Abstract image of a woman sitting on books and studying on a laptop

Xac dinh vi khuan lau va phat hien gen dot bien khang ciprofloxacin bang ky thuat sinh hoc phan tu

Huy Hoang, profile picture
Huy Hoang

Bệnh lậu, do vi khuẩn Neisseria gonorrhoeae gây ra, là một trong những bệnh lây truyền qua đường tình dục phổ biến, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng và có thể gây ra nhiều biến chứng nếu không được điều trị kịp thời. Tỉ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu, đặc biệt là ciprofloxacin, đang gia tăng tại Việt Nam, yêu cầu cần có những phương pháp chẩn đoán mới hiệu quả hơn. Nghiên cứu nhằm xác định tỷ lệ nhiễm và tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lậu từ năm 2005-2007 sử dụng kỹ thuật PCR là cần thiết để nâng cao khả năng phát hiện và điều trị.

1 of 123
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
1 Đặt vấn đề Bệnh Lậu là một trong những bệnh lây truyền qua đường tình dục (LTQĐTD) phổ biến hiện nay ở nước ta và nhiều nước trên Thế giới. Bệnh không gây tử vong nhưng nếu điều trị không kịp thời, không đúng phác đồ sẽ để lại nhiều biến chứng và di chứng làm ảnh hưởng không những đối với bản thân mà còn đến xã hội, kinh tế, gia đình và giống nòi [6], [9]. Căn nguyên gây bệnh Lậu là vi khuẩn lậu. Đây là song cầu bắt màu Gram (-) có tên khoa học là Neisseria gonorrhoeae, được Neisser mô tả năm 1879. Theo thông báo của WHO, hàng năm trên thế giới có khoảng 333 triệu người bị bệnh LTQĐTD, trong đó có 62 triệu người bị bệnh Lậu. ở khu vực châu á Thái Bình Dương, hàng năm có tới 30 triệu người bị bệnh LTQĐTD, trong đó 5,4 triệu người bị bệnh Lậu. Trong số này, 80% là phụ nữ; 70% người bị bệnh Lậu không có triệu chứng. Điều này dẫn đến mầm bệnh không được phát hiện, làm gia tăng khả năng lây bệnh cho cộng đồng [134], [151]. ở Việt Nam, theo báo cáo của Phòng Chỉ đạo chuyên khoa Viện Da liễu Quốc Gia năm 2007 có 211.476 người bị bệnh LTQĐTD trong đó có 5.491 người bị bệnh Lậu. Vi khuẩn lậu, ngoài gây viêm niệu đạo, âm đạo, còn có khả năng gây viêm kết mạc, hay gặp là viêm kết mạc mắt trẻ sơ sinh, viêm khớp, hội chứng Reiter và những biến chứng ngoài tiết niệu sinh dục. Các kỹ thuật chẩn đoán thông thường như nhuộm soi, nuôi cấy thường không phát hiện được các trường hợp này. Vì vậy, bổ sung phương pháp chẩn đoán mới, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với các phương pháp kinh điển là cần thiết, để đánh giá đúng hơn về tình hình bệnh Lậu hiện nay. Một trong những kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng hiện nay là PCR. Theo thông báo của WHO (2008) về chương trình giám sát kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu ở khu vực châu á Thái Bình Dương năm 2006, đã phân lập 7.954 chủng tại 14 quốc gia. Tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng
2 kháng sinh thuộc nhóm quinolon đang ở mức độ cao: Trung Quốc là 99,6%; Hồng Kông 97,8%; Hàn Quốc 89,4%; Nhật Bản 83,4%; Brunei 81,7%; Philippines 69%; Việt Nam 82,1%... [157]. ở Việt Nam, tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng penicillin có xu hướng giảm dần từ 75,26% (1996) xuống 47,77% (2000), nhưng tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng các kháng sinh nhóm quinolon và đặc biệt là ciprofloxacin có xu hướng gia tăng một cách rõ rệt từ 10,75% (1996) lên 42,67% (2000) [13], [14], [15]. Ciprofloxacin là một kháng sinh mới được đưa vào điều trị bệnh Lậu trong những năm gần đây với một liều uống duy nhất (500 mg) đã điều trị được bệnh Lậu cấp; vì vậy đây là kháng sinh được cả thầy thuốc và bệnh nhân rất ưa chuộng. Chính vì thế, việc lạm dụng kháng sinh này đã dẫn tới tốc độ đề kháng đang tăng nhanh. Người ta lo ngại rằng, nếu không có biện pháp can thiệp hữu hiệu, ciprofloxacin có thể trở thành kháng sinh không có tác dụng đối với vi khuẩn lậu trong thời gian tới. Tuy vậy, cơ chế đề kháng của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin vẫn còn chưa rõ ràng. Với những lý do nêu trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định vi khuẩn lậu và phát hiện đột biến gen kháng ciprofloxacin bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007” Nhằm mục tiêu: 1. Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007. 2. So sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật: PCR, nhuộm soi và nuôi cấy. 3. Tìm hiểu sự kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu phân lập được tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007. 4. Phát hiện đột biến gen liên quan đến kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu.
3 Chương I Tổng quan 1.1. bệnh lậu 1.1.1. Lịch sử Bệnh Lậu là một trong những bệnh được loài người biết đến sớm nhất và đã được người Ai Cập cổ đại mô tả từ năm 1550 trước công nguyên [5]. Có nhiều bài tổng quan về lịch sử bệnh Lậu, một trong những bài tổng quan xuất sắc là chuyên khảo của R.S. Morton [104]. Bệnh Lậu được biết tới từ rất lâu và đã được cảnh báo về sự lây truyền qua tiếp xúc với người nhiễm bệnh. Sách "The Book of Leviticus" mô tả: người bị tiết dịch niệu đạo phải tự tránh xa bạn tình trong 7 ngày, điều này cho thấy họ đã biết khả năng lây bệnh trong những ngày này là rất lớn. Vào thế kỷ thứ IV và V trước Công nguyên, Hippocrates đã viết rất nhiều về bệnh Lậu. Ông gọi bệnh Lậu cấp là “chứng đái són đau” (strangury) và hiểu rằng bệnh là kết quả “khoái lạc của Thần Vệ nữ” (the pleasures of Vernus) [84]. Celsus, một thầy thuốc La Mã, có những hiểu biết sâu rộng về bệnh Lậu, các biến chứng của nó và ông cũng biết cách "thông tiểu" (catheterize) cho bệnh nhân bị hẹp niệu đạo. Vào thế kỷ thứ II, Galen (năm 130 sau Công nguyên) đã đặt ra từ gonorrhea, hàm ý là “dòng chảy của tinh dịch” (flow of semen). Các thầy thuốc Hy Lạp-La Mã khác đã mô tả các cách khác nhau để điều trị bệnh Lậu, bao gồm kiêng quan hệ tình dục đối với người lớn và rửa mắt đối với trẻ sơ sinh. ở châu Âu, những hiểu biết về bệnh Lậu và các bệnh LTQĐTD khác còn rất ít cho tới cuối thời kỳ Trung cổ. Thuật ngữ "clap" lần đầu tiên xuất hiện trên các ấn phẩm vào năm 1378. Thuật ngữ này thường được dùng để chỉ bệnh Lậu, tuy chưa biết rõ về nguồn gốc của từ "clap" nhưng có thể đây là từ ám chỉ quận Les Clapier thuộc Paris, nơi trú ngụ của gái mại dâm thời Trung
4 cổ. Có thể có những nguồn gốc khác của thuật ngữ "clap", nhưng cho dù có nguồn gốc là gì đi nữa thì trong các tài liệu của châu Âu vào cuối thời Trung cổ, người ta đều biết rõ bệnh có liên quan tới quan hệ tình dục. Sau khi bệnh Giang mai lan tới châu Âu vào cuối thế kỷ XV, có sự nhầm lẫn đáng kể về mối liên quan giữa bệnh Lậu và bệnh Giang mai. Các nhà phẫu thuật lớn như Ambroise Paré (thế kỷ XVI) và John Hunter (thế kỷ XVIII) coi bệnh Giang mai và bệnh Lậu là những biểu hiện khác nhau của cùng một bệnh. Kết luận của Hunter là kết quả của một thí nghiệm nổi tiếng, ông tiêm cho chính mình chất lấy từ một bệnh nhân bị bệnh Lậu. Hậu quả là ông bị bệnh giang mai vì bệnh nhân này mắc cả bệnh Lậu và bệnh Giang mai [55]. Trong suốt thế kỷ thứ XIX vấn đề này vẫn không được giải quyết. Cho tới khi nhà hoa liễu học người Pháp, Philippe Ricord (1799 - 1889), phân biệt được hai bệnh này bằng một loạt các thực nghiệm [42]. Hiểu biết thực sự về căn nguyên gây bệnh Lậu chỉ đạt được sau mô tả của Neisser (1855 - 1916) về Neisseria gonorrhoeae vào năm 1879 và nuôi cấy được vi khuẩn lần đầu tiên trên môi trường nhân tạo của Leistikow và Loeffler vào năm 1882. Năm 1962, môi trường Thayer-Martin ra đời đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc chẩn đoán bệnh Lậu và làm tăng tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu bằng nuôi cấy [124]. Từ giữa những năm 1960, những hiểu biết về cấu trúc phân tử của vi khuẩn lậu, vật chủ và dịch tễ học bệnh Lậu đã tăng lên đáng kể nhờ những tiến bộ vượt bậc của khoa học-công nghệ. 1.1.2. Tình hình bệnh Lậu trên thế giới - Theo thống kê của WHO, hàng năm trên thế giới có hơn 60 triệu người bị bệnh Lậu. Riêng ở Mỹ hàng năm, có khoảng 2 triệu người mới mắc, tỷ lệ phụ nữ có thai nhiễm vi khuẩn lậu là 6%. ở London (Anh), theo dõi 516 thai phụ, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là 0,4% [67], [103], [134].
5 - ở châu Phi, tỷ lệ viêm kết mạc mắt ở trẻ sơ sinh do vi khuẩn lậu là 5-10/1000 trẻ sơ sinh sống, trong khi đó ở Mỹ, tỷ lệ này là 0,1-0,6/1000 [151]. - Matsumoto (2008) cho biết, tại Nhật Bản: tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis tăng trên toàn thế giới, trong khi đó tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu lại giảm, trừ những nước thuộc châu á [99]. Khi nghiên cứu về tình hình bệnh Lậu trên thế giới tôi nhận thấy: bệnh Lậu có xu hướng giảm đi ở các nước phát triển và các nước đang phát triển thì không. 1.1.3. Tình hình bệnh Lậu ở Việt Nam Sau ngày giải phóng miền Nam, bệnh hoa liễu nói chung và bệnh Lậu nói riêng lan tràn khắp nơi. Năm 1977, phòng khám khoa Da liễu bệnh viện Bạch Mai điều trị cho 276 người bị lậu. Theo thống kê của ngành Da liễu từ năm 1999 đến năm 2007 số bệnh nhân bị bệnh Lậu mỗi năm là: Năm 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Số bệnh nhân 6.747 6.375 5.581 5.699 6.740 6.409 5.233 5.526 5.491 Về tình hình bệnh Lậu ở Việt Nam, tôi nhận thấy số lượng bệnh nhân mắc bệnh Lậu hầu như không giảm trong khoảng mười năm qua. Có những lúc bệnh Lậu tưởng chừng đã giảm nhưng lại tăng ngay trong những năm tiếp theo, ví dụ: năm 2001 số bệnh nhân mắc bệnh Lậu là 5.581 người nhưng lại tăng ngay sau năm 2003 lên 6.740 người. Tình hình bệnh Lậu mắt ở trẻ sơ sinh: Năm 1996 1998 2000 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Số bệnh nhân 140 66 21 22 18 10 04 13 13 Theo dõi về tình hình bệnh Lậu mắt ở trẻ sơ sinh trong khoảng hơn mười năm qua cho thấy: nhìn chung số lượng bệnh nhân có giảm. Điều này nói lên công tác tuyên truyền về giáo dục y tế và sức khỏe sinh sản những năm gần đây có tiến bộ. Nhưng số liệu này có thể chưa phản ánh đúng thực tế vì chỉ do ngành Da liễu cung cấp, cần có thêm số liệu của Viện Mắt, bệnh
6 viện Phụ Sản và các trung tâm khám chữa bệnh tư nhân. 1.2. vi khuẩn lậu Vi khuẩn lậu, Neisseria gonorrhoeae, thuộc họ Neisseriaceae, giống Neisseria. Trong giống Neisseria, có loài gây bệnh, có loài hoại sinh, chúng khác biệt nhau về một số tính chất sinh vật hoá học (lên men đường glucose, không sinh hơi). Dựa vào tính chất này, người ta phân biệt vi khuẩn lậu với một số Neisseria hoại sinh khác [28]. 1.2.1. Hình thể của vi khuẩn lậu Trên tiêu bản lấy mủ từ bệnh nhân bị bệnh Lậu và nhuộm Gram, vi khuẩn lậu là những cầu khuẩn, hình hạt cà phê, đứng thành đôi, hai mặt dẹt quay vào nhau, bắt mầu Gram (-), có kích thước 0,6 µm x 0,8 µm, khoảng cách giữa hai cầu khuẩn bằng 1/5 chiều rộng. Khi ở trong tế bào bạch cầu đa nhân trung tính, vi khuẩn lậu là loại vi khuẩn độc chiếm tế bào (có nó thì không có loại vi khuẩn nào sống trong tế bào). Người ta có thể gặp một cặp, hai cặp, bốn cặp hoặc nhiều hơn nữa, có khi xếp lèn chặt trong lòng tế bào bạch cầu đa nhân trung tính. Vi khuẩn lậu không sinh nha bào, không có lông, không có tiêm mao (fibria), một số chủng có pili. Hình thể, tính chất bắt mầu, vị trí nằm trong lòng bạch cầu đa nhân trung tính của vi khuẩn lậu có giá trị lớn trong chẩn đoán xác định bệnh Lậu khi kết hợp với tiền sử bệnh nhân và triệu chứng lâm sàng [4], [28]. 1.2.2. Một số đặc điểm về siêu cấu trúc của vi khuẩn lậu - Cấu trúc màng Khi quan sát vi khuẩn lậu cắt ngang dưới kính hiển vi điện tử dẫn truyền (Transmission electron microscopy - TEM), người ta thấy có một màng ngoài điển hình của vi khuẩn Gram (-) phủ lên lớp peptidoglycan tương đối mỏng và màng tế bào chất. Não mô cầu chứa một vỏ polysaccharid thực, rất quan trọng đối với độc tính, trong khi vi khuẩn lậu không có cấu trúc này.
