địNh danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa trên gen its và xác định sự lây nhiễm bằng kĩ thuật sem

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ĐỊNH DANH NẤM SỢI GÂY HỎNG TRỨNG CÁ BÁ
CHỦ (Pterapogon kauderni) DỰA TRÊN GEN ITS VÀ
XÁC ĐỊNH SỰ LÂY NHIỄM BẰNG KĨ THUẬT SEM
Ngành: Công Nghệ Sinh Học
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Giảng viên hướng dẫn : Ths. Võ Minh Sơn
CN. Ngô Đức Duy
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Thủy Tiên
MSSV: 1151110524 Lớp: 11DSH04
TP. Hồ Chí Minh, năm 2015

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Đồ án này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân,
được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của ThS. Võ Minh Sơn, CN. Ngô Đức
Duy. Các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong đề tài là trung thực, đề tài
không trùng với bất kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào. Những thông tin tham khảo
trong khóa luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 8 năm 2015
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Thủy Tiên

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ
Đức, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy cô, các anh chị và các bạn , em đã
hoàn thành tốt đồ án này. Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
TS. Hoàng Quốc Khánh, trưởng phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học
Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo điều kiện cho em
được làm đề tài.
Thầy Ngô Đức Duy, TS. Nguyễn Hoàng Dũng và chị Loan phòng Vi Sinh
ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã
tận tình chỉ bảo, giảng dạy và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án.
Thầy Võ Minh Sơn đang công tác tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản
II thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, đã nhiệt tình giúp em trong quá
trình thu nhập mẫu bệnh trên trứng cá, và hỗ trợ giải đáp thắc mắc trong quá trình
làm đề tài.
Cô Nguyễn Hoài Hương, phòng Vi sinh, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực
Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận
tình giúp đỡ em trong quá trình nhận đề tài.
Các bạn lớp 11DSH04 đã luôn đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ em trong suốt
thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, con xin cám ơn Ba Mẹ, đã nuôi nấng, chăm sóc và tạo mọi điều
kiện cho con ăn học thành người có ích cho xã hội và anh hai, người đã luôn bên
cạnh động viên, định hướng cho em những khi em gặp khó khăn trong công việc.

Đồ Án Tốt Nghiệp
i
MỤC LỤC
MỤC LỤC................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................................... vii
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu ......................................................................................1
3. Mục đích nghiên cứu.......................................................................................2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu......................................................................................2
5. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................2
6. Các kết quả đạt được của đề tài.......................................................................3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................4
1.1. Cá Bá Chủ......................................................................................................4
1.1.1. Hệ thống phân loại ..............................................................................4
1.1.2. Đặc điểm sinh thái học ........................................................................5
1.1.2.1. Hình thái ..........................................................................................5
1.1.2.2. Sinh học sinh sản .............................................................................6
1.1.3. Quy trình ấp trứng cá Bá Chủ tại Việt Nam........................................9
1.2. Bệnh nấm thủy sản ........................................................................................9
1.2.1. Bệnh nấm thủy mi .............................................................................10
1.2.2. Bệnh do nấm Lagenidium..................................................................10
1.2.3. Bệnh do nấm Haliphthoros ...............................................................10
1.2.4. Bệnh do nấm Fusarium .....................................................................11

ii
1.2.5. Bệnh do nấm Plectosporium .............................................................11
1.3. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử..........................................11
1.3.1. Các phương pháp ly trích DNA.........................................................11
1.3.1.1. Nguyên tắc.....................................................................................11
1.3.1.2. Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật ..........................................12
1.3.2. PCR trong định danh vi sinh vật .......................................................13
1.3.2.1. Kỹ thuật PCR.................................................................................13
1.3.2.2. Gen rDNA......................................................................................14
1.3.2.3. Mồi.................................................................................................14
1.3.2.4. Ứng dụng của PCR trong quá trình định danh loài vi sinh vật......16
1.3.3. Xây dựng cây phát sinh loài..............................................................16
1.4. Kỹ thuật khuếch tán đĩa giấy kháng sinh vào môi trường thạch.................17
1.4.1. Phạm vi áp dụng................................................................................17
1.4.2. Kháng sinh.........................................................................................17
1.5. Phương pháp chụp SEM..............................................................................22
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................24
2.1. Vật liệu, thiết bị và hóa chất........................................................................24
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................24
2.1.2. Nguồn mẫu ........................................................................................24
2.1.3. Hóa chất.............................................................................................24
2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy ......................................................................24
2.1.3.2. Các hóa chất định danh..................................................................24
2.1.3.3. Các hóa chất phản ứng PCR ..........................................................24
2.2. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................25

iii
2.2.1. Phân lập nấm gây bệnh......................................................................25
2.2.2. Phương pháp phòng ẩm.....................................................................26
2.2.3. Định danh bằng sinh học phân tử......................................................26
2.2.3.1. Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA bằng CTAB ...26
2.2.3.2. Phản ứng PCR................................................................................27
2.2.3.3. Dùng PCR để khuếch đại đoạn gen ITS của nấm bệnh................30
2.2.3.4. Giải trình tự và định danh..............................................................32
2.2.4. Kháng sinh đồ....................................................................................32
2.2.4.1. Nguyên lý.......................................................................................32
2.2.4.2. Đĩa giấy kháng sinh .......................................................................32
2.2.4.3. Các bước thực hiện........................................................................33
2.2.5. Phương pháp cảm nhiễm...................................................................33
2.2.5.1. Chuẩn bị.........................................................................................33
2.2.5.2. Bố trí thí nghiệm............................................................................34
2.2.6. Phương pháp chụp SEM....................................................................34
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.........................................................35
3.1. Kết quả phân lập và làm thuần của nấm bệnh.............................................35
3.1.1. Kết quả thu nhận mẫu trứng bệnh .....................................................35
3.1.2. Kết quả hình thái khuẩn lạc...............................................................36
3.1.3. Kết quả quan sát sợi khuẩn ty và bào tử............................................38
3.2. Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS............................................40
3.2.1. Kết quả ly trích, thu nhận bộ gen DNA.............................................41
3.2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS ...........................................41

iv
3.3. Kết quả so sánh vùng gen ITS của 3 chủng M.1.1, M.1, M.4.1 và thiết lập
cây phát sinh loài dựa trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI .....................................42
3.3.1. Trình tự vùng gen ITS của các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1.............42
3.3.2. Thiết lập cây phát sinh loài................................................................43
3.4. Kết quả độ nhạy cảm của các chủng nấm với kháng sinh...........................45
3.5. Kết quả hình ảnh quá trình lây nhiễm giữa nấm và trứng cá bằng kĩ thuật
SEM .....................................................................................................................46
3.5.1. Kết quả hình ảnh lây nhiễm dưới kính hiển vi quang học ................47
3.5.2. Kết quả hình ảnh quá trình lây nhiễm bằng kĩ thuật SEM ................49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................51
1. Kết luận .........................................................................................................51
2. Kiến nghị.......................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................53
PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường........................................................................1
PHỤ LỤC B: Kết quả trình tự vùng gen bảo tồn ITS.................................................2
PHỤ LỤC C: Kết quả trình tự vùng gen của các chủng so sánh trên NCBI ..............5
PHỤ LỤC D: Kết quả hình ảnh kĩ thuật SEM quá trình lây nhiễm giữa nấm và
trứng cá Bá Chủ...........................................................................................................7

v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Bp Base Pair
CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
DNA Deoxyribonucleotide Acid
EDTA Ethylene- diamine-Tetraacetic-Acid
ITS Internal transcribed spacer
PCR Polymerase Chain Reation
PDA Potato Dextrose Agar
PDB Potato Dextrose Broth
PYGSA Peptone Yeast extract Glucose Salt Agar
SEM Scanning Electron Microscope
TAE Tris-Acetic acid- Ethylenediamine- Tetraacetae
TE Tris- Ethylenediamine- Tetraacet

vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các trình tự đoạn mồi vùng gen ITS [22]. ...............................................15
Bảng 3.1. Kết quả độ nhạy cảm của chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 với kháng sinh ...45
Bảng 3.2. Kích thước đường kính vòng kháng khuẩn và kháng nấm sau 72 giờ.....46

vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni) [28].....................................................5
Hình 1.2. Con đực đang nuốt trứng vào miệng để ấp [29].........................................7
Hình 1.3. Trứng cá Bá Chủ sau khi thụ tinh [21].......................................................8
Hình 1.4. Hệ thống bể ươm [4]. .................................................................................9
Hình 1.5. Bản đồ mồi trong vùng gen ITS [22]. ......................................................15
Hình 1.6. Hình thái bên ngoài của vật kí sinh chụp bằng SEM [14]........................23
Hình 1.7. Sự thay đổi hình thái xảy ra trên bề mặt tế bào chụp bằng SEM [14]. ....23
Hình 3.1. Trứng cá Bá Chủ ......................................................................................35
Hình 3.2. Trứng cá Bá Chủ bị nhiễm bệnh ..............................................................35
Hình 3.3. Khuẩn lạc chủng M.1.1 trên môi trường PDA ở 28o
C trong 72 giờ. .......36
Hình 3.4. Khuẩn lạc chủng M.1 trên môi trường PDA ở 28o
C trong 72 giờ. ..........36
C.............................37
Hình 3.6. Sợi khuẩn ty và sự hình thành bào tử của chủng M.1.1 (40X).................38
Hình 3.7. Sợi khuẩn ty và sự hình thành bào tử của chủng M.1 (100X)..................39
Hình 3.8. Sợi khuẩn ty và bào tử của chủng M.4.1 (100X). ....................................40
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm ly trích bộ gen DNA của 3 chủng M.1.1, M.1
và M.4.1 trên gel agarose 1%....................................................................................41
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 trên
gel agarose 1%. .........................................................................................................42
Hình 3.11. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS các chủng
M.1.1, M.1, M.4.1 với các chủng nấm trên ngân hàng gen NCBI............................43

viii
Hình 3.12. Kết quả mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.4.1 dưới kính hiển vi quang học
(100X). ......................................................................................................................47
Hình 3.13. Kết quả mẫu đối chứng dưới kính hiển vi quang học (100X)................48
(100X). ......................................................................................................................48
Hình 3.15. Kết quả mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1 dưới kính hiển vi quang học
(100X). ......................................................................................................................49
Hình 3.16. Bề mặt trứng mẫu đối chứng chụp bằng SEM. ......................................49
Hình 3.17. Bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 chụp bằng SEM (100X và 500X)
...................................................................................................................................50
Hình 3.18. Bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 chụp bằng SEM (500X và
1000X).......................................................................................................................50

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ở Việt Nam có tiềm năng lớn cho phát triển cá cảnh do có khí hậu nhiệt đới,
nguồn lợi thủy sinh tự nhiên phong phú và sự đa dạng của các hệ thống sông và
kênh rất thuận lợi cho sự phát triển nghề cá cảnh, đặc biệt phù hợp cho sự sinh sản
và phát triển các loài cá cảnh nhiệt đới. Người chơi cá cảnh ở nước ta đang có xu
hướng chuyển dần sang chơi các loài cá cảnh biển do chúng có nhiều màu sắc đẹp,
đa dạng về thành phần loài. Nguồn cá cảnh biển đa số được khai thác từ tự nhiên
hoặc nhập từ nước ngoài.
Hiện nay, cá Bá Chủ là loài có giá trị kinh tế cao, chúng có màu sắc đẹp và dễ
nuôi nên đang được người chơi cá cảnh ngày càng ưa chuộng. Cá Bá Chủ đang
trong quá trình nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình sản xuất giống cá Bá Chủ
trong điều kiện nuôi nhốt tại Việt Nam. Việc phát triển quy trình sản xuất trong điều
kiện nuôi nhốt sẽ giúp cho loài cá này được sinh sản nhân tạo tại chỗ, không cần
phải mua và vận chuyển từ nguồn đánh bắt ngoài tự nhiên. Điều này sẽ giúp gia
tăng số lượng cá Bá Chủ được sinh sản nhân tạo và làm giảm áp lực cho nguồn cá
tự nhiên, đồng thời đem lại nguồn lợi to lớn cho nghề nuôi trồng cá cảnh của nước
ta.
Tuy nhiên, trong quá trình xây dựng quy trình sinh sản và ương nuôi cá bột
thành cá giống, nấm bệnh gây hư hỏng trứng cá làm tỉ lệ trứng nở giảm mạnh, làm
chậm tiến trình gia tăng số lượng cá Bá Chủ, ảnh hưởng nghiêm trọng đến quy trình
sản suất. Cho nên việc xác định chủng nấm gây bệnh trên trứng cá Bá Chủ nhằm
tìm ra biện pháp khắc phục mang tính cấp thiết.
2. Tình hình nghiên cứu
Nghiên cứu ứng dụng quy trình sản xuất giống cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni
Koumans, 1933) tại Việt Nam của Thạc sĩ Võ Minh Sơn được công bố năm 2013
[4] và đang được triển khai với mục đích xây dựng quy trình sản xuất giống cá Bá

