the membrane
with excess of WB at 40 °C for 10 min.
9. Repeat the washing step for two more times.
10. Wrap the membrane with Saran wrap and expose to Phosphor
Image plates. If necessary, increase the stringency of the washes
by lowering the salt content of the washing buffer (i.e., 1×
SSC) or increasing the temperature during the wash.

4 Notes

1. This provides 10 mL volume, sufficient for casting two

0.75 mm gels using BIO-RAD mini-PROTEAN Tetra cell.
2. To speed up the dissolving of urea, place the 10 mL volume in
microwave for a maximum of 10 s (without magnetic
stirrer!).
3. We find that 10% ammonium persulfate performs best when
made fresh, but can be kept at 4 °C for a maximum of 2 weeks.
4. Clean all gel loading and running apparatus with soap, rinse
thoroughly with deionized ultrapure water, and drip-dry
before use. This helps to reduce the possibility of RNAse con-
tamination that can degrade the sample.
5. Can use a 10 mL syringe and needle to squirt running buffer
directly into wells. This should be performed immediately after
comb removal and again just prior to loading the samples.
6 C. Jake Harris et al.

6. Typically, 5–15 μg of total RNA per lane is sufficient.

7. Formaldehyde, formamide, 10× MOPS, and nuclease-free
water can be prepared as a master mix on ice before adding to
each RNA sample.
8. After cross-linking, can make a small cut off the top right hand
corner to help discern membrane orientation through subse-
quent steps.

Acknowledgment

C.J.H was supported by a BBSRC PhD Studentship. D.C.B. is the

Royal Society Edward Penley Abraham Research Professor. This
work was supported by the ERC Advanced Investigator grant
ERC-2013-AdG 340642 TRIBE. A.M. is a Chancellor’s Fellow at
the University of Edinburgh.

References
1. Hamilton AJ, Baulcombe DC (1999) A species 5. Smith NA, Eamens AL, Wang M-B (2010) The
of small antisense RNA in posttranscriptional presence of high-molecular-weight viral RNAs
gene silencing in plants. Science 286:950–952 interferes with the detection of viral small
2. Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, Bartel DP RNAs. RNA 16:1062–1067
(2000) RNAi: double-stranded RNA directs 6. Harris CJ, Molnar A, Muller SY, Baulcombe
the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to DC (2015) FDF-PAGE: a powerful technique
23 nucleotide intervals. Cell 101:25–33 revealing previously undetected small RNAs
3. Molnár A, Schwach F, Studholme DJ, sequestered by complementary transcripts.
Thuenemann EC, Baulcombe DC (2007) miR- Nucleic Acids Res 43:7590–7599
NAs control gene expression in the single-cell 7. Green MR, Sambrook J (2012) Molecular
alga Chlamydomonas reinhardtii. Nature 447: cloning: a laboratory manual, 4th edn. Cold
1126–1129 Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
4. Terry B, Karol M, Du T (2004) Analysis of Harbor. ISBN: 978-1-936113-42-2
RNA by Northern and slot blot. Curr Protoc
Mol Biol Chapter 4
 Chapter 2

High-Throughput RT-qPCR for the Analysis

of Circulating MicroRNAs
Geok Wee Tan and Lu Ping Tan

Abstract
Reverse transcription followed by real-time or quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) is the
gold standard for validation of results from transcriptomic profiling studies such as microarray and RNA
sequencing. The current need for most studies, especially biomarker studies, is to evaluate the expression
levels or fold changes of many transcripts in a large number of samples. With conventional low to medium
throughput qPCR platforms, many qPCR plates would have to be run and a significant amount of RNA
input per sample will be required to complete the experiments. This is particularly challenging when the size
of study material (small biopsy, laser capture microdissected cells, biofluid, etc.), time, and resources are
limited. A sensitive and high-throughput qPCR platform is therefore optimal for the evaluation of many
transcripts in a large number of samples because the time needed to complete the entire experiment is short-
ened and the usage of lab consumables as well as RNA input per sample are low. Here, the methods of
high-throughput RT-qPCR for the analysis of circulating microRNAs are described. Two distinctive qPCR
chemistries (probe-based and intercalating dye-based) can be applied using the methods described here.

Key words High throughput, qPCR, Preamplification, microRNA, TaqMan, miScript

1 Introduction

The throughput of each qPCR run, as indicated by the amount of

transcripts and samples that can be studied in one single qPCR
plate/chip, can vary up to 100 times between platforms (Fig. 1).
The demand for high-throughput qPCR has become very common,
especially in studies which need to analyze a large panel of tran-
scripts in a large number of samples. High-throughput qPCR is an
answer to studies that utilize low starting input of samples such as
laser capture microdissected tissues, single cells and cell-­free nucleic
acid in biofluid samples. Also, as compared to qPCR platforms of
lower throughput, the time and cost needed to complete the experi-
ments are reduced when high-throughput qPCR is utilized.
In high-throughput microfluidic qPCR platform, each qPCR
reaction is carried out in a very small volume (range of nanoliter).
Preamplification is necessary to increase the target amount prior to

Tamas Dalmay (ed.), MicroRNA Detection and Target Identification: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology,
vol. 1580, DOI 10.1007/978-1-4939-6866-4_2, © Springer Science+Business Media LLC 2017

7
8 Geok Wee Tan and Lu Ping Tan

Fig. 1 (a) The numbers of reaction wells/chambers available in each qPCR plate/chip format are different and
can vary up to 100 times. (b) The maximum numbers of assays and samples that can be analyzed in different
format of plates/chips are compared under the setting of singleplex PCR and triplicate qPCR reactions per
sample. Standard SBS plate format has lower throughput compared to high-throughput chips such as
Fluidigm’s dynamic array

qPCR so that targets/samples can be distributed equally among

reaction chambers [1]. In order to prevent garbage in garbage out,
cautious steps should be taken to evaluate if nonspecific amplifica-
tions and over amplification of targets are introduced during the
preamplification step. Stringent quality control has to be applied
on each primer assay by analyzing data from positive and negative
controls to rule out nonlinear and/or nonspecific amplification.
For microRNA (miRNA) expression studies, different reverse
transcription (RT) and qPCR chemistries are available. TaqMan is
a probe-based system which is designed to specifically detect miR-
NAs with reference sequence registered in miRBase. On the other
hand, miScript is an intercalating dye-based system which detects
miRNAs with reference sequence registered in miRBase as well as
all isomirs of the said miRNA. At times, miRNA with reference
sequence registered in miRBase may not be the most abundant
miRNA expressed in the samples of interest [2]. Therefore, the
decision on using primer assay which is specific or generic will have
to be based on research needs.
In this chapter, the protocols for RT, preamplification, and
qPCR of both TaqMan and miScript systems are described. These
protocols are optimized for the use with microfluidic chips in
BioMark (Fluidigm) but nonetheless, the quality control (QC)
principles developed and described here can be applied to all
­high-­throughput RT-qPCR. Details are given on how to identify
and exclude data from downstream analysis based on evidences of
 High-Throughput RT-qPCR 9

nonspecific and/or nonlinear amplifications. Normalization

methods for the analysis of circulating miRNAs data are also
explained here. It is foreseeable that the lab methods described
here might require modifications in the future due to the changes
of reagents or protocols by manufacturers. Nonetheless, principle
of data QC detailed here is always valid and should be applied to
avoid garbage in, garbage out.

