Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nhà máy giấy

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải nhà máy giấy

• 1.
  BỘ GIÁO DỤCVÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY GIẤY Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : CN. Nguyễn Hoàng Mỹ Sinh viên thực hiện : Bùi Thị Trang MSSV: 107111189 : Lớp: 07DSH4 TP. Hồ Chí Minh, 2011
• 2.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP i SVTH: BÙI THỊ TRANG MỤC LỤC Nội dung Trang Mục lục............................................................................................................................i Danh mục các chữ viết tắt..............................................................................................iii Danh mục các bảng .........................................................................................................iv Danh mục hình ảnh ..........................................................................................................v LỜI MỞ ĐẦU................................................................................................................vi Chƣơng 1. TỔNG QUAN ..............................................................................................3 1.1 Tổng quan về công nghiệp sản xuất giấy ...........................................................3 1.1.1 Giới thiệu .....................................................................................................3 1.1.2 Công nghệ sản xuất bột giấy........................................................................4 1.1.3 Công nghệ sản xuất giấy..............................................................................6 1.2 Tổng quan về nước thải nhà máy giấy ...............................................................7 1.2.1 Giới thiệu về nước thải nhà máy giấy..........................................................7 1.2.2 Thành phần tính chất ...................................................................................7 1.2.3 Ảnh hưởng của nước thải nhà máy giấy....................................................10 1.2.4 Phương pháp xử lý nước thải ........................................................................11 1.3 Tổng quan về cellulose.....................................................................................13 1.3.1 Thành phần cấu tạo....................................................................................13 1.3.2 Tính chất ....................................................................................................15 1.3.3 Enzyme cellulase .......................................................................................16 1.3.4 Cơ chế phân hủy ........................................................................................18 1.4 Tổng quan về vi sinh vật phân hủy cellulose ...................................................21 1.4.1 Giới thiệu chung ........................................................................................21 1.4.2 Vi khuẩn.....................................................................................................22 1.4.3 Xạ khuẩn ...................................................................................................22
• 3.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP ii SVTH: BÙI THỊ TRANG 1.4.4 Nấm mốc....................................................................................................26 1.5 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của vi khuẩn ................................................................................................27 1.6 Các nghiên cứu liên quan ở Việt Nam và trên thế giới ....................................31 1.6.1 Trên thế giới...............................................................................................31 1.6.2 Ở Việt Nam................................................................................................31 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP...........................................................34 2.1 Thời gian và địa điểm...........................................................................................34 2.2 Vật liệu ................................................................................................................34 2.2.1 Đối tượng.......................................................................................................34 2.2.2 Cơ chất...........................................................................................................34 2.3 Thiết bị và hóa chất ..........................................................................................34 2.3.1 Thiết bị.......................................................................................................34 2.3.2 Hóa chất .....................................................................................................35 2.4 Các phương pháp nghiên cứu...........................................................................35 2.4.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi sinh vật...............................................35 2.4.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase)................................................................................................................38 2.4.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn............................................................................42 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................44 3.1 Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn .................................................................44 3.1.1 Kết quả tuyển chọn trên môi trường A ......................................................44 3.1.2 Kết quả xác định hình thái.........................................................................44 3.2 Kết quả khảo sát theo thời gian ........................................................................47 3.2.1 Kết quả hoạt tính cellulase.........................................................................47 3.2.2 Kết quả xác định mật độ tế bào .................................................................51 3.3 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo pH .........................................53
• 4.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP iii SVTH: BÙI THỊ TRANG 3.4 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo nồng độ CMC .......................56 3.4.1 Xác định hoạt tính theo nồng độ CMC......................................................56 3.4.2 Xác định đường kính vòng phân giải theo nồng độ CMC.........................59
• 5.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP iv SVTH: BÙI THỊ TRANG DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BOD : Biochemical oxygen Demand COD : Chemical Oxygen Demand CMCase : Carboxymethyl cellulase CMC : Carboxymethyl cellulose CBH hay C1 : Cellobiohydrolase hay Exoglucanase DNS : Acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic Dal : Dalton ĐC : Đối chứng EG hay Cx : Endoglucanase IU : International Unit, đơn vị quốc tế. OD : Optical Density TN : Thí nghiệm UV : Ultraviolet
• 6.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP v SVTH: BÙI THỊ TRANG DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các thông số của nguồn nước thải nhà máy giấy .................................. 10 Bảng 1.2. Thành phần và số lượng vi sinh vật trên một số loại đất chính ............ 25 Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn ............................................ 35 Bảng 2.2 Dựng đường chuẩn gluose ..................................................................... 40 Bảng 2.3. Xác định hoạt tính enzyme Carboxymethyl cellulase........................... 41 Bảng 3.1. Hình thái đại thể và hình thái vi thể của 10 chủng vi khuẩn................. 45 Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 10 chủng theo thời gian ................................... 48 Bảng 3.3 Hoạt tính và mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn............................... 51 Bảng 3.4. Hoạt tính enzyme cellulase theo từng pH khác nhau............................ 53 Bảng 3.5. Hoạt tính enzyme cellulase theo từng nồng độ CMC........................... 56 Bảng 3.6. Đường kính vòng phân hủy cellulose theo từng nồng độ CMC. .......... 59
• 7.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP vi SVTH: BÙI THỊ TRANG DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Công nghệ sản xuất bột giấy. ......................................................................4 Hình 1.2 Công nghệ sản xuất giấy..............................................................................6 Hình 1.3. Công nghệ xử lý nước thải nhà máy giấy................................................... 12 Hình 1.4 Công thức hóa học của cellulose.................................................................14 Hình 1.5 Endoglucanase.............................................................................................16 Hình 1.6 Exoglucanase...............................................................................................17 Hình 1.7 β-glucosidase ...............................................................................................17 Hình 1.8 Cơ chế thủy phân cellulose..........................................................................19 Hình 1.9.Sơ đồ cấu trúc cellulose và các vi trí cắt của enzyme exoglucanase, endoglucanase và β-glucosidase .................................................................................20 Hình 1.10 Cơ chế thủy phân phân tử cellulose và phức hệ cellulose của các enzyme thuộc phức hệ cellulase. ..............................................................................................21 Hình 1.11 Vi khuẩn Bacillus subtilis..........................................................................22 Hình 1.12 Xạ khuẩn Streptomyces ............................................................................23 Hình 1.13 Nấm Trichoderma .....................................................................................26 Hình 2.1 Công thức cấu tạo của CMC .......................................................................34 Hình 2.2 Quy trình tuyển chọn chủng vi khuẩn. ........................................................36 Hình 2.3 Quy trình khảo sát các yếu tố môi trường lên hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn.......................................................................................................................42 Hình 3.1. Hình ảnh vi thể của 10 chủng vi khuẩn sau khi nhuộm Gram ...................46 Hình 3.2 Xác định hoạt tính enzyme cellulase theo Miller........................................47 Hình 3.3 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo thời gian...........................49 Hình 3.4 Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn. .......................................................52 Hình 3.5 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo pH. ................................... 54 Hình 3.6 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase cơ chất......................................57
• 8.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP vii SVTH: BÙI THỊ TRANG Hình 3.7 Một số hình ảnh đường kính vòng phân hủy của các chủng vi khuẩn........60
• 9.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 1 SVTH: BÙI THỊ TRANG LỜI MỞ ĐẦU Cellulose là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân hủy cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hưởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp. Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm: exoglucanase hay C1, endoglucanase hay Cx và β-glucosidase, có khả năng hoạt động phối hợp để thủy phân cellulose thành glucose. Cellulase được ứng dụng trong nông nghiệp để chế biến thức ăn chăn nuôi; trong công nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, trong quá trình trích ly các chất từ thực vật, ngày nay người ta còn ứng dụng cellulase vào xử lý môi trường. Vấn đề môi sinh ngày càng trở nên trầm trọng trên phạm vi toàn cầu. Ở Việt Nam, lượng chất thải của các nhà máy thải ra ngoài môi trường ngày càng lớn, nguy cơ ô nhiễm môi trường ở nhiều nơi là rất cao. Việc sử dụng biện pháp sinh học trong xử lý nước thải đã và đang mang lại nhiều giá trị to lớn. Tuy nhiên, việc sử dụng các vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên để xử lý nước thải, thời gian thường kéo dài gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường, tốn nhiều diện tích và công sức. Để xử lý triệt để hơn, giảm giá thành và thời gian xử lý, ngoài việc tạo điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển tốt thì việc tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng sinh trưởng nhanh, hoạt tính phân giải mạnh, chịu được nhiệt độ cao để bổ sung vào nước thải là một trong những hướng nghiên cứu đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Công nghiệp sản xuất giấy là một ngành công nghiệp chiếm vị trí quan trọng trong xã hội. Giấy đáp ứng được những nhu cầu thiết yếu trong cuộc sống của con người. Tuy nhiên, hằng năm nguồn nước thải do ngành công nghiệp này thải ra không qua xử lý đã ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường. Trong nguồn nước thải này có sự hiện diện của lignin, cellulose… là các chất hữu cơ khó phân hủy.
• 10.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 2 SVTH: BÙI THỊ TRANG Đối với nước thải nhà máy giấy, người ta đã áp dụng nhiều phương pháp xử lý như vật lý, hóa học...nhưng vẫn chưa phân hủy hoàn toàn lượng cellulose hiện diện trong nguồn nước thải này. Vì vậy, các biện pháp sinh học với việc ứng dụng enzyme cellulase do vi khuẩn sinh tổng hợp để xử lý nguồn nước thải là một vấn đề cấp thiết. Xuất phát từ những lý do trên và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập từ nƣớc thải nhà máy giấy” với các mục tiêu: 1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp hoạt tính enzyme celullase cao. 2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn.