7 Thông thường, có thể nhìn thấy các bọng hoặc các bướu nhỏ ở màng ngoài qua kính hiển vi điện tử dẫn truyền. Không giống Escherichia coli và nhiều vi khuẩn đường ruột khác, vi khuẩn lậu thường giải phóng các mảnh vỡ của màng vào môi trường xung quanh và các mảnh kháng nguyên gắn vào kháng thể vật chủ [35], [56]. - Pili Những phần quan trọng nhất của vi khuẩn lậu trong bệnh nguyên có liên quan tới các phân tử bề mặt bao gồm sự bám dính, xâm nhập hay gây tổn thương vật chủ hoặc liên quan tới cơ chế tạo miễn dịch của vật chủ. Một trong số các phân tử bề mặt được nghiên cứu kỹ nhất là pili. Nhìn dưới kính hiển vi điện tử, pili xếp thành từng sợi hoặc tập hợp sợi và hầu như che phủ toàn bộ bề mặt tế bào bên ngoài vi khuẩn. Thực tế, pili là các polymer được tạo nên bởi hàng nghìn cấu trúc dưới mức phân tử, kích thước khoảng 18 kDa [35]. Hiện nay, người ta biết nhiều về cấu trúc dưới phân tử của pili, khi đánh giá bằng nghiên cứu cấu trúc tinh thể [56]. Pili làm tăng sự bám dính vào các mô của vật chủ. Cơ chế bám dính: hai cấu trúc bám dính quan trọng đã được chứng minh là pili và Opa. Pili của vi khuẩn lậu gắn tốt hơn vào tế bào biểu mô hình trụ của người so với tế bào sừng và gắn tốt hơn vào tế bào của người so với tế bào không phải của người. Pili biểu hiện khả năng gắn chọn lọc với những tế bào đặc biệt trong những điều kiện nhất định [88]. Các kháng thể kháng pili làm giảm sự bám dính của vi khuẩn lậu vào tế bào biểu mô. Sự thay đổi kháng nguyên của cả pili và Opa có thể là ưu điểm sinh học không chỉ đối với việc thoát khỏi các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu mà còn cung cấp những cấu trúc bám dính đặc hiệu để gắn với những vị trí khác nhau in vivo. Gần đây, protein tế bào CD66 được xác định là thụ thể tế bào chủ đối với Opa [145], [146]. - Lipo Oligo Saccharid (LOS) Tất cả vi khuẩn lậu đều có LOS trên bề mặt tế bào, tương tự
8 lipopolysacharid (LPS) của các vi khuẩn Gram (-) khác. LOS của vi khuẩn lậu chứa một nửa là lipid A và một nửa là polysacharid lõi gồm ketodeoxy octanoic acid (KDO), heptose, glucose, galactose và glucosamin hoặc galactosamin. Như vậy LOS của vi khuẩn lậu rõ ràng nhỏ hơn LPS điển hình của các vi khuẩn Gram (-) khác. Những đường cốt lõi của LOS tạo nên kháng nguyên của vi khuẩn, do vậy nó có vai trò quan trọng đối với phản ứng miễn dịch diệt khuẩn. Những kiểu hình khác nhau của cấu trúc kháng nguyên có vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của vi khuẩn. Quả thực, nhiều chứng cứ cho rằng, vi khuẩn lậu với LOS "ngắn" thì nhạy cảm với huyết thanh nhưng lại có thể xâm nhập tế bào chủ. Những vi khuẩn lậu với những LOS "dài" thì đề kháng huyết thanh và không xâm nhập được [62], [63]. 1.2.3. Tính chất nuôi cấy Vi khuẩn lậu khó nuôi cấy, khi ra khỏi cơ thể, chúng dễ chết. Sức đề kháng của vi khuẩn lậu rất kém, dễ bị bất hoạt khi ở điều kiện ngoại cảnh. Chúng ký sinh bắt buộc ở vật chủ duy nhất là người, vi khuẩn chết rất nhanh ở 550 C, chỉ sau 5 phút. Trong điều kiện khô và giàu oxy, vi khuẩn lậu chết sau 1-2 giờ. Với các dung dịch sát khuẩn phenol 1%, formol 0,1%, sublime 0,1%, vi khuẩn chết sau 1-5 phút tiếp xúc [4]. Nuôi cấy vi khuẩn lậu trên môi trường chọn lọc Thayer-Martin có chất tăng sinh Isovitalex và chất ức chế V-C-N. Chất tăng sinh (Isovitalex) gồm rất nhiều các axít amin, để kích thích sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, chất ức chế Vancomycin-Colistin-Nystatin (V-C-N) để ức chế các cầu khuẩn Gram(+), trực khuẩn Gram(-) và nấm nhưng không làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lậu. Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp là 35-360 C, độ ẩm > 70%, khí trường CO2 từ 3-10%, pH 7,3. Sau 24 giờ nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc 0,5-1 mm, tròn, lồi, bờ khuẩn lạc đều, nhầy và có màu hơi xám, óng ánh như giọt sương.
9 Sau 48 giờ nuôi cấy, vi khuẩn lậu tự dung giải nhanh chóng, thông thường khuẩn lạc to ra; khi nhuộm Gram, người ta thấy những song cầu khuẩn phình to hơn. Nếu để 48-72 giờ, khuẩn lạc có kích thước tới 3 mm. 1.2.4. Tính chất sinh vật hóa học - Test Oxidase: dương tính - Test Neisseria 4H: dương tính với glucose 1.2.5. Định týp vi khuẩn Để nghiên cứu dịch tễ học, cần phải định týp vi khuẩn. Có nhiều kỹ thuật đã được triển khai và áp dụng thành công cho mục đích này. - Týp dinh dưỡng Một hệ thống tương đối phức tạp để phân biệt các chủng vi khuẩn lậu dựa vào khả năng phát triển trên môi trường xác định đã được phát triển. Ban đầu, hệ thống này được B.W. Catlin triển khai và phân loại dựa vào khả năng vi khuẩn có thể phát triển được trong môi trường không có một số acid amin, purin hoặc pyrimidin, hay các chất dinh dưỡng đặc trưng khác [36]. Một chủng không mọc trên môi trường dinh dưỡng nếu không có prolin được gọi là Pro- và một chủng không mọc trong môi trường dinh dưỡng nếu không có arginin được gọi là Arg- . Vi khuẩn lậu phân lập từ người bệnh biểu hiện tính đa dạng rõ rệt về khả năng sinh tổng hợp, có thể phản ánh môi trường giầu dinh dưỡng của vật chủ, cung cấp cho vi khuẩn phần lớn các hợp chất cần thiết cho sự phát triển của chúng. Týp dinh dưỡng thường liên quan tới nhiều đặc tính khác nhau như xu hướng gây nhiễm trùng niệu đạo nam không triệu chứng, tăng khả năng gây nhiễm khuẩn huyết và các đặc tính khác [48]. Do sự phức tạp của một hệ thống môi trường với từng hóa chất riêng biệt và thời gian bảo quản ngắn, kỹ thuật định týp dinh dưỡng thường không được áp dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm lâm sàng.
10 - Týp huyết thanh Các nhà nghiên cứu đã cố gắng phát triển một hệ thống định týp huyết thanh trong nhiều thập kỷ. Hiện tại, kỹ thuật đang được dùng phổ biến nhất cho mục đích này là dựa vào kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các epitope khác nhau trên protein P.I hoặc Por của màng ngoài (outer membrane) [85]. Por xuất hiện trong 2 nhóm huyết thanh khác nhau về hóa miễn dịch: PorA và PorB. Dùng một bộ kháng thể đơn dòng kháng PorA và một bộ khác kháng PorB. Có thể phân nhỏ mỗi nhóm huyết thanh thành một loạt các serovar khác nhau (ví dụ P.IA-6, P.IA-1); chúng khác nhau về khả năng phản ứng với những thành phần nhất định của một bộ (panel) kháng thể đơn dòng. Hàng loạt serovar đặc hiệu đã được xác định bằng kỹ thuật này [85]. - Xác định kiểu gen Việc định týp vi khuẩn có thể dựa vào xác định ADN trên cơ sở những khác biệt rõ rệt trong cấu trúc ADN giữa các chủng. Sẽ không thực tế nếu muốn lập bản đồ toàn bộ bộ gen, hoặc xác định trình tự một hay một vài gen, song có thể dùng kỹ thuật sinh học phân tử để đánh giá nhanh sự khác biệt trong trình tự ADN. Kỹ thuật đầu tiên là dùng enzyme giới hạn endonuclease, dựa vào phân tích kiểu cách các băng ADN trên gel agarose [51], [112]. Một kỹ thuật khác được gọi là PCR (polymerase chain reaction), ở đây các đoạn mồi (ADN) ngắn được dùng để gắn vào vị trí đặc hiệu để tạo thành sản phẩm ADN trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase. Có lẽ được sử dụng nhiều nhất cho mục đích dịch tễ là kỹ thuật định týp Opa: dùng đoạn mồi PCR cho Opa để tạo ADN từ mỗi gen của khoảng 11 gen Opa. Những đoạn ADN này sau đó được cắt bởi enzyme giới hạn và kết quả của kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP) được dùng để so sánh các chủng. Phối hợp với những hệ thống định týp khác, xác định kiểu gen đã góp phần giải quyết hiệu quả việc định týp vi khuẩn [113].
11 1.2.6. Hệ thống di truyền Có hai hệ thống chủ yếu để tiến hành phân tích chất liệu di truyền của vi khuẩn lậu là biến nạp và tiếp hợp (transformation and conjugation). Người ta chưa tìm thấy phage và vai trò lớn của transposon đối với sự đề kháng ở vi khuẩn lậu. Đến nay, có những transposon gây những biến đổi trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn lậu. Vì vậy, Seifertso và cộng sự đã triển khai một hệ thống đột biến gen "con thoi" rất hữu ích cho nghiên cứu di truyền, trong đó gen chloramphenicol acetyltransferase (cat) (hoặc một gen kháng kháng sinh khác) thế chỗ β-lactamase (penicilinase) trên transposon Tn3 [122]. Các hệ thống đột biến gen "con thoi" tạo ra những đột biến ở một đoạn trên ADN của vi khuẩn lậu được nhân bản ở E. coli và dùng hệ thống này chuyển ADN đã được nhân bản có chứa đột biến quay trở lại nhiễm sắc thể vi khuẩn lậu bằng biến nạp, nhưng những thử nghiệm này đòi hỏi phải nhân bản đoạn gen quan tâm ở vật chủ E. coli trước. 1.2.7. Plasmid - Plasmid là một thành phần mang các thông tin di truyền ngoài nhiễm sắc thể (NST). Tương tự ADN, NST, plasmid là những phân tử ADN xoắn kép dạng vòng khép kín, có khả năng tự sao chép, với kích thước thay đổi từ 1,5-400 Kb, kích thước các plasmid thay đổi đáng kể nhưng luôn nhỏ hơn nhiều so với NST. Plasmid được coi như yếu tố cộng sinh của vi khuẩn. Nhìn chung, các plasmid mang những gen không thiết yếu cho sự sống của tế bào chủ, trong khi NST mang tất cả các gen này, vì thế khi mất các plasmid, các tế bào chủ vẫn có thể sống. Một số plasmid nhỏ, ẩn, kín, cuộn chặt, có thể tích hợp vào NST. - Các plasmid được chia thành 2 nhóm chính: + Các plasmid tiếp hợp (tự truyền): là những plasmid lớn (60-120 Kb), ví dụ các R-factor, F-factor. Plasmid tiếp hợp mang bộ gen tra (transfer gene) tạo ra bộ máy tiếp hợp, giúp cho việc truyền các gen của plasmid từ vi khuẩn
12 này sang vi khuẩn khác (có thể cùng loài hoặc khác loài) khi chúng tiếp xúc trực tiếp với nhau. + Các plasmid không tiếp hợp (không tự truyền) là những plasmid nhỏ (1,5-15Kb), ví dụ plasmid mang một số gen sinh bacteriocin, một số quyết định đề kháng. Các plasmid không tiếp hợp không có khả năng tự truyền (do không có bộ gen tra). Tuy nhiên, chúng có thể được dẫn truyền (mobilisation) nếu trong cấu trúc có hai vùng mob và nic-bom. Gen mob (mobilisation) tạo ra một protein gọi là protein dẫn truyền; nic-bom (nic=nicking, bom=basis of mobilisation) là nơi tạo ra điểm gãy trên sợi ADN giúp nó gắn vào một plasmid tự truyền tra+ hay F-plasmid cùng nằm trong nguyên tương của tế bào vi khuẩn. Một số plasmid nhỏ khác không có gen tra (tra- ), cũng không có gen mob (mob- ) có thể hoà nhập vào một plasmid tự truyền nào đó, hình thành nên một plasmid hợp nhất tra+ , do đó các gen của plasmid tra- mob- lại có thể được truyền sang vi khuẩn khác qua tiếp hợp. - Mỗi loại plasmid được duy trì số lượng bản sao (copy number) đặc trưng so với NST của một loài vi khuẩn nhất định và luôn ổn định qua các thế hệ. Các plasmid lớn thường có từ 1-4 bản sao, trái lại các plasmid nhỏ thường có số lượng bản sao lớn hơn (10-20 bản sao). - Vi khuẩn lậu chứa một plasmid tự truyền (tiếp hợp), có trọng lượng phân tử 36 kb. Các dẫn xuất lớn hơn một chút của plasmid 36 kb đã được phân lập, có chứa transposon tetM kháng tetracyclin [102]. Nhiều plasmid mang gen kháng β-lactamase (kháng penicilin) khác nhau của vi khuẩn lậu đã được phân lập và xác định đặc điểm. Hai plasmid hay gặp nhất là loại có kích cỡ khoảng 5,3 hoặc 7,2 kb. Phần lớn vi khuẩn lậu chứa một plasmid 4,2 kb (cryptic plasmid) nhưng chưa rõ chức năng. ADN của plasmid này đã được giải trình tự hoàn toàn. Đôi khi có thể phân lập được vi khuẩn lậu không chứa plasmid 4,2 kb sao chép tự do này nhưng chúng vẫn có vẻ bình thường về các đặc tính sinh học [111].
13 Plasmid có khả năng tự nhân lên, nên trong một vi khuẩn sẽ có rất nhiều những bản sao, do đó nếu chọn primer nhằm khuếch đại một đoạn gen nào trên plasmid thì độ nhạy sẽ cao hơn khi đoạn gen đó nằm trên nhiễm sắc thể. Tuy nhiên sẽ bỏ sót những chủng vi khuẩn lậu không có plasmid. Nhưng những chủng vi khuẩn lậu không có plasmid chỉ chiếm một tỉ lệ rất nhỏ và chỉ có ở một số nơi trên thế giới. Nên trong nghiên cứu này đã chọn primer HO1 và HO3 của hãng Invitrogen, Tokyo, Nhật Bản nhằm vào gen cppB trên plasmid pJD1 mà gen cppB lại rất ổn định trên plasmid pJD1. Các tác giả khác trên thế giới khi nghiên cứu về plasmid pJD1 này đã khảng định rằng có tới trên 96% số chủng vi khuẩn lậu chứa plasmid pJD1 [70], [136]. 1.2.8. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn lậu - ở người lớn Vi khuẩn lậu có một vật chủ duy nhất là người. Bệnh liên quan chặt chẽ với hoạt động tình dục. Vi khuẩn lậu gây viêm niệu đạo cho cả nam và nữ. Triệu chứng điển hình là đái mủ, đái khó, chảy mủ niệu đạo. Nhưng cũng có khoảng 1/5 số người không có triệu chứng điển hình [30], [54], [77]. ở phụ nữ, triệu chứng phức tạp hơn bao gồm: tiết dịch niệu đạo, âm đạo. Vị trí bị bệnh của phụ nữ thường ở niệu đạo, cổ tử cung, tuyến Skène, tuyến Bartholin, có khi tới cả tử cung, vòi trứng, buồng trứng [71], [97]. Viêm trực tràng thường gặp ở những người đồng tính luyến ái nam. Triệu trứng viêm trực tràng do vi khuẩn lậu thường không điển hình. Nhiễm vi khuẩn lậu ở họng thường gặp ở bệnh nhân đồng tính luyến ái nam và quan hệ đường miệng [31], [32]. - ở trẻ em Thường biểu hiện bệnh ở mắt do lây vi khuẩn lậu từ mẹ trong thời kỳ sinh con, phổ biến nhất là chảy mủ kết mạc sau đẻ 1-7 ngày. Nếu không được điều trị kịp thời, có thể dẫn tới mù loà. Có thể gặp viêm âm hộ, âm đạo, niệu
14 đạo do vi khuẩn lậu ở các bé gái do dùng chung khăn và chậu với bố mẹ bị bệnh Lậu vì sức đề kháng của trẻ em còn thấp nên khi tiếp xúc với những vật dùng có nhiễm vi khuẩn lậu sẽ dễ bị lây. - Nhiễm trùng lan tỏa Bệnh thường gặp ở những người bị bệnh Lậu nhưng không được điều trị kịp thời, đúng phác đồ. Hầu hết nhiễm vi khuẩn lậu lan toả xảy ra ở phụ nữ. Biểu hiện của bệnh như: viêm khớp, viêm gan, viêm cơ tim, viêm nội tâm mạc, viêm màng não, nhiễm vi khuẩn lậu trên da [5]. - Xâm nhập Nghiên cứu mảnh sinh thiết từ bệnh nhân bị bệnh Lậu cho thấy, vi khuẩn lậu chui một phần vào trong bề mặt tế bào. Cũng có thể thấy vi khuẩn lậu trong các tế bào biểu mô, đôi khi bị bao quanh bởi màng tế bào. Shaw và Falkow đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy liên tục một tế bào ung thư biểu mô nội mạc tử cung của người để nghiên cứu những biến cố ảnh hưởng đến sự xâm nhập của vi khuẩn lậu trên in vitro và thấy rằng, sự xâm nhập tăng lên khi vi khuẩn lậu được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung sắt [123]. Nghiên cứu trên ống dẫn trứng của người trong nuôi cấy nội tạng đã góp phần đáng kể vào việc tìm hiểu cơ chế của sự bám dính và xâm nhập. Vi khuẩn lậu bám dính chọn lọc vào tế bào tiết nhày không có nhung mao của ống dẫn trứng và dần dần được nhấn chìm vào tế bào biểu mô theo cơ chế ẩm bào. Vi khuẩn lậu nhân lên và phân chia trong tế bào, mặc dù chúng không xâm nhập giữa các tế bào [100]. Cuối cùng, một số vi khuẩn lậu đi ra từ bề mặt đáy của tế bào nhờ một quá trình gọi là xuất bào ra khỏi tế bào (exocytosis) [101]. Khi đã ở trong tế bào biểu mô, vi khuẩn lậu không bị tấn công của kháng thể, bổ thể, bạch cầu trung tính; khả năng sống sót ở một mức độ nhất định trong tế bào biểu mô cho thấy có thể xem chúng như "những vật ký sinh nội bào tùy ý" (facultative intracellular parasites).