2
Chủ trong điều kiện nuôi nhốt tại Việt Nam. Trong phạm vi đề tài, quan tâm đến
quy trình sinh sản và trứng cá bị nhiễm nấm bệnh gây hư hỏng.
Cá Bá chủ được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1996 và được xem là một loài cá
có khả năng kháng bệnh rất tốt. Tuy nhiên đã có nhiều nghiên cứu về bệnh trên loài
cá này, nhưng đến nay vẫn chưa có nghiên cứu về sự nhiễm nấm bệnh trên trứng
của cá Bá Chủ.
3. Mục đích nghiên cứu
Mục đích của đề tài là xác định được nấm gây bệnh trên trứng cá Bá Chủ, sau
khi xác định được nấm gây bệnh sẽ dựa vào những đặc điểm và những nghiên cứu
về nấm bệnh rồi đưa ra các biện pháp khắc phục kịp thời, đảm bảo quy trình sản
xuất đạt kết quả cao nhất.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Phân lập và làm thuần chủng nấm từ mẫu trứng bị nhiễm nấm bệnh.
- Quan sát hình thái học (khuẩn lạc, khuẩn ty, bảo tử).
- Định danh bằng sinh học phân tử.
- Khảo sát khả năng kháng nấm của một số loại kháng sinh.
- Cảm nhiễm bệnh bằng phương pháp Robert Koch.
- Quan sát sự xâm nhiễm bằng phương pháp chụp SEM (kính hiển vi điện tử
quét).
5. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp phân lập và làm thuần nấm bệnh.
- Phương pháp phòng ẩm (xem sợi khuẩn ty và bào tử).
- Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA (theo phương pháp CTAB).
- Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi ITS1F và ITS4R.
- Phương pháp sinh tin học dựa trên các phần mềm (ChromasPro 1.5.0.0,
MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0).
- Phương pháp kháng sinh đồ (theo phương pháp đĩa thạch).

3
- Phương pháp cảm nhiễm (theo phương pháp Robert Koch).
- Phương pháp chụp SEM.
6. Các kết quả đạt được của đề tài
- Kết quả phân lập và làm thuần được các chủng nấm gây bệnh trên trứng cá
Bá Chủ.
- Kết quả thu nhận được bộ gen DNA.
- Kết quả nhân bản được vùng gen ITS bằng phương pháp PCR.
- Kết quả kháng sinh có khả năng kháng nấm bệnh.
- Kết quả cảm nhiễm
- Kết quả hình SEM

4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cá Bá Chủ
1.1.1. Hệ thống phân loại
Theo Koumans, 1933 cá có hệ thống phân loại như sau [4].
Giới (Kingdom) Animalia
Ngành (Phylum) Chordata
Lớp (Class) Actinopterygii
Bộ (Order) Perciformes
Họ (Family) Apogonidae
Giống (Genus) Pterapogon
Lòai (Species) Pterapogon kauderni
Tên tiếng Anh: Banggai Cardinalfish, Cardinalfish, Highfin Cardinalfish,
Banner Cardinalfish, Outhouse Cardinal và tên tiếng Việt gọi là cá Bá Chủ.
Cá Bá Chủ là loài cá thuộc họ cá Sơn Apogonidae, tuy nhiên về di truyền
loài cá này tiến hoá một nhánh khác và có tên khoa học riêng biệt. Đa số các loài
thuộc họ cá Sơn là nhóm cá ăn đêm (nocturnal diet) và đóng vài trò quan trọng
trong hệ sinh thái san hô. Tuy nhiên, chỉ riêng loài cá Bá Chủ thuộc họ này có tập
tính ăn ban ngày (diurnal diet). Là loài ăn các động vật phù du và giáp xác nhỏ bao
gồm chủ yếu là nhóm giáp xác chân chèo (copepod) và nhóm giáp xác Crustacean
(tôm, cua). Chúng luôn luôn được tìm thấy sống cùng với các sinh vật khác bao
gồm hải quỳ (anemone), san hô (branching coral), cầu gai (sea urchin), sao biển (sea
star) và rễ cây ngập mặn. Khảo sát cho thấy vị trí cư trú của cá Bá Chủ có liên quan
tuyến tính với sự hiện diện của của mật độ cầu gai và mật độ cá Bá Chủ. Theo khảo

5
sát cho thấy khi khai thác cá Bá Chủ đã dẫn đến quần thể động vật không xương
sống cũng giảm theo [7].
Hiện nay, cá Bá Chủ được ưa chuộng và đã xuất đi nhiều nước thuộc Châu
Âu, Mỹ và Châu Á với mục đích phục vụ cho người chơi cá cảnh. Do nhu cầu tiêu
thụ loài cá này càng tăng trên thế giới, cá Bá Chủ đã được nhiều nước sinh sản
thành công như Hawai (Mỹ) và Indonesia [4].
1.1.2. Đặc điểm sinh thái học
1.1.2.1. Hình thái
Cá Bá Chủ có hình thái vẻ ngoài rất đặc biệt, toàn thân màu trắng bạc rực rỡ
với những đường kẻ sọc màu đen. Cơ thể của nó còn được bao phủ bằng những
đốm nhỏ màu trắng và rất dễ nhận thấy những đốm này trên các vây lưng, vây hông,
vây đuôi và vây hậu môn. Sự bố trí, kích thước và số lượng của các đốm trắng nhỏ
này hết sức độc đáo và riêng biệt, có thể sử dụng để xác định mẫu vật. Ngòai ra, vây
lưng đầu tiên của cá Bá Chủ có núm tua và đuôi được chẻ nhánh sâu. Mắt của cá Bá
Chủ (loài ăn ngày) rất to, thậm chí khi so sánh với cả những thành viên ăn đêm
trong cùng một họ. Trọng lượng lớn nhất của loài cá này quan sát là khoảng 6,5 g
[18].
Hình 1.1. Cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni) [28].

6
1.1.2.2. Sinh học sinh sản
Trong điều kiện phòng thí nghiệm, cá Bá Chủ đạt kích cỡ có thể tham gia
sinh sản khoảng 8 – 9 tháng tuổi với chiều dài chuẩn từ 3,5 cm khi được nuôi ở
nhiệt độ 25 – 26o
C. Trong tự nhiên, khi nhiệt độ môi trường từ 29 – 31o
C, con cái
có khả năng sinh sản đạt chiều dài chuẩn từ 3,4 – 3,5 cm tương đương với 6 tháng
tuổi. Trong khi đó, con đực nhỏ nhất có thể ấp trứng trong miệng được tìm thấy
trong tự nhiên có chiều dài chuẩn là 3,1 cm.
Cá Bá Chủ là loài cá sinh sản theo chu kỳ. Chu kì phát triển của noãn bào
tương thích với kiểu phát triển đồng bộ theo nhóm, trong đó có ít nhất hai nhóm
noãn bào có thể phân biệt được rõ ràng cùng một lúc, một nhóm noãn bào lớn phát
triển một cách đồng bộ và một nhóm noãn bào nhỏ hơn phát triển không đồng bộ từ
buồng trứng đang được phục hồi. Mỗi một chu kì sinh sản, con cái cần ít nhất là 20
ngày để buồng trứng có thể phát triển hoàn thiện. Tần suất sinh sản cao nhất được
quan sát là mỗi 25 ngày cho cá Bá Chủ được nuôi ở nhiệt độ 26o
C. Kích thước lớn
nhất của noãn bào trưởng thành là khoảng 0,27 cm và trọng lượng trung bình là
0,013 g ở con cái có chiều dài lớn hơn 4,6 cm chiều dài chuẩn. Số lượng trứng trung
bình trong mỗi lần ấp trứng (được tách ra khỏi miệng con đực) là 40 trứng với
đường kính trung bình cỡ 0,03 cm. Trứng được kết dính với nhau bởi nhiều sợi đan
xen lẫn nhau giúp cho trứng không bị tách ra khi con đực xoay khối trứng để cung
cấp oxy.
Ngoài ra, cá Bá Chủ là loài ít sinh sản nhất so với các loài khác trong họ
Apogonidae và không thể hiện mối liên hệ giữa kích thước và sự mắn đẻ. Chiều dài
chuẩn của con cái trưởng thành là từ 3,8 – 5,8 cm và số lượng trứng sinh ra là dao
động từ 60 – 70 trứng. Khi kích thước của noãn bào càng lớn thì sức sinh sản sẽ
giảm đi. Thêm vào đó, khả năng sinh sản của cá Bá Chủ trong điều kiện phòng thí
nghiệm thường thấp hơn so với khả năng thực tế của nó. Nguyên nhân của hiện
tượng này là do số lượng trứng bị mất đi trong suốt quá trình chuyển từ con cái sang
con đực (khoảng 10 – 20 trứng) và một số trứng không được thụ tinh hoặc không

7
phát triển được tìm thấy trong khoan miệng của cá đực trong vòng một giờ sau khi
thụ tinh.
Hình 1.2. Con đực đang nuốt trứng vào miệng để ấp [29].
Một điều thú vị nữa là cá Bá Chủ có chu kì sinh sản theo chu kì của trăng.
Trong đó, 60 % trứng được đẻ trong thời kì trăng tròn, 30 % ở tuần trăng cuối và 10
% ở tuần trăng đầu. Do đó, khi tính toán thời gian đẻ trứng và thời gian phóng thích
cá con nên dựa vào chu kì trăng.
Khác với các loài cá ôn đới khác, quá trình sinh sản chỉ diễn ra vào các tháng
ấm, cá Bá Chủ sinh sản quanh năm. Quá trình bắt cặp và ve vãn thường diễn ra vào
buổi sáng, quá trình thụ tinh xảy ra từ 13:00 giờ đến 15:30 giờ. Quá trình giải phóng
trứng diễn ra trong vòng 2 giây, khi cá cái giải phóng chùm trứng, cá đực lập tức
bơi vòng quanh, thụ tinh và ngậm trứng vào miệng. Thời gian diễn ra của quá trình
thụ tinh này không quá 3 giây. Sau khi thụ tinh, con cái thể hiện vai trò là người bảo
vệ cho con đực nhưng biểu hiện này không dài quá 30 phút. Con đực sau khi ngậm
trứng thường xuyên mở rộng miệng và xoay khối trứng, hành động này thường thu
hút sự chú ý của những con đực khác và bị tấn công dành trứng nếu được nuôi
chung một bể.
Trứng của cá Bá Chủ có đường kính trứng lớn (trung bình 0,3 cm), nhiệt độ
tại thời điểm sinh sản là 26o
C, tuổi biến thái vào ngày thứ 20 - 25 sau khi nở (tương

8
ứng chiều dài 0,10 – 0,11 cm). Loài cá này sinh sản tự nhiên trong bể nuôi cá cảnh
ở nhiệt độ 27o
C. Con đực ấp trứng trong miệng và tiếp tục giữ cá bột cho đến ngày
thứ 21 – 24. Thời gian ấp trứng từ khoảng 25 - 28 ngày ở nhiệt độ 26o
C, trong thời
gian này con đực không ăn. Tuy nhiên, với các điều kiện nuôi không tốt, bị ép bắt
cặp và sức khỏe con đực kém sẽ dẫn đến tình trạng con đực nuốt trứng. Trong quá
trình ấp trứng, con đực có thể phát hiện ra trứng chết và tống nó ra ngoài. Điều này
hạn chế quá trình nhiễm nấm và vi khuẩn từ trứng chết đồng thời tránh lây lan cho
những trứng khỏe. Tỉ lệ thụ tinh đạt trung bình 60 % khi trứng được ấp trong miệng
con đực. Tuy nhiên, trong điều kiện phòng thí nghiệm tỉ lệ thụ tinh đạt thấp hơn vào
khoảng 40 – 60 % trong điều kiện tách riêng từng cặp sinh sản và khoảng 15 – 25 %
khi nuôi chung trong bể nhiều con.
Hình 1.3. Trứng cá Bá Chủ sau khi thụ tinh [21].
Sau khi nở từ 6 đến 8 ngày, cá con được phóng thích ra khỏi miệng con đực.
Thời gian phóng thích thường vào lúc gần sáng, khi trời còn tối. Ngay sau đó, lập
tức chúng bơi theo từng đàn nhỏ và có thể bắt đầu ăn thức ăn có kích thước lớn như
ấu trùng Artermia. Chúng cũng bắt đầu tìm kiếm nơi để trú ngụ từ các giá thể có sẳn
như đá, nhưng nếu có nhím biển Diadema, chúng lập tức lẫn vào giữa các ống gai
của nhím hoặc các giá thể nhân tạo có hình dáng giống nhím biển hay bãi cỏ biển,...