• 11.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 3 SVTH: BÙI THỊ TRANG Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về công nghiệp sản xuất giấy 1.1.1 Giới thiệu Công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy chiếm một vị trí rất quan trọng trong nền kinh tế nước ta. Công nghiệp giấy phát triển cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, nhu cầu về các sản phẩm giấy ngày càng tăng, thu hút nhiều lao động tham gia cũng như kéo theo sự phát triển của một số ngành liên quan như: lâm nghiệp, xuất nhập khẩu, vận tải,…Chính vì vậy, ngành công nghiệp này không thể thiếu được trong đời sống của người dân. Công nghiệp sản xuất giấy ra đời vừa đáp ứng được nhu cầu trong nước vừa giải quyết việc làm cho bộ phận đáng kể nhân dân. Giấy đáp ứng các nhu cầu bức thiết trong cuộc sống của con người để phục vụ nhiều mục đích khác nhau như: giấy viết, giấy in, giấy bao bì, vàng mã, giấy sinh hoạt... Giấy và bột giấy được sản xuất từ nguyên liệu thô chính là gỗ, tre, nứa, lồ ô, giấy tái sinh. Tuy nhiên, hằng năm lượng nước thải do ngành công nghiệp này thải ra mà không qua xử lý đã ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường nước. Độc tính của các dòng nước thải từ các nhà máy sản xuất bột giấy và giấy là do sự hiện diện một hỗn hợp phức tạp các dịch chiết trong thân cây bao gồm: nhựa cây, các acid béo, ligno-cellulose…Ligno-cellulose là thành phần cấu trúc chính của cây gỗ và cây thân mềm (cỏ, rơm rạ) gồm cellulose, hemicellulose, lignin. Mà thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật là cellulose . Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40-50% trong gỗ.[1,11,14] Hiện nay, có khoảng 90 nhà máy giấy hoạt động trong cả nước, sản lượng giấy các tỉnh phía Nam gần 90000 tấn/năm, trong đó Thành phố Hồ Chí Minh chiếm hơn 12000 tấn/năm. Tổng sản lượng bột giấy ở miền Nam đạt đến 92500 tấn/năm, trong đó Tp Hồ Chí Minh chiếm hơn 18000 tấn/năm. [11]
• 12.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 4 SVTH: BÙI THỊ TRANG Công nghệ sản xuất giấy có thể chia làm 2 giai đoạn: sản xuất bột giấy và xeo giấy. 1.1.2 Công nghệ sản xuất bột giấy Bột giấy được sản xuất từ những nguyên liệu thô như: tre, nứa, gỗ…Thành phần và nồng độ chất thải từ quá trình sản xuất bột giấy lớn hơn rất nhiều so với giai đoạn xeo giấy.  Quy trình công nghệ: Hình 1.1 Công nghệ sản xuất bột giấy. (Nguồn: Nguyễn Đức Ban, xử lý nước thải nhà máy giấy) Nước thải rửa nấu Nguyên liệu thô ( lồ ô, gỗ, dăm) Chặt, băm nhỏ thành dăm Nước, NaOH Dịch đen Nấu Rửa Nghiền nhão Khuấy trộn, rửa Tách nước Nước Nước thải Nước thải rửa Nước Nước, bột giấy Bột giấy thành phẩm
• 13.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 5 SVTH: BÙI THỊ TRANG  Thuyết minh quy trình:  Nghiền bột  Nghiền bột từ sợi tái chế Máy nghiền bột cơ học được sử dụng để nghiền giấy, trộn nước và chuyển hóa thành một hỗn hợp đồng nhất. Các chất nhiễm bẩn nặng như cát, sỏi,…được thải bỏ khi chảy lơ lửng trong hệ thống máng. Tại đây các chất nặng sẽ lắng xuống và lấy ra khỏi hệ thống theo định kỳ. Sợi được phân loại riêng dưới dạng huyền phù nhẹ, sau đó được chảy qua một loạt các sàng lọc có lớp tấm đục lỗ. Ở đây các chất nhiễm bẩn nhẹ hơn, nhưng lớn hơn sợi sẽ bị loại ra. Ở công đoạn này, phải sử dụng một máy lọc tinh cơ học hoặc khử mảnh vụn nhằm đảm bảo sao cho các sợi tách rời nhau và có thể tạo ra đủ độ bền liên kết giữa các sợi trong giấy. Cách sản xuất này rất phù hợp trong việc sản xuất các loại bao gói.  Nghiền bột cơ học Trong nghiền bột cơ học, các sợi chủ yếu bị tách rời nhau do lực cơ học trong máy nghiền hoặc trong thiết bị tinh chế. Quy trình công nghệ nguyên thủy là gia công gỗ tròn bằng đá – gỗ được ép bằng đá nghiền quay tròn. Công nghệ này làm ra bột giấy có độ dai tương đối thấp. Ở các máy tinh chế và các máy nghiền áp lực sản phẩm cho độ dai tốt hơn.  Nghiền bột hóa học và bán hóa học Trong nghiền bột hóa học và bán hóa học, nguyên liệu sợi được xử lý với hóa chất ở nhiệt độ và áp lực cao. Mục đích của quá trình này là nhằm hòa tan hoặc làm mềm thành phần chính của chất lignin liên kết các sợi trong nguyên liệu với nhau, đồng thời lại gây ra sự phá hủy càng ít càng tốt đối với thành phần cellulose.  Sau khi chưng cất, hóa chất chuẩn bị cho quá trình tạo bột giấy được chuyển vào và đóng nắp lại. Ở đó những chất thải dịch đen sẽ xả bỏ bởi những ống tháo nước. Bột giấy được cô cạn sau đó rửa, nước rửa này có thể xả bỏ, tái sử dụng hay cho quay trở lại quá trình phân tách tái tạo ban đầu. Trong đó quá trình rửa bột giấy, do đi qua
• 14.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 6 SVTH: BÙI THỊ TRANG các máy lọc sạch nên những mác gỗ và các chất không bị phân hủy sẽ bị loại bỏ. Sau đó được dẫn vào bộ phận khử nước bao gồm một lưới chắn hình trụ xoay quanh đường dẫn bột giấy vào. Sau khi khử nước hỗn hợp được chuyển sang bể tẩy trắng, ở đây hỗn hợp được xáo trộn trong nước ấm hòa tan dung dịch canxi hypochlorite (Ca(OCl)2) hay hydrogen peroxide (H2O2). Sản phẩn sau quá trình này là sản phẩm bột giấy có thể bán hay tái tạo trong công nghệ làm giấy.[11] 1.1.3 Công nghệ sản xuất giấy Giai đoạn làm giấy là giai đoạn tiếp theo của giai đoạn làm bột giấy, sản phẩm của giai đoạn này là bột giấy. Bột giấy được nghiền và phối liệu theo sơ đồ sau:  Quy trình công nghệ: Hình 1.2 Công nghệ sản xuất giấy (Nguồn: Nguyễn Đức Ban, xử lý nước thải nhà máy giấy) Nguyên liệu thô ( giấy vụn và bột giấy) Thành phẩm Cắt cuộn Xeo giấy Hòa trộn Nghiền tinh Lắng lọc Phối liệu Cán ép (tạo hình giấy) Nước Phèn, nhựa thông, màu Nước thải
• 15.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 7 SVTH: BÙI THỊ TRANG  Thuyết minh quy trình: Quá trình làm giấy bao gồm trước tiên là sự chọn lựa sự xáo trộn thích hợp của bột giấy (gỗ, vỏ cây, rơm…). Hỗn hợp bột giấy bị phân hủy và xáo trộn trong máy nhào trộn hay những loại thiết bị nhồi với thuốc nhuộm, để chất lượng sản phẩm giấy sau cùng đạt kết quả tốt, người ta cho hồ vào để lấp đầy những lỗ rỗng do bột khí có trong bột giấy. Bột giấy được tinh chế trong phễu hình nõn lõm cố định, bên trong và bên ngoài mặt hình nón gắn những con dao cùn, máy có tốc độ quay điều chỉnh được với mục đích xáo trộn và điều chỉnh đồng dạng quá trình làm giấy. Cuối cùng bột giấy được lọc qua lưới chắn để loại bỏ những dạng vón cục và những bùn tạo vết làm giảm chất lượng của giấy. Kế tiếp, bột giấy được chuyển qua những dây đai của những lưới chắn và mang vào máy cán. Nước loại bỏ trong giai đoạn này là nước thải xeo. Khuôn in giấy bao gồm những máy cán sau: máy cán gạn lọc để loại bỏ những giấy không chất lượng, cán hút để loại bỏ nước, ép và cán khô khử phần nước còn lại trước khi cho ra giấy, và cuối cùng là cán hoàn tất để định hình cuối cùng là sản phẩm giấy. [11] 1.2 Tổng quan về nƣớc thải nhà máy giấy 1.2.1 Giới thiệu về nước thải nhà máy giấy Theo thống kê, các nhà máy giấy trên thế giới nhờ công nghệ tiên tiến nên chỉ dùng từ 7-15m3 nước/tấn giấy. Ở Việt Nam do thiết bị sản xuất, công nghệ lạc hậu nên vẫn dùng từ 30-100m3 nước/tấn giấy. Sự lạc hậu này không chỉ gây lãng phí nguồn nước ngọt, tăng chi phí xử lý nước thải mà còn gia tăng lượng nước thải đưa ra sông rạch. Hiện nay, doanh nghiệp sản xuất giấy tại Việt Nam chủ yếu là thuộc thành phần doanh nghiệp vừa và nhỏ, sản xuất tới 75% lượng giấy cả nước. Các doanh nghiệp này nằm rải rác tại các địa phương, do đó có nguy cơ gây ô nhiễm tại các cơ sở này rất cao. 1.2.2 Thành phần tính chất Nước thải của ngành công nghiệp giấy có hàm lượng COD khá cao 22000- 46500 mg/l, BOD chiếm từ 40-60% COD .
• 16.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 8 SVTH: BÙI THỊ TRANG Thành phần chủ yếu trong nước thải ở giai đoạn sản xuất bột giấy là cellulose, hemicellulose, lignin, extractive. Các dòng nước thải được thải ra ngoài qua nhiều công đoạn khác nhau như:  Dòng thải rửa nguyên liệu bao gồm chất hữu cơ hòa tan, đất đá, thuốc bảo vệ thực vật, vỏ cây,..  Dòng thải của quá trình nấu và rửa sau nấu chứa phần lớn các chất hữu cơ hòa tan, các hóa chất nấu và một phần xơ sợi. Dòng thải có màu tối nên thường gọi là dịch đen. Dịch đen có nồng độ chất khô khoảng 25 đến 35%, tỷ lệ giữa chất hữu cơ và vô cơ là 70:30. Cũng vì thế, mức độ ô nhiễm từ nước thải công nghiệp xeo giấy tỷ lệ nghịch với khả năng thu hồi dịch đen. Thành phần chất hữu cơ chủ yếu là dịch đen lignin hòa tan vào dịch kiềm (30- 35% khối lượng chất khô), ngoài ra là những sản phẩm phân hủy hydratcacbon và acid hữu cơ. Thành phần hữu cơ bao gồm những chất nấu, một phần nhỏ là Na2SO4, Na2S, Na2CO3 còn phần nhiều là kiềm natrisunfat liên kết với các chất hữu cơ trong kiềm. Ở những nhà máy lớn, dòng thải này được xử lý để thu hồi tái sinh sử dụng lại kiềm bằng phương pháp cô đặc – đốt cháy các chất hữu cơ – xút hóa. Đối với những nhà máy nhỏ thường không có hệ thống thu hồi dịch đen, dòng thải này được thải thẳng cùng các dòng thải khác của nhà máy, gây tác động xấu tới môi trường.  Dòng thải từ công đoạn tẩy của các nhà máy sản xuất bột giấy bằng phương pháp hóa học và bán hóa học chứa các hợp chất hữu cơ, lignin hòa tan và hợp chất tạo thành của những chất đó với chất tẩy rửa ở dạng độc hại, có khả năng tích tụ sinh học trong cơ thể sống như các hợp chất clo hữu cơ. Dòng này có độ màu, giá trị BOD5 và COD cao.  Dòng thải từ quá trình nghiền bột và xeo giấy chủ yếu chứa xơ sợi mịn, bột giấy ở dạng lơ lửng và các chất phụ gia như nhựa thông, phẩm màu, cao lanh.  Dòng thải từ khâu rửa thiết bị, rửa sàn, dòng chảy tràn có hàm lượng các chất lơ lửng và các chất rơi vãi. Dòng này không liên tục.
• 17.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 9 SVTH: BÙI THỊ TRANG Nước ngưng của quá trình cô đặc trong hệ thống xử lý thu hồi hóa chất từ dịch đen. Mức độ ô nhiễm của nước ngưng phụ thuộc vào loại gỗ, công nghệ sản xuất. Những chất ô nhiễm chủ yếu của ngành tạo bột xeo giấy đối với các nguồn nước bao gồm: - Vật huyền phù: là những hạt chất rắn không chìm trong nước, bao gồm chất vô cơ, cát, bụi, quặng…hoặc những chất hữu cơ như dầu, cặn hữu cơ. Nhiều vật huyền phù xả xuống nguồn nước dần dần sẽ hình thành các “bãi sợi” và tạo ra quá trình lên men, từ đó tiêu hao oxy hòa tan trong nước, tác động tới sự sống còn của các sinh vật trong nước, phủ lấp không gian sinh tồn, gây cản trở các hoạt động bình thường… - Vật hóa hợp dễ sinh hóa phân giải: là những thành phần nguyên liệu với số lượng tương đương đã tan trong quá trình tạo bột xeo giấy dễ sinh hóa phân giải, bao gồm các vật có lượng phân tử thấp (chất bán sợi, metanol, axit, loại đường…) Những chất này sẽ bị oxy hóa, do đó cũng tiêu hao oxy hòa tan trong nước, gây tác hại đối với các sinh vật. - Vật hóa hợp khó sinh hóa phân giải: bắt nguồn chủ yếu từ chất đường phân tử lớn và lignin trong nguyên liệu sợi. Những chất này thường có màu, do đó ảnh hưởng đến sự chiếu rọi của ánh sáng vào nguồn nước. Những vật chất này cũng có thể gây biến dị trong cơ thể sinh vật nếu bị hấp thu. - Các vật chất có độc: rất nhiều vật chất có độc đối với sinh vật hiện diện trong nước thải của công nghiệp giấy như colophan và axit béo không bão hòa trong dịch đen, dịch thải của đoạn tẩy trắng, dịch thải đoạn rút xút.[11] Bên cạnh các vật chất độc hại trên, nước thải của ngành công nghiệp giấy có thể làm ảnh hưởng trầm trọng đến trị số pH của nguồn nước, hoặc làm ngăn cản ánh sáng, tác động đến quá trình quang hợp, từ đó làm mất sự cân bằng sinh thái trong môi trường nước. Đặc tính của nước thải trong quá trình xeo giấy chiếm lượng lớn chất thải có hàm lượng ô nhiễm rất lớn như ở bảng 1.1.