2 Materials

2.1 Positive 1. RNA from pooled cell lines or pooled synthetic oligonucle-
and Negative Controls otides (see Note 1).
2. Nuclease-free water.

2.2 TaqMan System 1. TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit: 100 mM

dNTPs, RNase Inhibitor (20 U/μl), RT Buffer (10×),
Multiscribe Reverse Transcription (50 U/μl).
2. TaqMan MicroRNA Assays: RT primer (5×) and real time
primer (20×).
3. TaqMan PreAmp Master Mix (2×).

2.3 miScript 1. miScript II RT kit: miScript Nucleics Mix (10×), miScript

PCR System HiSpec Buffer (5×), miScript Reverse Transcriptase Mix.
2. miScript Primer Assay (10×).
3. miScript PreAMP Buffer (5×).
4. HotStarTaqDNA Polymerase.
5. miScript PreAMP Universal Primer.
6. miScript Universal Primer (10×).
7. Side Reaction Reducer.

2.4 qPCR 1. Assay Loading Reagent (2×).

2. GE Sample Loading Reagent (20×) (for TaqMan system only).
3. DNA Binding Dye Sample Loading Reagent (20×) (for miS-
cript PCR system only).
4. TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG (for
TaqMan system only).
5. SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX (for miScript
PCR system only).
6. Dynamic Array IFC (integrated fluidic circuit) for gene expres-
sion (Fluidigm).

2.5 Others 1. Dilution buffer: TE (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) or

nuclease-free water.
Random documents with unrelated
content Scribd suggests to you:
 Paavo vilkaisi nuhtelevasti tyttöön.

— Turhia. Sattuuhan niitä onnettomuuksia joskus. Mutta ei niitä

kannata ajatella… Äitiä taitaa jo pelottaa taas, lohdutteli hän
huolettomasti.

— Niin. Jos vielä kotoa vievät… Mutta johan minä kokonaan

unohdan kahvin. Ja huokaisten kiiruhti emäntä tuvan puolelle.

Kahvi tuotiin. Tarjottimella oli sanomalehti ja leipäkorissa tuoretta

vehnäleipää.

— Katsopas, Paavo, millainen onni sinulla oli. Tuoretta pullaa, jota

koko kesänä ei ole saatu maistaakaan. Ainon tuomaa ja leipomaa.

— Voi täti! Ei se taida olla hyvääkään. Oli niin vähän sokeria,

huudahti tyttö, lehahtaen punaiseksi kuin ruusu.

*****

Pian piti Ainon mennä ja Paavo lähti häntä saattamaan.

Miltei äänettöminä ja ikäänkuin jonkinlaisessa ahdistuksessa he

kulkivat vieretysten yli niityn, jonka sänki oli alkanut voimakkaasti
työntää apilasta. Minttujen väkevä tuoksu huumasi ja ojasta
kurkisteli kaino, ihastuttava suolemmikki ikäänkuin arastellen. Oli
ihmeen tyyntä. Järvi päilyi tiheiden leppäpensastojen ympäröimänä
ja pikkulinnut hyppelivät hiljaisina himmeästi kiiltävien lehtien
välissä.

Vasta kun polku painui metsään, pysähtyi tyttö ja tuijotti hetken

nuorukaiseen. Sitten kiersi hän kätensä tämän kaulaan ja katsoi,
katsoi kuin olisi tahtonut nähdä sydämen syvyyteen…
 — Oletko kaivannut Aino? kysyi nuorukainen hiljaa.

— Ja sitä sinä kysyt!

— Minä luulin, että olisit jo kihloissa… toisen kanssa.

Tyttö ponnahti erilleen.

— Hyi sinua!… Mutta ethän. Se ei ollut totta, sano?

— Ei, ei ollut… Mutta olen sitä joskus toivonut, ihan todella. Joskus
vain, pimeinä hetkinä. On tullut mieleen, ettei sinua enää näkisi. Ja
silloin olen toivonut… sinulle helpotukseksi.

Ainon silmiin kihosi vettä ja sieraimet värisivät herkkinä.

— Ei koskaan, kuiskasi hän epäselvästi. — Ja kukapa minusta.

Mutta sinä! Jos tietäisit, kuinka olen ollut mustasukkainenkin. Siellä
on kaunottaria, olen ajatellut. Paavo ei muistakaan enää
maalaistyttöään… Niin olen ajatellut väliin, oletko vihainen minulle?

— Olen hirveästi, oikein suutuksissani.

Tyttö hiipi hänen rinnalleen.

— Ethän.

— Olen, olen. Ikinä et saa anteeksi. Hiljaisuus. Tytön syvistä

silmistä kuulsi epäröivä huoli.

— Paavo, kuiskasi hän.

Silloin nuorukainen sulki hänet syliinsä. —

 — Nyt minä menen. Juoksen oikein, sanoi tyttö iloisesti, posket
punertavina ja silmissä unen raukeus.

— Näkemiin sitten, Aino.

— Näkemiin, Paavo,… pian!

Tyttö kiepsahti ympäri, astui muutaman askelen, mutta kääntyi

heti ja pysähtyi.

— Tulehan tänne Paavo vielä!

— No, mitä sitten?

— Tule nyt, minulla on asiaa.

Nuorukainen asteli hänen luokseen. Silloin tyttö tarttui hänen

päähänsä ja kuiskasi hiljaa, aivan korvaan.

— Rakas Paavo!

Sitten hän lähti täyttä vauhtia kirmasemaan kotiin.

*****

Kun Paavo palasi, istui isä yhä kahvipöydän ääressä, otsa rypyssä
ja niin syventyneenä lukemiseensa, ettei hän näyttänyt tulijaa
huomaavankaan. Kului hetkiä. Poika ei tahtonut häiritä vanhusta,
kunnes tämä yhtäkkiä huudahti.

