Uji potensi antibiotik secara mikrobiologi
- 1. Penetapan Potensi Antibiotik Secara Mikrobiologi Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy ITB
- 2. Mengapa antibiotik perlu ditentukan kadar atau potensinya? Efek penggunaan antimikroba yang meningkat, sehingga meningkatkan pula efek resistensi berbagai mikroba patogen Mikroba patogen dan virus baru : HIV, Avian Flu Virus Efektivitas daya hambat atau daya bunuh antimikroba sangat tergantung pada jumlah dan kekuatan zat aktif nya
- 3. Pengertian kadar vs potensi Kadar jumlah per satuan berat/volume Potensi ukuran kekuatan /daya hambat atau daya bunuh zat aktif terhadap mikroorganisme tertentu
- 4. Mengapa harus dengan cara mikrobiologi? Respons mikroba terhadap antibiotik berbeda-beda Spesifik Sensitif
- 6. Skema analisis patogen dan metode analisis yang digunakan •ELISA untuk analisis antigen spesifik pada mikroba patogen •Uji senyawa antibiotik untuk penentuan KHM antibiotik terhadap mikroba suspect
- 7. Estimasi dari potensi antibiotik melalui perbandingan langsung antara sampel (antibiotik uji) dengan antibiotik standar yang telah disahkan penggunaannya, terkalibrasi dengan baik, dan umum digunakan sebagai rujukan. Prinsip uji potensi antibiotik berdasarkan Farmakope Indonesia edisi IV 1995
- 8. Tujuan uji Sebagai standar untuk mengatasi keraguan tentang kemungkinan hilangnya aktivitas (potensi) antibiotik terhadap efek daya hambatnya pada mikroba.
- 9. Metode Umum 1. Lempeng (silinder / kertas cakram) 2. Turbidimetri (tabung)
- 10. Metode Lempeng Silinder Difusi antibiotik dari silinder yang dipasang tegak lurus pada lapisan agar padat dalam cawan petri atau lempeng yang berisi biakan mikroba uji pada jumlah tertentu Mikroba dihambat pertumbuhannya
- 11. Hambatan pertumbuhan biakan mikroba dalam larutan serba sama antibiotik, dalam media cair yang dapat menumbuhkan mikroba dengan cepat bila tidak terdapat antibiotik Metode turbidimetri digunakan pada sampel yang sulit larut dalam air, contoh: Gramisidin Metode Turbidimetri
- 13. Cuci bersih sebelum dan sesudah digunakan Sterilkan dengan pemanasan kering atau uap air Peralatan
- 14. Selama inkubasi dalam penetapan pada lempeng dan tabung Metode lempeng ± 0,5°C Metode turbidimetri ± 0,1°C suhu dapat diperoleh dengan sirkulasi udara dan air. Pengendalian Termostatik
- 15. Wadah (1) Metode Lempeng Silinder: 1. Cawan petri kaca atau plastik ukuran 20 x 100 mm 2. Silinder dari besi tahan karat atau porselen diameter luar 8 mm, diameter dalam 6 mm, tinggi 10 mm 3. Bersihkan dengan asam nitrat 2 N bila perlu
- 16. Metode Turbidimetri: 1. Tabung reaksi kaca/plastik ukuran dan ketebalan seragam 2. Tabung Spektrofotometer harus steril dan sesuai 3. Semua residu dihilangkan serta selalu sterilisasi sebelum dan sesudah Wadah (2)
- 17. Media dan Larutan Dapar Media Larutan Dapar Media 1 pH 6,6 Media 2 pH 6,6 Media 3 pH 7,0 Media 5 pH 7,9 Media 8 pH 5,9 Media 9 pH 7,2 Media 10 pH 7,2 Media 11 pH 8,3 Media 13 pH 5,6 Media 19 pH 6,1 Media 32 pH 6,6 Media 34 pH 7,0 Media 35 pH 7,0 Media 36 pH 7,3 Media 39 pH 7,9 Dapar nomor 1 pH 6,0 Dapar nomor 3 pH 8,0 Dapar nomor 4 pH 4,5 Dapar nomor 10 pH 10,5 Dapar nomor 16 pH 7,0 Cat: untuk pelarut lain Air murni Formaldehide encer Injeksi larutan NaCl
- 18. Unit dan Baku Pembanding Potensi Antibiotik
- 19. Adalah antibiotik dimana potensinya yang dinyatakan dalam “unit” atau “µg” aktivitas antibiotik per mg zat kering telah ditetapkan secara nasional (BPFI). “µg” aktivitas dianggap terdiri dari bahan kimia tunggal unit merupakan baku pembanding apabila terdapat lebih dari satu bahan aktif antibiotik dalam suatu obat antibiotik. Definisi
- 20. Penyiapan Baku Larutan persediaan: larutkan sejumlah atau seluruh isi vial baku pembanding antibiotik seperti pada tabel 1 Simpan dalam lemari pendingin dan gunakan dalam waktu yang ditentukan Pada hari penetapan, buat pengenceran dari larutan persediaan (5), umumnya dengan perbandingan 1 : 1,25 untuk lempeng silinder atau lebih kecil pada turbidimetri