• 18.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 10 SVTH: BÙI THỊ TRANG Bảng 1.1 Các thông số của nguồn nước thải nhà máy giấy Thông số Đầu vào Tiêu chuẩn xử lý nước thải (TCVN 5945 : 1995, loại B) pH 6,3 – 7,2 6,0 – 8,5 BOD5 tổng (mg/l) 500 ≤ 50 COD (mg/l) 1100 ≤ 100 SS (mg/l) 653 ≤ 100 Độ màu (Pt-Co) 450 N-NH3 (mg/l) 1,15 ≤ 35 P-PO4 3- ( mg/l) 1,21 ≤ 4 (Nguồn: Nguyễn Đức Ban, xử lý nước thải nhà máy giấy) 1.2.3 Ảnh hưởng của nước thải nhà máy giấy Độc tính của các dòng nước thải từ các nhà máy sản xuất giấy và bột giấy là do sự hiện diện của một hỗn hợp phức tạp các dịch chiết trong thân cây bao gồm: nhựa cây, các acid béo, cellulose, lignin... và một số sản phẩm phân hủy của lignin đã bị phân hóa có trọng lượng phân tử thấp. Nồng độ của một số chất từ dịch chiết có khả năng gây ức chế đối với thủy sản. Khi xả trực tiếp nguồn nước thải này ra kênh rạch sẽ hình thành từng mảng giấy nổi trên mặt nước, làm cho nước có độ màu khá cao và hàm lượng OD trong nước hầu như bằng không. Điều này không những ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường sống của sinh vật mà còn gián tiếp ảnh hưởng đến sức khỏe của con người Trong các cơ sở công nghiệp giấy và bột giấy, nước thải thường có độ pH trung bình 9 - 11, chỉ số nhu cầu ôxy sinh hoá (BOD), nhu cầu oxy hoá học (COD) cao, có thể lên đến 700mg/l và 2,500mg/l. Hàm lượng chất rắn lơ lửng cao gấp nhiều lần giới hạn cho phép.
• 19.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 11 SVTH: BÙI THỊ TRANG Đặc biệt nước có chứa cả kim loại nặng, lignin, phẩm màu, xút, các chất đa vòng thơm Clo hoá là những hợp chất có độc tính sinh thái cao và có nguy cơ gây ung thư, rất khó phân huỷ trong môi trường. Có những nhà máy giấy, lượng nước thải lên tới 4.000 - 5.000m3 /ngày, các chỉ tiêu BOD, COD gấp 10 – 18 lần tiêu chuẩn cho phép; lượng nước thải này không được xử lý mà đổ trực tiếp vào sông. Ngoài ra, trong công nghiệp xeo giấy, để tạo nên một sản phẩm đặc thù hoặc những tính năng đặc thù cho sản phẩm, người ta còn sử dụng nhiều hóa chất và chất xúc tác. [2] 1.2.4 Phương pháp xử lý nước thải Đối với nước thải nhà máy giấy, người ta có nhiều phương pháp xử lý như vật lý, hóa học...nhưng vẫn chưa phân hủy hoàn toàn lượng cellulose hiện diện trong nguồn nước thải này. Những chất này nếu không được thu hồi hoặc xử lý mà xả thẳng ra sông ngòi thì vấn đề ô nhiễm là không tránh khỏi, làm mất cân bằng sinh thái trong môi trường nước. Do đó, xử lý bằng phương pháp sinh học làm tăng khả năng phân hủy cellulose trong nước thải. Dựa vào các chỉ tiêu của nước thải nhà máy giấy mà người ta có nhiều biện pháp xử lý như xử lý cơ học, hóa lý, hóa học, sinh học. Xử lý cơ học, xử lý hóa lý nhằm mục đích loại bỏ các chất cặn, các chất lơ lững, các chất hữu cơ để làm sạch nguồn nước. Nhưng những biện pháp trên vẫn chưa xử lý triệt để nguồn hữu cơ trong nước thải. Do đó, các biện pháp xử lý sinh học được áp dụng nhằm loại bỏ hoàn toàn các nguồn hữu cơ không mong muốn. Phương pháp sinh học được ứng dụng để xử lý các chất hữu cơ hòa tan có trong nước thải dựa trên cơ sở hoạt động của các vi sinh vật. Vi sinh vật sử dụng các chất hữu cơ và một số khoáng chất làm thức ăn để sinh trưởng và phát triển. Phương pháp xử lý sinh học có thể phân thành 2 loại: - Phương pháp kỵ khí: Sử dụng nhóm vi sinh vật kỵ khí, hoạt động trong điều kiện không có ôxy.
• 20.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 12 SVTH: BÙI THỊ TRANG - Phương pháp hiếu khí: sử dụng nhóm vi sinh vật hiếu khí, hoạt động trong điều kiện cung cấp ôxy liên tục. Các vi sinh vật được được bổ sung vào từng giai đoạn theo từng liều lượng và nồng độ cho phép. Ở Việt Nam có khá nhiều tác giả đã thiết kế thành công về công trình xử lý nguồn nước thải nhà máy giấy bằng phương pháp sinh học. Tiêu biểu như thiết kế dây chuyền công nghệ xử lý nước thải xeo giấy của tác giả Nguyễn Đức Ban với đề tài thiết kế bể Aerotank xử lý nước thải xeo giấy công suất 1000m3 /ngày đêm.  Dây chuyền công nghệ Hình 1.3. Công nghệ xử lý nước thải nhà máy giấy. (Nguồn: Nguyễn Đức Ban, xử lý nước thải nhà máy giấy) NT xeo Bãi chôn lấp Nguồn thải Song chắn rác Bể nén bùn Bể chứa bùn Máy ép bùn Bể khử trùng Bể lẳng II Bể Aerotank Bể tuyển nổi Bể điều hòa Bể thu gom Bể chứa bột giấy Nước tách ra sau nén, ép bùn.
• 21.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 13 SVTH: BÙI THỊ TRANG  Thuyết minh công nghệ Nước thải xeo từ phân xưởng chảy qua song chắn rác, song chắn rác có nhiệm vụ giữ lại các tạp chất thô (giấy vụn, sợi …) có kích thước ≥ 16mm, đi vào bể thu gom, nước thải được bơm liên tục vào bể điều hòa, bể điều hòa có quá trình khuấy trộn và cấp khí, nước thải được điều hòa về lưu lượng và nồng độ, các chất ô nhiễm như: COD, BOD, SS, pH…xử lý một phần. Nước thải chảy qua bể tuyển nổi, nhằm thu hồi bột giấy dưới dạng các hạt nhỏ lơ lửng khó lắng, vào bể Aerotank. Tại bể Aerotank diễn ra quá trình sinh học hiếu khí được duy trì nhờ không khí cấp từ các máy thổi khí. Tại đây, các vi sinh vật ở dạng hiếu khí (bùn hoạt tính) sẽ phân hủy các chất hữu cơ còn lại trong nước thải thành các chất vô cơ ở dạng đơn giản như: CO2, H2O…Theo phản ứng sau: - Sự oxy hóa tổng hợp CxHyOzNtSn + O2 + dinh dưỡng CO2 + NH3 + C5H7NO2 + các sản phẩm khác - Phân hủy nội bào C5H7NO2 + 5O2 5CO2 + NH3 + H2O + năng lượng Hiệu quả xử lý BOD của bể Aerotank đạt từ 90-95% [11] 1.3 Tổng quan về cellulose 1.3.1 Thành phần cấu tạo Hằng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành nhờ quá trình quang hợp. Trong số này có 172 tỷ tấn được tạo thành trên đất liền và 60 tỷ tấn được tạo thành ở các đại dương. Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose. [1] Cellulose là hợp chất cao phân tử có công thức là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n , trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, được cấu tạo từ các mắt xích β-D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết 1.4 glucocid, do vậy liên kết này thường không bền trong các phản ứng thủy phân.[20] Vi khuẩn Vi khuẩn
• 22.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 14 SVTH: BÙI THỊ TRANG Phân tử cellulose có cấu trúc dạng mạch thẳng. Cấu trúc này tạo điều kiện hình thành các liên kết hyđro giữa các phân tử cellulose nằm song song với nhau, tạo nên cấu trúc màng cellulose và vi sợi trong cấu trúc màng cellulose của tế bào thực vật.[21] Các sợi này không tan trong nước, rất bền về cơ học nên tạo nên lớp màng cellulose bền chắc, thành phần hóa học của màng khá phức tạp, gồm 60% là nước chứa trong các khoảng tự do của màng, 30% cellulose. Các sợi cellulose liên kết với nhau tạo thành các mixen, với kích thước khoảng 10-20 nm, và cứ 250 sợi bé lại tạo nên 1 sợi lớn. Các sợi đan chéo với nhau theo nhiều hướng làm cho màng cellulose rất bền vững, nhưng lại có khả năng đàn hồi. Ở giữa các sợi là khối không gian chứa các chất vô định hình gồm gồm hemicellulose, pectin và nước.[5] Hình 1.4 Công thức hóa học của cellulose[21] Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (chiếm 20- 40% trọng lượng khô), đây là loại heteropolymer chứa nhiều loại monosaccharide như galactose, mannose, glucose, xylose, arabinose và các nhóm acetyl; do bản chất không kết tinh nên hemicellulose tương đối dễ bị thủy phân. Cellulose còn liên kết chặt chẽ với lignin (10-25% trọng lượng khô). Đây là thành phần ảnh hưởng rất nhiều đến sự thủy phân cellulose của enzyme. Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ trong sợi bông) cellulose tồn tại trong trạng thái một polymer gần tinh khiết.[1,14] Trong phân tử cellulose có nhiều nhóm hydroxyl tồn tại ở dạng tự do, hydro của chúng dễ dàng bị thay thế bởi một số gốc hóa học, ví dụ như metyl (-CH3), hoặc các gốc acetyl (-CH3CO) hình thành nên các gốc ete hoặc este của cellulose.[5]
• 23.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 15 SVTH: BÙI THỊ TRANG Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzyme thủy phân cơ chất này có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chất, nhiên liệu, thực phẩm, rượu và bia, thức ăn gia súc, vải sợi, bột giặt, giấy và bột giấy...[14] 1.3.2 Tính chất 1.3.2.1 Tính chất vật lý Cellulose là chất rắn không màu, không mùi, không vị, không tan trong nước (chỉ phồng lên nếu hấp thụ nước), không tan trong các dung môi hữu cơ, không có trạng thái nóng chảy. Khi đun trong chân không thì bị phân hủy thành glucose. Cellulose bị phân hủy ở nhiệt độ thường hoặc ở nhiệt độ 40-500 C do sự thủy phân cellulose bởi enzyme cellulase.[5] Tỷ trọng lúc khô là 1.45, khi khô cellulose dai và khi tẩm nước nó mềm đi. Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân. Người và động vật không có enzyme phân giải cellulose nên không tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, cellulose lại có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose. Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose.[22] 1.3.2.2 Tính chất hóa học - Phản ứng thủy phân: Đun nóng cellulose trong dung dịch acid vô cơ đặc thu được glucose Phương trình phản ứng : ( C6H10O5)n + nH2O nC6H12O6 - Phản ứng với acid vô cơ: đun nóng cellulose trong hỗn hợp acid nitric đặc và acid sunfuric đặc thu được cellulose nitrat. - Phương trình phản ứng: H+ , t0