9
kích thước của cá con sau khi được phóng thích là 0,8 cm và noãn hoàn hầu như đã
được hấp thụ hết [19].
1.1.3. Quy trình ấp trứng cá Bá Chủ tại Việt Nam
Ấp trứng ngoài cơ thể cá đực: Trứng sau khi thụ tinh vài ngày và được con
đực ấp trong miệng, trứng được tách ra từ con đực, ấp trong hệ thống nước chảy
tràn với độ mặn 30 ppt, nhiệt độ 28o
C cho đến khi trứng nở thành cá bột. Hệ thống
ấp hình phiễu được đặt chìm trong bể ương [4].
Hình 1.4. Hệ thống bể ươm [4].
1.2. Bệnh nấm thủy sản
Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh nấm ở động vật thủy
sản như một số loài nấm bất toàn thuộc các giống như Fusarium, Acremonium,
Plectosporium, Ochroconis, Phoma, Exophiala và nhóm nấm thủy mi như
Saprolegnia, Achlya, Leptolegnia và Aphanomyces là tác nhân gây bệnh ở động vật
thủy sản [3].

10
1.2.1. Bệnh nấm thủy mi
Tác nhân chủ yếu gồm các giống Saprolegnia, Aphanomyces và Achlya.
Nấm có dạng sợi, cấu tạo các sợi nấm đa bào và không có vách ngăn ngang. Các sợi
nấm dầy và bện vào nhau trông giống như túi bông gòn bên ngoài cơ thể vật chủ,
chúng có khả năng sinh sản vô tính và hữu tính. Nấm Saprolegnia là tác nhân cơ hội
gây bệnh ở cá chép Cyprinus carpio, cá lóc Chanos chanos và cá Odonthetes
bonariensis ở Nhật Bản. Loài S. diclina nhiễm ở trứng cá hồi Oncorhynchus mykiss
ở Nhật Bản, trứng cá chép ở Thái Lan và S. salmonis sp. nov. nhiễm ở cá hồi O.
nerka [20].
1.2.2. Bệnh do nấm Lagenidium
Nấm khi nuôi cấy trên môi trường PYGSA khuẩn lạc có màu trắng và đường
kính 3,5 - 4,0 cm sau 5 ngày, ở 25o
C. Sợi nấm không vách ngăn và không phân
nhánh, có nhiều hạt nhỏ bên trong, đường kính 5 - 40 µm. Dấu hiệu nhận biết là
xuất hiện đốm trắng bên ngoài vật chủ, đồng thời quan sát tiêu bản tươi cho thấy có
sự hiện diện của sợi nấm. Tỷ lệ gây chết do nấm Lagenidium trên ấu trùng cua có
thể lên đến 100 %. Loài L. callinectes gây bệnh ở giai đoạn trứng và ấu trùng ghẹ
xanh Callinectes sapidus và Portunus pelagicus, ở ấu trùng cua biển Scylla serrata
và ở tôm biển Pandalus hypsinotus. Loài nấm khác là L. thermophilum nhiễm ở giai
đoạn trứng và ấu trùng cua biển và tôm sú và L. myophilum nhiễm ở tôm Pandalus
hypsinotus. Nhiệt độ tối ưu cho nấm phát triển tốt là 25o
C và độ mặn khoảng
0 - 50‰ [2].
1.2.3. Bệnh do nấm Haliphthoros
Nấm khi nuôi cấy trên môi trường PYGSA khuẩn lạc có màu trắng và đường
kính 2,0 - 2,5 cm sau 5 ngày ở 25o
C. Sợi nấm có nhiều hạt nhỏ sáng bên trong,
không có vách ngăn, nhưng phân nhánh, đường kính 7,5 - 30 µm. Sợi nấm có điểm
mấu tạo thành túi bào tử. Động bào tử có kích thước 6,5 x 8,5 µm, hình quả thận
hay đế giày với hai tiên mao ở hai đầu. Loài nấm H. milfordensis và H.

11
philippinensis nhiễm ở hàu Urosalpinx cinerea, tôm hùm Homarus americanus, bào
ngư Haliotis sieboldii, ấu trùng cua S. serrata, ghẹ P. pelagicus và tôm he P.
japonicas. Nhiệt độ tối ưu cho nấm phát triển từ 25- 30o
C, pH 4 - 11 và độ mặn
khoảng 10-50‰ [3].
1.2.4. Bệnh do nấm Fusarium
Một số loài như Fusarium solani, F. moniliforme và F. oxysporum là tác
nhân gây bệnh đen mang ở tôm he P. japonicus. Tác nhân gây bệnh đen mang ở tôm
sú P.monodon và trên tôm hùm Homarus americanus do nấm F. incarnatum. Ngoài
ra, nấm F. solani nhiễm trên rùa biển Caretta caretta và nấm Fusarium sp. nhiễm
trên tôm càng xanh [10].
1.2.5. Bệnh do nấm Plectosporium
Nấm Plectosporium khuẩn lạc phát triển rất chậm trên môi trường PYGSA,
đường kính 1,0 - 1,3 cm sau 14 ngày ủ ở 25o
C, bề mặt nhẵn có màu trắng đục hoặc
hơi vàng. Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn đường kính 1 - 4 µm. Cuống sinh bào
tử dạng thể bình không phân nhánh, có vách ngăn ở phần gốc. Bào tử dạng ellip, trụ
hơi cong, có 0, 1, hoặc 3 vách ngăn, đường kính 12 - 16 x 3 - 4 µm. Loài
Plectosporium oratosquillae trên môi trường PYGSA, khuẩn lạc 0,9 - 1,7 cm sau 15
ngày ở 25o
C, có nguồn gốc từ nước mặn vì chúng phát triển tốt ở môi trường có 100
% nước biển và không phát triển trong môi trường nước ngọt. Nấm P.oratosquillae
là tác nhân gây bệnh nâu mang ở tôm tít O. oratoria và loài này có khả năng gây
bệnh đen mang ở tôm he P.japonicus trong điều kiện thí nghiệm [3].
1.3. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
1.3.1. Các phương pháp ly trích DNA
1.3.1.1. Nguyên tắc
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu
nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp

12
theo. Mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận
được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác
nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải
bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic
acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các
enzyme nội bào (desoxyribonuclease - DNase và ribonuclease - RNase).
1.3.1.2. Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật
Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay
đổi theo từng môi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn
hoặc là những quần thể vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh
vật được đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt
của những bộ gen hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá. Do đó, việc tách
chiết DNA vi sinh vật để phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng là rất cần thiết. Quá
trình ly trích DNA cần phải đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc
để có thể thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo. Có rất nhiều phương pháp
ly trích DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương
pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp.
Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên
thường được sử dụng:
- Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): được xem là phương pháp
thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật với
hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo. Phương pháp ly trích sử
dụng nồng độ muối cao 11 (1,5 M NaCl) và ủ mẫu trong 2 - 3 giờ trong sự
hiện diện của SDS, hexadecyltrimethylammonium bromide, và proteinase K.
- Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là phương
pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB là một dung
môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với

13
vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic. Ly trích DNA cần phải có
cả hai yếu tố là hiệu suất và độ tinh khiết.
- Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương đối
hiệu quả, có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia nhiệt đến
650
C. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh chóng và mang lại
kết quả khá cao.
- Phương pháp đóng băng và tan băng: Phương pháp này sử dụng kỹ thuật
đóng băng và tan băng ở - 65o
C trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ vách tế
bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho
việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên.
1.3.2. PCR trong định danh vi sinh vật
1.3.2.1. Kỹ thuật PCR
Đây là một kĩ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại
nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật
sống. Hiện nay, PCR đã trở thành một kĩ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi
trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát hiện các bệnh di truyền, tạo
ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gen.
PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa
trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản
sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase
và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Primer là những đoạn DNA
ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt
động của DNA polymerase, đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới.
Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn
DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức
có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn
DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để
khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về

14
trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các
primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược [11].
1.3.2.2. Gen rDNA
Gen rDNA là nhóm gen mã hóa RNA của ribosome, đóng vai trò quan trọng
trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó
là một gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao
của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa.
Hơn nữa, ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa.
Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương
đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa
trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật
nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer
và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng trình tự không bảo tồn dùng trong
phát hiện và định danh vi sinh vật.
Gen rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gen,
khuếch đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt
phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho
các nghiên cứu liên quan đến rDNA. Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân
loại nấm trên cơ sở rDNA được phát triển những năm đầu của thập niên 90 đã tìm
được quan hệ di truyền của nhiều loài nấm sợi.
1.3.2.3. Mồi
Internal transcribed spacer (ITS) là vùng phiên mã bên trong, có rất nhiều sự
biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa của vi
sinh tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác
định các biệt hóa trong cùng loài [9].
Các mồi vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18S, 5,8S
và 28S. ITS1 là trình tự bổ sung của NS8. Mồi ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng

15
lọc dựa trên vùng bảo tồn thuộc 5,8S của N. crassa, Szchiosaccharomyces prombe
và S.cerevisiae, Viciafaba và chuột. Vùng bảo tồn trên rDNA 28 S của S. prombe,
S.cerevisiae và lúa (Oryza sativa) được so sánh để thiết kế ITS4. Mồi ITS5 có trình
tự giống với rDNA 18S của N. crassa, có đầu 5’ chỉ cách mồi ITS1 25bp.
Bảng 1.1. Các trình tự đoạn mồi vùng gen ITS [22].
ITS1 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G White và cộng sự. 1990
ITS1-F CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A Gardes và Bruns 1993
ITS2 GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC White và cộng sự. 1990
ITS3 GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC White và cộng sự. 1990
ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC White và cộng sự. 1990
ITS4-B CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG Gardes và Bruns 1993
ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G White và cộng sự. 1990
Hình 1.5. Bản đồ mồi trong vùng gen ITS [22].