— Jumalani! Minun eläkkeeni. Nyt olen varmaankin sen

menettänyt.

— Mitä sinä sanot, isä?

 — Tohtori Koski on kuollut. Salaperäinen tohtori Koski, joka
varmaankin oli parhain ihminen, minkä koskaan olen tavannut.

— Enhän minä ymmärrä sinua ollenkaan, isä, sanoi huolestunut

poika ihmeissään.

Vanhus mietti pitkän aikaa mitään vastaamatta ja mutisi vihdoin

kuin itsekseen.

— Niin, hänhän on kuollut nyt, eikä lupaukseni kai enää velvoita.

Sitäpaitsi, eihän sinun tarvitse siitä muille hiiskuakaan.

Sitten alkoi hän kertoa.

— Siihen aikaan asuimme vielä kaupungissa, eikä minulla ollut tätä

taloa…

———

Ilta hämärtyi. Rusko purppuroi taivaanrannan ja heitti loihtuisan

kajonsa sen huoneen akkunasta, jossa poika jännittynein mielin
kuunteli isänsä kertomusta.

Oli elokuun 17 päivä armon vuonna 1916.

VII.

Jäähyväiset.

Suurena ja punertavana kuu kohosi yli metsänreunan. Sen

kiehtovassa valossa kimmelsi joki, jonka rannoilla, siellä täällä nukkui
tuuhea, matalahko koivu tai tiheä pajupensasto. Muutama vaalea
tähti vilkutti vedenkalvosta ja niityn suuret kastepisarat oli loihtuisa
yö muuttanut sädehtiviksi päärlyiksi. Ei ääntä, ei todellisuutta. Yön
ihmeellinen lumous oli hetkeksi tuudittanut luonnon elokuiseen
uneen.

Metsänreunassa, jossa varjo oli synkkänä hiipinyt nurmikolle,

näytti vanha, harmaa lato nukkuvan. Sen oviaukko ammotti
mustana, mutta keskellä aukkoa hehkui tulinen piste, joka
levottomasti liikahti, kirkastui ja himmeni. Tarkkaava silmä saattoi
nähdä nuorukaisen istuvan kynnyksellä paperossia poltellen.

Kauempaa, maantieltä kuului askeleita, keveätä, tiuhaa

rapsahtelua. Sitten ääni lakkasi, mutta kastekimalteisella niityllä liiteli
valkea, notkea olento, kuin yön hengetär. Se läheni. Nyt otti
nurmikon varjo sen syliinsä… Nyt oli se jo ladon luona ja pysähtyi…
Kuului keveä hupsahdus, kun nuorukainen hyppäsi maahan
kynnykseltä ja tulinen piste sammui. Ladon harmaata seinää vasten
kuvastui kaksi haamua, toinen oli tumma, toinen valkea. Kauan aikaa
seisoivat ne liikkumatta, ääneti. Sitten tumma otti askeleen…
Haamut näyttivät sulautuvan yhteen.

*****

— Voi sinua, Paavo. Taas lähdet. Ja näin pian, kuului hiljaa ja

kuiskaten hämärästä.

— Ehkä palaan vielä, ennenkuin oikein lähden. Mutta varmasti en

voi luvata.

— Tai et palaa koskaan.

— Hyvänen aika. Älä nyt toki tuollaista kuvittele.

Hiljaisuus.

— Paavo, kun voisi kerran oikein puhua. Sanoa kaikki…

— Etkö sitten voi? Minullekaan?

— Katsos… Minusta tuntuu… Ei, en osaa kuitenkaan…

— Sano, Aino.

— Ei se ollut mitään. Tyhjänpäiväistä.

— Eikö sydämesi enää olekaan avoin minulle, Aino?

Äänettömyys. Kulmakarvojen syvään varjoon kihosi kaksi

kimmeltävää helmeä, sitten ne vierähtivät pois, jäi vain silmien
lämmin hohde. Tyttö painautui nuorukaisen rintaa vasten ja kuiskasi
kiihkeästi.

— Tiedäthän sinä sen… Mutta minusta tuntuu… Minun on niin

kauheata ajatellakaan, että sinä et enää palaisi… Ei, älä keskeytä, ei
siinä ole kaikki. Mutta jos sinä palaat loistossa ja kunniassa. Jos
teidän suuri ajatuksenne toteutuu, niin… niin minusta ei ole sinulle.

— Aino!

— Enkä minä tule sinulle… Silloinhan sinä olet suuri sotaherra ja…
ja elät hienoissa piireissä… Minä olen maalaistyttö… Ja sellaisena
pysynkin.

— Tahtoisitko, että jäisin kotiin? kysyi nuorukainen miltei

katkerasti.

— En, en. Sitä en tarkoittanut. Sinun velvollisuutesi on kai

mennä… Nyt sinä olet pahoillasi ja suutuksissasi. Johan sanoin, että
oli tyhmyyksiä vaan… Anna anteeksi, Paavo, minusta niin tuntuu,
etten koskaan enää saa olla sinun kanssasi näin.

Tyttö kiersi kiihkeästi käsivartensa nuorukaisen kaulaan ja taas

kihosi kyyneleitä hänen silmiinsä. Hänen kaunispiirteiset kasvonsa
näyttivät valjuilta varjon hämärässä.

— Et saa ajatella tuollaisia, Aino, ethän. Muistellaan ennemmin

jotain muuta, entisiä. Annahan kun kerron. Muistatko… muistatko
sitäkin, ensimäistä kertaa. Täällä oltiin, tässä samassa ladossa,
saman joen rannalla ja oli vielä sama aika kesästäkin, vaikka monta
vuotta sitten. Muistatko, miten monta?

— Kolme, kuului varmasti.