• 24.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 16 SVTH: BÙI THỊ TRANG [C6H7O2(OH)3]n+3nHNO3(đặc) [C6H7O2(ONO2)3]n+3nH2O 1.3.3 Enzyme cellulase 1.3.3.1 Phân loại Cellulase là một nhóm enzyme hoạt động phối hợp trong việc thủy phân cellulose thành glucose [5]. Cellulase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ cellulase được xếp thành các nhóm khác nhau. Trước đây, cellulase được chia làm hai nhóm: nhóm enzyme C1 và nhóm enzyme Cx. Các enzyme C1 có khả năng thủy phân sợi cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng. Các enzyme Cx được chia thành hai loại: exo β-1,4- glucanase (3.2.1.21) xúc tác cho phản ứng cắt đứt gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose; endo β-1,4-glucanase (3.2.1.4) hoạt động tùy tiện hơn, xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết bên trong phân tử cellulose [2]. Hiện nay, cellulase được chia làm ba dạng: dạng 1 là endoglucanase hoặc 1,4-β- D-glucan-4-glucanohydrolase hay carboxylmethylcellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), dạng 2 là exoglucanase bao gồm 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (còn gọi là cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91), dạng 3 là β-glucosidase hoặc β-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết ở bên trong phân tử cellulose.  Endoglucanase-EC.3.2.1.4 Tên thường gọi: cellulase Tên hệ thống: 1,4-(1,3:1,4)-β-D-glucan-4- glucannohydrolase Đôi khi người ta gọi enzyme này với tên khác: H2SO4(đặc),t0 Hình 1.5 Endoglucanase
• 25.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 17 SVTH: BÙI THỊ TRANG endo-1,4-β-D-glucanase; β-1,4-glucanase; cellulase A... Enzyme này thường thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucoside trong cellulose và các β-D-glucan của các loại ngũ cốc.  Exoglucanase-EC.3.2.1.91 Tên thường gọi: cellulose 1,4-β-cellobiosidase Tên hệ thống: 1,4-β-glucan cellobiohydrolase. Các tên khác exo-cellobiohydrolase, exoglucanase, cellulase C1, exo-β-1,4-glucan cellobiohydrolase... Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cellulose.[15]  β-glucosidase- EC.3.2.1.21 Tên thường gọi: β-glucosidase Tên hệ thống: β-D-glucosid glucohydrolase Một số tên gọi khác: β-D-galactosidase, β- D-fucoside, β-D-xyloside, α-L-arabinoside. β-glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose thành glucose. [16] Các cellulase có nguồn gốc khác nhau được sắp xếp thành các họ.Trước đây, dựa vào cấu trúc bậc một của phân tử protein enzyme, cellulase được chia làm 6 họ: A, B, C, D, E và F. Sau đó, cellulase được chia thành 9 họ: A, B, C, D, E, F, G, H và I dựa vào cấu trúc của tâm xúc tác . Hiện nay, các cellulase được sắp xếp trong 12 họ: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 44, 45, 48, 61 và 74 [17]. Các enzyme có tính đặc hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ nhau. Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất. [6] Hình 1.6 Exoglucanase Hình 1.7 β-glucosidase
• 26.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 18 SVTH: BÙI THỊ TRANG 1.3.3.2 Cấu tạo của enzyme cellulase Trọng lượng của enzyme cellulase thay đổi từ 30-110 Kdal. Cấu trúc không gian khoảng 280-600 amino acid nhưng chiều dài cellulose thường khoảng 300-400 amino acid và trung tâm xúc tác có khoảng 250 amino acid. Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong không gian các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng liên kết cơ chất. Chính nhờ sự khác nhau về cấu trúc không gian của các protein enzyme dẫn tới sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng. Endoglucanase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối lượng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi polypeptide. Exoglucanase là một enzyme chứa hai vùng xúc tác nối với một vùng gắn cellulose qua một vùng liên kết. Exoglucanase gồm có 2 chuỗi A và B. Cả hai chuỗi đều có 434 amino acid nhưng giữa chúng đều có sự khác biệt. Cellulose bị ức chế bởi các sản phẩm của nó như glucose, cellobiose. Thủy ngân ức chế cellulose hoàn toàn, trong khi các ion khác như Mn, Ag, Zn chỉ ức chế nhẹ.[5] 1.3.4 Cơ chế phân hủy Quá trình thủy phân cellulase tự nhiên được thực hiện dưới sự tác động của một phức hệ cellulase, bao gồm chủ yếu là các enzyme C1, Cx và β-glucosidase. Enzyme C1 là một enzyme không đặc hiệu. Dưới tác động của enzyme này các loại cellulose tự nhiên (bông, giấy lọc...) bị trương lên và chuẩn bị cho tác động của enzyme khác tiếp theo. Hiện nay có nhiều tác giả cho rằng enzyme C1 không phải là một enzyme mà chỉ là một yếu tố của enzyme C1, có tác dụng làm biến đổi cellulose, nhưng khi tách riêng ra thì tác dụng này không còn nữa. Để xác định hoạt tính enzyme C1 người ta thường sử dụng các loại cellulose tự nhiên nhất là sợi bông thấm nước. Enzyme Cx còn gọi là enzyme β-1,4-glucanase. Enzyme này thủy phân các cellulose thành cellobiose. Chữ x cho ta biết đây là loại enzyme có nhiều thành phần
• 27.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 19 SVTH: BÙI THỊ TRANG khác nhau. Người ta thường chia Cx thành 2 loại: (i) Exo-β-1,4-glucanase : có khả năng xúc tác tách ra một cách liên tiếp các đơn vị glucose từ đầu không khử các chuỗi cellulose; (ii) Edo-β-1,4-glucanase: có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosid ở bất kỳ chỗ nào bên trong chuỗi cellulose phân tử. Theo Ogawa và Toyama (1967) cho rằng một số enzyme khác có tác dụng trung gian giữ C1 và Cx đó là C2. Enzyme C2 có tác động vào các cellulose đã bị C1 làm trương lên và thủy phân chúng thành những loại cellulosedextrin hòa tan. Enzyme Cx sẽ tiếp tục thủy phân các loại này thành cellobiose. Enzyme β-glucosidase là những enzyme rất đặc hiệu, enzyme này thủy phân cellobiose thành cellohexose (D-glucose ) Reese (1950) đã làm sáng tỏ các bước hoạt động thủy phân cellulose của cellulase. Hình 1.8 Cơ chế thủy phân cellulose ( Nguồn: Reese, 1950) Đầu tiên, exoglucanase phá vỡ liên kết hydrogene trong phân tử cellulose, sau đó endoglucanase tiếp tục thủy phân cellulose thành các phân tử cellobiose và sau cùng β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose.[5]
• 28.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 20 SVTH: BÙI THỊ TRANG Hình 1.9. Sơ đồ cấu trúc cellulose và các vi trí cắt của enzyme exoglucanase, endoglucanase và β-glucosidase Theo Miller G (1959), Endo-β-1,4-glucanase tham gia thuỷ phân các liên kết β- 1,4 glucoside ở bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tương tự khác. Sản phẩm phân cắt là các oligosaccharide. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cơ chất, giải phóng các oligosaccharide, cellobiose và glucose. β-Glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose tạo thành các phân tử glucose.
• 29.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 21 SVTH: BÙI THỊ TRANG Hình 1.10 Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của các enzyme thuộc phức hệ cellulase. (Nguồn: Lee , 2002) 1.4 Tổng quan về vi sinh vật phân hủy cellulose 1.4.1 Giới thiệu chung Cellulose là polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất được sinh tổng hợp chủ yếu từ thực vật với tốc độ ước tính là 4.109 tấn/năm. Dựa vào số liệu trên, người ta cho rằng cellulase là enzyme chiếm ưu thế nhất trong tự nhiên và được sinh ra chủ yếu từ vi sinh vật . Cellulase được sinh tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm sợi. Ngoài ra, cellulase còn có mặt trong các hạt của thực vật bật cao, hạt lúa mạch, giun đất, sâu róm, và ốc sên [5].
• 30.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 22 SVTH: BÙI THỊ TRANG Hình 1.11 Vi khuẩn Bacillus subtilis 1.4.2 Vi khuẩn Là nhóm vi sinh vật được nghiên cứu nhiều nhất từ trước đến nay. Bên cạnh các loài vi khuẩn gây hại, còn có hàng loạt các vi khuẩn có ích được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, công nghệ chế tạo hoá chất, dược phẩm, các chế phẩm lên men, làm sạch môi trường. Vi khuẩn phân huỷ cellulose là nhóm vi sinh vật đáng quan tâm. Chúng sinh ra chủ yếu endoglucanase và β- glucosidase, chúng gần như không tạo ra exoglucanase. Đặc biệt là chủng Bacillus subtilis được nghiên cứu nhiều. Vi khuẩn dạ cỏ: Ruminococcus albus. Vi khuẩn hiếu khí: Cellulomonas persica sp. nov và Cellulomonas iranensis sp. nov . Vi khuẩn kỵ khí: Clostridium thermocellum, Clostridium cellulovorans (Murashima, 2002), Clostridium celluloliticus [5]. G.V.Iterson (1903) đã phát hiện ra khả năng phân huỷ cellulose của nhóm vi khuẩn phân giải hiếu khí. Sau đó nhiều nghiên cứu về các nhóm vi khuẩn và niêm vi khuẩn hiếu khí được nghiên cứu, đặc biệt là chi Cytophaga. Popov (1857) là người đầu tiên xác nhận khả năng phân giải cellulose của nhóm vi khuẩn kị khí và về sau được Omelianxkii (1985) tiếp tục nghiên cứu.[12] 1.4.3 Xạ khuẩn Theo hệ thống phân loại của Cracxilnhicop, xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đơn bào, phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, trong nước và trong các hợp chất hữu cơ khác. Xạ khuẩn là một trong những vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên. Chúng tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá các hợp chất trong đất.