16
1.3.2.4. Ứng dụng của PCR trong quá trình định danh loài vi sinh vật
Hoàng Quốc Khánh thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và
Công Nghệ Việt Nam, Phạm Thị Lan Thanh thuộc Trường Đại học Lạc Hồng với
đề tài “Phân lập, định danh và xác định các chủng Lactobacillus có tiềm năng
probiotic từ con người”
Khoa, L. V., K. Hatai, và T. Aoki. 2004, “Fusarium incarnatum isolated
from black tiger shrimp, Penaeus monodon Fabricius, with black gill disease
cultured in Vietnam”
Nguyễn Thị Thanh Thủy, Đỗ Ngọc Thúy và Nguyễn Bá Hiên với để
tài:”Thiết lập phương pháp pcr để xác định vi khuẩn verotoxigenic e.coli (vtec)
trong thịt” với phương pháp PCR phức với 3 loại cặp mồi (VT1, VT2 và eae), các
điều kiện phản ứng như đã được thiết lập và chuẩn hóa trong nghiên cứu này có thể
được áp dụng để xác định vi khuẩn Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC).
M M Songe, A Willems, J Wiik-Nielsen, E Thoen, Ø Evensen, P van West
và I Skaar 2015, “Saprolegnia diclina IIIA and S. parasitica employ different
infection strategies when colonizing eggs of Atlantic salmon, Salmo salar L”.
Văn Hồng Cầm, Phan Thị Thảo, Đặng Thúy Bình với đề tài:” Phân lập và
định danh vi khuẩn phát sáng gây bệnh trên cá ngựa đen (Hippocampus kuda)”
1.3.3. Xây dựng cây phát sinh loài
Các phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S - rDNA và việc xây dựng cây
phát sinh loài hiện nay đã trở nên khá phổ biến và được xây dựng trên cơ sở dữ liệu
của sinh học và tin học (sinh tin học). Những trình tự mới này sẽ được so sánh với
những trình tự trong ngân hàng dữ liệu gen bằng cách sử dụng chương trình BLAST
(Basic Local Alignment Search Tool) cho kết quả những loài nào có số trình tự
tương đồng cao nhất với chủng đang khảo sát. Sau đó sử dụng các phần mềm sinh
tin học như ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 để xây dựng

17
cây phát sinh loài, tập hợp những thông tin có liên quan đến tiến hóa. Một cây phát
sinh loài gồm các thành phần như sau:
- Một nhánh (một đơn vị huyết thống) là một nhóm vi sinh vật hay nhóm gen
bắt nguồn từ tổ tiên chung. Trong phân tích cây phát sinh loài, chiều dài
nhánh phát sinh diễn tả mức độ phân hóa giữa các loài.
- Nút giao điểm của các nhánh
- Hệ thống phát sinh loài dựa trên các phân tử mà đặc biệt là trình tự gen được
sử dụng phổ biến trong định danh phân loại.
1.4. Kỹ thuật khuếch tán đĩa giấy kháng sinh vào môi trường thạch
1.4.1. Phạm vi áp dụng
Kỹ thuật đĩa giấy kháng sinh khuếch tán có thể áp dụng cho tất cả các phòng thí
nghiệm vi sinh trong các bệnh viện và cho các trung tâm y tế dự phòng tuyến tỉnh.
Phương pháp được áp dụng nhằm đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của vi
khuẩn gây bệnh để giúp cho các bác sĩ lựa chọn các thuốc kháng sinh phù hợp cho
bệnh nhân.
Sử dụng để giám sát dịch tễ học nhằm đánh giá về tình hình kháng thuốc của vi
khuẩn qua đó sẽ đưa ra các biện pháp nhằm khống chế và ngăn chặn sự lây lan của
vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện và cộng đồng.
1.4.2. Kháng sinh
Kháng sinh là những chất có tác động chống lại sự sống của vi khuẩn ngăn
vi khuẩn nhân lên bằng cách tác động ở mức phân tử, hoặc tác động vào một hay
nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết của đời sống vi khuẩn hoặc tác động vào sự
cân bằng lý hóa. Kháng sinh có khả năng ức chế chọn lọc đối với một số khâu trong
quá trình phát triển của vi khuấn gây bệnh.
Căn cứ vào tác dụng trị bệnh, có thể chia kháng sinh thành 3 nhóm chính

18
- Kháng sinh kháng khuẩn.
- Kháng sinh trị nấm.
- Kháng sinh chống ung thư.
Trong phạm vi đề tài quan tâm đến một số loại kháng sinh kháng khuẩn thông
dụng trong nuôi trồng thủy sản và kháng sinh kháng nấm như sau
- Ampiciline (Am)
Ampicillin là một kháng sinh rất hữu ích cho việc điều trị của một số vi
khuẩn nhiễm trùng. Nó là một kháng sinh thuộc nhóm betalactam, một phần của
nhóm aminopenicillin và tương đương với amoxicillin về hoạt động [5].
Ampicillin thực chất là một penicillin bán tổng hợp nhóm A có hoạt phổ
rộng với nhiều chủng vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-). Ampicillin có tác
dụng chống lại những vi khuẩn mẫn cảm gây nhiễm khuẩn đường hô hấp, dẫn
mật, tiêu hoá, tiết niệu, một số bệnh ngoài da như viêm bì có mủ, áp -xe, đầu
đinh... viêm tai giữa, bàng quang và thận.. Hiệu quả đối với nhiễm trùng tai và
bệnh nhiễm trùng đường hô hấp như viêm xoang do vi khuẩn, đợt cấp của
COPD và viêm nắp thanh quản. Nó cũng được sử dụng để điều trị các bệnh
nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm màng não , và nhiễm khuẩn salmonella [15].
Do bị lạm dụng nên hiện nay nhiều báo cáo cho thấy ampicillin đã bị vi
khuẩn kháng lại với tỷ lệ khá cao. Xu hướng dùng những kháng sinh mới phổ
rộng hơn để điều trị nhiễm khuẩn đã làm cho ampicillin trở thành loại thuốc bị
nhiều người cho là cũ.
- Chloramphenicol (Cl)
Chloramphenicol là một kháng sinh rất hữu ích cho việc điều trị của một số vi
khuẩn nhiễm trùng. Chloramphenicol, còn được gọi là chlornitromycin, có tác dụng
chống lại nhiều loại vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm, bao gồm hầu hết

19
các sinh vật kỵ khí. Chloramphenicol thường có tác dụng kìm khuẩn, nhưng có thể
diệt khuẩn ở nồng độ cao hoặc đối với những vi khuẩn nhạy cảm cao.
Do sức đề kháng và tính an toàn , nó không còn là lựa chọn hàng đầu cho bất kỳ
nhiễm trùng ở các quốc gia phát triển, ngoại trừ điều trị tại chỗ của vi khuẩn viêm
kết mạc. Tuy nhiên, các vấn đề toàn cầu trong việc nâng cao sức đề kháng của vi
khuẩn để loại thuốc mới đã dẫn đến sự ưa chuộng trong việc sử dụng nó [7]. Ở các
quốc gia có thu nhập thấp, chloramphenicol vẫn được sử dụng rộng rãi bởi vì nó
không tốn kém và có sẵn.
- Penicilin (Pn)
Penicillin là một trong một nhóm kháng sinh thu được từ nấm Penicillium hay
được điều chế. Alexander Fleming đã tình cờ phát hiện ra penicillin vào năm 1928
nhưng phải 10 năm sau thì penicillin mới được nhà hoá sinh người Anh gốc Đức
Ernest Chain và nhà nghiên cứu bệnh học Úc Howard Florey và một số nhà khoa
học khác nghiên cứu kỹ.
Penicillin sát trùng bằng cách giết vi khuẩn và hạn chế sự sinh trưởng của
chúng. Chất này không giết các phần tử trong trạng thái nghỉ mà chỉ tiêu diệt các
phần tử đang sinh trưởng và sinh sản. Penicillin tiêu diệt nhiều loài vi khuẩn gây
bệnh khác nhau như pneumococci, streptococci, gonococci, meningococci,
clostridium và syphilis spirochete. Penicillin được sử dụng làm dược phẩm trị các
căn bệnh chết người như viêm nội tâm mạc, nhiễm trùng máu, gas gangrene, mủ
lậu, sốt vàng da, giang mai, và viêm loét lưỡi cấp [30].
- Streptomycin (Sm)
Strepxomycin là kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng diệt khuẩn, bằng
cách ngăn cản quá trình tổng hợp bình thường protein của vi khuẩn.
Phổ kháng khuẩn của strepxomycin bao gồm vi khuẩn Gram âm hiếu khí và
một số vi khuẩn Gram dương; strepxomycin không có tác dụng với vi khuẩn yếm

20
khí. Strepxomycin có hoạt tính đặc biệt chống M. tuberculosis và M. bovis.
Strepxomycin cũng có hoạt tính chống một số vi khuẩn Gram dương và Gram âm
hiếu khí như: Brucella, Francisella tularensis, Yersinia pestis,
Calymmatobacterium granulomatis, Escherichia coli, Proteus spp., Aerobacter
aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Enterococci faecalis, Strepxococcus viridans,
Haemophylus ducreyi và Haemophylus influenza.
Có nguồn gốc từ các actinobacterium Streptomyces griseus. Streptomycin là
một khuẩn kháng sinh [16]. Các tác dụng phụ của thuốc này là độc tính trên tai, độc
với thận, độc tính thính giác của thai nhi và tê liệt thần kinh cơ.
- Tetracycline (Te)
Tetracycline là một kháng sinh thuộc thế hệ kháng sinh cũ được tìm ra, từ năm
1948, nhưng cho đến nay nó vẫn là một kháng sinh tốt. Trong quá trình sử dụng dù
tỷ lệ kháng lại kháng sinh này khá nhiều nhưng nó vẫn là một kháng sinh công hiệu
và chưa thể loại bỏ khỏi tủ thuốc kháng sinh của nhân loại.
Tetracycline là một dòng kháng sinh phổ rộng, có hiệu lực với hầu như các vi
khuẩn gram âm cũng như gram dương. Nó đã từng được coi là kháng sinh “bách
bệnh” dùng cho mọi loại vi khuẩn và được sử dụng khá lạm dụng. Tỷ lệ kháng
kháng sinh này khá cao nhưng không phải vì thế mà nó mất đi công hiệu vốn có của
nó. Với những tác dụng đặc hiệu thì tetracycline vẫn được bảo toàn sau 70 - 80 năm
và là kháng sinh đầu bảng của các bệnh nhiễm Chlamydiae, bệnh nhiễm
Mycoplasma, Rickettsiae như sốt kiểu thương hàn, sốt hồi quy và đặc biệt là nhiễm
phẩy khuẩn tả Vibrio cholerae gây ra bệnh dịch tả điển hình trong mùa hè [26].
- Amphotericin (AMB)
Amphotericin là một kháng sinh chống nấm nhờ gắn vào sterol (chủ yếu là
ergosterol) ở màng tế bào nấm làm biến đổi tính thấm của màng. Amphotericin B
cũng gắn với sterol bào chất của người (chủ yếu cholesterol) nên giải thích được

21
một phần độc tính của thuốc đối với người. Do đó thuốc đã được bào chế dưới dạng
liposom hoặc phức hợp với lipid để giảm độc tính. Amphotericin B có tác dụng kìm
nấm đối với một số nấm như: Absidia spp., Aspergillus spp., Basidiobolus spp.,
Blastomyces dermatitidis., Candida spp., Coccidioides immitis, Conidiobolus spp.,
Crypxococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Mucor spp., Paracoccidioides
brasiliensis, Rhizopus spp., Rhodotorula spp. và Sporothrix schenckii.
Nồng độ ức chế tối thiểu trong khoảng từ 0,03 - 1 microgam/ml đối với đa số
các loài nấm này. Những loài khác như: Prototheca spp, Leishmania và Naegleria
protozoa cũng được thông báo có nhạy cảm với amphotericin B. Thuốc không có
tác dụng với vi khuẩn, Rickettsia và virus.
Kháng thuốc: Dường như không có kháng thuốc invivo. Không thấy có chủng
Candida nào kháng amphotericin trên lâm sàng mặc dù có một số ít chủng kháng
invitro, nhưng chỉ thấy ở các chủng thứ cấp sau nhiều lần cấy [27].
- Flucytosine (AFY)
Thuốc chống nấm phổ hẹp. Tác dụng trực tiếp trên nấm. Kết quả là nấm phát
triển mất cân bằng và chết.
Flucytosine được chỉ định điều trị các bệnh nhiễm trùng nhiêm trọng gây ra
bởi các chủng nhạy cảm của Candida hoặc Cryptococcus neoformans. Nó cũng có
thể được sử dụng để điều trị chromomycosis (Chromoblastomycosis), nếu chủng
nhạy cảm gây ra nhiễm trùng. Do Flucytosine có tác dụng kháng nấm tương đối yếu
nên thường được kết hợp với amphotericin B và azole chống nấm như fluconazole
hoặc itraconazole. Nhiễm khuẩn nhẹ như candidal viêm bàng quan có thể được điều
trị bằng flucytosine [23].
- Ketoconazole (KCA)
Là thuốc kháng nấm phổ rộng, tác dụng trên nhiều nấm gây bệnh, bao gồm
các loại nấm bề mặt da, niêm mạc và nấm nội tạng.