 — Niin, kolme. Ajatteles, olit juuri täyttämäisilläsi
seitsemäntoista… Olimme tulleet ravustamaan. Minä tein keppejä ja
sinä kiinnitit syötit. Oli helteinen, hiostava sunnuntai-iltapäivä ja
auringon sauhuinen ilma värähteli kesantopellolla. Pistimme kepit
jokeen ja sinä hyppelit yli ojien niin että paksu hiuspalmikkosi
heilahteli; annoit ravun nipistää sormiasi ja nauroit, kun tihkui verta
hiukkasen. — Sitten kohosi nopeasti synkkä, paksu pilvenmöykky
metsän takaa ja aurinko paahtoi niin, että tahtoi siihen paikkaan
uupua… Jo alkoi tiputella, suuria, raskaita pisaroita. Silloin sinä kiisit
kuin tuulispää latoon. Minä koin vielä kepit, muistatko, kuinka
hirveän suuren saksivaarin sainkin, mutta sitten oli minunkin
riennettävä sateensuojaan… Hengästyneenä saavun tähän ovelle.
Heinien tuoksu hulmahtaa kasvoilleni, mutta sinua ei näy missään.
Kiipeän yli kynnyksen, katsahdan vähän ihmeissäni ympärilleni ja
silloin, äkkiarvaamatta saan huikean tukon heiniä kasvoilleni. Heitto
on niin voimakas, että kaadun, mutta samalla on se järkyttänyt
sinutkin tasapainosta ja nauraen sinä putoat korkean kasan päältä
miltei suoraan syliini ja minä otan vastaan sinun notkean, alaspäin
vierivän ruumiisi… Silloin leimahtaa hetkeksi kaikki oudon valoisaksi,
seuraa ankara jyrähdys kuin olisi kymmenellä tykillä yhtaikaa
ammuttu, se jatkuu kumeana jylinänä ja rankka sadekuuro pieksee
kattoa… Sinä olet muuttunut totiseksi ja povesi aaltoaa levottomasti
vasten rintaani… Minä puristan sinua, ensin hiljaa ja arkaillen, sitten
lujemmin… Ummistat silmäsi… Kuuluu onnen ensimäisiä
kuiskauksia… Muistatko?

— Muistan, muistan Paavo, vastasi nuori tyttö onnellisena. Syntyi

hiljaisuus.

— Mutta paljon selvemmin minä tänään muistan erään toisen

tapauksen, jatkoi neitonen vihdoin.
 — Minkä sitten, Aino?

— Vuosi takaperin…

— No niin?

Oli kolea ja pilvinen elokuun ilta, ei tällainen kuin nyt. Koko päivän
oli satanut. Eräs tyttö istui kamarissaan ikävöiden ja katsellen
ikkunasta puistoon. Silloin välähti pensaiden välissä… Lyhty siellä
kulki hitaasti, kuin ilmassa riippuen, lähellä maanpintaa. Sen takaa
saattoi erottaa jalat polvien kohdalta; ne näkyivät ottavan varovaisia
askeleita, hiipien pitkin kaalimaan vakoa. Tuon tuostakin käsi
koukkasi maahan ja hämärä valonkajastus lankesi kasvoille… Tytön
sydän sykähti. "Matoja noukitaan", ajatteli hän, tullen levottomaksi.
"Hän se on, hän se on", riemuitsi aavistus, mutta itsekseen hän
sanoi: "Vaikka marjan varkaita olisi. Menen katsomaan…" Niin, sitten
ei muuta olekaan… Tai onpas. Erään vaon päässä lyhty painui
maahan ja jäi paikoilleen. Se valaisi suuren orapihlajan kiiltäviä ala-
lehtiä. Sitten sen valopiiriin tuli jotakin valkeata, hame ehkä, ja
tarkemmin katsoen näki sivummalla saappaat. Siinä onkin kaikki…
Saappaat vain tulivat ehkä lähemmäksi… Ja kuuluihan tosiaan
kuiskauksiakin:

"Kalaanko aiot?"

"Niin… Mitä sanoisit, jos hiukan viipyisin kalamatkallani?"

"Viipyisit!… Montako päivää?"

"Jos menisi viikkoja, ehkä kuukausia?…"

— Sen illan perästä ei tuli ole koskaan kulkenut pensaiden välillä…

 Hiljaisuus.

— Se oli kaunista, Aino. Kerro vielä.

Surumielisenä pudisti tyttö päätään, eikä vastannut.

*****

Kuu oli noussut korkealle ja saanut hopeaisemman värihohteen.

Nuorukainen istui kynnyksellä heinän kortta pureskellen, tyttö

nojasi päätään seinään ja tuijotti kaukaisuuteen niin mietteissään,
että hän näytti nukkuvan valveillaan. Kauan aikaa olivat he olleet
äänettöminä.

Vihdoin katsoi nuorukainen kelloaan ja hypähti maahan.

— On aika jo; sanoi hän hiljaa. Tyttö vavahti ja tuntui ikäänkuin

heräävän. Hänen silmänsä kiintyivät oudon suurina nuorukaiseen.

— Et usko, kuinka on raskasta, kuiskasi hän. — Paljon raskaampaa

kuin vuosi sitten… Minusta tuntuu…

— Sinusta tuntuu?

— Minusta… minä aavistelen, että sinä et palaakaan… Tai, että

minä…

— Taas sinä sitä samaa, Aino. Äänettöminä astellen olivat he

saapuneet maantielle, metsän reunaan.

— Etkö sinä voisi jäädä vielä muutamaksi päiväksi? Minun on niin

hirveän ikävä, kysyi tyttö nuorukaisen käteen tarttuen.
 — En voi, Aino. Ja mitä se hyödyttäisi. Lähdettävä olisi kumminkin,
eikä se silloin olisi yhtään helpompaa. Äitikin on niin levoton, eikä
nuku öisin. On parempi, kun olen poissa kotoa.

— Niin, niin. Mene sinä vaan, Paavo. Minä vielä teen lähtösi
vaikeammaksi ruikutuksillani. Annathan anteeksi, sanoi tyttö
kiihkeästi.

— Sinä olet niin alakuloinen ja lohduton tänään.

— En. En ole enää, sen lupaan. Äänettömyys. Sitten sulki

nuorukainen neidon syliinsä.

— Hyvästi, kuiskasi hän tuskin kuuluvasti.

— Hyvästi, rakas… rakas, kuului tukahtunut vastaus.

II.
Keksintö
I.

Testamentti.

Kauniin huvilansa puistossa, suuren, tuuhean vaahteran alla, istui

herra Otto Vahlberg, nuori, vaaleaverinen, lapsuudestaan saakka
Suomessa oleskellut, mutta silti Ruotsin alamainen aviomies, joka
juhannuksena oli mennyt naimisiin leskirouva Bernerin ihastuttavan
ja tavoitellun tyttären kanssa. Oli elokuun 18 p. v. 1916. Ilma oli
hiostuttavan lämmin ja aivan tyyni. Vaikka auringon säteet vain
vaivoin siivilöityivät vaahteran vehmaitten lehvien lomitse,
muodostaen omituisen, liikehtivän valo- ja varjoverkon sille pyöreälle
pöydälle, johon herra Vahlberg nojasi kyynärpäätään, kihosi otsalle
hikikarpaloita, kellertävän valkean kesätakin kainalokuopat kostuivat
ja silmät, jotka välinpitämättöminä olivat kiitäneet sinne tänne
sanomalehden riveillä, pyrkivät väkisinkin painumaan umpeen.
Kalpeista, hiukan väsähtäneistä kasvoista kuvastui uneliaisuus ja
lerpallaan olevien huulten raossa riippui sammunut paperossi.