• 31.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 23 SVTH: BÙI THỊ TRANG Hình 1.12 Xạ khuẩn Streptomyces Đặc điểm quan trọng nhất là khả năng hình thành chất kháng sinh, hơn 70% xạ khuẩn phân lập được trong tự nhiên có khả năng này. Về điều kiện sống, xạ khuẩn phân thành 2 loại: xạ khuẩn ưa ấm với nhiệt độ thích hợp từ 28-300 C; xạ khuẩn ưa nhiệt với nhiệt độ thích hợp 50-600 C. Xạ khuẩn ưa nhiệt lần đầu tiên tìm thấy trong nước sông, hồ bẩn và trong đất. Rabinowitch (1895) và Tsiklinsky (1903) đã phân lập được các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt từ phân. Noack (1912) cũng đã phân lập được xạ khuẩn ưa nhiệt từ cỏ khô. Năm 1904, Gilbert đã phân lập xạ khuẩn ưa nhiệt từ nhiều nguồn gốc khác nhau: đất cát, sa mạc, than bùn và đặc biệt là trong ruột người và nước cống thải. Phân đang lên men nóng, cỏ khô và đất mùn là những môi trường phát triển tốt nhất của xạ khuẩn ưa nhiệt. Miehen (1907) đã mô tả mức độ sinh trưởng của xạ khuẩn ưa nhiệt là gần như tạo lớp vỏ màu trắng, bao phủ toàn bộ các đống phân, cỏ khô đang lên men nóng. Tendle (1959) và Burkholder (1960) đã phân lập được hơn 100 chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thuộc giống Thermo actiniomyces và Streptomyces từ các mẫu đất khác nhau của Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Pêru và Chilê. Kosmatcher (1953, 1956, 1962) đã phân lập được một số chủng xạ khuẩn ưa nhiệt từ các vùng núi cao như: Crimê, Capcazơ, Palmia, Tiansan và các vùng có nguồn nước nóng. Như vậy xạ khuẩn được phân bố rộng khắp mọi nơi và từ nhiều nguồn cơ chất khác nhau. Xạ khuẩn ưa nhiệt cũng được tìm thấy ở cả 4 mùa trong năm. Ngay cả vùng ôn đới nhiều loại đất cũng thường có tới 10.000-15.000 khuẩn lạc hoặc bào tử xạ khuẩn
• 32.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 24 SVTH: BÙI THỊ TRANG trong 1g đất. Trong các mẫu đất chỉ bón phân vô cơ thì số lượng xạ khuẩn khoảng 200.000 khuẩn lạc trong 1g đất. Mùa đông số lượng xạ khuẩn chỉ chiếm 10-15% so với toàn bộ tổng số vi sinh vật ưa nhiệt. Vào mùa hè tỷ lệ này tăng lên 70- 90%. Như vậy, độ biến động về số lượng xạ khuẩn ưa nhiệt phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ và thời tiết.[12]
• 33.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 25 SVTH: BÙI THỊ TRANG Theo nghiên cứu của Agre (1962, 1964) cho rằng: trong đất đồng cỏ và đất xám số lượng xạ khuẩn ưa nhiệt không nhiều lắm, nhưng trong các vùng đất rừng, thảo nguyên số lượng xạ khuẩn ưa nhiệt lại nhiều hơn. Trong đất canh tác số lượng xạ khuẩn ưa nhiệt chiếm tới vài chục nghìn/1g đất tươi, số liệu được trình bày ở bảng 1.2. Bảng 1.2. Thành phần và số lượng vi sinh vật trên một số loại đất chính Loại đất Cây trồng Vi khuẩn (%) Xạ khuẩn (%) Nấm mốc (%) Đất đỏ bazan (Đồng Nai) Cao su 95,5 2,7 1,8 Đất phù sa sông Cửu Long (Cần Thơ) Lúa - Rau màu 90,3 6,1 3,6 Đất đỏ vàng trên đá sét (Vĩnh Phúc) Chuyên màu 76,8 11,0 12,2 Đất cát biển (Nghệ An) Chuyên màu 83,5 5,5 11,0 Đất phèn ngoại ô TPHCM Chuyên màu 59,6 15,9 24,5 Đất phù sa sông Hồng (Hà Nội) Lúa 96,9 1,7 1,4 Đất phù sa Tiền Hải (Sông Thái Bình) Lúa 97,6 1,7 1,4 Đất bạc màu (Bắc Giang) Lúa - Rau màu 92,6 4,2 3,4 Đất đồi pheralit trên đá vôi (Thanh Hoá) Chuyên màu 92,0 3,2 4,8 Đất cát biển Hậu Lộc (Thanh Hoá) Chuyên màu 85,6 3,9 10,5 Đất vàng trên đá biến chất (Hà Giang) Sắn 87,9 5,0 5,9 (Nguồn: Agre, 1962, 1964)
• 34.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 26 SVTH: BÙI THỊ TRANG Hình 1.13 Nấm Trichoderma fertile 1.4.4 Nấm mốc Hầu hết các loài nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng. Tuy nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử. Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 2o C đến 5o C, tối ưu từ 22o C đến 27o C và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35o C đến 40o C, cá biệt có một số ít loài có thể sống sót ở 0o C và ở 60o C. Nói chung, nấm mốc có thể phát triển tốt ở môi trường acid (pH = 6) nhưng pH tối ưu là 5 - 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9.[22] Nấm mốc thường tập trung phát triển ở vùng đất canh tác giàu dinh dưỡng, tơi xốp, thoáng khí… Đó là nơi tập trung rễ cây, chất dinh dưỡng, cường độ chiếu sáng, nhiệt độ thích hợp… Nấm mốc phát triển mạnh ở vùng rễ cây vì rễ cây thường xuyên tiết chất hữu cơ làm nguồn dinh dưỡng cho nấm mốc; hơn nữa rễ cây làm cho đất thoáng khí, giữ được đổ ẩm. Tuy nhiên, sự phát triển của nấm mốc cũng phụ thuộc vào loại hệ rễ cây vì mỗi loại hệ rễ khác nhau nó sẽ tiết ra các hợp chất khác nhau. Là vi sinh vật hiếu khí nên số lượng nấm mốc giảm dần theo tầng đất. Tiêu biểu nhiều loại nấm có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulose thuộc giống Alternaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Pinicillium, Cladosporum...Trong đó hai giống nấm là Trichoderma, Aspergillus đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất cellulose. Giống Trichoderma sinh tổng hợp một lượng tương đối lớn endoglucanase và exoglucanase, nhưng chỉ một lượng ít β-glucosidase, trong khi các chủng thuộc giống
• 35.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 27 SVTH: BÙI THỊ TRANG Aspergillus sinh ra một lượng tương đối lớn endoglucanase và β-glucosidase nhưng chỉ một lượng ít exoglucanase.[6] 1.5 Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của vi khuẩn Trong tự nhiên, đa số các loài vi sinh vật sống hoại sinh, phân giải các nguồn hợp chất hữu cơ có sẵn trong môi trường thành các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của mình. Khả năng sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng sinh tổng hợp các enzyme chịu sự tác động của nhiều yếu tố môi trường như: nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường, nguồn carbon, nguồn nitơ.  Nguồn carbon Các loài vi sinh vật có thể sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau tùy thuộc đặc điểm của từng loài. Có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài thì không đòi hỏi nghiêm ngặt mà có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau. Nguồn carbon có thể đơn giản như các loại đường đơn, đường đôi hoặc phức tạp như glucan, tinh bột, cellulose.Theo lý thuyết sinh tổng hợp enzyme cảm ứng, trong môi trường nuôi cấy các vi sinh vật sinh cellulase nhất thiết phải có cellulose là chất cảm ứng và nguồn carbon. Những nguồn cellulose có thể là giấy lọc, bông, bột cellulose, lõi ngô, cám bổi, mùn cưa, bã củ cải, rơm, than bùn...Trichoderma lignorum và Trichoderma koningii được nuôi trên môi trường có nguồn carbon là giấy lọc cho hoạt tính enzyme cao nhất. Kết quả cũng tương tự như vậy khi nuôi Myrothecium verrucaria trên môi trường có giấy lọc và lõi ngô, bã củ cải. Chất cảm ứng enzyme cellulase còn là cellobiozooctaacetat, cám mì, lactose, salixyl. Đối với Stachybotris atra nguồn carbon tốt nhất để sinh tổng hợp cellulase là tinh bột (1%). Các nguồn carbon khác (glucose, cellobiose, acetat, citrat, oxalate, succinat và những sản phẩm trung gian của chu trình Krebs) có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp
• 36.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 28 SVTH: BÙI THỊ TRANG cellulase. Song, trong môi trường với nồng độ glucose rất thấp có tác dụng kích thích vi sinh vật phát triển, không cảm ứng tổng hợp enzyme. Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cộng sự (1999) cho thấy, nguồn carbon thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải là glucose và CMC. Nguồn carbon thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn CD6-9 là tinh bột, chủng CD9-9 là CMC và saccharose, chủng CD5-12 là lactose; các chủng Actinomyces griseus là bã mía hoặc mùn cưa. Nguồn carbon thích hợp đối với các chủng xạ khuẩn ưu ấm là vỏ lạc hoặc rơm . Đối với các chủng nấm mốc, nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase và một số loại enzyme khác là các nguồn carbon tự nhiên, đặc biệt là các phế phụ phẩm nông nghiệp. Theo Acharya và cộng sự (2008), nguồn carbon thích hợp nhất cho các chủng A. niger sinh tổng hợp endoglucanase là mùn cưa. Còn theo kết quả nghiên cứu của Ojumu và cộng sự (2003), chủng A. flavus Linn isolate NSPR 101 có khả năng sinh tổng hợp cellulase khi sử dụng mùn cưa, bã mía hay lõi ngô làm nguồn cơ chất, trong đó mùn cưa đuợc xem là nguồn cơ chất tối ưu. Các loài Penicillium pinophilum, P. persicinum, P. Brasilianum sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất đối với nguồn cellulose tự nhiên, còn đối với nguồn carbon xylan hoặc birchwood xylan thì khả năng sinh tổng hợp rất kém [19]. Theo kết quả nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006), nguồn carbon thích hợp nhất cho chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 là rơm.  Nguồn nitơ Các loài vi sinh vật khác nhau có nhu cầu khác nhau đối với nguồn nitơ. Nhìn chung, các loài đều có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ nhưng mức độ đồng hóa tùy thuộc từng loài. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong môi trường chứa nguồn nitơ là peptone và cao nấm men [14].
• 37.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 29 SVTH: BÙI THỊ TRANG Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các vi sinh vật sinh cellulase là muối nitrate. Đối với các giống của bộ nấm bông (Hyphomycetales) nguồn nitơ tốt nhất lại là (NH4)2HPO4. Nói chung các muối amon ít có tác dụng nâng cao hoạt lực enzyme này thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì trong môi trường nuôi cấy, các muối này làm acid hóa môi trường. Do đó, ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme, và thậm chí có thể làm mất hoạt tính enzyme sau khi tạo thành. Natri nitrate làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase. Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase. Điều này phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng giống. Cao ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật; nhưng với cao ngô, khả năng sinh tổng hợp exoglucanase và endoglucanase cao hơn so với cao nấm men. Nguồn nitơ urea và đậu nành ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình sinh tổng hợp cellulase của chủng A. niger NRRL-363 với hoạt tính cellulase tổng số từ 46 đến 76 IU/g . Nghiên cứu của Narasimha và cộng sự (2006) cho thấy, các chủng A. niger có thể sử dụng nhiều nguồn nitơ khác nhau như: urea, peptone, ammonium nitrate. Trong đó, urea là nguồn nitơ tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp các cellulase của các chủng nấm này.  Những nguyên tố khoáng Như Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu có ảnh hưởng rõ đến khả năng tổng hợp cellulase của vi sinh vật. Trong đó, Zn, Mn, Fe, có tác dụng kích thích sự tạo thành enzyme này ở nhiều chủng. Nồng độ tối thích của Zn là 0,11-2,2mg/l, Fe là 2-10mg/l, Mn là 3,4- 27,2mg/l. Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme. Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme. Sharma (1995) nhận thấy, Ca2+ làm tăng hoạt tính cellulase của Bacillus sp. lên 40% so với đối chứng; còn Mg2+ làm giảm nhẹ (hoạt tính còn lại 92%)
• 38.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 30 SVTH: BÙI THỊ TRANG và Zn2+ ức chế mạnh hoạt tính enzyme này (hoạt tính còn lại bằng 37% so với đối chứng). Theo nghiên cứu của Gao (2008), endoglucanase từ Aspergillus terreus bị giảm 77% hoạt tính khi ủ với Hg2+ , 59% khi ủ với Cu2+ .  Nhiệt độ nuôi cấy Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trưởng, các loài vi sinh vật được chia làm 3 nhóm: các loài ưa lạnh và chịu lạnh; các loài ưa ấm và các loài chịu nhiệt. Các loài ưa lạnh có khả năng sinh trưởng trong điều kiện dưới 150 C, các loài ưa ấm thường sinh trưởng phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20-370 C; còn các loài chịu nhiệt có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 500 C. Khi nghiên cứu các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải cho thấy, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ 45-550 C và có thể chịu được nhiệt độ 65-800 C [7]. Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hương và cộng sự (2003) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ 500 C. Chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus có khả năng sinh tổng hợp cellulase tối ưu ở nhiệt độ 580 C [8]. Trong khi đó, các chủng nấm mốc N1và N2 có nhiệt độ sinh tổng hợp cellulase tối ưu là 31 và 340 C [9]. Acharya và cộng sự (2008) cho rằng, các chủng A. niger tổng hợp cellulase mạnh nhất khi lên men trong điều kiện 280 C, pH 4,0-4,5.[4]  pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu pH môi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi sinh vật. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH môi trường ban đầu là 8,0 [9]; còn chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus thích hợp với pH môi trường ban đầu là 6,7[16]. Đối với các chủng nấm mốc N1 và N2 sinh tổng hợp cellulase tối ưu ở môi trường có pH ban đầu là 4,5 và 5,5; các chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong khoảng pH môi trường ban đầu từ 6,0-7,0 [9].
• 39.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 31 SVTH: BÙI THỊ TRANG Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các loại enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác như: thời gian nuôi cấy, tốc độ lắc và sục khí, lượng giống được tiếp vào ban đầu. 1.6 Các nghiên cứu liên quan ở Việt Nam và trên thế giới 1.6.1 Trên thế giới Nghiên cứu đầu tiên về vi sinh vật phân giải cellulose có lẽ là công trình nghiên cứu về nấm mốc của A.de Bary (1886). Tiếp đó là những nghiên cứu nhằm xác nhận vai trò phân giải cellulose mạnh mẽ của nấm mốc trong đất (Ap.pel 1906, Scales 1915, Walsman 1924) và Imsem hatski (1984), Zlochevski (1986) xác định độ ẩm tối ưu của loài Aspergillus repens. [12] Một số loài nấm có khả năng phân giải cellulose được chú ý nhiều: + Aspergillus fumigatus (Loginova, 1965) + Aspergillus flavus (Reese, 1950) + Aspergillusniger (Su – guira và đồng sự 1966) + Aspergillus oryzae [12] Ở Nhật người ta sử dụng loại nấm Trichoderma viride và loài Trichoderma koningin nuôi cấy theo phương pháp bề mặt. Ở Mỹ người ta sử dụng chủng đột biến Trichoderma viride để tạo cellulase. Một loại chế phẩm cellulase được sản xuất tại Liên Xô (cũ) có tên gọi là chế phẩm thô được chiết rút qua quá trình nuôi cấy nấm Trichoderma lignorum theo phương pháp bề mặt, sau đó sấy khô đến độ ẩm 13% trở xuống. Chế phẩm này chứa enzyme C1 và Cx, ngoài ra còn hemicellulase, pectinase, xylase... [13] 1.6.2 Ở Việt Nam Cho đến nay, ở Việt Nam đã có khá nhiều tác giả nghiên cứu về cellulase. Các nghiên cứu được tiến hành trên nhiều phương diện khác nhau liên quan đến loại enzyme này.