- 22. Ampisilin : buat enceran larutan baku pembanding dan larutan uji secara bersamaan Zink Basitrasin : tiap enceran larutan baku harus mengandung asam klorida sejumlah sama dengan larutan uji. Secara umum pengeringan dilakukan pada oven hampa udara 5 mmHg, 60°C, selama 3 jam. Ketentuan
- 23. Penyiapan Contoh Buat larutan serta enceran larutan uji sesuai dengan antibiotik pembanding. Penetapan hanya membutuhkan 1 tingkat dosis uji yang sesuai dengan dosis tengah baku pembanding Dosis uji (U) = Dosis S3
- 24. Mikroba Uji dan Inokula
- 25. Mikroba Uji Mikroba uji untuk masing-masing antibiotik tertera pada Tabel 2, pelihara pada agar miring dan inkubasikan sesuai dengan Tabel 3 Mikroba uji harus merupakan galur murni dan dipindahkan setiap minggu. Pada Klebsiella pneumoniae gunakan biakan tidak berkapsul
- 28. Penyiapan Inokula 1. Inokulasikan biakan segar ke 250 ml media agar dalam tabung Roux, sebarkan secara merata, inkubasikan pada suhu dan waktu tertentu. 2. Larutkan biakan permukaan ke dalam 50 ml larutan NaCl 0,9 % steril. 3. Atur perbandingan hingga inokula mempunyai transmitans 25 % terhadap blangko. 4. Untuk penetapan turbidimetri, optimalkan hubungan antara dosis dan respon. 5. Pada penetapan lempeng silinder, atur larutan suspensi hingga menghasilkan batas daerah hambatan yang memuaskan; yaitu 14 mm-16 mm
- 30. Cara Pengujian: 1. Desain penetapan 2. Metode lempeng silinder 3. Metode Turbidimetri 4. Cara perhitungan
- 31. Desain Penetapan (1) Pada penetapan lempeng silinder, perbandingan pokok dibatasi pada hubungan pengukuran diameter hambatan antar lempeng. Pada penetapan turbidimetri, perbandingan pokok dibatasi pada hubungan antara kekeruhan yang diamati pada tiap rak. Dianjurkan hanya menggunakan satu aras dosis dengan suatu kurva baku dan pengenceran larutan minimal 5 atau lebih
- 32. Penetapan potensi antibiotik secara mikrobiologi dipengaruhi oleh variabel intra dan antar penetapan. Awali dengan penyiapan larutan baku dan uji secara terpisah, dan ulangi pada hari yang berbeda. Jika hasil yang diperoleh berbeda signifikan, lakukan satu atau lebih penetapan tambahan Desain Penetapan (2)
- 33. Metode Turbidimetri 1 ml larutan uji dan larutan baku tiap dosis pada 3 tabung reaksi; buat triplo dan letakkan acak Buat 2 tabung kontrol Tambahkan 9,0 ml inokula ke dalam tiap tabung Letakkan tabung dalam tangas air atau inkubator pada suhu (36- 37,5)°C; selama 2 jam Setelah inkubasi tambahkan 0,5 ml larutan formaldehide encer Ukur transmitans atau serapan pada 530 nm
- 34. Metode Turbidimetri (2) Pada desain penetapan 5 aras dosis: 1. Buat 20 sediaan uji yang sama dengan S3 baku 2. Buat juga pengenceran S3 lain sebagai rujukan uji pertumbuhan 3. Tambahkan 1 ml larutan uji ke dalam 3 tabung dan 1 ml pengencer bebas antibiotik ke dalam 6 tabung 4. Tambahkan 9,0 ml inokula 5. Inkubasi 6. Tambahkan 0,5 ml larutan formaldehide encer 7. Hitung transmitan atau serapan pada 530 nm
- 35. Metode Lempeng Silinder Pada cawan petri dibuat lapisan dasar yang licin Tambahkan 4,0 ml lapisan inokula Jatuhkan 6 buah silinder pada permukaan agar dalam radius 2,8 cm; pada ketinggian 12 mm Isi silinder selang seling dengan dosis tengah baku (S3); buat triplo Inkubasikan pada suhu 32-35°C selama 16-18 jam Ukur diameter hambatan yang terbentuk pada agar
- 37. Desain pengujian Dipilih berdasarkan hasil akhir yang diinginkan, presisi tinggi atau tidak. Desain yang digunakan : 2+2 : yaitu satu baku pembanding dan satu sampel, masing-masing dengan dua tingkat dosis yang diperlakukan dalam satu lempeng (cawan) agar 3+3 : yaitu satu baku pembanding dan satu sampel, masing-masing dengan tiga tingkat dosis yang diperlakukan dalam satu lempeng (cawan) agar 5+1 : yaitu satu baku pembanding dengan 5 tingkat dosis dan satu sampel dengan satu tingkat dosis yang setara dengan dosis menengah (dosis acuan) baku pembanding.