15 - Các hệ thống mô hình thực nghiệm Các nghiên cứu về sự phát sinh bệnh trở nên phức tạp bởi không có mô hình động vật phù hợp. Nhiều mô hình động vật khác nhau đã được triển khai, mỗi mô hình đều có ứng dụng nhất định, nhưng không có mô hình động vật nào tái tạo đầy đủ hình ảnh bệnh mắc phải tự nhiên ở người. Người ta đã thu được những bằng chứng đáng kể về sự thay đổi kháng nguyên và các tương tác với bạch cầu trung tính khi chủng dưới da ở chuột lang hoặc các động vật khác. Tế bào nuôi cấy cũng là một cách để nghiên cứu sự bám dính và xâm nhập. Mô hình tốt nhất cho nhiều nghiên cứu in vitro là nuôi cấy mô của người, nhất là hệ thống ống dẫn trứng đã được McGee và cộng sự sử dụng thành công [100]. 1.2.9. Chẩn đoán phòng xét nghiệm 1.2.9.1. Kỹ thuật nhuộm soi: lấy mủ hoặc dịch tiết của bệnh nhân, dàn tiêu bản, nhuộm Gram, để khô, soi kính hiển vi và nhận định kết quả. - Ưu điểm: đơn giản, cho kết quả nhanh chỉ sau 15-20 phút, không cần nhiều trang thiết bị hiện đại, đắt tiền. - Nhược điểm: dễ nhầm với các loài thuộc họ Neisseriaceae khác; độ nhạy và độ đặc hiệu thấp; ít có giá trị chẩn đoán trong những trường hợp lậu mạn tính và những biến trứng ngoài tiết niệu sinh dục; gây phiền hà cho bệnh nhân (phải cởi quần để bộc lộ bộ phận sinh dục). - ứng dụng hiện tại: là một kỹ thuật được áp dụng rộng rãi khắp cho các tuyến cơ sở, nơi không có điều kiện nuôi cấy hoặc không co điều kiện áp dụng được các kỹ thuật chẩn đoán hiện đại khác. 1.2.9.2. Kỹ thuật nuôi cấy: lấy mủ hoặc dịch tiết của bệnh nhân, cấy trên môi trường thạch Thayer-Martin với nhiệt độ 36-370 C, nồng độ CO2 3-10%, độ ẩm > 70%, để 18-24 giờ thực hiện các kỹ thuật xác định vi khuẩn lậu. - Ưu điểm: cho kết quả chính xác; là một trong những tiêu chuẩn để chẩn đoán và xác định bệnh Lậu; cho biết sự kháng kháng sinh của vi khuẩn
16 lậu, từ đó có thể có biện pháp can thiệp hữu hiệu trong những trường hợp vi khuẩn lậu đa kháng thuốc. - Nhược điểm: chậm có kết quả, phải cần ít nhất 72 giờ để phân lập vi khuẩn; gây phiền hà cho bệnh nhân; cần có nhiều trang thiết bị hiện đại, nhiều sinh phẩm và hóa chất đắt tiền. - ứng dụng hiện tại: là kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đối cao, được áp dụng cho tuyến tỉnh và trung ương. 1.2.9.3. Chẩn đoán huyết thanh Các xét nghiệm huyết thanh được triển khai để phát hiện kháng thể kháng N. gonorrhoeae hoặc các thành phần của nó thông qua phản ứng kết hợp bổ thể, tủa miễn dịch, tiêu vi khuẩn, miễn dịch huỳnh quang, ngưng kết hồng cầu, ngưng kết mủ, hấp phụ miễn dịch liên quan tới enzyme và các kỹ thuật khác. Nhiều phương pháp được xác nhận là có giá trị trong các nghiên cứu đáp ứng miễn dịch và bệnh sinh của bệnh Lậu. Tuy nhiên, phần lớn các xét nghiệm chẩn đoán huyết thanh được báo cáo có độ nhạy khoảng 70% và độ đặc hiệu khoảng 80% đối với bệnh nhân lậu không biến chứng và do đó không có giá trị trong sàng lọc, xét nghiệm, hoặc chẩn đoán [72]. - Ưu điểm: thực hiện một lúc số lượng lớn các xét nghiệm; kết quả nhanh. - Nhược điểm: cần nhiều thiết bị và sinh phẩm đắt tiền, tốn kém cho bệnh nhân; độ nhạy và độ đặc hiệu không cao. - ứng dụng hiện tại: ít được ứng dụng trong thực tế, thường được áp dụng trong các phòng nghiên cứu. 1.2.9.4. Một số kỹ thuật sinh học phân tử thường dùng * PCR Năm 1985, nhà khoa học người Mỹ, Kary B. Mullis đã phát triển “phản ứng chuỗi polymerase’’ (Polymerase Chain Reaction - PCR). Kỹ thuật này cho phép nhân bất kỳ một đoạn vật liệu di truyền nào (ADN hoặc ARN) lên
17 hàng tỉ lần trong một thời gian ngắn [50], [52], [64], [79], [83], [115], [126]. Nguyên lý của phản ứng PCR hoàn toàn dựa theo sự sao chép của ADN trong tế bào, trong đó, ADN được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn. Từ một phân tử ADN chuỗi kép ban đầu, chúng được tách ra làm hai chuỗi đơn, mỗi chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp sợi ADN mới. Kỹ thuật PCR được thực hiện với một cặp mồi đặc hiệu, mồi này có khả năng bắt cặp, bổ sung vào hai đầu của hai sợi ADN khuôn theo chiều 5’ đến 3’ dưới tác dụng của enzym Taq ADN polymerase. Đoạn mồi sẽ được kéo dài về phía đầu 3’ của mồi để hình thành mạch ADN mới với các nucleotide bổ sung với các nuclotide trên sợi ADN khuôn. Qua mỗi chu kỳ nhiệt, số lượng đoạn ADN cần tổng hợp sẽ tăng gấp đôi. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ 940 -950 C, đoạn ADN duỗi xoắn và tách hoàn toàn thành hai sợi đơn. - Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ được hạ xuống 500 -650 C các nucleotide trên mỗi đoạn mồi xuôi và mồi ngược sẽ gắn theo nguyên tắc bổ sung với các nucleotide ở hai đầu (trên hai sợi) của đoạn gen cần tổng hợp. - Giai đoạn kéo dài mồi: nhờ hoạt động của enzyme Taq ADN polymerase, các dNTPs được gắn vào đầu 3’ của đoạn mồi theo trình tự và bổ sung với các nucleotide trên sợi ADN khuôn mẫu. Giai đoạn này được thực hiện ở 720 C. * Tách, tạo dòng gen Mục đích của việc tạo dòng là nhằm thu được một lượng lớn bản sao của một trình tự ADN xác định. Chính xác hơn, tạo dòng chính là chọn lọc trong một thư viện gen, dòng vi khuẩn tái tổ hợp cần tìm, tức là tập hợp ADN cùng bắt nguồn từ một tế bào vi khuẩn ban đầu có mang vector tái tổ hợp cần tìm. * Giải trình tự gen Trong thuật ngữ di truyền học, xác định trình tự ADN là quá trình xác định thứ tự nucleotide của một đoạn ADN. Hiện nay, hầu hết mọi xác định
18 trình tự ADN đều sử dụng phương pháp phân tích trình tự (sequencing) được phát triển bởi Frederick Sanger. Kỹ thuật này dùng phân tách trình tự cụ thể của một phản ứng tổng hợp ADN trong ống nghiệm dùng nucleotide đã được chỉnh sửa. Ưu điểm của kỹ thuật sinh học phân tử: - Thực hiện được một số lượng lớn xét nghiệm cùng lúc. - Kết quả nhanh, chính xác. Có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao. - Không gây phiền hà cho bệnh nhân (có thể lấy nước tiểu, dịch...mà bệnh nhân không cần đến bệnh viện có thể gửi mẫu bệnh phẩm qua các dịch vụ y tế) Nhược điểm của kỹ thuật sinh học phân tử: - Kỹ thuật viên phải có trình độ khoa học kỹ thuật cao. - Chi phí cho sinh phẩm, hóa chất và máy móc cao, trong quá trình thao tác dễ nhiễm tạp, gây dương tính giả. - Giá thành xét nghiệm cao. - Không biết sự có mặt của căn nguyên gây bệnh còn sống hay đã chết. - Không giám sát được tính kháng kháng sinh của vi khuẩn. ứng dụng hiện tại: được ứng dụng tương đối rộng rãi trong các labo chẩn đoán và nghiên cứu từ tuyến tỉnh đến trung ương. 1.3. Nghiên cứu Sinh học phân tử ở vi khuẩn lậu Vi khuẩn lậu là vi khuẩn chỉ gây bệnh ở người. Trình tự gen trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn lậu FA1090 đã được giải và số lượng nucleotide là 2.153.922 (GenBank accession No NC 004969). Các chủng vi khuẩn lậu có một số plasmid quan trọng có vai trò trong cơ chế chuyển hoá, kháng kháng sinh của vi khuẩn. Cho tới nay, việc xác định vi khuẩn lậu vẫn chủ yếu dựa vào kết quả
19 nhuộm soi, nuôi cấy phân lập và xác định vi khuẩn đối với các bệnh phẩm trên lâm sàng. Kỹ thuật nhuộm soi cho kết quả nhanh, đơn giản, rẻ tiền và khá đặc hiệu. Tuy nhiên, nó cũng có những khó khăn với các bệnh phẩm lấy từ họng hoặc trực tràng. Ngoài ra, những trường hợp nhiễm trùng không triệu chứng thì việc phát hiện vi khuẩn qua nhuộm soi cũng gặp nhiều khó khăn. Nuôi cấy, phân lập bệnh phẩm tìm vi khuẩn lậu vẫn là tiêu chuẩn vàng trong việc chẩn đoán bệnh Lậu. Tuy nhiên, để có kết quả tốt, cần phải tối ưu các khâu lấy bệnh phẩm, sử dụng môi trường vận chuyển hợp lý và mang bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt. Ngoài ra, việc chọn môi trường nuôi cấy, phân lập phù hợp và điều kiện nuôi cấy tối ưu là đặc biệt quan trọng. Trong điều kiện đã được tối ưu, việc nuôi cấy xác định vi khuẩn lậu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao và thực hiện được với hầu hết các loại bệnh phẩm. Ngoài ra, nuôi cấy phân lập còn cung cấp chủng vi khuẩn thuần cho thử nghiệm kháng sinh đồ. Vi khuẩn lậu là một vi khuẩn dễ bị chết khi ra ngoài môi trường. Ngoài ra, điều kiện nuôi cấy cũng đòi hỏi những điều kiện ngặt nghèo về chất dinh dưỡng, khí trường… Trong trường hợp bệnh nhân bị bệnh Lậu mạn tính hoặc đã điều trị, lượng vi khuẩn trong bệnh phẩm rất ít, làm cho việc nuôi cấy, phân lập gặp rất nhiều khó khăn. Các kỹ thuật sinh học phân tử đã khắc phục được các nhược điểm này của các kỹ thuật thông thường vì các kỹ thụât sinh học phân tử được sử dụng để phát hiện trực tiếp sự có mặt của vật liệu di truyền của vi khuẩn lậu trong bệnh phẩm thông qua quá trình khuếch đại vật liệu di truyền. Các kỹ thuật này rất nhạy nên chỉ cần có một số lượng rất ít vi khuẩn, về lý thuyết chỉ cần có 1 CFU là phản ứng có thể cho kết quả dương tính. Kết quả dương tính này cho phép kết luận sự có mặt của vi khuẩn lậu trong bệnh phẩm. Các kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong chẩn đoán vi khuẩn lậu đã
20 được phát triển từ những năm 1990, các kỹ thuật này đã được sử dụng thường qui. Chúng bao gồm kỹ thuật lai, khuếch đại acid nucleic, giải trình tự gen [37], [39], [66], [86], [121], [137], [135], [149]. 1.3.1. Kỹ thuật lai Các mẫu dò đặc hiệu được lai trực tiếp với đoạn acid nucleic của vi khuẩn lậu có mặt trong bệnh phẩm. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy, kỹ thụât này có độ nhạy và độ đặc hiệu đôi khi thấp hơn so với kỹ thuật nuôi cấy, phân lập thông thường [149]. Kỹ thuật lai ADN sử dụng các mẫu dò ADN là một phương tiện có hiệu quả để xác định vi khuẩn lậu trong các bệnh phẩm từ đường sinh dục, tiết niệu. Các mẫu dò sử dụng trình tự các nucleotid của các gen qui định cho đặc điểm cấu trúc, chuyển hoá của vi khuẩn cũng đã được nghiên cứu và áp dụng như gen cho enzyme phân huỷ protein IgAl, ARN của ribosom hay plasmid ... Kỹ thuật lai có độ đặc hiệu cao nhưng có độ nhạy thấp. 1.3.2. Kỹ thuật khuếch đại ADN Kỹ thuật khuếch đại acid nucleic có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao. Nhìn chung, kỹ thuật này có khá nhiều ưu điểm. Trước hết, độ nhạy được cải thiện rất nhiều so với kỹ thuật nuôi cấy, phân lập thông thường. Khi so sánh với kỹ thuật khuếch đại acid nucleic, kỹ thuật nuôi cấy, phân lập có độ nhạy từ 85% đến 90% đối với trường hợp bị lậu cấp và chỉ có 50% đối với trường hợp lậu mạn tính. Các kỹ thuật khuếch đại cũng có những hạn chế của nó. Đó là giá thành đầu tư cho trang thiết bị, sinh phẩm, khả năng bị nhiễm trong quá trình thao tác, sản phẩm không đặc hiệu, hay không thể cho biết thông tin về tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn. Ngoài ra, trong một số trường hợp đặc biệt, những trình tự nucleotide là đích của quá trình khuếch đại có thể không có mặt trong một số chủng vi khuẩn hoặc là chúng xuất hiện ở cả những chủng Neisseria thường có mặt trong đường sinh dục, tiết niệu. Điều
21 này dẫn đến khả năng bị âm tính hoặc dương tính giả tuỳ từng trường hợp. 1.3.3. Kỹ thuật giải trình tự phát hiện các gen kháng thuốc Vi khuẩn lậu là một trong các căn nguyên quan trọng nhất gây nhiễm trùng LTQĐTD. Tỷ lệ mắc bệnh không thể ước tính được, bởi vì rất ít báo cáo của các nước nêu lên được tỷ lệ bị bệnh thực sự ở nước mình. Tỷ lệ hiện mắc giảm chậm ở các nước phát triển. Sự gia tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu đã làm cho vấn đề điều trị bệnh Lậu gặp rất nhiều khó khăn. Có rất nhiều cơ chế gây nên sự kháng kháng sinh như sự đề kháng penicillin qua trung gian plasmid (TEM-1 β-lactamase) và qua trung gian nhiễm sắc thể. Trong khi tỷ lệ kháng penicillin của vi khuẩn lậu có β-lactamase (penicillinase-producing N. gonorrhoeae-PPNG) giảm xuống một cách có ý nghĩa trong những năm 1991 đến 1998 thì tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng lại penicillin qua trung gian nhiễm sắc thể (chromosomally mediated resistant N. gonorrhoeae-CMRNG) lại gia tăng [118]. Cơ chế kháng kháng sinh qua trung gian nhiễm sắc thể là do đột biến gen ponA, gen mã hoá mối liên kết penicillin - Binding protein 1 - PBP1 (patricia). Sự kháng lại ciprofloxacin của vi khuẩn lậu là do đột biến gen gyrA và parC [131]. Để phát hiện các gen đột biến, người ta sử dụng PCR để nhân lên các đoạn gen đích này và xác định trình tự đoạn gen (sequencing) để tìm ra điểm đột biến. 1.3.4. Một số kỹ thuật sinh học phân tử khác - Phân tích plasmid. - Giải trình tự theo phương pháp của Sanger đối với các mảnh đa hình của gen porB. - Kỹ thuật phân tích trình tự đa kháng nguyên của vi khuẩn lậu phân tích các mảnh của gen porB và gen qui định cho protein B gắn chuyển sắt. - Phân tích tính đa hình của đoạn nucleotide được khuếch đại. - Định týp đoạn ADN đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên.