• 40.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 32 SVTH: BÙI THỊ TRANG Năm 1999, Tăng Thị Chính và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện lên men và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt được phân lập từ bể ủ rác thải, nhằm tìm ra điều kiện tối ưu nhất cho khả năng sinh tổng hợp cellulase, ứng dụng vào việc xử lý rác thải chứa nhiều cellulose. Kết quả cho thấy, các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng chịu được nhiệt độ 800 C, nhiệt độ lên men tối ưu từ 450 C đến 550 C, pH môi trường ban đầu thích hợp nhất là 8. Nguồn carbon tốt nhất cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn nghiên cứu là glucose và CMC; nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men. Các tác giả cũng đã nghiên cứu động thái của quá trình sinh tổng hợp cellulase và kết quả cho thấy, thời gian tích lũy cao nhất ở 48 giờ lên men. Nguyễn Đức Lượng và cộng sự (1999) đã tiến hành nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus. Qua nghiên cứu tác giả thấy rằng khả năng sinh tổng hợp cellulase của A. griseus là cao và khả năng này đạt tối ưu ở 580 C, pH ban đầu là 6.7, độ ẩm ban đầu là 55% với thời gian nuôi cấy là 72 giờ. Qua nghiên cứu tác giả cũng thấy rằng nguồn lignocellulose thích hợp là bã mía hoặc mùn cưa. Cũng trong năm này, Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn ưa ấm phân lập từ mùn rác ở một số nơi có khả năng phân giải cellulose mạnh. Trong số 195 chủng xạ khuẩn nghiên cứu thì các chủng xạ khuẩn phân lập được từ các mẫu rơm mục và đất chân đống rơm có khả năng phân giải cellulose và CMC mạnh nhất . Trong số các loài vi sinh vật, nấm sợi là một trong những đối tượng có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao. Việc tìm ra các chủng nấm sợi có khả năng phân hủy cellulose cao và tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase của chúng đang là vấn đề được nhiều tác giả quan tâm. Năm 1999, Đặng Minh Hằng đã nghiên cứu tuyển chọn được hai chủng nấm sợi có khả năng phân giải cellulose cao. Tác giả cũng đã nghiên cứu và tìm ra được một số điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp cellulase của hai chủng nấm này .
• 41.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 33 SVTH: BÙI THỊ TRANG Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh và cộng sự đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm của cellulase từ chủng A. niger NRRL-363. Qua nghiên cứu, tác giả đã tìm ra được một số thông tin và điều kiện cơ bản cho sự tổng hợp cellulase của chủng này trên môi trường trấu xay và một số chất thải công nghiệp như mật rỉ đường . Bằng cách tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu nhiệt, phân giải cellulose cao, Lý Kim Bảng và cộng sự (1999) đã xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm Micromix 3 bổ sung vào bể ủ rác thải. Nghiên cứu cho thấy, khi chế phẩm này được bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, một nửa thời gian lên men so với bể đối chứng bổ sung chế phẩm VSV-xen. Lượng mùn tạo thành của bể ủ bổ sung chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29%, và các chất dinh dưỡng cao hơn 10% so với bể đối chứng . Võ Hoài Bắc, Lê Hương Thuỷ, Lê Thị Lan Oanh với đề tài sàng lọc chủng vi sinh vật sinh cellulose sử dụng trong thủy phân bã thải agar đã chọn lọc được 17 chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase có hoạt tính cao. Tuy nhiên, chưa có công trình nghiên cứu nào về hệ vi sinh vật phân hủy cellulose từ các nhà máy sản xuất giấy và nghiên cứu về hoạt tính enzyme của các hệ vi sinh vật này. Chính vì vậy, đây cũng là hướng nghiên cứu của đề tài chúng tôi.
• 42.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 34 SVTH: BÙI THỊ TRANG Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Thời gian và địa điểm Thực hiện đề tài từ ngày 7/4 đến 30/6/2011 tại PTN Khoa MT & CNSH trường ĐH Kỹ thuật Công nghệ TpHCM. 2.2 Vật liệu 2.2.1 Đối tượng Các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose phân lập được từ nước thải nhà máy giấy trên địa bàn TpHCM. 2.2.2 Cơ chất Nguồn cơ chất sử dụng ở đây là Carboxymethylcellulose (CMC). Là một dẫn xuất của cellulose, được tạo thành sau phản ứng với kiềm và acid chloroacetic. Hình 2.1 Công thức cấu tạo của CMC 2.3 Thiết bị và hóa chất 2.3.1 Thiết bị Máy quang phổ kế Kính hiển vi quang học Cân phân tích Máy ly tâm
• 43.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 35 SVTH: BÙI THỊ TRANG Nồi hấp 2.3.2 Hóa chất Hóa chất dùng để pha dung dịch đệm : CH3COONa.3H2O, CH3COOH. Hóa chất dùng để xác định hoạt tính enzyme cellulase : glucose, lactose, 2- hydro-3,5-dinitrobenzoic acid (DNS). Môi trường nuôi cấy (A) : Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn Thành phần Hàm lƣợng Đơn vị CMC 1% 100 ml Tinh bột 1 g MgSO4 0,2 g NaHCO3 0,2 g K2HPO4 5 g CaCl2 0,2 g NaCl 0,2 g Peptone 0,2 g Nước cất 1000 ml 2.4Các phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi sinh vật Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme mạnh nhất từ các chủng vi khuẩn phân lập được từ Đề tài “Nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme cellulase từ nước thải nhà máy giấy” của sinh viên Nguyễn Thanh Tùng đã thực hiện vào tháng 4 năm 2011.
• 44.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 36 SVTH: BÙI THỊ TRANG Hình 2.2 Quy trình tuyển chọn chủng vi khuẩn. 2.4.1.1 Phương pháp xác định đường kính vòng phân giải Giống vi khuẩn sau khi tăng sinh trên môi trường A trong 24h, ủ ở 370 C được ly trích thu dịch enzyme ngoại bào bằng cách ly tâm 7000 vòng/phút trong 15 phút. Hoạt tính enzyme cellulase được xác định tương đối theo phương pháp khuếch tán enzyme trên môi trường A có bổ sung 2% agar. Đĩa thạch chứa cơ chất CMC tùy theo nồng độ trong đệm acetate 50mM pH 7, dày khoảng 0,5 cm được đục lỗ đường kính 0,5 cm. Cho 100 μl dịch enzyme vào lỗ thạch rồi ủ 2 giờ ở 40 C cho enzyme khuếch tán đều xung quanh và sau đó ủ 24 giờ ở 370 C. Nhuộm bằng dung dịch 1% 7000 vòng/phút, 15 phút Chủng vi khuẩn Thu dịch Xác định đường kính vòng phân hủy ( môi trường A bổ sung 2% agar) Ly trích enzyme 24h, 370 C Tăng sinh (môi trường A) Chọn các chủng có đường kính lớn nhất 24h, 370 C Nhuộm Gram Xác định hình thái
• 45.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 37 SVTH: BÙI THỊ TRANG Lugol và đo đường kính vòng phân giải cơ chất. Hoạt tính tương đối của enzyme tỷ lệ thuận với kích thước đường kính vòng phân giải cơ chất: Đường kính = D - d (với D là đường kính vòng ngoài và d là đường kính lỗ) [2]. 2.4.1.2 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái Sau khi chọn lựa được 10 chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose cao, tiến hành xác định đặc điểm hình thái.  Quan sát hình thái khuẩn lạc - Nguyên tắc Quan sát hình thái khuẩn lạc giúp nhận diện được những khuẩn lạc đặc trưng trên những môi trường riêng biệt. - Phƣơng pháp thực hiện Từ môi trường phân lập, lấy các khuẩn lạc đã mọc sau 24h đặt lên phiến kính và quan sát hình thái trên kính hiển vi.  Phƣơng pháp nhuộm Gram - Nguyên tắc Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào. - Phƣơng pháp Dùng que cấy ria lấy ít khuẩn lạc dàn mỏng trên phiến kính rồi hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. Nhuộm bằng thuốc nhuộm crystal violet trong 1 phút, rửa nước. Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa nước, rửa cồn 96. Nhuộm lại bằng dung dịch fushin trong 1 phút, rửa nước. Soi kính 100.
• 46.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 38 SVTH: BÙI THỊ TRANG 2.4.1.3 Phương pháp xác định mật độ tế bào - Nguyên tắc Phương pháp xác định mật độ tế bào cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu. - Phƣơng pháp thực hiện Bước pha loãng mẫu theo dãy thập phân: Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân 10-1 , 10-2 , 10-3 ...Mỗi bậc pha loãng là 10-1 được thực hiện bằng cách dùng 1ml mẫu ( hoặc dung dịch có độ pha loãng trước đó) thêm vào 9ml nước hoặc môi trường trong một ống nghiệm. Thực hiện dãy nhiều nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp để được nồng độ pha loãng thích hợp. Cấy trang 1ml mẫu đã pha loãng trên môi trường A có bổ sung 2% agar. Mỗi độ pha loãng lặp lại 2 lần. 2.4.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) 2.4.2.1 Nguyên tắc  Định nghĩa đơn vị hoạt tính Một đơn vị CMCase là lượng enzyme mà sẽ giải phóng đường khử như glucose khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng.  Nguyên tắc Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5 và 400 C . Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid, màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 540nm. Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzyme mà giải phóng đường khử (như glucose) khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng.
• 47.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 39 SVTH: BÙI THỊ TRANG 2.4.2.2 Các dung dịch chuẩn bị - Pha dung dịch đệm acetat 1000ml nước cất + 4.1g CH3COOH chuẩn độ tới pH mong muốn (dùng NaOH 0.1N và HCl 0.1N để chuẩn độ) dung dịch đệm CH3COONa 50mM. - Pha dung dịch cơ chất CMC 1% Cân 1g CMC +100ml dung dịch đệm CH3COONa 50mM đun lên sau khi CMC tan hết chuyển vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch đệm cho đến vạch và lắc đều ta được dung dịch đệm CMC 1% . - Pha dung dịch DNS Cân 10g DNS, cho vào becher 1000ml, thêm khoảng 400ml nước cất, đun becher ở 800 C và khuấy đều. Thêm dung dịch NaOH (16g NaOH trong 150ml nước cất) từ từ vào dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 800 C. Tiếp tục thêm 300g postassium sodium tartrate tetrahydrate vào dung dịch DNS và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ 800 C. Làm lạnh dung dich DNS đến nhiệt độ phòng. Chuyển dung dịch vào bình định mức 1000ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS trong chai màu nâu có nắp.
• 48.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 40 SVTH: BÙI THỊ TRANG 2.4.1.1 Dựng đường chuẩn glucose Hòa tan 100mg glucose monohydrate với 80ml nước cất và chuyển vào bình định mức100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều . Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng 2.2: Bảng 2.2 Dựng đường chuẩn gluose Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 ml dung dịch glucose ( mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 ml dung dịch CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 ml dung dịch DNS – lactose 2 2 2 2 2 2 2 ml nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. So màu trên máy quang phổ ở bước sóng 540 nm. Từ các giá trị OD, dựng đường tương quan tuyến tính giữa nồng độ glucose và giá trị OD.