Juurista punotussa nojatuolissa, pöydän toisella puolen, istui

leskirouva, majurinna Berner, ainainen sukankudin käsissään, tumma
pitsimyssy päässään, yhtä hienon ja sielukkaan näköisenä kuin koska
tahansa ja tuon tuostakin vilkaisten lempeästi nuoreen
vävypoikaansa. Hänen tavattomasti ohentuneessa tukassaan oli yhä
vielä kaunis kastanjanruskea väri ja vaikka hänen kasvoillaan oli
uurteita, kuvastui niistä yhä vielä nuoruuden päivien kauneus, joka
tuntui vuosien kuluessa muuttuneen vain henkevämmäksi ja
äidillisemmäksi. Hänellä oli lihavahko, joltisenkin raskas ruumis ja
hänen rintansa tiheä nousu ja lasku ilmaisivat sydänvikaisen
ahdistuneen hengityksen.

Pikkulinnut tirskuivat oksilla, puiston takaa pilkoitteli järven

rasvatyyni pinta ja nurmikentän monivärisissä kukkasissa surisi
mehiläisten ahkera parvi.

Tiheän kuusama-, syreeni- ja siperialaisen hernepensaston

ympäröimän huvilan portaita kiiti nuori, notkea, valkopukuinen
nainen keveästi kuin keijukainen alas pihamaalle. Hän oli rouva Karin
Vahlberg, joka vielä näytti vallattomalta tytöltä, eikä tuntunut
suinkaan olevan taipuvainen vaihtamaan kulmikkaita ja huimapäisiä
liikkeitään rouvamaiseen tahdikkuuteen ja arvokkuuteen. Hulmuavin
hamein hän nytkin juoksi pitkin nurmikenttää suoraan vaahteraa
kohti. Tällä kertaa ei hän kuitenkaan pysähtynyt kukkasoikioitten luo,
siepatakseen resedan tai tulipunaisen unikon hiuksiinsa, vaan häntä
näytti kannustavan todellinen kiire ja jo kaukaa hän huusi
hengästyneenä ja käsiään hurjasti huitoen:

— Otto, Otto! Kuuletko yhtään, vetelys?

— Kuulen, olen kuullut ja tulen kuulemaan, mikäli ei huutosi

puhkaise rumpukalvojani.

Nuori rouva pysähtyi puolisonsa eteen ponnistuksesta hehkuvana

ja ampui kuin tykillä, syvänsinisten silmien säihkyessä ja
irtaantuneiden kiharoiden valuessa punertuneelle poskelle.

— Minä olen saanut kartanon!

— ?!

— Luolakosken kartanon!… Niin!

Ja äkkiä kiepsahtaen äitinsä kaulaan, jatkoi onnesta melkein

kyyneliin liikutettu nainen.

— Ajattele, äiti, sinun vanhan kotitalosi, sinun rakkaan

syntymäpaikkasi, josta aina niin ikävöiden olet puhunut…

Mutta äkkiä hän lakkasi ja muuttui totiseksi.

— Hyvä jumala, äiti! Mikä sinun on?… Pullo, Otto, pullo, pullo! Se
on minun huoneessani, mutta pian!

Leskirouva Berner oli käynyt kalman kalpeaksi. Kudin putosi hänen

käsistään, hän puristi sydäntään ja näytti tukehtuvan. Toinen käsi,
joka taudinomaisesti puserti juuri tuolin kaidetta, vapisi
huomattavasti, silmät painuivat umpeen ja tumma varjo laskeutui
syvään vaipuneille luomille.

— Äiti, rakas äiti! Anna anteeksi, olin varomaton, enkä muistanut

sairauttasi, puheli nuori rouva onnettomana, miltei vaikertaen,
hieroen potilaan ohimoita ja pitäen hänen nenänsä edessä
hajuvesipulloa, jonka Otto oli vihdoinkin tuonut.

— Ei se ole mitään. Se on jo ohitse… Mutta tieto tuli niin äkkiä…

Mitä sinä sanoit, Karin? Selitä nyt tarkemmin, rakas lapsi. Vai oletko
taas hassutellut tapasi mukaan?
 — Niin, äiti, minä olen saanut Luolakosken. Lakiasiain-toimisto
Korte & Kivimaa vastikään soitti, että tohtori Kustaa Koski on
testamentissaan määrännyt minulle koko kartanon irtaimistoineen
päivineen. Tuomari kysyi, halusinko lähteä sitä katsomaan ja milloin,
koska toiminimi oli saanut huolekseen järjestää kaikki testamentista
aiheutuvat asiat… Mutta äiti, sinähän voit jälleen huonosti.

— Se on ohimenevää, ei se ole mitään… Tohtori Koski, kuka hän

on?
En minä tunne sen nimistä. Kuinka se voi olla mahdollista?

Nuoren rouvan silmät tummenivat hämmästyksestä; innoissaan oli

hän nähtävästi unohtanut kaikki sivuseikat ja vasta nyt tuntui hänelle
selviävän asian eriskummallisuus. Tosiaankin! Kuka oli tohtori Koski,
kuka oli se outo lahjoittaja, joka oli määrännyt suuren kartanonsa
"neiti Karin Bernerille" perinnöksi, otaksuttavasti ollenkaan
tietämättä, että tämä neiti nyt oli rouva?

— Minä luin sanomalehdestä hänen kuolemastaan, sanoi herra

Vahlberg. Hän lienee ollut etevä tiedemies, joka vanhuutensa päivinä
oli elänyt aivan erakkona ja joka tietenkin oli Luolakosken kartanon
omistaja. Mutta minä en ymmärrä, ellet sinä äiti, eikä Karin häntä
edes tunne, niin miten on testamentti selitettävissä? Mikäli ei Karin
nyt taas vehkeile.

— Vehkeile, pölkkypää! Onko kartanon periminen vehkeilyä, mitä?

Soita Korte & Kivimaalle, jos kerran minua epäilet.