22 - Phân tích toàn bộ gen của vi khuẩn lậu sau khi cắt liên tục bằng các enzyme hạn chế và điện di trên gel polyacrylamide [57]. 1.3.5. Một số gen liên quan đến đề kháng của vi khuẩn - Tất cả Neisseria gây bệnh đều có một protein Rmp mang tính kháng nguyên (gọi là protein III hoặc P.III) với trọng lượng phân tử thay đổi từ 30- 36 kDa trên SDS-PAGE ở trạng thái khử. Protein này rất được quan tâm đối với sinh bệnh học vì rất nhiều kháng thể có hoạt tính diệt khuẩn trong huyết thanh chống lại kháng nguyên này. Cấu trúc gen Rmp đã được tạo dòng gen và giải trình tự. Cấu trúc ban đầu của protein porin (Por) đã được xác định bằng giải trình tự ADN. Cấu trúc này giống với các Por ở các vi khuẩn Gram-âm khác. So sánh trình tự của protein PorA và PorB phát hiện có một số vùng, ở cả 2 loại protein và một số vùng có sự khác biệt thay đổi lớn [61]. Những thay đổi khác biệt này có thể là biểu hiện cho tính đa dạng của kháng nguyên. Gen porA và porB là hai allen của một vị trí (locus). Như vậy, Por thực hiện nhiều chức năng đối với vi khuẩn lậu, trong đó có việc tạo ra một đặc hiệu anion qua màng ngoài giầu lipid. Por tồn tại trong 2 lớp hóa học và miễn dịch quan trọng riêng được gọi là PorA và PorB. Một chủng nhất định chỉ có PorA hoặc PorB và không bao giờ có cả hai. Chúng biểu hiện nhiều kháng nguyên của 2 lớp Por quan trọng này [85]. - Về sự đột biến trên nhiễm sắc thể. Đích của các thuốc õ-lactam là protein gắn penicillin (PBPs)-enzym nằm trên màng tế bào tham gia vào sinh tổng hợp vách tế bào. Những thay đổi trong PBP-2 và PBP-1 làm giảm ái lực của chúng với penicillin và do đó làm giảm độ nhạy cảm của vi khuẩn [47]. PBP-2 được mã hóa bởi vị trí penA. Những thay đổi ở các vị trí (locus) khác như mtr và penB sẽ gây ra các
23 tác dụng phụ. Vị trí mtr quyết định sự đề kháng nhiều kháng sinh và chất sát khuẩn qua hệ thống bơm chủ động [65]. Đột biến ở vị trí penB, tác động tới porin, dẫn tới giảm tính thấm của màng ngoài tế bào với kháng sinh ưa nước và các hợp chất khác. Vi khuẩn lậu cũng có "gen giả" porA nhưng không được biểu hiện [53]. Tác động phối hợp của các đột biến penA và tăng biểu hiện mtr là làm tăng MIC của penicillin lên 120 lần [78]. - Đề kháng qua trung gian nhiễm sắc thể liên quan tới những biến đổi mtr và penB cũng làm giảm độ nhạy với penicillin [78]. - Các tác giả trên thế giới: Xiahong Su và Inga Lind; Tiffany R. Shultz; U. Chaudhry; Masatoshi Tanaka...nghiên cứu về đề kháng quinolon của vi khuẩn lậu lại có chung một nhận xét là những chủng vi khuẩn lậu đề kháng với quinolon thì đều có những đột biến trên gen gyrA, gen parC và số lượng đột biến cũng tăng theo nồng độ MIC [38], [125], [128], [131]. Vậy, những gen quyết định sự đề kháng của vi khuẩn như: gen gyrA, parC, gyrB, parE, penA, penB, mtr...những gen này trên nhiễm sắc thể và plasmid dẫn tới sự đề kháng rõ rệt trên lâm sàng. Do hạn chế về thời gian, kinh tế và đã theo dõi những nghiên cứu đi trước của các tác giả trên thế giới nên tôi chỉ chọn gen gyrA và parC để nghiên cứu về sự đề kháng của vi khuẩn lậu với kháng sinh ciprofloxacin và những gen khác ít được đề cập, mặt khác tôi cũng muốn giành cho nghiên cứu lần sau. Gen gyrA có độ dài 2.751 nucleotid mã hoá 916 axít amin, vùng quyết định đề kháng quinolon dài khoảng 279 nucleotid mã hoá 93 axít amin. Gen parC có độ dài 2.307 nucleotid mã hoá 768 axít amin, vùng quyết định đề kháng quinolon dài khoảng 255 nucleotid mã hoá 85 axít amin. 1.4. kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu 1.4.1. Trên thế giới
24 Việc sử dụng penicillin trong điều trị bệnh Lậu lần đầu tiên được khuyến cáo vào thập niên 40. Bệnh nhân bị bệnh Lậu được điều trị bằng penicillin cho kết quả tốt. Năm 1950, bắt đầu xuất hiện những chủng vi khuẩn lậu kháng lại penicillin. Mức độ kháng lại penicillin ngày càng gia tăng với tốc độ khác nhau tùy từng vùng và từng khu vực trên thế giới. Cho đến năm 1976, lần đầu tiên người ta đã phát hiện ra các chủng vi khuẩn lậu kháng penicillin có β-lactamase ở Anh, Mỹ, Tây Phi, châu á (Philippines) và vùng Cận Đông [40], [134]. Theo WHO (2001), tỷ lệ kháng nhóm quinolon của vi khuẩn lậu: Trung Quốc là 54,2% (1997, 1998) tăng lên 85,2% (2000); ở Nhật Bản tỷ lệ này là 40%, Hàn Quốc 16%, Brunei 12%, Singapore 19%, Philippines 37,9% [156]. Nghiên cứu của Olsen (2005), cho biết ở Thụy Điển: khi phân lập 180 chủng, 100% nhạy cảm với cefixim, ceftriaxon và spectinomycin; kháng azithromycin 2%, ciprofloxacin 50% và ampicillin 75% [109]. Tapsall J. W (1997 - 2006) cho biết tại úc: khi nghiên cứu 36.000 chủng vi khuẩn lậu, nhận thấy có sự gia tăng đề kháng với ciprofloxacin, penicillin và tetracyclin. Khoảng một nửa số chủng phân lập ở những thành phố lớn có sự đề kháng với penicillin và ciprofloxacin, tỷ lệ đề kháng ở mức cao mặc dù penicillin ít được dùng còn ciprofloxacin thì gần như là không được sử dụng [138]. Thông báo của WHO (2008), cho biết tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại kháng sinh thuộc nhóm quinolon năm 2006 ở khu vực châu á Thái Bình Dương: Trung Quốc là 99,6%; Hồng Kông 97,8%; Hàn Quốc 89,4%; Nhật Bản 83,4%; Việt Nam 82,1%; Brunei 81,7%; Singapore 70%; Philippines 69%; Malaysia 62%; Australia 38,7%; New Zealand 13,7% và tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng tetracyclin ở mức độ cao: Singapore 76,8%; Hong Kong 48,9%;
25 Trung Quốc 35,2%; Philippines 31%; New Zealand 25%; Việt Nam 16,2%; Australia 12% [137]. Garcia S. (2008) ở Argentina từ 2005-2007, nghiên cứu 595 người có quan hệ đồng tính nam và 571 người có quan hệ với nữ giới, nhận thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu trong 2 nhóm này là 0,91%, trong nhóm quan hệ đồng tính có 20% vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin và 3,8% ở nhóm quan hệ khác giới [59]. Matsumoto (2008), cho biết: tại Nhật Bản, vi khuẩn lậu kháng hầu hết các kháng sinh như penicillin, tetracyclin, các kháng sinh thuộc nhóm quinolon và cephalosporin ngoại trừ ceftriaxon và cefodizim [99]. Zhang T. (2009) nghiên cứu 80 chủng vi khuẩn lậu ở Thượng Hải, Trung Quốc nhận thấy: 95% kháng ciprofloxacin, 95% kháng ofloxacin và 97,5% kháng lomefloxacin. Chỉ có một chủng là nhạy cảm với ciprofloxacin [165]. Khi nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu trên thế giới tôi nhận thấy tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu tăng cao, đặc biệt với ciprofloxacin không những tăng cao mà còn tăng dần theo thời gian, như thông báo của WHO năm 1997-1998 tỷ lệ này ở Trung Quốc là 54,2% nhưng đến năm 2006 thì tỷ lệ này là 99,6% và ở Nhật Bản là 40% tăng lên 83,4%. 1.4.2. Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu ở Việt Nam Trong tình hình kinh tế thị trường thời mở cửa, xã hội Việt Nam cũng có những biến đổi tiêu cực nhất định, trong đó nổi lên các vấn đề tệ nạn xã hội mà nạn mại dâm là một vấn đề đáng báo động. Một trong những hậu quả của hành nghề mại dâm là các bệnh LTQĐTD, đặc biệt là bệnh lậu, phát sinh và phát triển. Do việc sử dụng kháng sinh không được kiểm soát mà vi khuẩn lậu ngày nay đã kháng lại các kháng sinh thông thường; vì vậy các thầy thuốc lâm sàng phải thay thế bằng những kháng sinh thế hệ mới mà sự đề kháng những
26 kháng sinh này của vi khuẩn lậu hiện nay chưa xuất hiện hoặc tỷ lệ đề kháng còn thấp. ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về mức độ nhạy cảm của vi khuẩn lậu đối với kháng sinh như: - Theo Lê Tử Vân và cộng sự (1978-1981): tỷ lệ vi khuẩn lậu nhạy cảm với penicillin là 59,04%; tetracyclin 60,08%; erythromycin 63,05% [20]. - Theo Đào Việt Hải và cộng sự nghiên cứu tại Đắc Lắc (1991): tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại penicillin là 88%; cephalothin 18,25%; tetracyclin 88,35%; cloramphenicol 39,47% và erythromycin 38,64% [8]. - Theo Nguyễn Văn Thục tại thành phố Hồ Chí Minh (1994): tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại penicillin là 94,67%; tetracyclin 5,33%; gentamicin 15,38%; chloramphenicol 1,33%; nalidixic acid 1,33% [18]. - Theo Lê Thị Phương (1996-2000), tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng penicillin là 65,46%; nalidixic acid 41,75%; tetracyclin 40,50%; ciprofloxacin 35,60%; erythomycin 2,06%. Năm 2001 tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng nalidixic acid là 56,68%; penicillin 47,47%; tetracyclin 44,52%; ciprofloxacin 42,67%; Spectinomycin 0,64% [14]. - Theo Lê Văn Hưng (từ 4.1997 đến 3.1998), tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại penicillin là 80,43%; tetracyclin 31,52%; nalidixic acid 12,3%; ciprofloxacin 5,43%. - Năm 2003, các tỷ lệ này là ciprofloxacin 60,87%; penicillin 27,39%; tetracyclin 23%; erythomycin 13,48%; spectinomycin 3,93%. - Năm 2005, các tỷ lệ này là ciprofloxacin 59,62%; tetracyclin 9,88%, penicillin 35,18%. - Năm 2006, tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng penicillin là 31,1%, ciprofloxacin 56,6%; tetracyclin 16,5%; erythromycin 3,8%; giảm nhạy cảm với azithromycin 1,9% và cefotaxim 0,9%. Qua nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu tại Việt
27 Nam, tôi có những nhận định như sau: cũng giống như tình hình kháng kháng sinh trên thế giới, tỷ lệ vi khuẩn lậu không những ngày càng kháng lại nhiều loại kháng sinh mà còn gia tăng mức độ đề kháng, đặc biệt với ciprofloxacin, như thông báo của Lê Thị Phương năm 1996-2000 tỷ lệ này là 35,6% nhưng đến năm 2006 theo thông báo của Lê Văn Hưng thì tỷ lệ này là 56,6% và giảm nhạy cảm 25,5% nâng mức tổng kháng 82,1%. 1.4.3. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu Kháng kháng sinh có thể là do thay đổi đích tác dụng của kháng sinh, loại bỏ kháng sinh ra khỏi tế bào hoặc phá hủy phân tử kháng sinh đó. Việc xuất hiện và lan truyền sự đề kháng kháng sinh trong vi khuẩn lậu chủ yếu là do nhận được ADN mới thông qua hình thức tiếp hợp hoặc biến nạp. Các quyết định đề kháng này có thể nằm trên nhiễm sắc thể hoặc trên plasmid- ngoài nhiễm sắc thể. Nếu vi khuẩn lậu có cả gen đề kháng trên nhiễm sắc thể và plasmid thì có thể kháng nhiều loại kháng sinh. Biến đổi trên nhiễm sắc thể tác động tới khả năng thẩm thấu, đồng thời làm giảm độ nhạy cảm với penicilin, tetracyclin và macrolide. Plasmid thường có quyết định đề kháng cho cả penicilin và tetracyclin mức độ cao. Vi khuẩn lậu, cũng như những vi khuẩn khác, ban đầu nhạy cảm cao với kháng sinh [116], nhưng dần dần thích nghi trong môi trường bất lợi mà ở đó có kháng sinh. Các cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu có thể chia thành hai nhóm: nhóm làm giảm sự tiếp cận của kháng sinh tới vị trí đích và nhóm tự làm thay đổi vị trí đích. Sự tiếp cận của kháng sinh tới vị trí đích có thể bị hạn chế bởi: giảm tính thấm của màng tế bào do những thay đổi trong protein porin; hoạt tính đẩy kháng sinh khỏi tế bào như hệ thống bơm đẩy và phân hủy kháng sinh trước khi nó có thể tác động tới vị trí đích. Những thay đổi ở các vị trí (locus) như mtr và penB sẽ gây ra các tác dụng phụ. Vị trí mtr quyết
28 định sự đề kháng nhiều kháng sinh và chất sát khuẩn nhờ hệ thống bơm chủ động [65]. Sự thay đổi vị trí đích của kháng sinh sẽ làm giảm ái lực của nó với kháng sinh và triệt tiêu đích tác động làm mất tác dụng của kháng sinh. Về mặt di truyền, những biến đổi này có thể được quyết định bởi các yếu tố di truyền nằm trên nhiễm sắc thể hoặc ngoài nhiễm sắc thể (plasmid). Nhiều yếu tố quyết định kháng kháng sinh có thể cùng tồn tại trong một vi khuẩn khiến mức độ kháng kháng sinh có thể tăng lên rất nhiều và một chủng đơn thuần có thể kháng với nhiều kháng sinh khác nhau. Kháng kháng sinh qua trung gian plasmid, được lan truyền qua hình thức tiếp hợp. Quá trình này đòi hỏi sự có mặt của plasmid tiếp hợp toa+ để vận chuyển plasmid mang yếu tố quyết định kháng kháng sinh. Plasmid tiếp hợp được là plasmid có bộ gen toa (toa+ ). Bộ gen toa giúp cho tế bào có nó tiếp xúc được với tế bào khác và truyền (transfer) chất liệu di truyền trên plasmid sang tế bào nhận. Vì không phải tất cả các chủng đều có plasmid tiếp hợp nên tỷ lệ lan truyền gen kháng kháng sinh có thể hạn chế ở một mức độ nhất định. Tuy nhiên, các tiếp hợp cũng có thể biến đổi trong quá trình sống, vì vậy một số chủng nhận sau này có thể trở thành chủng cho [78]. 1.4.4. Ciprofloxacin và kháng ciprofloxacin Kháng sinh ciprofloxacin thuộc nhóm quinolon thế hệ thứ hai, là một kháng sinh bán tổng hợp, có phổ kháng khuẩn rộng, được chỉ định để điều trị các bệnh: nhiễm trùng máu, nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, nhiễm khuẩn đường hô hấp, nhiễm khuẩn xương khớp và nhiễm khuẩn đường sinh dục tiết niệu... Điều trị tất cả các vi khuẩn Gram (-) và Gram (+). Vì thế, đây là một kháng sinh được cả bệnh nhân và thầy thuốc ưa chuộng, đặc biệt được đưa vào điều trị bệnh Lậu ngay từ khi thuốc được đưa ra thị trường vào những năm 1980 với liều uống duy nhất 500 mg đã có thể điều trị được bệnh Lậu cấp. Chính vì vậy, sự lựa chọn kháng sinh đường uống trong những giai đoạn 1980 đến