- 38. Desain Pengujian 3+3 Larutan baku pembanding : sejumlah tertentu baku pembanding dilarutkan dalam pelarut yang sesuai sedemikian sehingga diperoleh larutan induk yg setara dgn 1000 IU/mL. Pengenceran dibuat sehingga diperoleh larutan baku dosis rendah, dosis menengah dan dosis tinggi dengan pebandingan yang relatif sama, misalnya 1:2, 2:3 atau 3:4
- 39. Larutan uji : ditimbang sejumlah tertentu sampel, dilarutkan dalam pelarut yang sesuai sehingga diperoleh larutan sampel induk yg setara dengan 1000 IU/mL. Pengenceran dilakukan dengan dosis yang kira-kira sama dengan larutan baku pembanding.
- 40. Masing-masing larutan dimasukkan ke dalam selinder atau serapkan pada kertas cakram sebanyak 100 μL di atas media agar yang telah diinokulasikan mikroba uji. Pre-inkubasi selama 1 jam, lalu inkubasi pada 35-37 ºC selama 18-24 jam. Setelah masa inkubasi, daerah hambat yang terbentuk diukur garis tengahnya.
- 42. Desain pengujian 5+1 Larutan baku pembanding yang dibuat sama dengan desain 3+3, hanya dibuat pengenceran S1, S2, S3, S4 dan S5 dengan tingkat perbandingan 1,25. Dosis tengah ditetapkan dulu, misalnya 10 IU/mL, maka: S2=8,0 IU/mL, S1=6,4 IU/mL, S4=12,5 IU/mL dan S5=15,6 IU/mL
- 43. Larutan uji/sampel dibuat larutan induk dan pengenceran yang sama dengan larutan baku pembanding. Larutan S3 (pembanding dosis tengah) selanjutnya selalu ditempatkan pada setiap media agar yg digunakan, dan ke dalam selinder pencadang atau kertas cakram yg digunakan dimasukkan 100 μL larutan pembanding lainnya (S1, S2, S4, S5) dan larutan uji (U) , masing-masing triplo.
- 44. Masing-masing larutan dimasukkan ke dalam selinder atau serapkan pada kertas cakram sebanyak 100 μL di atas media agar yang telah diinokulasikan mikroba uji. Pre-inkubasi selama 1 jam, lalu inkubasi pada 35-37 ºC selama 18-24 jam. Setelah masa inkubasi, daerah hambat yang terbentuk diukur garis tengahnya.
- 45. Pola letak uji pada desain (5+1) Dosis S3 Dosis lainnya S3 S1 S3 S2 S3 S4 S3 S5 S3 U
- 46. Cara Perhitungan
- 47. Desain pengujian (3+3) Cara perhitungan dengan desain 3+3 terdapat pada Farmakope Indonesia edisi III, tahun 1979 Analisis meliputi : analisis variansi, perhitungan potensi dan batas keyakinan potensi hasil penetapan
- 48. Desain pengujian (5+1) Sebelum menghitung potensi , dilakukan terlebih dahulu koreksi garis tengah rata-rata diameter daerah hambat dosis larutan baku S1, S2, S4 dan S5 Cara :
- 49. Hitung diameter rata-rata S3 di semua cawan (Y3T) Hitung diameter rata-rata S3 pada masing-masing cawan larutan baku S1,2,4 dan 5 (Y31, Y32, Y34 dan Y35) Hitung diameter S1,2,4 dan 5 (Y1, Y2, Y4 dan Y5)
- 50. Maka diameter koreksi masing-masing larutan baku adalah : S1 (a) = Y1 + (Y3T – Y31) S2 (b) = Y2 + (Y3T – Y32) S3 (c) = Y3T S4 (d) = Y4 + (Y3T – Y34) S5 (e) = Y5 + (Y3T – Y35)
- 51. Untuk kurva baku, dihitung diameter dosis terendah dan tertinggi yaitu : YT = (3e + 2d + c – a ) 5 YR = (3a + 2b + c – e ) 5 YR = diameter hambat dosis terendah YT = diameter hambat dosis tertinggi
- 52. Selanjutnya dibuat kurva baku pada kertas semilog : Sumbu X : log dosis Sumbu Y : diameter hambat Hubungkan titik-titik untuk S1 (YR) sampai S5 (YT)
- 53. Sebelum Perhitungan potensi sediaan uji, dilakukan koreksi diameter larutan sampel U: YU koreksi = YS + (YU – Y3U) Y3U = diameter rata-rata S3 pada pengujian larutan U YU = diameter rata-rata U pada cawan larutan U YS = Hasil interpolasi S3 pada kurva baku Cara Perhitungan potensi sampel
- 54. Perhitungan Potensi sampel Potensi sediaan uji ditentukan dengan menginterpolasi YU pada sumbu Y ke garis kurva baku dan tarik garis ke sumbu X (diperoleh XU) Dosis U = XU/S3 x dosis S3 Potensi U = dosis U x faktor pengenceran
- 55. Cara Perhitungan (1) Potensi antibiotik dihitung dengan menggunakan metode garis lurus transformasi log dengan penyesuaian kuadrat terkecil dan uji linearitas. Apabila dilakukan lebih dari satu penetapan potensi dari bahan uji yang sama; maka dapat dirata-ratakan.
- 57. Pencadang