Majurinna Berner näytti omituisesti hiljentyneen. Hänen silmissään

oli tuijottava ilme ja niiden katse tähtäsi puiston varjoisaan
vihreyteen mihinkään erikoisesti kiintymättä. Hänen aivonsa
tuntuivat turhaan etsivän ratkaisua sille, minkä hämärä, hiipivä
aavistus sanoi, aavistus niin arka, että hän tuskin oli siitä tietoinen.
Pitkän aikaa viipyi hän liikkumattomassa asennossaan ollenkaan
kuulematta nuorten sanasotaa ja umpikujaan joutunutta pohdintaa.
Vihdoin sanoi hän lempeästi, hiljaisella äänellään, johon entinen
tyyneys oli jo palannut.

— Otto, tuo minulle se lehti, jossa hänestä puhutaan. Äläkä

unohda silmälaseja. Minä tahdon tarkempia tietoja. Tämä on niin
ihmeellistä.

Sanomalehti ei tuonut suurtakaan selvitystä. Se mainitsi muutamia

vuosilukuja, kertoi vainajan pitkistä ulkomaanmatkoista ja
yksinkertaisesta, yksinäisestä elämästä maatilallaan, joka vuodesta
1902 oli ollut hänen hallussaan. Se kertoi suuresta kunnioituksesta ja
rakkaudesta, jota alustalaiset olivat tunteneet aina avuliasta
herraansa kohtaan, mutta ihmeen vähän se tiesi
yksityiskohtaisemmin kuvata vainajan vaiheita.

Pettyneenä ja yhä enemmän hämmästyneenä rouva Berner laski

lehden käsistään. Mitä syytä oli tällä herralla lahjoittaa kartanonsa
hänen tyttärelleen? Oliko kenties majuri ollut hänen ystävänsä?
Mutta kuinka ei siitä majurin vielä eläessä koskaan oltu puhuttu?…
Luolakoski, vanha, romanttinen kotikartano, jonka satavuotinen
puisto kasvoi lehteviä jättiläislehmuksia ja suuria hevoskastanjia,
jonka mahtava, synkkä kuusikuja kansoitti mielikuvituksen
taruolennoilla, oli jälleen palautettu alkuperäiselle omistajalleen.
Majurinnan kaunis koti, jossa hän oli tyttösenä leikkinyt ja varttunut,
kokenut ensi lemmen riemua ja tuskaa, tuskaa, joka eronhetkellä oli
murtanut hänen terveytensä!

Vaikka vapaaherra Järnskiöld, aateluudestaan ylpeä ylimys, ei ollut

tahtonut antaa tytärtään, nykyistä majurinnaa, alhaissäätyiselle
miehelle, oli tämä kuitenkin pysynyt rakastetulleen uskollisena,
kunnes onnettomat ulkonaiset seikat olivat heidät erottaneet.
Majurinna oli sairastunut, lähtenyt lääkärin neuvosta ulkomaille,
jossa vihdoin oli suostunut hienosukuisen hyvän ja rehellisen, vaikka
jo vanhan majuri Bernerin puolisoksi, isänsä suureksi tyydytykseksi.
Isä oli kuitenkin jo seuraavana vuonna kuollut ja mikä ikävämpää,
velkaantunut Luolakoski, jonka asema jo isän käsissä oli horjunut, oli
hyväsydämistä ja helposti petettävää majuria kohdanneiden
rahahuolien takia myötävä. Ostaja oli muuan juutalainen rahamies,
joka sittemmin suunnattomasta voitosta oli luovuttanut tilan tohtori
Koskelle.

Kuinka paljon surua! Isä oli poissa, äitiä majurinna tuskin

muistikaan ja neljättä vuotta oli majuri jo maannut haudassa…

Leskirouva Berner vaipui mietteihinsä, ja kirjavia muistoja vilisi

kuvasarjana hänen mielikuvituksessaan. Luolakoski, koti, jossa hän
ei ollut saanut käydyksi senjälkeen kuin kerran sairastuneena oli
sieltä lähtenyt, väikkyi nyt haaveissa kuin utulinna ja vanha,
arpeutunut haava tuntui jälleen tuottavan kipua. Mikä omituinen
suloisuus olikaan nyt tuon tuskan kaihertavalla muistolla! Kuinka
kummallisesti se liikutti sydäntä!… Kyyneleitä pyrki väkisinkin
majurinnan silmiin…

Yhtäkkiä hän huudahti, ponnahti nopeasti tuoliltaan painoi

molemmin käsin sydäntään, horjahti sitten taaksepäin ja jäi vapisten,
suu hieman auki ja kasvot ylöspäin taipuneina liikkumattomaan
asentoon. Kun herra ja rouva Vahlberg, jotka olivat väitellessään
lähteneet puistoon kävelemään, kiiruhtivat paikalle, tapasivat he
vanhan majurinnan pyörtyneenä.

*****
 Auto mennä huristi hyvää kyytiä halki metsien ja peltojen, joilla
kuhilaat törröttivät kullankeltaisina elokuun auringon valossa. Herra
Vahlberg, joka oli ollut pakotettu jättämään vaimonsa hoitamaan
huonovointista rouva Berneriä, oli lähtenyt yksin käymään
Luolakoskella sekä järjestämään asianmukaisia papereita lailliseen
kuntoon. Tuomari Korte, joka monta vuotta oli vakituisesti ollut
vainajan asiamiehenä, oli lähtenyt mukaan ja nyt istuivat molemmat
herrat kiitävässä biilissä.

Jos lyhyesti tahtoisi sanoa sen, mitä herra Vahlberg

vieruskumppanilleen jutteli, niin riittäisi jotakuinkin: "minä en käsitä,
minä en voi ymmärtää". Lakimies pysytteli varovaisena ja
vaikenevana vastaten vältellen ja kierosti — taito, jonka hänen
ammattinsa edellytti.

Maantieltä poikkesi biili syrjään, kulkien halki viljavan vainion ja

syöksyi sitten suoraan, ikivanhain kuusten aitaamaan kujaan, joka
yhtäkkiä loppui miltei kartanon pihaan. Vanha, pitkä rakennus oli
oikeastaan kaksikerroksinen, vaikka yläkerrassa ei ollutkaan
asuttavia huoneita kuin molempien pitkien sivujen keskikohdalla.
Huopakatto oli mitä omituisimmin taitettu ja vanhanaikuiset, leveät,
valkeat vuorilaudat olivat kulmauksistaan maalatut ruskeiksi. Leveät
portaat johtivat ensin verannalle, jonka pylväät olivat elämänlangan
kiertämiä, samoin kuin itse rakennuskin oli hukkua suurten
hevoskastanjien vihreyteen. Pihamaalla pulppusi suihkukaivo:
harmaasta kivestä hakattu karhu puristi pallomaista ruiskua
sylissään.