22
Có hoạt tính diệt nấm hoặc kìm nấm đối với vi nấm ngoài da như nấm men
(Cadida, Pityrosporum, Torulopsis, Cryptococcua), các nấm nhị độ và các
Eumycetes. Kém nhạy cảm hơn là các chủng Aspergillus, Sporothrix schenckii, một
số Dematiaceae, các chủng Mucor và các Phycomycetes khác ngoại trừ
Entomophthorales. Ketoconazol ức chế sự sinh tổng hợp ergosterol ở nấm và làm
thay đổi các thành phần lipid khác ở màng tế bào vi nấm, làm thay đổi tính thấm
màng tế bào, ức chế chức năng màng và ức chế sự phát triển của nấm.
- Nystatin (NY)
Nystatin (tên ban đầu là Fungicidin) là một thuốc kháng nấm polyene mà có
nguồn gốc từ một loại vi khuẩn Streptomyces noursei. Nhiều người nhiễm nấm mốc
và nấm men đều nhạy cảm với nystatin, có tác dụng rất tốt trên Candida albicans.
Nó được sử dụng chủ yếu cho các bệnh nhiễm trùng liên quan đến da, miệng, thực
quản, và âm đạo.
Nystatin có tác dụng chống bội nhiễm Candida albicans đường tiêu hóa trong
quá trình điều trị kháng sinh [25].
1.5. Phương pháp chụp SEM
Kính hiển vi điện tử quét là một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với
độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm
các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện
thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện
tử với bề mặt mẫu vật.
Ứng dụng của kĩ thuật SEM
Nghiên cứu vật kí sinh bằng SEM cho phép chúng ta hình dung đặc điểm hình
thái bên ngoài và là một công cụ hữu ích cho việc thu nhập dữ liệu về các nghiên
cứu hệ thống phân loại của vật ký sinh nói chung. Kĩ thuật SEM là một công cụ
mạnh mẽ để hình dung sự thay đổi hình thái xảy ra trên bề mặt tế bào.

23
Hình 1.6. Hình thái bên ngoài của vật kí sinh chụp bằng SEM [14].
Hình 1.7. Sự thay đổi hình thái xảy ra trên bề mặt tế bào chụp bằng SEM [14].

24
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, thiết bị và hóa chất
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ: Pipet, pipetman, đầu tip, Erlen, Lame, Lamelle, que cấy, cân phân
tích, máy chụp hình, ống đong, eppendorf…
Thiết bị: Kính hiển vi quang học, tủ lạnh, máy ly tâm lạnh, nồi hấp khử trùng,
máy PCR sprint thermo Cycler, máy lắc…
2.1.2. Nguồn mẫu
Trứng bệnh của cá Bá Chủ được thu tại Trại nghiên cứu thực nghiệm Thủ Đức
(đơn vị trực thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II), địa chỉ 658 Kha Vạn
Cân, Phường Linh Đông, Quận Thủ Đức.
2.1.3. Hóa chất
2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy
Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar)
2.1.3.2. Các hóa chất định danh
Đệm CTAB (0,2 M Tris-Cl pH 7,5, 2 M NaCl, 0,05M EDTA, 2 % CTAB),
Chloroform_Isoamyl alchol (24:1), Isopropanol, Etanol 70 %, 6X LB Loading dye,
TAE 1X, Agarose, Ethidium bromide, Thang DNA 1kb.
2.1.3.3. Các hóa chất phản ứng PCR
Nước khử ion.
Master Mix (2x My taq MixP).
Mồi xuôi ITS1F: TCCGTAGGTGAACCTGCGG.

25
Mồi ngược ITS4R :TCCTCCGCTTATTGATATGC.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập nấm gây bệnh
Vì yêu cầu phải phân lập nấm gây bệnh trên trứng cá Bá Chủ nên các mẫu
nấm sẽ được thu thập và phân lập từ các mẫu trứng bệnh.
Có nhiều phương pháp phân lập nấm trong đó người ta có thể dùng các chất
kháng khuẩn để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và thu nhận nấm, cụ thể trong đề
tài này sử dụng chất kháng khuẩn Chloramphenicol, Sodium propionate.
Các bước phân lập:
- Chuẩn bị dụng cụ môi trường
Môi trường PDA, đĩa petri và ống nghiệm thạch nghiêng, kéo, kẹp.
 Các dụng cụ trên được hấp khử trùng trong nồi áp suất ở 121o
C, 1 atm trong 20
phút.
- Phân lập
Mẫu trứng bệnh sau khi thu về sẽ được đặt lên bề mặt đĩa thạch đã chuẩn bị
trước, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng 2 ngày.
- Làm thuần
Sau 2 ngày ủ, dùng que cấy thao tác vô trùng chấm nhẹ vào khuẩn lạc riêng
lẻ có đặc trưng khác với các khuẩn lạc còn lại ria trên đĩa petri khác, và đem ủ để
tạo khuẩn lạc đơn dòng.
Lặp lại việc tách dòng nhiều lần để có được giống thuần.
Kiểm tra tính thuần và giữ giống trong môi trường PDA thạch nghiên trong
ngăn mát tủ lạnh.

26
2.2.2. Phương pháp phòng ẩm
Cách tiến hành:
Trước hết ta chuẩn bị lame, lamelle, đĩa petri có giấy lọc ở dưới và thanh thủy
tinh chữ “u” bên trên. Đem hấp khử trùng cùng với một ống môi trường PDA và
một bình nước cất.
Dùng pipetman hút môi trường và nhỏ vào lame sao cho môi trường trang
mỏng khoảng 2/3 lame để môi trường đông tự nhiên.
Dùng que cấy vòng ria tế bào nấm theo dấu “-” rồi đậy lamelle lại.
Nhỏ nước cất vô trùng cho thấm đều giấy thấm.
Đậy nắm đĩa lại và gói đĩa cẩn thận và ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày.
Quan sát dưới kính hiển vi.
2.2.3. Định danh bằng sinh học phân tử
2.2.3.1. Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA bằng CTAB [17]
Các bước tiến hành
Hút 200 µl dịch nuôi cấy nấm trong môi trường PDB sau 2 ngày vào
eppendorf 1,5 ml
Thêm vào 800 µl đệm CTAB sau đó đêm ủ 60o
C trong 60 phút.
Ly tâm 1300 rpm trong 5 phút
Lấy ra 600 µl dịch nổi cho vào 1 tube 1,5 ml.
Thêm một thể tích chloroform-isoamylalcohol (24:1) tương đương với thể tích
phần dịch lấy ra (600 µl), trộn đều bằng cách lắc tube sau đó đem ly tâm 13000 rpm
trong 10 phút ở 4o
C và thu dịch nổi bên trên màng phân cắt.

27
Chuyển phần dịch thu được vào 1 tube 1,5 ml mới ( phần dịch khoảng
400µl).
Thêm vào isopropanol lạnh ( tỉ lệ thể tích 1:1).
Trộn đều.
Để lạnh -80o
C 45 phút – 60 phút
Ly tâm 1300 rpm trong 20 phút ở 4o
C
Thu tủa.
Rửa tủa DNA với 700µl etanol 70%, lắc nhẹ rồi đem ly tâm 13000 rpm trong
1 phút
Bỏ dịch, thu tủa và để khô tự nhiên (hoặc làm khô 1 giờ ở 60o
C)
Hòa tan tủa trong 30-50 µl nước cất tinh khiết, bảo quản -4o
C.
2.2.3.2. Phản ứng PCR [5]
Tất cả các DNA polymerase cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một
mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen
(gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho nấm. Mồi là những đoạn DNA ngắn
có khả năng bắt cặp bổ sung cho một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của
DNA polymerase, đoạn mồi này được nhận biết và kéo dài để hình thành mạch mới.
Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase.
Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một
trình tự DNA trong phản ứng PCR và ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA
polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại tạo nên số lượng lớn
các bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và
điện di trên gel agarose.
- Các thành phần của phản ứng PCR

28
DNA mẫu: chứa vùng DNA cần được khuếch đại.
Mồi: là những đoạn oligonucleotide, bổ sung cho vùng DNA tại đầu 5’ và 3’
của vùng DNA cần được khuếch đại.
DNA polymerase: (Taq DNA polymerase hay một polymerase khác mà có khả
năng hoạt động tốt ở nhiệt độ khoảng 70O
C) dùng để tổng hợp đoạn DNA của vùng
cần khuếch đại.
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs): là vật liệu để polymerase tổng hợp
DNA.
Dung dịch Buffer: cung cấp môi trường thích hợp cho hoạt tính cao và bền
vững của polymerase.
Cation hóa trị 2 (Mg2+
hay Mn2+
): thông thường Mg2+
được sử dụng, nhưng
Mn2+
có thể được dùng cho phản ứng PCR tức thời. Tuy nhiên, nồng độ Mn2+
cao
gia tăng tỉ lệ bắt cặp sai trong quá trình tổng hợp DNA.
Cation hóa trị 1: K+
.
Một trong những DNA polymerase bền nhiệt đầu tiên được thu nhận từ
Thermus acquaticus và thường được gọi là Taq polymerase. Taq polymerase hiện
nay được sử dụng rộng rãi trong các phản ứng PCR. Một trong những nhược điểm
của Taq polymerase là thỉnh thoảng chúng tổng hợp sai khi tổng hợp đoạn DNA
dẫn đến những đột biến trong đoạn DNA, bởi vì chúng thiếu hoạt tính sửa sai
exonuclease 3’-5’. Một số polymerase khác như: Pwo và Pfu được thu nhận từ
Archaea có cơ chế đọc và sửa sai (cơ chế kiểm tra lại sự sai) mà có thể giảm phần
lớn những đột biến xảy ra trong quá trình tổng hợp DNA. Tuy nhiên những enzyme
này có hoạt tính tổng hợp DNA thấp hơn Taq. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và
Pfu polymerase cung cấp cả hoạt tính tổng hợp DNA cao và sự chính xác trong sự
tổng hợp DNA.
- Chu trình phản ứng

29
Thông thường, PCR kéo dài 20 - 35 chu kì, hầu hết các phản ứng PCR bao
gồm 3 bước:
Bước 1 (biến tính DNA): Đầu tiên, phản ứng PCR thường được gia nhiệt đến
nhiệt độ 94 - 96o
C, nhiệt độ này được giữ 1 - 9 phút nhằm đảm bảo tất cả DNA mục
tiêu và mồi bị biến tính , DNA được làm tách mạch bởi sự phá vỡ liên kết hydrogen
giữa các base bổ sung của chuỗi DNA, tạo thành các chuỗi DNA mạch đơn. Sau đó,
chu trình bắt đầu với một bước có nhiệt độ 94 - 980
C khoảng 20 - 30 giây.
Bước 2 (bước lai): Nhiệt độ phản ứng được làm thấp để mồi có thể bắt cặp với
mạch khuôn DNA đơn. Liên kết hydrogen giữa mạch khuôn và mồi bắt đầu được
hình thành. Liên kết này chỉ được bền vững khi mồi bắt cặp chính xác với mạch
khuôn và đoạn ngắn DNA mạch đôi này là nơi DNA polymerase gắn vào và bắt đầu
tổng hợp DNA. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ nóng chảy của mồi
và thông thường khoảng 50-64o
C trong thời gian 20 - 40 giây.
Bước 3 (bước kéo dài): DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới bổ sung
đối với DNA mạch khuôn. Nhiệt độ của bước này phụ thuộc vào nhiệt độ hoạt động
tối ưu của DNA polymerase. Taq DNA polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu 70
- 74o
C, trong hầu hết trường hợp nhiệt độ thường được dùng là 72o
C. Nối hydrogen
giữa đoạn mồi và DNA khuôn phải đủ bền để chịu đựng được nhiệt độ cao. Mồi đã
lai với vùng DNA có nhiều base sai sẽ bị tách ra từ khuôn mẫu và không được kéo
dài. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào DNA polymerase được sử dụng và chiều dài
đoạn DNA mục tiêu cần được khuếch đại. Bước kéo dài cuối cùng kéo dài khoảng 5
- 15 phút (phụ thuộc vào chiều dài mỗi đoạn DNA mẫu), chu kì cuối cùng này được
dùng để chắc chắn phần còn lại của chuỗi DNA có thể được kéo dài hoàn toàn.
Để kiểm tra có hay không phản ứng PCR tạo ra đoạn DNA cần khuếch đại,
điện di trên gel agarose có thể được sử dụng cho sự phân tách các sản phẩm PCR.
Kích thước của sản phẩm PCR được xác định bởi thang DNA, chứa đựng những
đoạn DNA có kích thước đã được biết chạy dọc trên gel cùng với sản phẩm PCR.