• 49.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 41 SVTH: BÙI THỊ TRANG 2.4.1.2 Thực hiện thí nghiệm Xác định hoạt tính phân hủy cellulose của enzyme cellulase đối với cơ chất CMC bằng cách so sánh ống đối chứng mẫu (bất hoạt enzyme bằng nhiệt độ) và ống thí nghiệm (ủ enzyme ở nhiệt độ thích hợp) như bảng sau: Bảng 2.3. Xác định hoạt tính enzyme Carboxymethyl cellulase Đối chứng Đối chứng mẫu Thí nghiệm 1ml H2O 1ml enzyme (đun sôi 5 phút) 1ml enzyme 2ml DNS - lactose 2ml DNS - lactose 1ml CMC ( ủ 400 C, 10 phút) 1ml CMC 1ml CMC 2ml DNS - lactose Đun sôi cách thủy 15 phút, làm lạnh nhanh, đo độ hấp thụ ở bước sóng 540nm 2.4.1.3 Công thức tính Từ phương trình đường chuẩn tính giá trị F theo công thức: Giá tri F = ( 0,1/AG0,1 + 0,2/AG0,2 + …+ 0,6/AG0,6)/ 6 Hoạt tính CMCase được tính dựa vào giá trị F và giá trị OD: CMCase (U/g) = (AT – AB)*F*(1000/180)*(1/10phút)*(1/1,0ml)*(1/C) Trong đó: AT: độ hấp thụ của dung dịch có phản ứng enzyme ( mẫu TN) AB: độ hấp thụ của dung dịch không có phản ứng enzyme ( mẫu ĐC) F : yếu tố glucose ( mg/ml) 1000: chuyển mg thành µg 180: phân tử lượng của glucose monohydrate, chuyển µg thành µmol 10: thời gian phản ứng (phút) 1.0: thể tích dung dịch enzyme (ml) C : nồng độ dung dịch mẫu (g/ml)[5]
• 50.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 42 SVTH: BÙI THỊ TRANG 2.4.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn Hình 2.3 Quy trình khảo sát các yếu tố môi trường lên hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn. 2.4.1.1 Phương pháp khảo sát hoạt tính enzyme cellulase theo thời gian Các chủng vi khuẩn được nghiên cứu trên môi trường A, sau các khoảng thời gian 12h, 24h và 48h, tiến hành ly trích ở 7000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch. Xác định hoạt tính enzyme của các chủng đã tuyển chọn. Chọn thời gian các chủng có hoạt tính cao nhất. Chủng vi khuẩn đã tuyển chọn Ly tâm 7000 vòng/phút trong 15 phút Nuôi cấy trên môi trường A ở nồng độ CMC 0.5%, 1%, 1.5%, 2% Xác định hoạt tính Xác định mật độ tế bào Thu dịch enzyme Xác định đường kính vòng phân giải Nuôi cấy trên môi trường A ở pH3, 5, 7 và 9 Nuôi cấy trên môi trường A ở 12h, 24h và 48h
• 51.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 43 SVTH: BÙI THỊ TRANG Tiến hành song song với phương pháp xác định hoạt tính enzyme là phương pháp xác định mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn trên môi trường A có bổ sung 2% agar. 2.4.1.2 Phương pháp khảo sát hoạt tính enzyme cellulase theo pH Môi trường A được điều chỉnh pH bằng NaOH 1M hoặc HCl 1M để được môi trường có pH thích hợp tăng dần từ 3, 5, 7, và 9. Sau đó, ủ các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn ở 370 C theo thời gian tối ưu đã chọn ở trên. Tiến hành ly trích lấy dịch enzyme ở 7000 vòng/phút trong 15 phút và xác định hoạt tính enzyme cellulase. Chọn giá trị pH của môi trường mà enzyme cellulase có hoạt tính cao nhất. 2.4.1.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính enzyme cellulase theo nồng độ cơ chất CMC Các chủng vi khuẩn được nghiên cứu trên môi trường A đã được điều chỉnh nồng độ cơ chất CMC tăng dần từ 0.5%, 1%, 1.5%, 2% và điều chỉnh pH tối ưu như đã khảo sát bên trên. Sau đó, tiến hành ly trích ở 7000 vòng/phút trong 15 phút để thu lấy dịch. Xác định hoạt tính enzyme của các chủng đã tuyển chọn. Chọn nồng độ cơ chất mà tại đó enzyme có hoạt tính cao. Tiến hành song song với phương pháp xác định hoạt tính enzyme là phương pháp xác định đường kính vòng phân giải của các chủng vi khuẩn trên môi trường A có bổ sung 2% agar.
• 52.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 44 SVTH: BÙI THỊ TRANG Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn 3.1.1 Kết quả tuyển chọn trên môi trường A Từ đề tài “ Nghiên cứu phân lập chủng VK có hoạt tính cellulase cao từ nước thải nhà máy giấy” của sinh viên Nguyễn Thanh Tùng, chúng tôi có 15 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose. Sau khi tăng sinh 24h, ủ ở 370 C trên môi trường A, dịch ly trích enzyme được cấy vào các giếng thạch trên môi trường A có bổ sung 2% agar. Dựa vào đường kính vòng phân giải lớn nhất, chúng tôi chọn lựa được 10 chủng VK, ký hiệu từ T1 đến T10. Các chủng VK này được phân lập từ nguồn nước thải của các cơ sở sản xuất giấy, bột giấy, bao bì trên địa bàn TpHCM. Trên môi trường A, chúng tôi sử dụng khoáng đa lượng, vi lượng và 1%CMC làm nguồn C và N. Đây là dẫn xuất của cellulose sau phản ứng với kiềm và acid chloroacetic. Chỉ các chủng VK có hệ enzyme cellulase, phân hủy được cellulose mới có thể phát triển được trên môi trường này. Quá trình phân hủy CMC sẽ tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose, sản phẩm này không bắt màu thuốc thử Lugol. Đường kính vòng phân giải của 10 chủng T1 đến T10 thay đổi từ 0,9 cm đến 2,7 cm. Trong đó, chủng có đường kính vòng phân giải lớn nhất là chủng T6 và chủng có đường kính vòng phân giải nhỏ nhất là chủng T10. Để xác định về hình thái vi thể, chúng tôi tiến hành nhuộm Gram 10 chủng này. 3.1.2 Kết quả xác định hình thái Từ 15 chủng vi sinh vật, tuyển chọn trong môi trường A có bổ sung 2% agar và ủ ở 370 C. Sau đó, chọn lọc 10 chủng VK có hoạt tính cellulase cao nhất để quan sát hình thái đại thể và vi thể .
• 53.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 45 SVTH: BÙI THỊ TRANG Kết quả quan sát hình thái đại thể và nhuộm Gram được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1. Bảng 3.1. Hình thái đại thể và hình thái vi thể của 10 chủng vi khuẩn. Chủng Hình thái đại thể Hình thái vi thể T1 Khuẩn lạc trơn, trong, nhỏ li ti. Vi khuẩn Gr(+), tụm lại từng đám, có dạng hình que. T2 Tròn, đục, lan. Vi khuẩn Gr(+), hình que. T3 Trắng, trong, trơn. Vi khuẩn Gr(+), hình que. T4 Đục, lan, nhăn. Vi khuẩn Gr(+), hình cầu. T5 Lan, nhăn. Vi khuẩn Gr(+), hình cầu. T6 Tròn, trắng, lồi. Vi khuẩn Gr(+), hình que. T7 Đục, trơn. Vi khuẩn Gr(+), hình que T8 Đục, tròn li ti, nhăn. Vi khuẩn Gr(+), hình que T9 Vàng, trơn, lan. Vi khuẩn Gr(+), hình que. T10 Tròn, trơn, nhăn. Vi khuẩn Gr(+), hình cầu.
• 54.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 46 SVTH: BÙI THỊ TRANG Chủng Hình ảnh minh họa Chủng T1 T6 T2 T7 T3 T8 T4 T9 T5 T10 Hình 3.1. Hình ảnh vi thể của 10 chủng vi khuẩn sau khi nhuộm Gram.
• 55.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 47 SVTH: BÙI THỊ TRANG Kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn chúng tôi tuyển chọn đều là Gram (+) và là trực khuẩn. Còn chủng T4, T5 và T10 thì cho kết quả là cầu khuẩn. Theo nghiên cứu của nhiều nhà khoa học như nghiên cứu của Nguyễn Đức Lượng (1999) về chủng Actinomyces griseus và Hoàng Quốc Khánh (2003) về chủng A. niger đã khẳng định chủng vi sinh vật có hệ enzyme celullase cao nhất là nấm mốc. Tuy nhiên, kết quả phân lập của chúng tôi lại thu được chủ yếu là vi khuẩn. Có thể do đặc điểm nguồn lấy mẫu là nước thải và môi trường phân lập là ở pH 6,5 – 7 phù hợp với điều kiện phát triển của vi khuẩn hơn. Như vậy, bước đầu chúng tôi đã tuyển chọn được 10 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose mạnh nhất cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cellulase theo thời gian 3.2.1 Kết quả hoạt tính cellulase Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường chứa CMC 1%, pH 7, ở nhiệt độ 370 C. Sau thời gian 12h, 24h và 48h xác định hoạt tính CMCase để chọn ra thời gian tối ưu vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme và xác định mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn trong khoảng thời gian tối ưu đó. Hình 3.2 Xác định hoạt tính enzyme cellulase theo Miller
• 56.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 48 SVTH: BÙI THỊ TRANG Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 10 chủng theo thời gian. Chủng Hoạt tính (U/g) 12h 24h 48h T1 0,0273 0,0302 0,0261 T2 0,0563 0,0651 0,0401 T3 0,0973 0,1926 0,0083 T4 0,1861 0,2075 0,0033 T5 0,0327 0,0385 0,0576 T6 0,1820 0,2635 0,0264 T7 0,1697 0,2250 0,0461 T8 0,0359 0,0394 0,0348 T9 0,0834 0,1989 0,0157 T10 0,0097 0,0112 0,0228 Trung bình 0,0881 0,1272 0,0281 Kết quả cho thấy 10 chủng vi khuẩn đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase trong thời gian 12h, 24h và 48h. Các chủng tăng từ lên 0,0881 (U/g) sau 12h lên 0,1272 (U/g) sau 24h, sau đó giảm dần xuống 0,0281 (U/g) sau 48h. Trong đó, tại thời điểm 24h, chủng cao nhất là T6 (0,2635 U/g) và chủng thấp nhất là T10 (0,0112 U/g). Riêng 2 chủng T5 và T10 hoạt tính cao sau 48h nuôi cấy. Tuy nhiên, điều kiện thí nghiệm không cho phép nên không thể quan sát thời gian tiếp theo nên 2 chủng này chúng tôi kết luận là cho hoạt tính cao nhất ở 48h. Bên cạnh đó 2 chủng T1 và T8 vẫn cho hoạt tính cao nhất ở 24h, tuy nhiên sự chênh lệch ở các khoảng thời gian 12h, 24h và 48h vẫn không cao.
• 57.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 49 SVTH: BÙI THỊ TRANG Hình 3.3 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo thời gian. 0.02 0.025 0.03 0.035 12h 24h 48h U/g Thời gian T1 0 0.2 0.4 12h 24h 48h U/g Thời gian T4 0 0.1 0.2 0.3 12h 24h 48h U/g Thời gian T3 0 0.05 0.1 12h 24h 48h U/g Thời gian T2 0 0.05 0.1 12h 24h 48h U/g Thời gian T5 0 0.1 0.2 0.3 12h 24h 48h U/g Thời gian T6 0 0.1 0.2 0.3 12h 24h 48h U/g Thời gian T7 0.03 0.035 0.04 12h 24h 48h U/g Thời gian T8 0 0.1 0.2 0.3 12h 24h 48h U/g Thời gian T9 0 0.01 0.02 0.03 12h 24h 48h U/g Thời gian T10
• 58.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 50 SVTH: BÙI THỊ TRANG Nghiên cứu của Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy (2010) với đề tài khảo sát các điều kiện nuôi cấy và phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus Subtilis cho thấy, khả năng tại thời điểm 32h và 34h hoạt tính enzyme sinh ra là lớn nhất. Đối với 10 chủng của chúng tôi, hoạt tính lại cao nhất sau 24h. Đây là các chủng phân lập trực tiếp từ nước thải nhà máy giấy, bột giấy nên có thể khả năng thích nghi của các chủng đối với cơ chất cellulose cao hơn. Do vậy, chỉ sau 24h nuôi cấy hoạt tính enzyme thu được là tối đa.