Vanha, kaljupäinen palvelija seisoi kumarrellen portailla vastassa.

Viisailla, terävillä silmillään hän tutki tulokkaita, näytti tuntevan
lakimiehen ja avasi tottuneesti raskaan, kaksipuolisen oven. Avarasta
eteisestä johtivat portaat ylös vintille. Näiden molemmin puolin seisoi
hiotuilla kivijalustoilla kaksi marmoriin hakattua rintakuvaa, joista
toinen kuvasi Beethovenia, toinen kuningas Kustaa III:tta.
Permannolla, suurissa puuastioissa upeili miehenkorkuisia,
tuuhealehtisiä kasveja, joiden vihreys näytti luonnottoman tummalta
uurteisten akkunalasien läpi tunkeutuvassa valossa.

Vasta sisähuoneista saattoi nähdä kosken, joka oli antanut

kartanolle nimen. Pauhaavana, lumivalkeana vyörynä kiiti se
uomassaan tuskin sadan metrin päässä rakennuksesta. Sen udussa
kimmelsi taivaankaari. Alempana teki se mutkan ja painui tuuheaan,
miltei mustaan kuusikkoon, jonka takaa noin puolen kilometrin
päässä pisti näkyviin tehtaan korkea savupiippu. Jyrkät, kalseat
rantakalliot olivat täynnä onkaloita ja omituisia luolia, jotka kansa oli
asuttanut mielikuvituksellisilla hirviöillä ja jättiläisillä. Ainoastaan
kartanon kohdalta oli kuusikko kaadettu ja maa muokattu
säännöllisiksi, kukkasoikioiden kirjavoimiksi nurmikentiksi, mutta
muualla, sekä ylä- että alapuolella huminoi synkkä metsä muinaisia
tarujaan.

Talon sisustus oli ympäristön kanssa sopusoinnussa. Kalusto oli

jykevää, mutta kallisarvoista ja aistikasta, ja suuressa salissa oli
tavanmukaisen pianon asemasta valtava, kullattu harppu. Palvelija,
joka äänettömästi aukoili ovia, teki vanhanaikaisessa asussaan
tarunomaisen vaikutuksen ja tarkastellessaan vaikenevan tuomarin
seurassa seinien tummanvärisiä, raskaspuitteisia tauluja, tuli herra
Vahlberg huomaamattaan apealle mielelle. Jotain painostavaa, jotain
salaperäistä ja juhlallista oli näiden vanhojen seinien suojassa.

Kun iäkkäältä palvelijalta kysyttiin, halusiko hän yhä edelleenkin

jäädä taloon, vastasi hän hillitysti, mutta varmasti tahtovansa
vetäytyä syrjään, valittaen väsymystään ja huonoa terveyttään ja
viitaten siihen armoon, jota hänen manallemennyt herransa oli
osoittanut, määrätessään runsaan eläkkeen uskolliselle palvelijalleen.
Niin, tohtori Koski ei todellakaan ollut unohtanut ketään; hänen
runsaista lahjoituksistaan huusivat sanomalehdet, ja niistä olivatkin
saaneet osansa sekä hyväntekeväisyyslaitokset että yksityiset
henkilöt. Tämä varakas erakko, joka omisti amerikalaisen patentin
nestemäisen ilman valmistustavalle ja joka tuntui olevan kokonaan
vailla ahnaita perillisiä, oli jakanut suuren omaisuutensa tavalla, jota
kaikkien täytyi kunnioittaa, mutta joka siitä huolimatta useata
hämmästytti; ei vähimmin herra Vahlbergia.

Tohtori Kosken suuressa työhuoneessa, oli monenmoisia tieteellisiä

kojeita, jotka, mikäli vieraat pystyivät arvostelemaan, näyttivät
viittaavan kemian alalle, ja runsas huolellisesti järjestetty kirjasto.
Avaralla pöydällä, jolla paitsi mustasta marmorista muovailtuja
kirjoitusneuvoja, ei ollut minkäänlaisia pikkutavaroita, huomasi herra
Vahlberg kuitenkin esineen, joka tavattomasti herätti hänen
mielenkiintoaan. Se oli suurehkon valokuvan kokoinen, selkäjalan
varassa seisova levy, joka oli tehty kauniin kiiltävästä, violettiin
vivahtavasta metallista ja jonka pinnalle oli tiivistynyt heikosti näkyvä
sumukerros. Käteen tuntui se omituisen kylmältä ja uskomattoman
kevyeltä, ja vaitelias lakimieskin kohotti hämmästyneenä tummia
kulmakarvojaan. Jotakin samantapaista muisti herra Vahlberg
nähneensä ennenkin, mutta kesti tuokion, ennenkuin hän sai
mieleensä palautetuksi, missä se oli tapahtunut. Hänen anopillaan,
leskirouva Bernerillähän oli samasta aineesta tehty lipas, tuo
ainutlaatuinen, kaunis kirjesäiliö, jonka avaimena oli äänirauta ja
joka kimmahti kuin taikavoimasta auki, niinpian kuin äänirauta oli
viritetty oikein ja napautettu soimaan lukon edessä. Samaa tiheätä
usvaa oli pisaroitunut lippaankin pinnalle…
 Kun herra Vahlberg kumartui lähemmin tarkastamaan levyä,
huomasi hän siinä taidokkaasti tehdyn kaiverruksen, jolla oli
seuraava muoto.

[Yksi nuottirivi.]
II.

Anoppi.

— Siinä se vasta on kalamies, huusi herra Vahlberg jo kaukaa,

tullessaan. — Eihän tuossa ole vettäkään. Onkisit ennemmin
kaivosta, jossa saattaa olla sammakoita.

Valkean kaiteen reunustamalla venesillalla istui mukavassa

nojatuolissa rouva Karin ja onki. Penkillä hänen lähellään oli
matotuokkonen ja aivan sen vieressä lasiastia puolillaan
puutarhamansikoista tehtyä hilloa.

— Tulehan katsomaan, Otto, vastasi nuori nainen, mansikoiden

punaamien huulten vetäytyessä nauruun valkean hammasrivin
ympäri. — Minulla on särki.