1990 là một lựa chọn đ cũng như những nước đ thường là dấu bệnh ít k tự sử dụng kháng sinh khuẩn lậu kháng kháng nói riêng. Andrew Si ciprofloxacin rất hiếm vùng sâu vùng xa thì kh đề cảnh báo ". 1.4.4.1. Công thức hóa Công thức hóa họ http://en.wikipedia.org/ Hình 1. 1.4.4.2. Dược lý và cơ c Hoạt động bình thường 29 ọn đúng đắn và duy nhất. Nhưng, bệnh nh ớc đang phát triển khi bị các bệnh nhiễm tr khi đi khám để chẩn đoán đúng bệnh ngay nh nên đã làm lan truyền và gia tăng nh ng sinh nói chung và kháng với kháng sinh Simor đã viết: "Cách đây trên 15 năm, vi ếm gặp, giờ đây, ngoài những cộng đồng d kháng với ciprofloxacin tại bệnh viện đang óa học học: g/wiki/Chemical_formulaC17H18FN3O3 1.1. Công thức phân tử của ciprofloxacin ơ chế tác dụng ờng của vi khuẩn: Enzyme DNA gyrase Gỡ xoắn ADN ADN nhân lên nhân ở nước ta trùng LTQĐTD ay từ đầu mà lại những chủng vi nh ciprofloxacin vi khuẩn kháng dân cư sống ở đ ng trở thành vấn
30 Tế bào vi khuẩn nhân lên Cơ chế tác động khi có quinolon: - Quinolon phong bế DNA-gyrase làm cho nó không hoạt động bình thường được, dẫn tới vi khuẩn không nhân lên được (vi khuẩn nhạy với kháng sinh này). Gen gyrase kiểm soát cấu trúc không gian của protein Gyrase. Cấu tạo Gyrase gồm hai tiểu phần GyrA và GyrB do gen gyrA và gyrB quy định. Tương tự topoisomerase IV cũng tham gia vào mở xoắn ADN. Cấu tạo topoisomerase IV gồm hai tiểu phần ParC và ParE do gen parC và parE quy định. - Khi enzyme DNA-gyrase bị thay đổi (do đột biến gen), nó không tương tác với quinolon nữa. Vì vậy, vi khuẩn vẫn nhân lên bình thường khi có mặt của quinolon (vi khuẩn kháng quinolon). Ciprofloxacin là kháng sinh bán tổng hợp, có phổ kháng khuẩn rộng, thuộc nhóm quinolon, còn được gọi là các chất ức chế DNA-gyrase. Do ức chế enzym DNA-gyrase, nên thuốc ngăn sự sao chép của chromosom khiến cho vi khuẩn không sinh sản được. Ciprofloxacin có tác dụng tốt với các vi khuẩn kháng lại kháng sinh thuộc các nhóm khác (aminoglycosid, cephalosporin, tetracyclin, penicilin...) và được coi là một trong những kháng sinh có tác dụng mạnh nhất trong nhóm fluoroquinolon. Ciprofloxacin hấp thu nhanh và dễ dàng ở ống tiêu hóa. Khi có thức ăn và các thuốc chống toan, hấp thu thuốc bị chậm lại nhưng không bị ảnh hưởng một cách đáng kể. Thuốc được phân bố rộng khắp và có nồng độ cao ở những nơi bị nhiễm khuẩn (các dịch cơ thể, các mô), nói chung thuốc dễ ngấm vào mô. Nồng độ trong mô thường cao hơn nồng độ trong huyết thanh, đặc biệt là ở các nhu mô, cơ, mật và tuyến tiền liệt. Nồng độ trong dịch bạch huyết và dịch ngoại bào cũng gần bằng nồng độ trong huyết thanh. Khoảng 40 - 50% liều uống đào thải dưới dạng không đổi qua nước
31 tiểu nhờ lọc ở cầu thận và bài tiết ở ống thận. Khoảng 75% liều tiêm tĩnh mạch đào thải dưới dạng không đổi qua nước tiểu và 15% theo phân. Hai giờ đầu tiên sau khi uống liều 250 mg, nồng độ ciprofloxacin trong nước tiểu có thể đạt tới trên 200 mg/lít và sau 8 - 12 giờ là 30 mg/lít. Các đường đào thải khác là chuyển hóa ở gan, bài xuất qua mật, và thải qua niêm mạc vào trong lòng ruột (đây là cơ chế đào thải bù trừ ở người bệnh bị suy thận nặng). Thuốc được đào thải hết trong vòng 24 giờ [19]. 1.4.4.3. Liều lượng và cách dùng Muốn thuốc hấp thu nhanh, nên uống thuốc 2 giờ sau bữa ăn. Người bệnh cần được dặn uống nhiều nước và không uống thuốc chống toan dạ dày trong vòng 2 giờ sau khi uống thuốc. Chỉ định dùng Liều lượng cho 24 giờ Nhiễm khuẩn đường tiết niệu dưới 100 mg x 2 Nhiễm khuẩn đường tiết niệu trên 250 -500 mg x 2 Lậu không có biến chứng 500 mg, liều duy nhất Viêm tuyến tiền liệt mạn tính 500 mg x 2 Nhiễm khuẩn ở da, mô mềm, xương 500 - 700 mg x2 Viêm ruột nhiễm khuẩn nặng: Liều điều trị Liều dự phòng 500 mg x 2 500 mg x 1 Phòng các bệnh do não mô cầu: Người lớn và trẻ em trên 20 kg Trẻ em dưới 20 kg 500 mg, liều duy nhất 250 mg, liều duy nhất hoặc 20mg/kg Phòng nhiễm khuẩn Gram (-) ở người bệnh bị suy giảm miễn dịch 250 - 500 mg x 2
32 Nhiễm khuẩn bệnh viện năng, nhiễm khuẩn huyết, điều trị nhiễm khuẩn ở người bị bệnh suy giảm miễn dịch 500 - 750 mg x 2 1.4.4.4. Phổ kháng khuẩn Ciprofloxacin có phổ kháng khuẩn rất rộng, bao gồm phần lớn các mầm bệnh quan trọng. Phần lớn các vi khuẩn Gram (+), kể cả Pseudomonas và Enterobacter đều nhạy cảm với thuốc. Các vi khuẩn gây bệnh đường ruột như Salmonella, Shigella, Yersina và Vibrio cholerae thường nhạy cảm cao. Tuy nhiên, với việc sử dụng ngày càng nhiều và lạm dụng thuốc, đã có báo cáo về tăng tỷ lệ kháng kháng sinh của Salmonella. Các vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp như Haemophilus và Legionella thường nhạy cảm, Mycoplasma và Chlamydia chỉ nhạy cảm vừa phải với kháng sinh. Neisseria thường rất nhạy cảm với kháng sinh. Do cơ chế tác dụng đặc biệt của thuốc nên ciprofloxacin không có tác dụng chéo với các kháng sinh khác như aminoglycosid, cephalosporin, tetracyclin, penicilin... Nói tóm lại ciprofloxacin thuộc thế hệ thứ 2 của nhóm quinolon là một kháng sinh bán tổng hợp, có phổ kháng khuẩn rộng, được chỉ định điều trị rộng rãi trong các bệnh nhiễm trùng, có ít tác dụng phụ hơn thế hệ 1 và 3, 4. Thuốc được cả bệnh nhân và thầy thuốc ưa chuộng, nhưng bệnh nhân ở nước ta lại lạm dụng kháng sinh này dẫn tới kháng kháng sinh là điều đã được khẳng định. Song điều gây ngạc nhiên cho các nhà khoa học là tại sao chúng lại hình thành kháng thuốc ciprofloxacin trong khi quần thể này chưa bao giờ phơi nhiễm với kháng sinh đó, đây là lời nhận xét của đồng tác giả Michael Silverman, một chuyên gia bệnh truyền nhiễm ở mạng lưới y tế Lakeridge Health Network tại Ontario. Quả thật, E.coli kháng với kháng sinh ciprofloxacin đã lan rộng khắp trên thế giới từ vùng sâu vùng xa và cả ở các
33 khoa hồi sức tích cực của Mỹ. Cũng giống như E.coli, vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin ngay cả trên bệnh nhân bị lậu mà bệnh nhân đó chưa dùng ciprofloxacin bao giờ. Chính vì lẽ đó mà tôi chọn ciprofloxacin là để đại diện cho quinolon với hy vọng góp phần tìm hiểu vấn đề này. 1.4.5. Các nghiên cứu về đột biến gen liên quan đến kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu trên thế giới Theo nghiên cứu của David L. Trees và cộng sự (1998), 65 chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin tại Trung tâm phòng chống bệnh Atlanta, Mỹ có 5 chủng đột biến ở gen parC: 3 chủng chứa 2 đột biến Ser-87 thành Ile và Glu-91 thành Gly, 1 chủng chứa 2 đột biến Gly-85 thành Cys và Arg-116 thành Leu) và 1 chủng chứa 1 đột biến Arg-116 thành Leu [140]. Masatoshi Tanaka và cộng sự nghiên cứu 502 mẫu phân lập tại Nhật Bản về sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu từ năm 1993-1998. Họ đã chọn những chủng kháng ciprofloxacin và phân tích những đột biến ở vùng QRDR (Quinolone-Resistant Determining Region) trên gen gyrA và parC. So sánh với chủng nhạy cảm các tác giả nhận thấy rằng, những chủng kháng ciprofloxacin chứa 3 hoặc 4 axit amin bị thay thế trong vùng QRDR ở protein gyrA và parC [131]. Theo nghiên cứu của Xiahong Su và Inga Lind (2001) trên 40 chủng vi khuẩn lậu tại Đan Mạch, có 35 chủng kháng ciprofloxacin. Giải trình tự vùng QRDR của gen gyrA và parC, 32 chủng (91%) có sự thay đổi tại Ser-91 và Asp-95 ở gen gyrA và sự thay đổi đơn hoặc đôi ở gen parC. Sự thay đổi Ser- 91 thành Phe và Asp-95 thành Gly trong gen gyrA được tìm thấy trong 28 chủng (80%). Có 19 chủng (54%) có sự thay đổi Asp-86 thành Asn trong gen parC [128]. Tiffany R. Shultz và cộng sự (2001) khi nghiên cứu 174 chủng vi
34 khuẩn lậu phân lập được tại Sedney, úc, thấy rằng 84 chủng ít nhạy cảm và đề kháng với nhóm quinolon, đại diện là ciprofloxacin, có MIC từ 0,12-16 µg/ml. 18 chủng kháng quinolon được giải trình tự và có những thay đổi trên gen gyrA: Ser-91 thành Phe, Ser-91 thành Tyr, Asp-95 thành Gly và Asp-95 thành Asn. Sự biến đổi của gen parC được thấy trong những mẫu mà có sự biến đổi của gen gyrA và bao gồm cả sự thay đổi các axit amin Asp-86 thành Asn, Ser-87 thành Asn, Ser-87 thành Arg, Ser-88 thành Pro, Glu-91 thành Lys, Glu-91 thành Gln [125]. U. Chaudhry và cộng sự (2002) nghiên cứu 63 mẫu vi khuẩn lậu phân lập trên bệnh nhân ở Delhi, ấn Độ có 5 mẫu (6%) nhạy cảm với ciprofloxacin (MIC < 0,06 µg/ml). Phân tích trình tự ADN của gen gyrA và parC cho thấy: tất cả các mẫu kháng ciprofloxacin (58 chủng) đều có sự đột biến ở đoạn gen gyrA và parC. GyrA (Ser91 thành Phe, Asp-95 thành Asn, Val-120 thành Leu) [38]. Cũng về vấn đề này, Xie P. và cộng sự (2003) cho biết: 20 chủng đề kháng và 20 chủng nhạy cảm với kháng sinh nhóm quinolon tại tỉnh Wusu, Trung Quốc đều có những đột biến điểm ở Asp-95 của gen gyrA và Asp-86, Ser-87, Ser-88, Glu-91 của gen parC [159]. Liên quan đến giá trị MIC và số lượng các đột biến, Xu J. S. và cộng sự (2006) nghiên cứu 18 chủng kháng ciprofloxacin ở tỉnh Jiangsu, Trung Quốc và phát hiện những đột biến tại gen gyrA và parC kết luận rằng những chủng có MIC cao thì có nhiều điểm đột biến [160]. Trong nghiên cứu của Karunakaran R và cộng sự (2007), khi phân tích 18 chủng vi khuẩn lậu đề kháng và 4 chủng nhạy cảm với ciprofloxacin tại một Bệnh viện thực hành ở Kuala Lumpur, Malaysia, các tác giả nhận thấy 19 trong tổng số 22 chủng bao gồm cả các chủng nhạy cảm đều có đột biến câm (còn gọi là đột biến trung tính, thường xảy ra ở vị trí thứ 3, làm codon bị biến đổi nhưng vẫn mã hóa cùng 1 axit amin, vì vậy mạch peptit không đổi), cụ thể
35 ở gen parC tại codon 131 (CTC thành CTG) cùng mã hoá Leu. Chỉ có 1 chủng nhạy cảm là không có đột biến câm, có 1 sự thay thế đơn ở gen gyrA. Một đột biến câm khác ở gen parC tại codon 141 (TAT thành TAC) cùng mã hoá Tyr được thấy ở 1 chủng. Các chủng đề kháng có ít nhất 2 đột biến tại gen gyrA và ít nhất 1 đột biến tại gen parC ngoại trừ 1 chủng không có đột biến ở gen parC và tác giả này đã nhận xét: những đột biến tại gen gyrA là cần thiết cho sự đề kháng quinolon, trong khi những đột biến tại gen parC chỉ có tính chất bổ sung. Vì thế, không có những chủng đề kháng nào chỉ mang riêng đột biến tại gen parC [81]. Zhang T. (2009) khi nghiên cứu 80 chủng vi khuẩn lậu ở Thượng Hải, Trung Quốc nhận thấy: 95% kháng ciprofloxacin, 95% kháng ofloxacin và 97,5% kháng lomefloxacin. Chỉ có 1 chủng là nhạy cảm với ciprofloxacin. Tất cả các chủng đề kháng hoặc giảm nhạy cảm đều có đột biến đôi ở gyrA (Ser-91, Ala-92, Asp-95). MIC của các chủng liên quan mật thiết đến những đột biến ở gyrA và parC. Điều này chỉ ra rằng những đột biến ở vùng QRDR của gyrA và parC đều là nguyên nhân gây ra sự đề kháng nhóm quinolon [165]. Qua nhiều nghiên cứu trên thế giới, các tác giả đều có chung nhận xét rằng, đột biến gen gyrA và parC có liên quan đến sự đề kháng của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin. Chương II Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
36 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Bệnh nhân Từ tháng 1/2005 - 12/2007 tôi thực hiện đồng thời hai kỹ thuật nhuộm soi và nuôi cấy tại Khoa xét nghiệm Viện Da liễu Quốc Gia cho 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo, cổ tử cung, được các bác sĩ lâm sàng chẩn đoán nghi nhiễm vi khuẩn lậu, đây là những kỹ thuật thường quy tại Khoa Xét nghiệm. 2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân - Có triệu chứng lâm sàng Đối với bệnh nhân nam giới: Lậu cấp: miệng sáo đỏ, sưng, có mủ hoặc dịch tiết ở niệu đạo có màu trắng đục, vàng hoặc hơi xanh, khi đi tiểu thấy nóng buốt, đôi khi có lẫn máu, bệnh nhân có thể bị sốt nhẹ. Lậu mạn tính: các triệu chứng không rầm rộ, không điển hình như lậu cấp, đi tiểu ít nóng hơn, mủ ít hơn, có khi chỉ tiết dịch vào buổi sáng. Đối với bệnh nhân nữ giới: Hội chứng tiết dịch âm đạo có thể thấy đi tiểu buốt hoặc khó tiểu tiện. Khám tuyến Skène, Bartholin, niệu đạo, cổ tử cung có mủ vàng hoặc hơi xanh. Bệnh nhân có cảm giác đau bụng, nóng rát khi đi tiểu, có viêm đỏ lỗ niệu đạo, đôi khi có sốt nhẹ. - Đồng ý tham gia vào nghiên cứu của tôi. 2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân - Đang dùng thuốc kháng sinh tại thời điểm lấy bệnh phẩm 7 ngày. - Bệnh nhân AIDS. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu của kỹ thuật nhuộm soi - Kính hiển vi.
37 - Que tăm bông, que cấy nhựa sử dụng một lần của hãng Human (Đức) hoặc công ty TNHH Nam Khoa (Việt Nam). - Thuốc nhuộm Gram của công ty TNHH Nam Khoa (Việt Nam). - Lam kính. 2.2.2. Vật liệu nghiên cứu của kỹ thuật nuôi cấy - Trang thiết bị và hoá chất + Lam kính. + Nước muối sinh lý 0,9%. + Các giá đựng ống nghiệm. + Que tăm bông, que cấy nhựa sử dụng một lần của hãng Human (Đức) hoặc công ty TNHH Nam Khoa (Việt Nam). + Thuốc nhuộm Gram của công ty TNHH Nam Khoa (Việt Nam). + Thước đo để làm kháng sinh đồ của Thụy Điển. + Kính hiển vi. + Tủ nuôi cấy điều chỉnh được CO2 của hãng Sanyo (Nhật Bản). + Hốt phân lập vi khuẩn của hãng Sanyo (Nhật Bản). - Môi trường phân lập vi khuẩn lậu: môi trường Thayer-Martin đông khô. + Môi trường Thayer-Martin và cách pha chế: Thạch GC chứa 10% Hemoglobin Powder của hãng BBL (Mỹ). Pha chế môi trường: dung dịch 1: lấy 36 g GC Agar Base hòa tan 500 ml nước cất 2 lần (pH=7,3). Đun cách thủy cho tan hết thạch, hấp ướt 1210 C trong 15 phút. Lắc đều và để nguội xuống 500 C. Dung dịch 2: lấy 10 g bột máu bò khô cho vào 100 ml nước cất 2 lần (pH=7,3) hòa tan, thêm nước cất cho đủ 500 ml. Hấp ướt 1210 C trong 15 phút. Lắc đều và để nguội xuống 500 C.