• 59.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 51 SVTH: BÙI THỊ TRANG 3.2.2 Kết quả xác định mật độ tế bào Để xác định sự phát triển của quần thể vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy, cặn tế bào thu được sau khi ly tâm được cấy trang trên môi trường A và đếm mật độ tế bào. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 Bảng 3.3 Hoạt tính và mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn Khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn cơ chất thích hợp, các chủng vi sinh vật sẽ phân hủy cơ chất cung cấp vật chất và năng lượng cho quá trình phát triển. Về mặt lý thuyết, sự gia tăng số lượng tế bào tương quan với hoạt tính enzyme. Tuy nhiên, chúng tôi không có điều kiện xác định mật độ tế bào ở các thời điểm tương ứng khi đo hoạt tính. Do đó, chúng tôi chỉ tiến hành xác định mật độ sau 24h. Chủng Mật độ tế bào (CFU/ml) T1 19x1010 T2 24x1010 T3 11x1010 T4 7,7x1010 T5 1,6x1010 T6 5,9x1010 T7 2,4x1010 T8 11x1010 T9 4,6x1010 T10 3,8x1010
• 60.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 52 SVTH: BÙI THỊ TRANG Hình 3.4 Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn. Kết quả ở bảng 3.3 và biểu đồ 3.4 cho thấy, tất cả các chủng đều có mật độ tế bào khá cao. Riêng chủng T6 khi nuôi cấy ở 24h cho hoạt tính cao nhất (0,2635U/g) nhưng mật độ tương đối thấp (5,9x1010 CFU/ml), điều này chúng tôi có thể khẳng định rằng, do chủng vi khuẩn này có hệ enzyme cellulase mạnh nên khi ứng dụng vào xử lý nước thải cần số lượng vi khuẩn không nhiều. Bên cạnh đó, chủng T2 có mật độ tế bào cao nhất (24x1010 CFU/ml) nhưng hoạt tính tương đối thấp (0,0651 U/g), vì vậy cần các nghiên cứu tiếp theo để xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng vi khuẩn này sinh hoạt tính cao nhất. 0 5 10 15 20 25 30 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 Mật độ tế bào * 10 (CFU/ml)
• 61.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 53 SVTH: BÙI THỊ TRANG 3.3Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo pH Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường chứa CMC 1%, ở nhiệt độ 370 C và ở 4 khoảng pH khác nhau. Sau thời gian 24h, ly trích và xác định hoạt tính CMCase. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Hoạt tính enzyme cellulase theo từng pH khác nhau. Chủng Hoạt tính (U/g) pH3 pH5 pH7 pH9 T1 0,0422 0,0211 0,0302 0,0285 T2 0,0273 0,0004 0,0651 0,0033 T3 0,0236 0,0149 0,1926 0,0319 T4 0,1702 0,0252 0,2075 0,0261 T5 0,1951 0,0238 0,0385 0,0227 T6 0,1818 0,0348 0,2635 0,0120 T7 0,0227 0,0261 0,2250 0,0082 T8 0,0066 0,0198 0,0394 0,0157 T9 0,0372 0,0484 0,1989 0,0430 T10 0,0339 0,0253 0,0112 0,0219 Trung bình 0,0741 0,0239 0,1272 0,0213
• 62.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 54 SVTH: BÙI THỊ TRANG Hình 3.5 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo pH. 0 0.02 0.04 0.06 pH3 pH5 pH7 pH9 U/g pH T1 0 0.05 0.1 pH3 pH5 pH7 pH9 U/g pH T2 0 0.2 0.4 pH3 pH5 pH7 pH9 U/g pH T3 0 0.1 0.2 0.3 pH3 pH5 pH7 pH9 U/g pH T4 0 0.2 0.4 pH3 pH5 pH7 pH9 U/g pH T5 0 0.2 0.4 pH3 pH5 pH7 pH9 U/g pH T6 0 0.1 0.2 0.3 pH3 pH5 pH7 pH9 U/g pH T7 0 0.02 0.04 0.06 pH3 pH5 pH7 pH9 U/g pH T8 0 0.1 0.2 0.3 pH3 pH5 pH7 pH9 U/g pH T9 0 0.01 0.02 0.03 0.04 pH3 pH5 pH7 pH9 U/g pH T10
• 63.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 55 SVTH: BÙI THỊ TRANG Từ đồ thị trên, cho thấy 10 chủng vi khuẩn đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase trong 4 khoảng pH. Tuy nhiên hoạt tính thay đổi khác nhau. Hầu hết các chủng có hoạt tính trung bình giảm từ 0,0741 (U/g) ở pH3 giảm xuống 0,0239 (U/g) ở pH5, sau đó tăng lên 0,1272 (U/g) ở pH7 rồi giảm xuống 0,0213 (U/g) ở pH9. Trong đó, 7 chủng vi khuẩn T2, T3, T4, T7, T8, T9 có hoạt tính cao nhất ở pH7. 3 chủng vi khuẩn T1, T5, T10 có hoạt tính cao ở pH3. Riêng chủng T10 hoạt tính thấp nhất ở pH7. Các chủng vi khuẩn này được phân lập trực tiếp từ nước thải nhà máy giấy, pH đầu vào của nước thải phân lập là 6,3 - 7,2. Nghiên cứu của Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy(2010) với đề tài khảo sát các điều kiện nuôi cấy và phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus Subtilis cho thấy, ở pH7 chủng vi khuẩn này cho hoạt tính enzyme là tối ưu. Mặt khác, trong các công trình xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học hoặc chế phẩm vi sinh sử dụng cho xử lý nước thải được đưa về pH trung tính là 6,5 – 7,5 trước khi bổ sung chủng vi sinh vật. Do đó, các chủng tuyển chọn của chúng tôi có hoạt tính cao nhất ở pH là 7 phù hợp khi ứng dụng xử lý trong thực tế.
• 64.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 56 SVTH: BÙI THỊ TRANG 3.4Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo nồng độ CMC 3.4.1 Xác định hoạt tính theo nồng độ CMC Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường chứa CMC ở 4 nồng độ khác nhau, pH 7, ở nhiệt độ 370 C. Sau thời gian 24h xác định hoạt tính CMCase: Bảng 3.5. Hoạt tính enzyme cellulase theo từng nồng độ CMC. Chủng Hoạt tính (U/g) 0,5% CMC 1% CMC 1,5% CMC 2% CMC T1 0,0787 0,0302 0,0224 0,0037 T2 0,0116 0,0651 0,0294 0,0145 T3 0,1003 0,1926 0,0062 0,0257 T4 0,0518 0,2075 0,0054 0,0153 T5 0,0613 0,0385 0,0651 0,0315 T6 0,0423 0,2635 0,0066 0,0497 T7 0,0394 0,2250 0,0335 0,0083 T8 0,0352 0,0394 0,0244 0,0398 T9 0,0994 0,1989 0,0286 0,0116 T10 0,0162 0,0112 0,0051 0,0037
• 65.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 57 SVTH: BÙI THỊ TRANG Hình 3.6 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase cơ chất. 0 0.2 0.4 0.50% 1% 1.50% 2% U/g CMC T3 0 0.2 0.4 0.50% 1% 1.50% 2% U/g CMC T4 0 0.05 0.1 0.50% 1% 1.50% 2% U/g CMC T1 0 0.05 0.1 0.50% 1% 1.50% 2% U/g CMC T2 0 0.05 0.1 0.50% 1% 1.50% 2% U/g CMC T5 0 0.2 0.4 0.50% 1% 1.50% 2% U/g CMC T6 0 0.1 0.2 0.3 0.50% 1% 1.50% 2% U/g CMC T7 0 0.02 0.04 0.06 0.50% 1% 1.50% 2% U/g CMC T8 0 0.1 0.2 0.3 0.50% 1% 1.50% 2% U/g CMC T9 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.50% 1% 1.50% 2% U/g CMC T10
• 66.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 58 SVTH: BÙI THỊ TRANG Dựa vào biểu đồ, chúng tôi nhận thấy 10 chủng vi khuẩn đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase ở các nồng độ CMC khác nhau. Ở nồng độ CMC 1% vi khuẩn cho hoạt tính enzyme là tối ưu. Ở 2 nồng độ CMC 1.5% và 2% hầu hết các chủng có hoạt tính thấp. Trong đó, chủng T10 cho hoạt tính khá thấp. Riêng T5, T1, T10 có hoạt tính cao ở CMC 0,5%, thấp hơn các chủng còn lại. Theo kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH, các chủng này tối ưu ở pH7. Do đó, thí nghiệm được bố trí ở pH7 nên có thể không phải khoảng pH tối ưu cho hoạt động của enzyme 3 chủng này. Vì thế chỉ có khả năng phát triển ở nồng độ cơ chất thấp là 0,5%. Các nghiên cứu của Võ Hoài Bắc, Lê Hương Thuỷ, Lê Thị Lan Oanh (Viện Nghiên cứu Hải sản) với mục đích phân lập chủng vi khuẩn từ nước thải nhà máy sản xuất agar; Nghiên cứu của Tăng Thị Chính (1999) với mục đích khảo sát điều kiện tối ưu của VK phân giải cellulose từ bể ủ rác và nghiên cứu của Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy(2010) với mục đích là khảo sát các điều kiện nuôi cấy từ chủng vi khuẩn Bacillus Subtilis đều sử dụng môi trường CMC 1% và đều cho kết quả hoạt tính cao. Do đó, chúng tôi kết luận với nồng độ cơ chất CMC 1% thì các chủng VK sinh enzyme là phù hợp.
• 67.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 59 SVTH: BÙI THỊ TRANG 3.4.2 Xác định đƣờng kính vòng phân giải theo nồng độ CMC Để khẳng định những lập luận trên, chúng tôi tiếp tục tiến hành thí nghiệm trên 4 nồng độ cơ chất để xác định vòng phân giải của các chủng VK đã tuyển chọn. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Đường kính vòng phân hủy cellulose theo từng nồng độ CMC. Chủng Đƣờng kính (mm) 0.5% 1% 1.5% 2% T1 17 11 10 6 T2 11 15 12 7 T3 21 24 8 9 T4 13 23 7 8 T5 15 12 13 11 T6 13 27 9 12 T7 12 26 12 9 T8 13 11 10 11 T9 20 26 11 9 T10 10 9 8 7
• 68.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 60 SVTH: BÙI THỊ TRANG Nồng độ 0,5%CMC Nồng độ 1%CMC Nồng độ 1,5%CMC Nồng độ 2%CMC Hình 3.7 Một số hình ảnh đường kính vòng phân hủy của các chủng vi khuẩn.
• 69.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 61 SVTH: BÙI THỊ TRANG Dựa trên kết quả hoạt tính và vòng phân giải của các chủng vi khuẩn, chúng tôi nhận thấy trên nền cơ chất CMC 1% đường kính vòng phân giải vi khuẩn tạo ra là cao nhất. Đường kính vòng phân giải của chủng T6 và T7 là 27mm và 26mm. So với kết quả hoạt tính, đây cũng là 2 chủng có hoạt tính enzyme khá cao ( 0,2635 U/g và 0,2250 U/g). Chủng T1, T5 và T10 có đường kính vòng phân giải cao nhất ở 0,5%, phù hợp với kết quả xác định hoạt tính. Như vậy, đối với nồng độ CMC, khả năng phân hủy trên môi trường thạch có sự tương quan với sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme trên môi trường lỏng. Vì vậy, chúng tôi kết luận nồng độ cơ chất CMC 1% là nồng độ tối ưu để vi khuẩn phát triển .
• 70.
  ĐỒ ÁN TỐTNGHIỆP 62 SVTH: BÙI THỊ TRANG Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Từ 15 chủng vi khuẩn phân lập từ nguồn nước thải nhà máy giấy chúng tôi đã tuyển chọn và phân lập được 10 chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase cao. - Điều kiện tối ưu để vi khuẩn phát triển và sinh tổng hợp enzyme cao trên môi trường A là ở pH7, nồng độ cơ chất CMC 1% và thời gian 24h. 4.2 Kiến nghị - Tiến hành các thí nghiệm định danh 10 chủng vi khuẩn tuyển chọn được. - Xác định mật độ tế bào ở các khoảng thời gian tương ứng với hoạt tính enzyme. - Khảo sát thêm ảnh hưởng của nhiệt độ, các nguồn cơ chất khác nhau đến hoạt tính enzyme cellulase. - Xác định mô hình ứng dụng các chủng vi khuẩn này để xử lý nước thải nhà máy giấy.