— Oho! Mutta minkä näköinen sinä olet! Sinähän ajat mansikoita

varmaankin nenääsi ja korviisi, koska poskesi ovat kuin
punamullassa. Ja taas sinä syöt sormillasi. Ensin panet matosen
koukkuun ja sitten mansikan suuhusi.
 — Minä olen rikas ja teen mitä tahdon. Se on hienoa! vastasi
rouva, puristaen huulensa veikeästi suppuun ja tehden hitaan,
ylimielisen kumarruksen päällään. Auringon säteet kultasivat hänen
hiuksiaan, jotka vielä riippuivat uinnista märkinä ja joita leppeä tuuli
leyhytteli hiljaa. Korviaan myöten rakastunut aviomies katseli
onnellisena puolisoaan.

— Vedä, vedä herran tähden! huudahti herra Vahlberg.

Karin säikähti, tempasi nopeasti onkensa järvestä, niin että kevyt

siima kimmahti korkealle ja hämääntyi pahlaimen kärkeen.
Kalamiehen takaa kuului heleä, kiusaava nauru.

— Hyi, kuinka sinä narraat! Eihän sitä syönyt. Selvitä nyt siima ja
joutuin, ilkimys.

Rouva oli kimmahtanut ylös näennäisesti suuttuneena ja heittänyt

vavan sillalle; sitten huomasi hän mansikat ja ajoi niitä suuhunsa
monta yhtaikaa. Tohvelisankarin nöyryydellä herra Vahlberg oikoi
siiman, korjasi matoa, heitti ongen järveen, sytytti sikaarin, pisti
monokkelin silmäänsä ja tarkkasi kohoa totisen ja arvokkaan
näköisenä, nuoren naisen katsellessa häntä sivulta kulmakarvat
koholla. Kumpikin vaikeni.

Silloin kuului kimeä, vihlova huuto puistosta. Se kaikui terävänä

kallioista kuin kuolevan viimeinen parkaisu. Molemmat aviopuolisot
säikähtivät ja katsoivat vaaleten toisiinsa… Sitten vallitsi kauniin
kesäpäivän hiljaisuus.

— Äiti, äiti, sammalsi rouva Vahlberg ja lähti kuin henkensä edestä

juoksemaan kohti tuuheata vaahteraa, jonka siimekseen vanhus oli
jäänyt istumaan.
 Kun nuori pari ehti puun varjoon, kohtasi heitä järkyttävä näky:
Selkäkenosillaan juurituolissa makasi majurinna Berner raollaan
olevissa silmissä kuoleman sammunut kiilto; toisella kädellään puristi
hän sydäntään, toisessa oli kirje. Hänen vieressään seisoi kalpea,
outo mies hätääntyneen näköisenä ja onnettomana väännellen
käsiään. Huvilasta juoksi palvelija vesikarahvi ja lasi kädessään,
kasvot säikähdyksen vääristäminä.

Herra Vahlberg otti kirjeen anoppinsa kädestä ja vilkaisi siihen

sivumennen. Mutta tavattomasti hän hätkähti. Kirjeessä oli
ainoastaan:

[Yksi nuottirivi.]

Nuottien alle oli voimakkaalla käsialalla piirretty:

Arvid Warén.

*****

— Kuka te olette? kysyi herra Vahlberg ankarasti vieraalta

mieheltä.

— Olen kirjeen tuoja, herra, vastasi puhuteltu hätääntyneenä,

mutta rehellisen näköisenä.

— Niin, sen käsitän. Mutta kuka teidät on lähettänyt ja keneltä on

kirje?

— Olen tohtori Koski-vainajan palvelija. Kuolinvuoteellaan jätti

tohtori minun huolekseni tämän kirjeen perille viemisen. Hän sanoi,
ettei kirjettä saanut panna postiin, koska sensuuri nykyään on niin
ankara, sekä ettei kirjettä pitänyt antaa omistajalleen ennenkuin
tohtorin testamentti oli julkaistu. Niinikään määräsi hän
ehdottomasti, että kirje oli jätettävä osoitteessa mainitun henkilön
omiin käsiin… Palvelija neuvoi minut puistoon… En tietystikään
voinut aavistaa tällaista onnettomuutta.

Hetken aikaa pyöri herra Vahlbergin huulilla kysymys: "Kuka on

Arvid Warén?" Mutta hän hillitsi itsensä vaistomaisesti, pisti kirjeen
taskuunsa ja jäi mykkänä tuijottamaan onnettoman näköistä
vierasta, joka syvään kumartaen vetäytyi syrjään. — Leskirouva
Berner kannettiin huoneeseensa, riisuttiin ja asetettiin sänkyyn.
Syntyi tavanmukainen hälinä. Telefooni soi yhtämittaa, lääkäri jakeli
puhelimitse neuvojaan, hätääntyneet palvelijat hyörivät kuin
kuumeessa, tietämättä mitä tehdä ja Karin Vahlberg itki
sydäntäsärkevästi, vavahtelevin käsin hyväillessään rakastettua
äitiään. Kun lääkäri vihdoin saapui, ei hän voinut muuta kuin todeta
hengen lähteneeksi; sydänhalvaus oli sattunut.

Suru oli astunut synkkänä vieraana nuoreen, onnelliseen kotiin,

joka vastikään oli saanut kiittää kohtaloa niin suurenmoisesta
perinnöstä. Kuherruskuukausien vallattoman ilon oli kuoleman kolkko
varjo verhonnut, synnyttäen kyyneliä, mutta samalla myöskin
lähentäen ja syventäen niitä kahta ihmistä, jotka olivat liittoutuneet
yhteisvoimin kantamaan elämänsä onnen ja taakan.

Sanomalehdet, joiden nenäkkäät kynäilijät kylmäverisesti

tunkeutuvat kaikkialle, kirjoittivat tapauksesta yksityiskohtaisesti,
näennäisesti ottaen osaa suruun, mutta etupäässä kuitenkin
riemuissaan siitä, että saivat tarjota lukijoilleen harvinaisen
sensatsioniuutisen, jonka otsikkona oli lihavin kirjaimin painettu:

Omituinen kuolemantapaus.
Salaperäinen kirje.
Welcome to our website – the ideal destination for book lovers and
knowledge seekers. With a mission to inspire endlessly, we offer a
vast collection of books, ranging from classic literary works to
specialized publications, self-development books, and children's
literature. Each book is a new journey of discovery, expanding
knowledge and enriching the soul of the reade

Our website is not just a platform for buying books, but a bridge
connecting readers to the timeless values of culture and wisdom. With
an elegant, user-friendly interface and an intelligent search system,
we are committed to providing a quick and convenient shopping
experience. Additionally, our special promotions and home delivery
services ensure that you save time and fully enjoy the joy of reading.

Let us accompany you on the journey of exploring knowledge and

personal growth!

ebooknice.com