30
Các DNA được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy dưới tia UV
(bước sóng 312 nm).
Phương pháp PCR có độ nhạy rất cao, thao tác lại đơn giản nhưng mức độ
ngoại nhiễm cao, sự kém trung thực trong quá trình tổng hợp của Taq polymerase…
Vì vậy, cần cẩn trọng khi tiến hành thí nghiệm cũng như phân tích kết quả.
2.2.3.3. Dùng PCR để khuếch đại đoạn gen ITS của nấm bệnh
 Thành phần phản ứng
Mater mix 6,5 µl
ITS1F 0,1 µl
ITS4R 0,1 µl
DNA 1 µl
H2O 17,3 µl
Tổng 25 µl
 Chu trình phản ứng PCR
- Bước 1: Biến tính DNA, 94o
C trong 5 phút
- Bước 2: 30 chu kỳ
94o
C trong 1 phút
55o
C trong 30 giây
72o
C trong 1 phút
- Bước 3: Kết thúc, 72o
C trong 10 phút
- Bước 4: Bảo quản 4o
C
 Kiểm tra kết quả PCR

31
Ta sử dụng phương pháp điện di để kiểm tra mẫu PCR
Các bước thực hiện
- Bước 1: Đổ gel
Dùng băng keo dán chặt hai đầu của khay điện di, đặt lược sẵn ở 1 đầu khay.
Đặt khay ở nơi bằng phẳng, dùng miếng bọt khí để kiểm tra.
Cân 0,4 g agarose cho vào bình tam giác 250 ml, thêm 50 ml nước cất. Lắc
nhẹ cho agarose hòa lẫn trong nước.
Đặt bình tam giác vào lò vi song đun khoảng 3 - 5 phút. Dung dich trong bình
tam giác trở thành màu trắng trong.
Lấy bình tam giác ra, đợi 15 phút rờ thấy vừa nóng (60o
C) thì đổ nhẹ dung
dịch vào khay điện di. Khoảng 45 phút thì agarose đặc lại, gel đổi thành màu trắng
đục.
- Bước 2: Chạy gel.
Đặt khay vào bể điện di, lấy nhẹ lược ra, không làm động đến gel.
Thêm dung dich đệm điện di phủ mặt gel khoảng 1 mm.
Dùng pipette P100 hút 10 µl loading buffer chia thành 4 giọt trên paraffin
Dùng pipette P100 hút 10 µl mẫu, trộn với 1 giọt loading buffer sau đó load
vào giếng. Thêm một giếng nạp mẫu thang đối chứng có kích thước từ 500 bp -
10000 bp.
Khởi động nguồn điện, chọn 80 voltage . Nhấn nút Run.
DNA sẽ chạy từ cực âm sang cực dương. Do DNA mang điện tích âm (các gốc
phosphate mang điện tích âm đưa ra ngoài)
Sau khi DNA chạy được hơn 2/3 mẫu gel (khoảng 45 phút) thì nhấn nút stop.

32
Lấy khay điện di ra.
Nhuộm gel với Ethidium Bromide trong 15 phút.
Xem gel dưới đèn UV.
Chụp hình
2.2.3.4. Giải trình tự và định danh
Công ty Nam Khoa, địa chỉ: 793/58 Trần Xuân Soạn - Phường Tân Hưng
Quận 7 - Thành phố HCM - Việt Nam.
Sau khi giải trình tự thì kết quả sẽ được gửi về và được xử lý bằng các phần
mềm chuyên dụng để định danh loài và xây dựng cây phân loài.
Chromas Pro, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 và Ngân hàng gen
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
2.2.4. Kháng sinh đồ
2.2.4.1. Nguyên lý
Kháng sinh ở trong đĩa giấy sẽ khuếch tán vào môi trường PDA có chứa các
chủng nấm sợi thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của nấm sợi với kháng sinh được
biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh đĩa giấy kháng sinh.
2.2.4.2. Đĩa giấy kháng sinh
Sử dụng đĩa giấy kháng sinh của các hãng sản xuất có bán trên thị trường cho
kỹ thuật đĩa giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch.
Các đĩa giấy kháng sinh phải được bảo quản trong hộp riêng trong điều kiện
khô ráo, ở trong tủ lạnh nhiệt độ 8o
C hoặc -200
C.
Khi sử dụng xong đĩa giấy còn thừa phải được đóng kín và cất giữ trở lại tủ
lạnh.

33
2.2.4.3. Các bước thực hiện
Chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng trong đĩa petri sau 2 - 4
ngày. Sau đó quan sát hình dạng khuẩn lạc.
Cấy trãi chủng nấm trên đĩa petri.
Đặt đĩa kháng sinh lên mặt môi trường đã được cấy trãi .
Ủ trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Quan sát và đọc kết quả sau 72 giờ.
2.2.5. Phương pháp cảm nhiễm
2.2.5.1. Chuẩn bị
- Dịch nuôi cấy nấm cảm nhiễm
Các chủng nấm phân lập từ trứng bệnh đã được làm thuần trên môi trường
PDA được cấy chuyển vào môi trường PDB. Ủ ở nhiệt độ phòng (28 – 300
C) trong
5 ngày để tạo lượng sinh khối lớn.
- Mẫu trứng sạch bệnh
Mẫu trứng sạch bệnh được cung cấp từ Trại nghiên cứu thực nghiệm Thủ Đức
(đơn vị trực thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II) được kiểm tra dưới kính
hiển vi không có dấu hiệu nhiễm bệnh và sự phát triển bình thường của phôi.
- Nước sử dụng ấp trứng
Nước được sử dụng ấp trứng là nước biển có độ mặn là 30ppt, được lấy trực
tiếp từ Trại nghiên cứu thực nghiệm Thủ Đức để có sự đồng nhất về độ mặn, tránh
để ảnh hưởng đến sự phát triển bình thường của trứng. Nước biển được hấp khử
trùng trong nồi áp suất ở 121o
C, 1 atm trong 20 phút.

34
2.2.5.2. Bố trí thí nghiệm
Trứng cá Bá Chủ đã thụ tinh không nhiễm các mầm bệnh (vi khuẩn, nấm, ký
sinh trùng) được bố trí thành 4 mẫu trứng thí nghiệm.
- Mẫu đối chứng: trứng được ấp trong nước biển đã hấp khử trùng, không bổ
sung dịch nuôi cấy nấm.
- Mẫu trứng M.1.1, M.1, M.4.1 : trứng được ấp trong nước biển đã hấp khử
trùng, bổ sung dịch nuôi cấy nấm.
Mỗi mẫu được bố trí 20 trứng/mẫu, trứng được ấp ở nhiệt độ 280
C, lắc với tốc
độ 90 rpm, quan sát các mẫu mỗi 24 giờ. Các mẫu có dấu hiệu nhiễm bệnh sẽ được
cố định và gửi mẫu chụp SEM để xác định sự xâm nhập của nấm vào trứng tại Viện
Công nghệ Hóa học.
2.2.6. Phương pháp chụp SEM
Mẫu đối chứng và mẫu trứng có dấu hiệu nhiễm bệnh sẽ được cho vào
eppendorf có chứa dung dịch cố định mẫu và gửi mẫu đến Viện Công nghệ Hóa
học, địa chỉ số 01 Mạc Đĩnh Chi, Phường Bến Nghé, Quận 1, Tp. Hồ Chí Minh –
Việt Nam.

35
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Kết quả phân lập và làm thuần của nấm bệnh
3.1.1. Kết quả thu nhận mẫu trứng bệnh
Hình 3.1. Trứng cá Bá Chủ
Hình 3.2. Trứng cá Bá Chủ bị nhiễm bệnh
Trứng cá Bá Chủ phát triển bình thường có màu đỏ cam (hình 3.1) sau khi
nhiễm bệnh trứng chuyển sang màu trắng đục (hình 3.2), trứng dai và cứng hơn so
với trứng phát triển bình thường.
Các mẫu trứng bệnh được thu nhận và phân lập trên môi trường PDA có bổ
sung Sodium propionate và Chloramphenycol.

36
3.1.2. Kết quả hình thái khuẩn lạc
Từ 4 mẫu trứng nhiễm bệnh, đã phân lập, làm thuần và chọn lọc được 3 chủng
nấm bệnh kí hiệu là M.1.1, M1, M.4.1.
C trong 72 giờ.
Chủng nấm M.1.1 được nuôi trên môi trường PDA ở nhiệt độ 28o
C trong thời
gian 72 giờ có kích thước khuẩn lạc là 20 – 24 mm, sợi nấm màu trắng, mặt trên
màu trắng ở giữa màu vàng nhạt, mặt dưới có màu vàng cam, hơi hồng, rìa khuẩn
lạc có dạng răng cưa.
Hình 3.4. Khuẩn lạc chủng M.1 trên môi trường PDA ở 28o
C trong 72 giờ.
Chủng nấm M.1 được nuôi trên môi trường PDA ở nhiệt độ 28o
C trong thời
gian 72 giờ có kích thước khuẩn lạc là 12 – 15 mm, sợi nấm màu trắng dạng mặt
nhung mịn, mặt trên màu trắng, mặt dưới ở giữa màu hơi vàng, mép mỏng.
Mặt trước Mặt sau

37
C
Chủng nấm M.4.1 được nuôi trên môi trường PDA ở nhiệt độ 28o
C trong thời
gian 24 giờ chủng M.4.1 phát triển nhanh và mọc tràn khắp đĩa peptri, khuẩn lạc
không có hình dạng rõ rệt, màu trắng tơi như bông gòn. Sau 48 giờ, chủng M.4.1
sinh bào tử có màu vàng cam.
Dựa vào hình thái học của khuẩn lạc trên môi trường PDA cho thấy chủng
M.1.1 có khả năng thuộc chi Fusarium, chủng M.1 thuộc chi Lecanicillium và
chủng M.4.1 thuộc chi Neurospora. Và tiếp tục khảo sát quá trình hình thành sợi
khuẩn ty và bào tử của các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1.
48 giờ
24 giờ

38
3.1.3. Kết quả quan sát sợi khuẩn ty và bào tử
Hình 3.6. Sợi khuẩn ty và sự hình thành bào tử của chủng M.1.1 (40X)
a,b: sợi khuẩn ty c,d: sự hình thành bào tử
Dựa vào hình ảnh sự hình thành sợi khuẩn ty (hình 3.6) của chủng M.1.1 cho
thấy sợi có dạng phân nhánh (hình 3.6a), hình thành vách ngăn( hình 3.6b) và tạo tế
bào phân đốt (hình 3.6d) cuống bào tử đính hình thành cấu trúc bó sợi và bào tử hơi
cong với một tế bào đỉnh nhọn và một tế bào hình chân từ thể bình đơn (hình 3.6c).
Kết hợp với hình thái khuẩn lạc (hình 3.3) cho phép kết luận sơ bộ về chủng M.1.1
có thể thuộc chi Fusarium.
a b
c d

39
Hình 3.7. Sợi khuẩn ty và sự hình thành bào tử của chủng M.1 (100X)
a,b,c: sợi khuẩn ty d: sự hình thành bào tử
Chủng M.1 cũng có dạng sợi phân nhánh và có sự hình thành vách ngăn (hình
3.7b) và tạo tế bào phân đốt (hình 3.7d). Kết hợp với hình thái khuẩn lạc (hình 3.4)
cho phép kết luận sơ bộ về chủng M.1 có thể thuộc vào chi Lecanicillium.
Chủng M.4.1 cũng có dạng sợi phân nhánh (hình 3.8a) và có sự hình thành
vách ngăn (hình 3.7b,c) và tạo bảo tử (hình 3.7d). Kết hợp với hình thái khuẩn lạc
(hình 3.5) cho phép kết luận sơ bộ về chủng M.4.1 có thể thuộc vào chi Neurospora.
d
c
b
a