38 Trộn đều dung dịch 1 và 2, sau đó cho thêm 1% chất tăng sinh và 1% chất ức chế, lắc đều phân phối ra các hộp petri. Bảo quản môi trường trong tủ lạnh 4-80 C, sử dụng trong vòng 10 ngày. + Chất tăng sinh và chất ức chế: chất tăng sinh Isovitalex của BBL (Mỹ) bao gồm các acid amin giàu dinh dưỡng tạo điều kiện cho vi khuẩn lậu phát triển. Chất ức chế V-C-N của BBL (Mỹ) là chất ức chế vi khuẩn Gram (+), trực khuẩn Gram (-) và nấm nhưng không ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lậu. + Môi trường Thayer-Martin dùng cho thử nghiệm kháng sinh đồ. Cách pha chế môi trường: Dung dịch 1: 36 g thạch GC Agar Base hoà với 500 ml nước cất 2 lần, đun sôi cho thạch tan hết, hấp ướt 1210 C trong 15 phút, lấy ra để nguội xuống 500 C, cho vào môi trường 1% chất tăng sinh, lắc đều. Dung dịch 2: 10 g bột máu bò khô cho vào 500 ml nước cất 2 lần. Khuấy đều cho đến khi tan hoàn toàn, hấp ướt 1210 C trong 15 phút. Lắc đều và để nguội xuống 500 C. Trộn đều dung dịch 1 và 2, đổ vào hộp petri (đường kính 9 cm) 25 ml thạch. Để thạch nguội ở nhiệt độ phòng và lấy 3-5% số đĩa thạch để vào tủ ấm 370 C trong thời gian từ 18-24 giờ để kiểm tra độ vô khuẩn. Bảo quản môi trường trong tủ lạnh 4-80 C, sử dụng trong vòng 10 ngày. - Test sinh vật hoá học Neisseria 4H của hãng Bio-rad (Mỹ) Oxidase - Các thanh giấy E-test Của hãng AB-BIODISK-Thụy Điển - Chủng chuẩn vi khuẩn lậu N. gonorrhoeae: ATCC 49226 Do WHO cung cấp ký hiệu các chủng: QA1, QA2, QA3, QA4, QA5, QA6.
39 - Các khoanh giấy kháng sinh bao gồm 2 nhóm khoanh giấy: Bảng 2.1. Các khoanh giấy kháng sinh thuộc nhóm chính [150]. Tên kháng sinh Ký hiệu Lượng kháng sinh/khoanh Hãng sản xuất UI µg Ceftriaxon CRO 30 Bio-rad Ciprofloxacin CIP 5 -- Penicillin PG 10 -- Spectinomycin SPT 100 -- Tetracyclin TE 30 -- Bảng 2.2. Các khoanh giấy kháng sinh thuộc nhóm bổ sung Tên kháng sinh Ký hiệu Lượng kháng sinh/khoanh (µg) Hãng sản xuất Azithromycin AZM 15 Bio-rad Cefotaxim CTX 30 -- 2.2.3. Dụng cụ và sinh phẩm cho kỹ thuật PCR - Máy ly tâm của hãng SIGMA (Đức). - Máy luân nhiệt i-Cycler Bio-rad (Mỹ) - Hoá chất: của hãng Bio-rad (Mỹ) Dung dịch đệm 10x dNTP 10 mM MgCl2 50 mM
40 Taq ADN polymerase 5 UI/µl Mồi xuôi HO1 và mồi ngược HO3 của hãng Invitrogen, Tokyo, Nhật Bản Trình tự mồi (5'-3') như sau: HO1: GCT ACG CAT ACC CGC GTT GC HO3: CGA AGA CCT TCG AGC AGA CA Cặp mồi này nhân lên một đoạn ADN dài 390 cặp base của gen trên plasmid pJD1 (GenBank: M10316.1, 3141-3530) của vi khuẩn lậu [70]. Mồi để xác định gen kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu: - Mồi phát hiện và giải trình tự gen gyrA (Invitrogen, Tokyo, Nhật Bản) Mồi xuôi: (5'-3') CGG CGC GTA CTG TAC GCG ATG CA Mồi ngược: (5'-3') AAT GTC TGC CAG CAT TTC ATG TGA GA Cặp mồi này nhân lên một đoạn ADN dài 279 cặp base. - Mồi phát hiện và giải trình tự gen parC (Invitrogen, Tokyo, Nhật Bản) Mồi xuôi: (5'-3') ATG CGC GAT ATG GGT TTG AC Mồi ngược: (5'-3') GGA CAA CAG CAA TTC CGC AA Cặp mồi này nhân lên một đoạn ADN dài 255 cặp base. 2.2.4. Dụng cụ và sinh phẩm cho kỹ thuật giải trình tự gen - MinElute PCR Purification Kit của hãng Qiagen (Đức). - Máy ly tâm 20.000 vòng/phút của hãng SIGMA (Đức). - Mồi giải trình tự (Invitrogen, Tokyo, Nhật Bản). - ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit của hãng Applied Biosystem (Mỹ). - Máy ABI PRISM 310 của hãng Applied Biosystem (Mỹ).
41 2.3. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu của tôi được thực hiện trên tất cả những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007 với số mẫu 5.091 bệnh nhân, để tôi: xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu và tìm hiểu sự kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu phân lập được ở đối tượng này. Trong tổng số 5.091 bệnh nhân, tôi chọn ngẫu nhiên lấy 500 bệnh nhân để: so sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, nhuộm soi và nuôi cấy tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu: mô tả cắt ngang. Phân tích các trình tự nucleotide và acid amin tôi sử dụng phương pháp kết thúc chuỗi của Sanger và cộng sự (1977). Cỡ mẫu dùng cho nghiên cứu : áp dụng công thức : p . (1-p) n = Z2 .(ỏ/2). d2 Trong đó: - p: tỷ lệ phân lập vi khuẩn dương tính là 12% (căn cứu vào kết quả phân lập vi khuẩn dương tính của khoa xét nghiệm Viện Da liễu Quốc Gia hàng năm) Với ngưỡng xác suất 95% ; α = 0,05 ; - Z2 .α/2 = 1,962 ; sai số là 3%. - d = 0,03. Theo công thức trên cỡ mẫu nghiên cứu của chúng tôi là: 0,12 . 0,88 n = 1,962 . 0,032 n = 450 Trong thực tế chúng tôi nghiên cứu 500 bệnh nhân.
42 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu Bệnh nhân Sơ đồ Mục tiêu Tình hình nhiễm vi khuẩn lậu So sánh Kháng kháng sinh Nhuộm soi Nuôi cấy PCR Kháng sinh đồ Ciprofloxacin Nhạy cảm Đề kháng MIC ≥ 1 µg/mlMIC ≤ 0,06 µg/ml Giải trình tự So với chủng gốc Không đột biến Có đột biến Tìm hiểu cơ chế đề kháng Tách chiết ADN PCR
43 2.3.2. Kỹ thuật lấy bệnh phẩm Theo qui trình kỹ thuật lấy bệnh phẩm của WHO (1999) [153]. + ở nữ giới - Cổ tử cung: làm ẩm mỏ vịt bằng nước cất vô trùng, đặt mỏ vịt để bộc lộ cổ tử cung, dùng tăm bông vô trùng đưa sâu vào trong cổ tử cung 2-3 cm, để 5-10 giây cho dịch ngấm vào tăm bông, dàn mỏng trên tiêu bản. - 2 bên của tuyến Skène - 2 bên của tuyến Bartholin - Niệu đạo: dùng que cấy hoặc tăm bông vô trùng loại nhỏ đưa sâu vào niệu đạo khoảng 1,5-2 cm rồi xoay nhẹ tăm bông, để khoảng 5-10 giây. Rút tăm bông ra một cách nhẹ nhàng và dàn mỏng lên tiêu bản. + ở nam giới Lậu cấp tính (xem phụ lục 1) Yêu cầu bệnh nhân bộc lộ bộ phận sinh dục, vuốt từ gốc dương vật lên dùng bông có thấm nước cất vô trùng, lau bỏ phần mủ ngoài trước khi lấy bệnh phẩm, dùng tăm bông đưa sâu vào niệu đạo 1,5-2 cm, xoay tròn, để tăm bông 5−10 giây cho dịch thấm vào tăm bông rồi rút ra một cách nhẹ nhàng, dàn mỏng trên tiêu bản. Lậu mạn tính Nhất thiết phải hướng dẫn bệnh nhân nhịn đi tiểu ít nhất là 2-3 giờ trước khi thực hiện xét nghiệm. Các bước tiến hành lấy bệnh phẩm cũng như trường hợp lậu cấp tính. + Dịch rỉ ở mắt trẻ sơ sinh (xem phụ lục 2)
44 Đeo găng tay vô trùng, dùng ngón tay cái và ngón trỏ ấn nhẹ vào mí mắt trẻ sơ sinh, mủ ở kết mạc chảy ra, dùng tăm bông vô trùng để lấy bệnh phẩm, để 5−10 giây cho mủ ngấm vào tăm bông. 2.3.3. Kỹ thuật nhuộm soi hình thể Sau khi phết bệnh phẩm lên lam kính, để khô tự nhiên, cố định trên ngọn lửa đèn cồn với sức nóng vừa phải. Tiến hành nhuộm Gram, nhuộm đơn theo thường qui của WHO năm 1999. Để khô tự nhiên. Nhận định kết quả: khi quan sát dưới kính hiển vi ta thấy vi khuẩn có hình hạt cà phê 2 mặt dẹt úp vào nhau, bắt màu Gram (-), vị trí nằm trong hay ngoài bạch cầu đa nhân trung tính thoái hóa, có thể kết luận là có song cầu khuẩn Gram (-) (nghĩ tới vi khuẩn lậu). 2.3.4. Kỹ thuật nuôi cấy (xem phụ lục 2) Bệnh phẩm được ria trên môi trường Thayer-Martin bằng những đường dích dắc hoặc kỹ thuật cấy phân vùng. Để đĩa thạch đã cấy vào tủ ấm nhiệt độ 35-360 C, có 3-10% khí CO2, độ ẩm > 70%. Sau 18-24 giờ, quan sát khuẩn lạc. Nếu chưa thấy vi khuẩn mọc để thêm 24 giờ nữa. 2.3.5. Xác định vi khuẩn lậu - Nhuộm Gram: Sau 18-24 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc vi khuẩn lậu có đường kính từ 0,5-1 mm, tròn, bờ khuẩn lạc đều, lồi, nhầy, óng ánh và có màu hơi xám (xem phụ lục 3). Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc dàn lên tiêu bản, cố định tiêu bản và tiến hành nhuộm Gram, soi trực tiếp dưới kính hiển vi quang học để xác định hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn. - Test Oxidase (xem phụ lục 3) Dùng đầu Pipette Pasteur uốn cong trên ngọn lửa đèn cồn, lấy khuẩn lạc nghi ngờ phết lên dải giấy thấm Whatman No1 kích thước 2,5 x 0,5 cm đã
45 được làm ẩm bằng 2-3 giọt thuốc thử: tetramethyl P-phenylendiamin hydrochloride 1%. Phản ứng dương tính: phết vi khuẩn lên dải giấy thấm Whatman No1, trong vòng 5 giây chỗ phết vi khuẩn từ màu đỏ hồng chuyển sang màu tím đậm vì những vi khuẩn có men oxidase khi tiếp xúc với thuốc thử tetramethyl P-phenylendiamin hydrochloride 1% và sự có mặt của oxy ngoài không khí sẽ chuyển màu. - Kỹ thuật phân hủy đường nhanh [153] Sử dụng môi trường Neisseria 4H. Môi trường này gồm 4 loại đường: Glucose, Maltose, Fructose, Saccharose (xem phụ lục 4). + Chuẩn bị: - Để hộp kit ở nhiệt độ phòng khoảng 15-20 phút. - Phiến thử (Well microplates), nắp nhựa đậy phiến thử. - Dung dịch trộn vi khuẩn (Suspen solution) - 2ml. - Dung dịch Mc Farland của kit - 1ml. - Micropipette nhỏ giọt. - Que cấy. - Chủng vi khuẩn lậu cần thử. + Các bước tiến hành: theo đúng thường quy hướng dẫn của kit - Chuẩn bị huyền dịch: dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc vi khuẩn lậu nuôi cấy sau 18-24 giờ. Hoà đều vi khuẩn lậu vào dung dịch có sẵn của kit. - So sánh với độ đục Mc Farland số 3 của kit. - Dùng micropipette nhỏ vào mỗi giếng 100 µl canh khuẩn trộn đều. - Đậy nắp và ủ ở tủ ấm 370 C không có CO2. - Đọc kết quả sau 4 giờ. + Cách đọc kết quả: - Kết quả được so sánh với giếng chứng.
46 - Phản ứng âm tính: màu đỏ giữ nguyên. - Phản ứng dương tính: dung dịch từ màu đỏ chuyển sang màu vàng vì vi khuẩn lậu đã chuyển hoá đường glucose thành các acid amin nên môi trường chuyển thành acid, vì vậy sẽ làm mất màu của đỏ phenol. Các tiêu chuẩn chẩn đoán xác định vi khuẩn lậu: - Soi trực tiếp: có song cầu khuẩn Gram (-) hình hạt cà phê nằm trong và ngoài bạch cầu đa nhân trung tính. - Nuôi cấy: thấy khuẩn lạc dạng S, lấp lánh như giọt sương và có màu hơi xám. Lấy khuẩn lạc nhuộm Gram thấy song cầu hình hạt cà phê bắt màu Gram (-) đa hình thái. - Test Oxidase (+). - Test phân giải đường nhanh: glucose (+). Đủ những tiêu chuẩn trên kết luận: Neisseria gonorrhoeae (+) 2.3.6. Kỹ thuật kháng sinh đồ Cả hai kỹ thuật kháng sinh đồ (khuếch tán trên thạch và E-test xác định MIC) được thử nghiệm song song với chủng chuẩn quốc tế (do WHO cung cấp) một tuần một lần. + Kỹ thuật khuếch tán trên thạch (xem phụ lục 4) Tiến hành theo kỹ thuật khuếch tán trên thạch của WHO khuyến cáo cho chương trình giám sát kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu khu vực châu á Thái Bình Dương [153]. - Sử dụng môi trường Thayer-Martin không có chất ức chế: lấy khuẩn lạc vi khuẩn lậu nuôi cấy 18-24 giờ, hoà đều với nước muối sinh lý 0,9%, so với độ đục tiêu chuẩn Mc Farland 0,5 (tương đương với 3 x108 vi khuẩn/1ml).
47 Dùng pipette Pasteur hút huyền dịch láng đều lên bề mặt đĩa thạch có đường kính 9 cm với độ dày 4 mm. Hút bỏ huyền dịch thừa trên mặt đĩa thạch. - Để khô mặt thạch ở nhiệt độ phòng. - Đặt các khoanh giấy kháng sinh lên mặt đĩa thạch (đường kính 9 cm, đặt 6 khoanh). Khoanh giấy cách thành đĩa thạch 1 cm. - Để khoảng 10 phút cho kháng sinh khuếch tán đều. - ủ tủ ấm 35-360 C, 3-10% CO2, độ ẩm > 70%. Đọc kết quả sau 18-24 giờ, đo đường kính vùng ức chế tính bằng mm. *Kỹ thuật làm chứng kháng sinh đồ Sử dụng vi khuẩn lậu (chủng chuẩn quốc tế) áp dụng mỗi tuần một lần song song với các chủng thử nghiệm. Đọc kết quả và so sánh với độ nhạy của chủng chuẩn. Từ đó đánh giá chất lượng môi trường và chất lượng khoanh giấy kháng sinh và kỹ thuật của người làm thử nghiệm. Đánh giá kết quả: Phân loại mức độ nhạy cảm của vi khuẩn lậu thành 3 mức theo bảng giới hạn cho chủng mẫu: S (Susceptible): nhạy cảm; I (Intermediate): trung gian; R (Resistant): đề kháng. Bảng 2.3. Giới hạn đường kính vùng ức chế xếp loại mức độ nhạy cảm (tính bằng mm) [107]. Các kháng sinh Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Ký hiệu Đề kháng Trung gian Nhạy cảm Azithromycin AZM ≤ 13 14-17 ≥ 18 Cefotaxim CTX − − > 31 Ceftriaxon CRO − − ≥ 35 Ciprofloxaxin CIP ≤ 27 28-40 ≥ 41 Penicillin G PG ≤ 26 27-46 ≥ 47
48 Spectinomycin SPT ≤ 14 15-17 ≥ 18 Tetracyclin TE ≤ 30* 31-37 ≥ 38 (*: TRNG đường kính vùng ức chế thường < 20 mm) Tất cả các lần thử nghiệm, kết quả đường kính vùng ức chế của các khoanh giấy kháng sinh trên chủng mẫu đều nằm trong giới hạn cho phép; chứng tỏ các yếu tố kỹ thuật đảm bảo chất lượng, từ đó tôi có thể khảng định rằng kết quả kháng sinh đồ ở các chủng vi khuẩn lậu phân lập được là chính xác. + Kỹ thuật xác định MIC của vi khuẩn lậu (E-test) (xem phụ lục 5) [150]. Nguyên lý của kỹ thuật: các thanh giấy E-test của hãng AB-BIODISK Thụy Điển đã thấm kháng sinh từ nồng độ cao xuống nồng độ thấp. Nồng độ kháng sinh nhỏ nhất ức chế được sự phát triển của vi khuẩn (biểu hiện là vi khuẩn không mọc được) thì đó là MIC. Nhất thiết phải kiểm tra kết quả MIC của các chủng mẫu quốc tế với kết quả đã biết trước. Nếu kết quả của các chủng mẫu không đúng theo quy định, thí nghiệm sẽ được thực hiện lại. Tiến hành theo kỹ thuật thường quy của WHO. Các bước tiến hành: - Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc vi khuẩn lậu nuôi cấy 18-24 giờ. - Hoà đều vi khuẩn với nước muối sinh lý 0,9%. - So với độ đục tiêu chuẩn Mc Farland 0,5. - Dùng tăm bông vô khuẩn nhúng vào huyền dịch, ép tăm bông vào thành trong của ống huyền dịch, loại bỏ huyền dịch thừa. - Ria tăm bông lên bề mặt môi trường sao cho các đường ria liền nhau. - Để khô mặt thạch ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút. - Đặt các thanh giấy kháng sinh E-test. Để khoảng 10-15 phút ở nhiệt độ phòng cho kháng sinh ở các thanh giấy khuyếch tán đều. - Để vào tủ ấm nhiệt độ 35-36o C, nồng độ CO2 3-10%, độ ẩm >70%.