40
Hình 3.8. Sợi khuẩn ty và bào tử của chủng M.4.1 (100X).
a,b,c: sợi khuẩn ty d: bào tử
Qua các kết quả sơ bộ về hình thái học khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử của các
chủng nấm gây bệnh được phân lập từ trứng cá Bá Chủ, tiếp tục định danh ở mức
độ phân tử dựa vào vùng gen ITS với cặp mồi ITS1F và ITS4R.
3.2. Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS
Sau khi phân lập và quan sát các đặc điểm hình thái học, các chủng M.1.1,
M.1 và M.4.1 được tăng sinh trong môi trường PDB để thu sinh khối và sau đó tiến
hành quá trình ly trích và thu nhận DNA bộ gen.
a b
c d

41
Quá trình định danh bao gồm các bước tách chiết DNA, khuếch đại đoạn DNA
bằng phản ứng PCR, điện di kiểm tra sản phẩm PCR, giải trình tự gen và so sánh
đoạn trình tự với trình tự gen của các loài cơ sở dữ liệu. NCBI.
3.2.1. Kết quả ly trích, thu nhận bộ gen DNA
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm ly trích bộ gen DNA của 3 chủng M.1.1, M.1
và M.4.1 trên gel agarose 1%.
Từ hình 3.9 cho thấy kết quả ly trích bộ gen DNA của 3 chủng M.1.1, M.1 và
M.4.1 đều tốt. Từ đó, tiếp tục sử dụng sản phẩm ly trích dùng cho phản ứng PCR để
khuếch đại đoạn gen ITS.
3.2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS
Đoạn gen bảo tồn ITS của các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 được nhân bản với
cặp mồi ITS1F và ITS4R bằng kĩ thuật PCR.
Từ hình 3.10 cho thấy kết quả điện đi của sản phẩm PCR đều có các vạch nằm
tương đương ở vị trí khoảng 500 - 600 bp. Sản phẩm PCR được gửi đi công ty Nam
Khoa để giải trình tự.
M.1.1 M.4.1
M.1

42
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 trên
gel agarose 1%.
3.3. Kết quả so sánh vùng gen ITS của 3 chủng M.1.1, M.1, M.4.1 và thiết lập
cây phát sinh loài dựa trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI
Sau khi gửi sản phẩm PCR để giải trình tự DNA tại công ty Nam Khoa thì kết
quả được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng như phần mềm
ChromasPro 1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 và Ngân hàng gen
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, dựng cây phát sinh loài.
3.3.1. Trình tự vùng gen ITS của các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1
ChủngM.1.1:TCTCCTACGGATACGGTCGGTGGACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTG
TGAACATACCTAAACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACT
CTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGAT
GAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC
CCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAAC
CCGCGTTCCCCAAATCGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGC
GGCCACGCCGTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA
AGCGGAGGAA
ChủngM.1:GCTTCGATTCTACGATCGGTGGACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCTTATGT
GAACATACCAATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCGGTGTCCGGCAGGCCCTCGCGGCCGGCCGCGACCCGGATCCAGGC
GGACGCCGGAGACCATCCAAAAACTCTTTGTATTTTAGCAAGTCTTCTGAATGAGCCGCAAGGCAACACAAATGAATCAA
AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAAT
TCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAAC
CCTCGAGCTCCCTTTGGGGAGCCCGGCGTTGGGGACCGGCCTCTACCGCCGGCCCCGAAATGAAGTGGCGGCCCGTCCGC
500-600 bp
M.1.1 M.1 M.4.1 Thang

43
GGCGACCTCTGCGTAGTAACTCACCTCGCACCGGAACCCCGACGTGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAACGTT
GACCTCGAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAA
ChủngM.4.1:CTCACGACTCTACCGATTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACAGAGTTGCAAAACTCCCACAAACC
ATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGGAAAGGCCCTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTCT
CCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACTAAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAATA
AGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTG
CAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCAT
TTCAACCATCAAGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGTCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCA
CACCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGTTGACCTC
GGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA
3.3.2. Thiết lập cây phát sinh loài
Hình 3.11. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS các chủng
M.1.1, M.1, M.4.1 với các chủng nấm trên ngân hàng gen NCBI.
Tiến hành so sánh vùng gen của các mẫu phân lập được với vùng gen bảo tồn
ITS của các chủng nấm sợi trên ngân hàng gen NCBI, các đặc điểm hình thái học
của các chủng tương đồng và có được kết quả như sau.
Chủng M.1.1 có mối quan hệ gần nhất với loài Fusarium incarnatum
KM519192.1, Penicillium expansum FJ008994.1 và Fusarium longipes

44
AB820724.1 có mức độ tương đồng là 100%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen
và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng M.1.1 là loài Fusarium incarnatum
Fusarium incarnatum được phân lập từ tổn thương mang của tôm sú nuôi
(Penaeus monodon), mỗi vụ thu hoạch trong thời gian 2000 - 2002 tại tỉnh Nghệ
An, Việt Nam. Tôm bị nhiễm bệnh cho thấy dấu hiệu điển hình của bệnh mang đen
và tỷ lệ chết khoảng một tháng trước khi thu hoạch [10].
Chủng M.1 có mối quan hệ gần nhất với loài Lecanicillium fusisporum
KF766521.1 và Lecanicillium tenuipes JN036556.1 với mức độ tương đồng là
100%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự gen và các nghiên cứu về đặc điểm hình
thái thì chủng M.1 là loài Lecanicillium tenuipes.
Lecanicillium tenuipes được phân lập từ 0,82% xác B. Piniaria được tìm thấy
trong đất và được phân loại như là một nấm keratinophylic. Nó có thể gây ra một
số bệnh hại cây trồng. L. tenuipes được tuyên bố hoạt động chitinolytic do đó nó có
thể được kết hợp với côn trùng hoặc tuyến trùng trong đất [8].
Chủng M.4.1 có mối quan hệ gần nhất với loài Neurospora Crassa
FJ360521.1, Neurospora pannonica KF881757.1 và Neurospora tetrasperma
FJ904922.1 với mức độ gen tương đồng là 99%. Dựa vào kết quả so sánh trình tự
gen và so sánh kết quả đặc điểm hình thái thì chủng M.4.1 là loài Neurospora
Crassa
Các báo cáo được công bố đầu tiên của loại nấm này là từ một sự phá hoại của
các tiệm bánh Pháp vào năm 1843 [24].
N. crassa có thể hoạt động không chỉ như là một thực vật ký sinh mà còn là
một tác nhân gây bệnh trên cây thông Scots, khi cây chủ đã được phát triển trên môi
trường thạch nước hoặc trong các môi trường có kiểm soát trong nhà kính. Nhiễm
trùng với N. crassa kích thích các triệu chứng bệnh điển hình, cuối cùng gây ra cái
chết của cây thông Scots [12].

45
3.4. Kết quả độ nhạy cảm của các chủng nấm với kháng sinh
Trong phương pháp sử dụng các đĩa giấy có tẩm kháng sinh. Sau khi cấy trải
các chủng nấm sợi trên môi trường PDA đặt các đĩa giấy kháng sinh lên bề mặt môi
trường và ủ trong 72 giờ ở nhiệt độ phòng. Kháng sinh ở trong các đĩa giấy sẽ
khuếch tán vào thạch PDA có chứa các chủng nấm sợi thử nghiệm và mức độ nhạy
cảm của các chủng nấm sợi thể hiện bằng đường kính các vòng xung quanh đĩa giấy
kháng sinh.
Bảng 3.1. Kết quả độ nhạy cảm của chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 với kháng sinh
Chủng Kháng sinh kháng khuẩn Kháng sinh kháng nấm
Mặt trước Mặt sau Mặt trước Mặt sau
M.1.1
M.1
M.4.1
Dựa vào bảng 3.2 và thí nghiệm được thực hiện với các đĩa giấy tẩm kháng
sinh cho thấy, đối với 5 loại kháng sinh Ampiciline (Am), Chloramphenicol (Cl),
Penicilin (Pn), Streptomycin (Sm) và Tetracycline (Te) thì hầu như không có tác
dụng với các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1.

46
Bảng 3.2. Kích thước đường kính vòng kháng khuẩn và kháng nấm sau 72 giờ.
Chủng
Kích thước đường kính
(mm)
Kháng sinh kháng khuẩn Kháng sinh kháng nấm
Am Cl Pn Sm Te AMB AFY KCA NY
M.1.1 0 0 0 0 0 13 0 13 18
M.1 0 0 0 0 0 0 0 0 17
M.4.1 0 0 0 0 0 14 0 14 30
Đối với kháng sinh Amphotericin (AMB), 2 chủng M.1.1 (Fusarium
incarnatum) và M.4.1 (Neurospora crassa) có tính nhạy cảm.
Với kháng sinh Flucytosin (AFY), hầu như không có tính kháng với các chủng
M.1.1, M.1 và M.4.1.
Còn với kháng sinh Ketoconozole (KCA) chủng M.1.1 (Fusarium
incarnatum) và M.4.1 (Neurospora crassa) có tính nhạy cảm.
Cuối cùng với kháng sinh Nystatin (NY) là thuốc kháng nấm polyene có tính
kháng mạnh với chủng M.4.1, kháng yếu với chủng M.1.1 (Fusarium incarnatum)
và chủng M.1 (Lecanicillium tenuipes).
Thí nghiệm chủ yếu khảo sát tính nhạy cảm với tính kháng của các chủng nấm
đã định danh với một số loại kháng sinh kháng khuẩn và kháng sinh kháng nấm phổ
biến trong nuôi trồng thủy sản, từ đó rút ra cơ sở để đưa ra các nghiên cứu các thuốc
kháng sinh để trị các bệnh do nấm bệnh này gây ra, ức chế hoặc tiêu diệt nấm bệnh.
3.5. Kết quả hình ảnh quá trình lây nhiễm giữa nấm và trứng cá bằng kĩ
thuật SEM
Trứng cá Bá Chủ được ấp ở nhiệt độ 280
C, lắc với tốc độ 90 rpm, quan sát
cách mẫu mỗi 24 giờ. Khi trứng có dấu hiệu nhiễm bệnh, đem trứng quan sát dưới
kính hiển vi quang học.

47
3.5.1. Kết quả hình ảnh lây nhiễm dưới kính hiển vi quang học
Mẫu trứng đã được cảm nhiễm chủng M.4.1 sau 48 giờ: trứng có màu trắng
đục, có độ dai và cứng hơn so với mẫu đối chứng.
(100X).
Kết quả hình 3.12 cho thấy mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.4.1 có sự hiện diện
của sợi nấm chằng chịt trong trứng.
Mẫu đối chứng: sau 48 giờ trứng không có hiện tượng bị nhiễm bệnh, trứng
vẫn phát triển bình thường.

48
Hình 3.13. Kết quả mẫu đối chứng dưới kính hiển vi quang học (100X).
Kết quả quan sát dưới kính hiển vi quang học (hình 3.13) cho thấy không phát
hiện có sự hiện diện của sợi nấm trong trứng.
Mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1.1: quan sát sau 48 giờ không có hiện tượng
trứng bị nhiễm bệnh, trứng vẫn phát triển bình thường.
(100X).
hiện có sự hiện diện của sợi nấm trong trứng.
Mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1: quan sát sau 48 giờ không có hiện tượng
trứng bị nhiễm bệnh, trứng vẫn phát triển bình thường.

49
Hình 3.15. Kết quả mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1 dưới kính hiển vi quang học
(100X).
hiện có sự hiện diện của sợi nấm trong trứng. Mẫu trứng cảm nhiễm có dấu hiệu
nhiễm bệnh, từ màu đỏ cam chuyển dần sang màu trắng đục, cứng và dai hơn.
Trứng chết được cố định và gửi đi chụp bằng kĩ thuật SEM.
3.5.2. Kết quả hình ảnh quá trình lây nhiễm bằng kĩ thuật SEM
Hình 3.16. Bề mặt trứng mẫu đối chứng chụp bằng SEM.
Kết quả chụp SEM bề mặt mẫu đối chứng (hình 3.16) không có dấu hiệu
nhiễm của sợi nấm.