49 - Sau 18-24 đọc kết quả. Cách đọc kết quả: - Khi vùng ức chế 2 bên thanh thử rõ ràng, kết quả MIC được đánh giá ứng với nồng độ kháng sinh in trên thanh thử tại góc bị ức chế. - Khi vùng ức chế 2 bên thanh thử không đều nhau, kết quả được đánh giá ở phía vùng ức chế có giá trị nồng độ kháng sinh cao hơn. - Khi vùng ức chế vi khuẩn thấp hơn giá trị nhỏ nhất của thanh thử, kết quả được đánh giá là nhỏ hơn giá trị thấp nhất của nồng độ kháng sinh in trên thanh thử. - Khi vi khuẩn phát triển dọc theo 2 bên thanh thử, kết quả được đánh giá ở giá trị nồng độ kháng sinh cao nhất. Bảng 2.4. Giới hạn MIC của một số kháng sinh với vi khuẩn lậu xếp loại theo mức độ nhạy cảm [107]. Tên kháng sinh Nhạy cảm (µg/ml) Trung gian (µg/ml) Đề kháng (µg/ml) Ceftriaxon ≤ 0,25 − − Penicillin ≤ 0,06 − ≥ 2 Spectinomycin ≤ 32 − ≥ 128 Ciprofloxacin ≤ 0,06 − ≥ 1 Tetracyclin ≤ 0,25 < 2 ≥ 2 2.4. Kĩ thuật PCR 2.4.1. Sinh phẩm và hóa chất Kit chiết tách: “QIAamp DNA Mini and Blood Mini Kit” của hãng Qiagen. 2.4.2. Kỹ thuật PCR phát hiện vi khuẩn lậu trong bệnh phẩm Quy trình kỹ thuật PCR phát hiện vi khuẩn lậu trong bệnh phẩm được thực hiện theo hướng dẫn của hãng Quiagen. 2.4.2.1. Quy trình tách chiết ADN
50 + Cắt đầu tăm bông cho vào tuýp ly tâm 1,5 ml. + Thêm 200 µl PBS. + Thêm 20 µl proteinase K, trộn đều bằng pipet. + Thêm 200 µl buffer AL, trộn đều 10 giây. + ủ 560 C trong 10 phút, ly tâm ngắn. + Thêm 200 µl cồn tuyệt đối, trộn đều 10 giây, ly tâm ngắn. + Hút tất cả dịch vào cột chiết tách. + Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần dịch lọc, chuyển sang tuýp thu dịch rửa khác. + Thêm 500 µl buffer rửa AW1, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần dịch lọc, chuyển sang tuýp thu dịch rửa khác. + Thêm 500 µl buffer rửa AW2, ly tâm 15.000 vòng/phút trong 3 phút, bỏ phần dịch lọc, chuyển sang tuýp ly tâm 1,5 ml. + Thêm 20 µl buffer AE vào chính giữa cột chiết tách. + Để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút. + Giữ ở -200 C. 2.4.2.2. Quy trình chạy PCR (Khuếch đại ADN) - Các thành phần tham gia phản ứng gồm Dung dịch đệm 10x 5 µl dNTPs 10 mM 1 µl MgCl2 50 mM 1,5 µl Taq polymerase 5UI/µl 0,5 µl Dung dịch ADN 5 µl Mồi xuôi HO1 10 µM 2,5 µl Mồi ngược HO3 10 µM 2,5 µl
51 Nước khử ion 32 µl Tổng thể tích cho 1 lần chạy PCR là 50 µl - Chu kỳ nhiệt: biến tính ADN ở 940 C trong 2 phút. Sau đó thực hiện 38 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: giai đoạn biến tính ADN ở 940 C trong 30 giây, giai đoạn gắn mồi ở 550 C trong 1 phút, giai đoạn kéo dài mồi ở 720 C trong 30 giây. Sau khi hoàn thành 38 chu kỳ, kết thúc phản ứng ở 720 C trong 5 phút. - Phát hiện sản phẩm khuếch đại gen: điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose 1,5% trong dung dịch đệm TBE 1x. Bản thạch sau khi chạy điện di được ngâm trong dung dịch ethidium bromide 0,5 µg/ml trong 30 phút, rửa qua
52 nước cất. Xem và chụp ảnh bản thạch trong buồng tối dưới ánh sáng cực tím, các băng ADN sẽ phát sáng. So sánh kích cỡ của sản phẩm với thang ADN chuẩn để kết luận sản phẩm có đặc hiệu cho vi khuẩn lậu hay không. 2.5. Quy trình giải trình tự gen 2.5.1. Quy trình PCR đối với gen gyrA và gen parC Quy trình PCR đối với gen gyrA và gen parC được thực hiện theo quy trình hướng dẫn của hãng Bio-Rad với trình tự mồi của gen gyrA và parC đã đề cập ở mục 2.2.3. Các hoá chất (hãng Bio-Rad) (Mỹ) - Taq polymerase 5 U/µl - dNTPs 10 mM - MgCl2 50 mM - Dung dịch đệm PCR 10x - Nước khử ion dùng trong sinh học phân tử Máy luân nhiệt: máy luân nhiệt i-Cycler (Bio-Rad, Mỹ). Chạy PCR (khuếch đại ADN): các thành phần tham gia phản ứng gồm Dung dịch đệm 10x 5 µl dNTP 10 mM 1 µl MgCl2 50 mM 1,5 µl Taq polymerase 5 UI/µl 0,5 µl Dung dịch ADN 5 µl Mồi xuôi 10 µM * 2,5 µl Mồi ngược 10 µM * 2,5 µl Nước khử ion 32 µl Tổng thể tích cho 1 lần chạy PCR là 50 µl. - Chu kỳ nhiệt Biến tính ADN ở 930 C trong 3 phút. Sau đó thực hiện 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: giai đoạn biến tính ADN ở 930 C trong 30 giây, giai * Xem trang 39: "Mồi để xác định gen kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu"
53 đoạn gắn mồi ở 520 C trong 1 phút, giai đoạn kéo dài mồi ở 720 C trong 1 phút. Sau khi hoàn thành 35 chu kỳ, kết thúc phản ứng ở 720 C trong 5 phút. - Phát hiện sản phẩm khuếch đại gen Điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose 1,5% trong dung dịch đệm TBE 1x. Bản thạch sau khi chạy điện di được ngâm trong dung dịch ethidium bromid 0,5 µg/ml trong 30 phút, rửa qua nước cất. Xem và chụp ảnh bản thạch trong buồng tối dưới ánh sáng cực tím, các băng ADN sẽ phát sáng. Xác định PCR bằng cách so sánh kích cỡ của băng ADN với băng ADN của chứng dương (gyrA và parC). Sản phẩm PCR được dùng để giải trình tự. 2.5.2. Quy trình giải trình tự gen Quy trình giải trình tự đoạn gen có thể chứa đột biến được thực hiện theo quy trình hướng dẫn của hãng. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng MinElute PCR Purification Kit - Thêm 200 µl buffer PB vào 40 µl sản phẩm PCR, trộn đều bằng pipet. - Cho toàn bộ dịch vào cột chiết tách. - Ly tâm 13.000 vòng phút trong 1 phút. - Hút bỏ phần dịch lọc. - Thêm 750 µl buffer PE, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. - Hút bỏ dịch lọc. - Ly tâm thêm 20.000 vòng/phút trong 1 phút. - Chuyển cột chiết tách sang ống ly tâm 1,5 ml. - Thêm 20 µl Buffer EB vào chính giữa cột chiết tách. - Để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút. - Giữ ở -200 C. Pha hỗn hợp giải trình tự - Mồi giải trình tự là mồi xuôi và mồi ngược của PCR. - Giải trình tự bằng ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit.
54 - Pha Premix: mỗi phản ứng cần 8 µl premix với các thành phần sau:
55 5X sequencing buffer 4 µl dNTP mix 1 µl A dye terminator 0,5 µl C dye terminator 0,5 µl G dye terminator 0,5 µl T dye terminator 0,5 µl AmpliTaq 1 µl - Pha hỗn hợp phản ứng: Mỗi phản ứng có lượng là 20 µl, gồm các thành phần sau: Premix 8 µl Sản phẩm PCR sau tinh sạch: 5 µl Mồi * 3,2 pmol Nước cất vừa đủ 20 µl - Chạy phản ứng: 960 C trong 10 giây 960 C trong 10 giây 500 C trong 5 giây 600 C trong 4 phút 40 C trong 1 phút - Tinh sạch sản phẩm sau khi làm phản ứng giải trình tự gen (sequencing reaction): Thêm vào 20 µl sản phẩm sequencing: 3 µl KCH3COO 3M pH=7,0 14,5 µl nước cất 62,5 µl cồn 100% Để nhiệt độ phòng 15 phút. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút. Hút bỏ dịch nổi. * Xem trang 39: "Mồi để xác định gen kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu" 25 chu kỳ
56 Thêm 200 µl cồn 70%. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút. Làm khô. Hoà tan bằng 25 µl Final Buffer. - Đọc kết quả bằng máy ABI PRISM 310 của hãng Applied Biosystem. Trình tự các nucleotide ở các mẫu nghiên cứu được so sánh với trình tự nucleotide của gen gyrA và parC của các chủng vi khuẩn lậu gốc để tìm ra các điểm khác nhau với chủng gốc. 2.6. Y đức trong nghiên cứu - Tư vấn cho bệnh nhân: lấy dịch tiết chỉ để phục vụ cho việc chẩn đoán định hướng điều trị và có lợi cho bệnh nhân. - Tuyệt đối giữ bí mật: tất cả những thông tin về bệnh nhân như tên, tuổi, địa chỉ, nghề nghiệp... bằng cách đánh mã, số cho từng bệnh nhân. - Được sự đồng ý của Hội đồng Y đức. 2.7. địa điểm nghiên cứu - Khoa xét nghiệm Viện Da liễu Quốc Gia: thực hiện các kỹ thuật: nhuộm soi, nuôi cấy và làm kháng sinh đồ, kỹ thuật PCR phát hiện vi khuẩn lậu trên các mẫu bệnh phẩm, kỹ thuật PCR xác định đoạn gen gyrA và parC. - Labo trung tâm trường Đại học Y Hà Nội: so sánh, đối chiếu với kỹ thuật PCR với Viện Da liễu Quốc Gia: những lần so sánh đều trùng khớp. - Khoa xét nghiệm Viện các bệnh Truyền nhiễm Quốc Gia - Nhật Bản: giải trình tự đoạn gen gyrA và parC chứa đột biến. 2.8. Xử lý số liệu Số liệu xử lý theo chương trình SPSS 16.0 và Whonet 5. Sự khác biệt giữa hai tỷ lệ được phân tích bằng test χ2 giá trị P < 0,05 được coi là khác biệt có ý nghĩa thống kê. Các trình tự nucleotide và acid amin được phân tích bằng phần mềm Bioedit verson 7.0.9.0.
57 chương III kết quả nghiên cứu 3.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005-2007 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu từ năm 2005 đến năm 2007 Từ năm 2005 đến năm 2007, tất cả những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia, được tôi tiến hành chẩn đoán bằng các kỹ thuật xét nghiệm nuôi cấy và nhuộm soi. Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu từ năm 2005 đến năm 2007 (n=5.091) Kết quả Nhuộm soi Nuôi cấy Số bệnh nhân Tỷ lệ (%) Số bệnh nhân Tỷ lệ (%) Dương tính 471 9,3 503 9,9 Âm tính 4.620 90,7 4.588 90,1 Tổng số 5.091 100 5.091 100 Giá trị P 0,29 Nhận xét: Tỷ lệ phát hiện được vi khuẩn lậu bằng phương pháp nhuộm soi là 9,3% và bằng phương pháp nuôi cấy là 9,9%. Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). 3.1.2. Những yếu tố liên quan đến tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu
Trong tổng số 5.0 được bác sĩ lâm sàng c liễu Quốc Gia từ năm 2 để tiến hành điều tra về 3.1.2.1. Thể bệnh Bảng 3.2. Kết quả phát h ệ Thể bệnh n Cấp tính 86 Mạn tính 414 Tổng số 500 Biểu đồ 3.1 Nhận xét: Tỷ lệ phát hiện đ niệu đạo, âm đạo cấp tí đoán là hội chứng tiết dị Sự khác biệt có ý nghĩa thố 0 40 80 120 Tỷ lệ % 58 ố 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệ g chẩn đoán nhiễm vi khuẩn lậu đến khám ă 2005 đến năm 2007, tôi chọn ngẫu nhiên 5 về thông tin cá nhân. t hiện vi khuẩn lậu theo thể bệnh (n=141) Dương tính Tỷ lệ (%) 80 93,0 61 14,7 141 28,2 ồ .1. Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu theo thể bện ệ được vi khuẩn lậu ở bệnh nhân được chẩn ấ tính chiếm tỷ lệ 93,0% và những bệnh nh ết dịch niệu đạo, âm đạo (mạn tính) chiếm tỷ ĩ thống kê (P < 0,05). CÊp tÝnh M¹n tÝnh 93.0 14.7 niệu đạo, âm đạo ám tại Viện Da n 500 bệnh nhân P < 0,05 ể ệnh ẩn đoán là viêm nhân được chẩn ế tỷ lệ 14,7%.
3.1.2.2. Theo giới Bảng 3.3. Số lượng bện Giới tính Nam giới Nữ giới Tổng số Biểu đồ Nhận xét: Số lượng bệnh nh chiếm tỷ lệ cao (64,4%) dễ tự phát hiện hơn. C chậm hơn, triệu chứng k Sự khác biệt có ý 59 ệnh nhân phân bố theo giới (n=500) Số bệnh nhân Tỷ lệ (%) 312 62,4 188 37,6 500 100 đồ 3.2. Tỷ lệ bệnh nhân phân bố theo giới nhân nam giới có hội chứng tiết dịch niệu đ %) vì những triệu chứng lâm sàng ở nam g ớ ơ . Còn ở bệnh nhân nữ, triệu chứng lâm s ứ g không rõ ràng nên tỷ lệ thấp hơn (37,6%) ý nghĩa thống kê (P < 0,05). 62.4% 37.6% Nam giíi N÷ giíi P < 0,05 ệu đạo đến khám giới, bệnh nhân sàng tiến triển ).