50
Hình 3.17. Bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 chụp bằng SEM (100X và 500X)
Kết quả chụp SEM bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 cho thấy vùng
không nhiễm với độ phân giải 100X (hình 3.17a) và 500X (hình 3.17b).
Hình 3.18. Bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 chụp bằng SEM (500X và
1000X)
Kết quả chụp SEM bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 cho thấy sự thay
đổi từ vùng không nhiễm sang vùng nhiễm nấm với độ phân giải 500X (hình 3.18a)
và vùng nhiễm nấm với độ phân giải 1000X (hình 3.18b) so sánh với bề mặt trứng
mẫu đối chứng (hình 3.16) cho thấy sự xâm nhiễm của chủng M.4.1 trên trứng.

51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Từ 4 mẫu trứng cá Bá Chủ bị nhiễm bệnh đã phân lập, làm thuần và chọn lọc
được 3 chủng M.1.1, M.1 và M.4.1.Kết quả hình thái học của khuẩn lạc, khuẩn ty
và bào tử cho thấy rằng chủng M.1.1 có khả năng thuộc chi Fusarium, chủng M.1
thuộc chi Lecanicillium và chủng M.4.1 thuộc chi Neurospora.
Dựa vào kết quả thu nhận bộ gen DNA và nhân bản vùng bảo tồn ITS của 3
chủng M.1.1, M 1 và M.4.1 cùng với so sánh các dữ liệu gen của các chủng trên
ngân hàng gen NCBI cho kết quả là: chủng M.1.1 có mức độ tương đồng với loài
Fusarium incarnatum là 100%, chủng M.1 có mức độ tương đồng với loài
Lecanicillium tenuipes là 100% và tương tự chủng M.4.1 với loài Neurospora
crassa là 99%.
Kết quả cảm nhiễm của 3 chủng nấm với trứng cá Bá Chủ từ những hình ảnh
kính hiển vi quang học và kĩ thuật SEM cho thấy rằng chủng Neurospora crassa có
khả năng xâm nhiễm vào trứng cá Bá Chủ gây hỏng trứng trong quá trình ấp.
Tiếp tục khảo sát sự ảnh hưởng của các kháng sinh trên 3 chủng trên cho kết
quả là: 5 loại kháng sinh kháng khuẩn Ampiciline (Am), Chloramphenicol (Cl),
Penicilin (Pn), Streptomycin (Sm) và Tetracycline (Te) thì không có tác dụng với
các loại nấm bệnh được định danh ở trên. Kháng sinh kháng nấm Amphotericin
(AMB), Ketoconazole (KCA) và Nystatin (NY) đều có tác dụng khá tốt đối với
chủng M.4.1 (Neurospora crassa), đặc biệt kháng tốt nhất là Nystatin (NY).
Từ các kết quả thu được cho thấy nấm Neurospora crassa có khả năng gây
bệnh và làm hỏng trứng cá Bá Chủ.
2. Kiến nghị
Khảo sát các đặc tính sinh lý, sinh hóa của nấm Neurospora crassa.

52
Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến sự lây nhiễm giữa nấm Neurospora
crassa và trứng cá Bá Chủ nhằm tăng hiệu suất trứng nở.
Cần khảo sát thêm các loại kháng sinh.

53
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
[1] Ts. Phạm Minh Đức, Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Tuấn, 2010. Tổng
quan bệnh nấm ở động vậy thủy sản. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ,
số 16b: 88-97.
[2] Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Bùi Quang Tề và Đỗ Thị Muội, 2004. Giáo
trình Bệnh học thủy sản. Đại học Thủy sản Nha Trang, 2004, NXB Nông Nghiệp,
Thành phố HCM.
[3] Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa. 2005. Giáo trình bệnh học thủy
sản. Đại học Cần Thơ. Trang 73
[4] Võ Minh Sơn (2013). Nghiên cứu ứng dụng qui trình sản xuất giống cá Bá Chủ
(Pterapogon kauderni Koumans, 1933) tại Việt Nam.
Tài liệu tiếng Anh
[5] AHFS DRUG INFORMATION 2006 (2006 ed.). American Society of
HealthSystem Pharmacists. 2006.
[6] "Aspergillus sydowii (Bainier & Sartory) Thom & Church 1926". MycoBank.
International Mycological Association. Retrieved 2012-10-10.
[7] Cites (2007). Convention on international trade in endangered species of wild
fauna và flora. Fourteenth meeting of the Conference of the Parties The Hague (N
etherlvàs), 3-15 June 2007. CoP14 Prop. 19.
[8] Dalė Pečiulytė, Irena Nedveckytė, Vaidilutė Dirginčiūtė-Volodkienė, Vincas
Būda (2010). Pine defoliator Bupalus piniaria L. (Lepidoptera: Geometridae) and
its entomopathogenic fungi. EKOLOGIJA. Vol. 56. No. 1–2. P. 34–40
[9] Guarro Josep, Gené Josepa, and Stchigel Alberto M., 1999. Developments in
fungal taxonomy. Clinical Microbiology Reviews Vol. 12, No. 3, p. 454-500

54
[10] Khoa, L. V., K. Hatai, và T. Aoki. 2004. Fusarium incarnatum isolated from
black tiger shrimp Penaeus monodon Fabricius, with black gill disease cultured in
Vietnam. Journal of Fish Diseases 27: 507-515.
[11] Handwerk, Brian (May 6, 2005) Egypt's "King Tut Curse" Caused by Tomb
Toxins_National Geographic.
[12] Hsiao-Che Kuo, Sun Hui, Jaeyoung Choi, Frederick O. Asiegbu, Jari P. T.
Valkonen and Yong-Hwan Lee (2014). Secret lifestyles of Neurospora crassa.
Scientific Reports 4, Article number: 5135 doi:10.1038/srep05135
[13] M M Songe, A Willems, J Wiik-Nielsen, E Thoen, Ø Evensen, P van West and
I Skaar (2015), Saprolegnia diclina IIIA and S. parasitica employ different infection
strategies when colonizing eggs of Atlantic salmon, Salmo salar L, Journal of Fish
Diseases, doi:10.1111/jfd.12368
[14] Núria Cortadellas, Eva Fernández, and Almudena Garcia, Biomedical and
Biological Applications of Scanning Electron Microscopy, Handbook of
instrumental techniques from CCiTUB.
[15] Petri WA in Brunton LL, Chabner BA, Knollmann BC (eds.) (2011 ) Goodman
and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th ed., Chapter 53.
McGraw-Hill, New York
[16] Singh B, Mitchison DA (16 January 1954). Bactericidal Activity of
Streptomycin and Isoniazid Against Tubercle Bacilli. British Medical Journal 1
(4854): 130 – 132.doi:10.1136/bmj.1.4854.130. PMC 2084433. PMID 13106497.
[17] T. R. Prabha, K. Revathi1, M. S. Vinod, S. P. Shanthakumar and Paul Bernard,
2013. A simple method for total genomic DNA extraction from water moulds.
Current science. 104(3): 345-346.

55
[18] Vagelli, A. (2007). Synopsis of the biology và conservation status of the
Banggai cardinalfish Pterapogon kauderni. Presentation given by Dr Alejvàro
Vagelli to the Indonesian CITES Authorities, Jakarta, 24 May 2007.
[19] Vagelli, A. A. (2011). The Banggai Cardinalfish: Natural History,
Conservation, và Culture of Pterapogon kauderni. Wiley, Hoboken.
[20] Yanong, R. P. E. 2003. Fungal diseases of fish. Vet Clin Exot Anim. 6: 377–
400.
Tài liệu từ Internet
[21] http://blog.aquanerd.com/wp-content/uploads/2013/12/
[22] http://www.clarku.edu/faculty/dhibbett/protocols_folder/primers/primers.htm
[23] http://en.wikipedia.org/wiki/Flucytosine
[24] https://en.wikipedia.org/wiki/Neurospora_crassa
[25] http://en.wikipedia.org/wiki/Nystatin
[26] http://www.dieutri.vn/s/14-6-2011/S804/Streptomycin.htm
[27] http://www.dieutri.vn/a/7-5-2011/S423/Amphotericin-B.htm
[28] http://www.practicalfishkeeping.co.uk/content.php?sid=5109
[29] http://www.oceanflooraquariums.com/underwater-photography-by-david-
dempsey
[30] http://vi.wikipedia.org/wiki/Penicillin

1
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường
Môi trường nuôi cấy : PDA (Potato Dextrose Agar)
Dịch chiết khoai tây 20%
Dextrose 2%
Agar 2%
Chloramphenycol 100 mg
Sodium propionate 2 g
pH 5.6
H2O 1000 ml

2
PHỤ LỤC B: Kết quả trình tự vùng gen bảo tồn ITS
Chủng M.1.1

3
Chủng M.1

4
Chủng M.4.1

5
PHỤ LỤC C: Kết quả trình tự vùng gen của các chủng so sánh trên
NCBI
Lecanicillium fusisporum KF766521.1
CAACTCCCAAACCCTTATGTGAACATACCAATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCGGTGTCCGGCAGGCCC
TCGCGGCCGGCCGCGACCCGGATCCAGGCGGACGCCGGAGACCATCCAAAAACTCTTTGTATTTTAGCAAG
TCTTCTGAATGAGCCGCAAGGCAACACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCAT
CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA
ACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCTCCCTT
TGGGGAGCCCGGCGTTGGGGACCGGCCTCTACCGCCGGCCCCGAAATGAAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCG
ACCTCTGCGTAGTAACTCACCTCGCACCGGAACCCCGACGTGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTTCTGA
ACGTTGACCTCGAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATC
Lecanicillium tenuipes JN036556.1
CAACTCCCAAACCCTTATGTGAACATACCAATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCGGTGTCCGGCAGGCCC
TCGCGGCCGGCCGCGACCCGGATCCAGGCGGACGCCGGAGACCATCCAAAAACTCTTTGTATTTTAGCAAG
TCTTCTGAATGAGCCGCAAGGCAACACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCAT
CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA
ACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCTCCCTT
TGGGGAGCCCGGCGTTGGGGACCGGCCTCTACCGCCGGCCCCGAAATGAAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCG
ACCTCTGCGTAGTAACTCACCTCGCACCGGAACCCCGACGTGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTTCTGA
ACG-TGACCTCGAATCAGG
Fusarium incarnatum KM519192.1
CAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGA
CGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAA
CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATT
GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGT
TCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGAT
TGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCC
GTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA
AGCGGAGGAA
Penicillium expansum FJ008994.1
CAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGA

6
GTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA
AGCGGAGGA
Fusarium longipes AB820724.1
CAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAAAGGGA
GTAAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA
AGCGGAGGAA
Neurospora tetrasperma FJ904922.1
CAGAGTTGCAAAACTCCCACAAACCATCGCGAATCTTACCCGTACGGTTGCCTCGGCGCTGGCGGTCCGGA
AAGGCCCTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTCTCCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACT
AAACTCTTGATATTTTATGTCTCTCTGAGTAAACTTTTAAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTG
GTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCG
AATCTTTGAACGCACATTGCGCTCGCCAGTATTCTGGCGAGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCATCA
AGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGCCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCACA
CCGAGCGTAGTAACTCTACATCGCTATGGTCGTGCGGCGGGTTCTTGCCGTAAAACCCCCCATTTCTAAGGT
TGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA
Neurospora crassa FJ360521.1
AAGGCCTTCGGGCCCTCCCGGATCCTCGGGTCTCCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACT
AGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGTCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCACA
TGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA
Neurospora pannonica KF881757.1
AAGGCCCTCGGGTCCTCCCGGATCCTCGGGTCTCCCGCTCGCGGGAGGCTGCCCGCCGGAGTGCCGAAACT

7
AGCTCTGCTTGCGTTGGGGATCCGCGGCTGCCCGCGGTCCCTCAAAATCAGTGGCGGGCTCGCTAGTCACA
TGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA
PHỤ LỤC D: Kết quả hình ảnh kĩ thuật SEM quá trình lây nhiễm giữa
nấm và trứng cá Bá Chủ

địNh danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa trên gen its và xác định sự lây nhiễm bằng kĩ thuật sem

More Related Content

What's hot (20)

Similar to địNh danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa trên gen its và xác định sự lây nhiễm bằng kĩ thuật sem (20)

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Recently uploaded (20)

địNh danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa trên gen its và xác định sự lây nhiễm bằng kĩ thuật sem