Bảng 3.4. Kết quả phát Giới tính Âm Nam giới 217 (6 Nữ giới 142 (7 Tổng số 359 (7 Biểu đồ 3.3. Kế Nhận xét: Tỷ lệ phát hiện đ so với 24,5%). Sự khác biệt khôn 0 8 16 24 32 40 Tỷ lệ % 60 át hiện vi khuẩn lậu phân bố theo giới (n=1 tính Dương tính Tổng cộng (69,6%) 95 (30,4%) 312 (100%) (75,5%) 46 (24,5%) 188 (100%) (71,8%) 141 (28,2%) 500 (100%) Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố the ệ được vi khuẩn lậu ở nam giới cao hơn ở nữ hông có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Nam giíi N÷ giíi 30.4 24.5 n=141) P 0,14 ố heo giới ở nữ giới (30,4%
3.1.2.3. Nhóm tuổi Bảng 3.5. Số lượng bện Lứa tuổi 0-15 16-20 21-30 31-40 41-50 > 51 Tổng số Biểu đồ 3.4 Nhận xét: Số lượng bệnh n (47,0%) và 31-40 (32,8 0 20 40 60 0-15 0.2 Tỷ lệ % 61 ệnh nhân phân bố theo nhóm tuổi (n=500) Số bệnh nhân Tỷ ệ 1 16 235 4 164 3 66 1 18 500 ồ 3.4. Tỷ lệ bệnh nhân phân bố theo nhóm tuổ ệ nhân đến khám bệnh tập trung vào nhó ,8%), vì đây là lứa tuổi hoạt động tình dục 16-20 21-30 31-40 41-50 >50 3.2 47.0 32.8 13.2 3. ỷ lệ (%) 0,2 3,2 47,0 32,8 13,2 3,6 100 tuổi hóm tuổi 21-30 ục mạnh. 50 3.6
Bảng 3.6. Kết quả phát Lứa tuổi Âm t 0-15 0 16-20 11 21-30 16 31-40 12 41-50 50 >51 12 Biểu đồ 3.5. Kết q Nhận xét: Tỷ lệ phát hiện đ 40 cao (31,9% và 23,2 không có ý nghĩa thống 0 20 40 16-2 31.3 Tỷ lệ % 62 át hiện vi khuẩn lậu phân bố theo nhóm tuổ tính Dương tính Tỷ lệ (%) 0 1 11 5 31,3 160 75 31,9 126 38 23,2 50 16 24,2 12 6 33,3 ết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo n ệ được vi khuẩn lậu ở nhóm tuổi 21-30 và n ,2%). Lứa tuổi 0-15 chỉ có 1 bệnh nhân. ống kê (P > 0,05). 20 21-30 31-40 41-50 >50 .3 31.9 23.2 24.2 33. uổi (n=141) P > 0,05 nhóm tuổi à nhóm tuổi 31- n. Sự khác biệt 3.3
3.1.2.4. Nghề nghiệp Bảng 3.7. Số lượng bện Nghề nghiệp Học sinh, sinh viên Tự do Nông dân Công nhân Cán bộ Lái xe Khác Tổng số Biểu đồ 3.6. Nhận xét: Số lượng bệnh nhâ (22,0%) do có trình độ 0 10 20 30 HSSV 7.0 Tỷ lệ % 63 ệnh nhân phân bố theo nghề nghiệp (n=500 Số bệnh nhân Tỷ ệ 35 79 1 59 1 49 110 2 29 139 2 500 .6. Tỷ lệ bệnh nhân phân bố theo nghề nghiệ hân có thông tin nghề nghiệp là cán bộ ch ộ nhận thức về bệnh LTQĐTD. Nghề khá Tù do N«ng d©n C«ng nh©n C¸n bé L¸i xe 15.8 11.8 9.8 22.0 5.8 500) ỷ lệ (%) 7 15,8 11,8 9,8 22,0 5,8 27,8 100 hiệp ộ chiếm tỷ lệ cao ề hác cũng chiếm Kh¸c 27.8
tỷ lệ cao (27,8%). Bảng 3.8. Kết quả phát Nghề nghiệp Học sinh, sinh viên Tự do Nông dân Công nhân Cán bộ Lái xe Khác Tổng số Biểu đồ 3.7. Kết quả Nhận xét 0 10 20 30 40 HSSV 28.6 Tỷ lệ % 64 át hiện vi khuẩn lậu phân bố theo nghề ngh ệ N n (%) Âm tính Dương tính 35 25 (71,4) 10 (28,6) 79 58 (73,4) 21 (26,6) 59 44 (74,6) 15 (25,4) 49 34 (69,4) 15 (30,6) 110 82 (74,6) 28 (25,5) 29 19 (65,5) 10 (34,5) 139 97 (69,8) 42 (30,2) 500 359 (71,8) 141 (28,2) ế quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo ng Tù do N«ng d©n C«ng nh©n C¸n bé L¸i xe 26.6 25.4 30.6 25.5 34.5 ghiệp (n=141) P > 0,05 nghề nghiệp Kh¸c 4.5 30.2
Tỷ lệ phát hiện đ nghề có thông tin là cán biệt không có ý nghĩa thố 3.1.2.5. Nguồn lây Bảng 3.9. Số lượng bện Nguồn lây Bạn tình Vợ chồng Mại dâm Khác Tổng số Biểu đồ 3.8 Nhận xét: Số lượng bệnh nhân 0 16 32 48 B¹n t× 39.2 Tỷ lệ % 65 ệ được vi khuẩn lậu theo nghề nghiệp tập tr án bộ 25,5%, lái xe 34,5% và công nhân 30 ĩ thống kê (P > 0,05). ệnh nhân phân bố theo nguồn lây (n=500) Số bệnh nhân Tỷ ệ 196 3 188 3 90 1 26 500 ồ 3.8. Tỷ lệ bệnh nhân phân bố theo nguồn lâ ân có nguồn lây từ bạn tình và vợ chồng c ×nh Vî chång M¹i d©m Kh¸c .2 37.6 18.0 5.2 ậ trung vào nhóm n 30,6%. Sự khác ỷ lệ (%) 39,2 37,6 18,0 5,2 100 ồn lây g chiếm tỷ lệ cao
(39,2% và 37,6%). Bảng 3.10. Kết quả phá Nguồn lây N Bạn tình 19 Vợ chồng 18 Mại dâm 90 Khác 26 Tổng số 50 Biểu đồ 3.9. Kết q Nhận xét: Tỷ lệ phát hiện đ 0 16 32 48 B¹n t×n 32.1 Tỷ lệ % 66 ả hát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo nguồn lâ N n (%) Âm tính Dương tính 196 133 (67,9) 63 (32,1) 188 146 (77,7) 42 (22,3) 90 64 (71,1) 26 (28,9) 26 16 (61,5) 10 (38,5) 500 359 (71,8) 141 (28,2) ết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo n ệ được vi khuẩn lậu theo nguồn lây vào nh nh Vî chång M¹i d©m Kh¸c 22.3 28.9 38 ồ lây (n=141) P > 0,05 nguồn lây nhóm nguồn lây ¸c 8.5
là bạn tình và vợ chồng thống kê (P > 0,05). 3.1.2.6. Trình độ học vấ Bảng 3.11. Số lượng bệ Học vấn Tiểu học Trung học cơ sở (T Trung học phổ thông Cao đẳng - Đại Trên đại học Tổng số Biểu đồ 3.10. T Nhận xét: 0 16 32 48 TiÓu häc 8.2 Tỷ lệ % 67 ồng cao (32,1% và 22,3%). Sự khác biệt khô ọc vấn bệnh nhân phân bố theo trình độ học vấn (n Số bệnh nhân Tỷ lệ 41 8 ở (THCS) 81 16 ng (THPT) 194 38 ại học 175 35 ọc 9 1 500 1 Tỷ lệ bệnh nhân phân bố theo trình độ họ THCS THPT C§-§H T 16.2 38.8 35.0 hông có ý nghĩa (n=500) ỷ lệ (%) 8,2 16,2 38,8 35,0 1,8 100 ọc vấn Trªn ®¹i häc 1.8
Số lượng bệnh n nhóm trình độ học vấn phản ánh đúng về mặt bằ Bảng 3.12. Kết quả ph (n=141) Học vấn Tiểu học Trung học cơ sở (TH Trung học phổ thôn (THPT) Cao đẳng - Đại họ Trên đại học Tổng số 0 13 26 39 TiÓu häc 19.5 Tỷ lệ % 68 nhân có triệu chứng lâm sàng đến khám ấn THPT (38,8%) và Cao đẳng - Đại học ặt bằng trình độ học vấn của xã hội nước ta ả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo trìn N n (%) Âm tính Dương tín 41 33 (80,5) 8 (19,5) HCS) 81 53 (65,4) 28 (34,6) ông 194 130 (67,0) 64 (33,0) ạ học 175 135 (77,1) 40 (22,9) 9 8 (88,9) 1 (11,1) 500 359 (71,8) 141 (28,2) THCS THPT C§-§H Trªn ®¹i h 34.6 33.0 22.9 11.1 m tập trung vào ọc (35,0%) cũng ta hiện nay. ình độ học vấn P ính > 0,05 ) ) ) ,2) häc .1
69 Biểu đồ 3.11. Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo trình độ học vấn Nhận xét: Tỷ lệ phát hiện được vi khuẩn lậu theo học vấn tập trung vào nhóm học vấn THPT (33,0%) và Cao đẳng-Đại học (22,9%), sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). 3.2. So sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, nhuộm soi và nuôi cấy 3.2.1. Kết quả PCR xác định vi khuẩn lậu của các bệnh nhân Marker 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Marker Hình 3.1. Kết quả PCR xác định vi khuẩn lậu của 8 bệnh nhân từ giếng 3-10 Thang ADN mẫu (marker): 100 bp Giếng 1: chứng âm. Giếng 2: chứng dương. Giếng 5 và 10: bệnh nhân có kết quả dương tính. Giếng 3, 4, 6, 7, 8 và 9: bệnh nhân có kết quả âm tính. 100 bp 390 bp 400 bp
3.2.2. Kết quả phát hiệ nuôi cấy Trong thời gian ừ bệnh nhân có hội chứng đoán nghi nhiễm vi khuẩ kỹ thuật nhuộm soi, nuô Bảng 3.13. Kết quả ph nuôi cấy (n=500) Kết quả Kỹ thuật Nhuộm soi Nuôi cấy PCR 0 12 24 36 Nhué 10 Tỷ lệ % 70 hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, n n từ năm 2005 đến năm 2007, tôi chọn ngẫ ứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo được bác sĩ l huẩn lậu, xét nghiệm tìm vi khuẩn lậu đồn uôi cấy và PCR. ả phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, uả Dương tính Âm Số bệnh nhân % Số bệnh nh 53 10,6 447 65 13,0 435 141 28,2 359 uém soi Nu«i cÊy PCR 10.1 13.0 28.2 , nhuộm soi và ọn ngẫu nhiên 500 sĩ lâm sàng chẩn đồng thời bằng 3 R, nhuộm soi và tính nhân % 89,4 87,0 71,8
Biểu đồ của 3 Nhận xét: Tỷ lệ phát hiện đ thuật nuôi cấy là 13,0% 3.2.3. Kết quả xét ngh ệ soi, nuôi cấy trên nhóm Nhóm 1: Bệnh nhân đư Nhóm 2: Bệnh nhân đư (mạn tính). Bảng 3.14. Tỷ lệ phát hiệ cấy ở 2 nhóm (n=500) Nhóm nghiên cứu Số bệnh nhân Dươ tí Nhóm 1 86 5 Nhóm 2 414 P (nhóm 1 và 2) 0 40 80 120 Nhué 58.1 Tỷ lệ % 71 ể đồ 3.12. Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu ủ 3 kỹ thuật PCR, nhuộm soi và nuôi cấy ệ được vi khuẩn lậu của kỹ thuật nhuộm so %. Đặc biệt kỹ thuật PCR đã phát hiện đượ ghiệm tìm vi khuẩn lậu của ba kỹ thuật óm 1 và nhóm 2 ược chẩn đoán là viêm niệu đạo, âm đạo c được chẩn đoán là hội chứng tiết dịch niệu đạ hiện vi khuẩn lậu bằng kỹ thuật PCR, nhuộm Nhuộm soi Nuôi cấy ương tính % Dương tính % Dươ tín 50 58,1 57 66,3 8 3 0,7 8 1,9 6 < 0,05 < 0,05 ém soi Nu«i cÊy PCR 66.3 93.0 0.7 1.9 14.7 Nh Nh soi là 10,6%, kỹ ợc 28,2%. ật PCR, nhuộm cấp (cấp tính). ệu đạo, âm đạo ộm soi và nuôi PCR ương tính % 80 93,0 61 14,7 < 0,05 hãm 1 hãm 2
72 Biểu đồ 3.13. Tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu bằng kỹ thuật PCR, nhuộm soi và nuôi cấy ở 2 nhóm Nhận xét: tỷ lệ phát hiện được vi khuẩn lậu bằng kỹ thuật PCR ở nhóm 1 là 93,0%. ở nhóm 2 kỹ thuật PCR đã phát hiện được 14,7% bệnh nhân trong khi đó kỹ thuật nuôi cấy chỉ phát hiện được 1,9% bệnh nhân và kỹ thuật nhuộm soi phát hiện 0,7% bệnh nhân. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P <0,05). 3.3. kết quả kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu năm 2005-2007 3.3.1. Mức độ nhạy cảm với kháng sinh năm 2005 Bảng 3.15. Mức độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm chính năm 2005 (n=162) Tên kháng sinh n (%) Nhạy cảm Trung gian Đề kháng Penicillin 62 (38,3%) 43 (26,5%) 57 (35,2%) Ceftriaxon 162 (100%) 0 0 Ciprofloxacin 31 (19,1%) 35 (21,6%) 96 (59,3%) Spectinomycin 162 (100%) 0 0 Tetracyclin TRNG: 16 (9,9%) Tỷ lệ %
Biểu đồ 3.14. Mức đ Nhận xét: Vi khuẩn lậu kh Không thấy sự đề kháng Bảng 3.16. Mức độ n (n=162) Tên kháng sinh Azithromycin Cefotaxim 0 40 80 120 Penicillin 38.3 26.5 35.2 Tỷ lệ % 73 ức độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm chính ậ kháng ciprofloxacin cao nhất (tổng khán áng với ceftriaxon và spectinomycin. độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm bổ su n (%) Nhạy cảm Trung gian Đ 153 (94,4%) 9 (5,6%) 160 (98,8%) 2 (1,2%) Ciprofloxacin 100 19.1 100 0 21.6 0 .2 0 59.3 0 Nh¹y c¶m Trung gian §Ò kh¸ng nh năm 2005 áng là 80,9%). ổ sung năm 2005 Đề kháng 0 0 Tetracyclin 9.9
Biểu đồ 3.15. Mức độ Nhận xét: Tuy không có ch sung nhưng có 5,6% số và 1,2% số chủng giảm 3.3.2. Mức độ nhạy cảm Bảng 3.17. Mức độ nhạ Tên kháng sinh Penicillin Ceftriaxon Ciprofloxacin Spectinomycin Tetracyclin 0 20 40 60 80 100 120 Az 94 Nh Tỷ lệ % 74 ứ độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm bổ sung chủng nào đề kháng với 2 kháng sinh th ố chủng giảm nhạy cảm (trung gian) với ảm nhạy cảm với cefotaxim. ảm với kháng sinh năm 2006 hạy cảm với kháng sinh nhóm chính năm 2 n (%) Nhạy cảm Trung gian Đ 97 (45,8%) 49 (23,1%) 66 212 (100%) 0 38 (17,9%) 54 (25,5%) 12 212 (100%) 0 TRNG: 35 (16,5%) Azithromycin Cefotaxime 4.4 98.8 5.6 1.20 0 h¹y c¶m Trung gian §Ò kh¸ng ng năm 2005 nh thuộc nhóm bổ ới azithromycin ă 2006 (n=212) Đề kháng 66 (31,1%) 0 120 (56,6%) 0
Biểu đồ 3.16. Mức đ Nhận xét: Mức độ đề khán hơn năm 2005, nâng m đề kháng nào với ceftria Bảng 3.18. Mức độ n (n=212) Tên kháng sinh Azithromycin Cefotaxim 0 40 80 120 Penicillin 45.8 23.1 31 Tỷ lệ % 75 ức độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm chính áng với ciprofloxacin của vi khuẩn lậu nă mức tổng kháng lên 82,1%. Tôi vẫn khôn triaxon và spectinomycin. độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm bổ su n (%) Nhạy cảm Trung gian Đ 208 (98,1%) 4 (1,9%) 210 (99,1%) 2 (0,9%) Ceftriaxone Ciprofloxacin Spectinomyci 100 17.9 100 0 25.5 0 31.1 0 56.6 0 Nh¹y cam Trung gian §Ò kh¸ng nh năm 2006 ậ năm 2006 tăng ông tìm thấy sự ung năm 2006 Đề kháng 0 0 cin Tetracyclin 16.5
Biểu đồ 3.17. Mức độ Nhận xét: tuy không có sung nhưng có 1,9% số chủng giảm nhạy cảm vớ 3.3.3. Mức độ nhạy cảm Bảng 3.19. Mức độ nhạ Tên kháng sinh Penicillin Ceftriaxon Ciprofloxacin Spectinomycin 0 30 60 90 120 Az 98 Nh 76 ứ độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm bổ sung có chủng nào đề kháng với 2 kháng sinh th ố chủng giảm nhạy cảm với azithromycin ả với cefotaxim. ảm với kháng sinh năm 2007 hạy cảm với kháng sinh nhóm chính năm 2 n (%) Nhạy cảm Trung gian Đ 75 (58,1%) 6 (4,7%) 48 129 (100%) 0 14 (10,8%) 45 (34,9%) 70 129 (100%) 0 Azithromycin Cefotaxime 8.1 99.1 1.9 0.9 0 0 Nh¹y c¶m Trung gian §Ò kh¸ng ng năm 2006 nh thuộc nhóm bổ in và 0,9% số ă 2007 (n=129) Đề kháng 48 (37,2%) 0 70 (54,3%) 0
Tetracyclin Biểu đồ 3.18 : Mức đ Nhận xét: mức độ đề tăng hơn năm 2006, nân sự đề kháng nào với cef Bảng 3.20. Mức độ n (n=129) Tên kháng sinh Azithromycin Cefotaxim 0 40 80 120 Penicillin 57.1 4.7 37 Tỷ lệ % 77 TRNG: 48 (37,5%) (n=128) ức độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm chính ề kháng với ciprofloxacin của vi khuẩn ậ âng mức tổng kháng lên 89,2%. Tôi vẫn k ceftriaxon và spectinomycin. độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm bổ su n (%) Nhạy cảm Trung gian Đ 128 (99,2%) 1 (0,8%) 125 (96,9%) 4 (3,1%) Ciprofloxacin 100 10.8 100 0 34.9 0 37.2 0 54.3 0 Nh¹y c¶m Trung gian §Ò kh¸ng nh năm 2007 ẩn lậu năm 2007 ẫn không tìm thấy ung năm 2007 Đề kháng 0 0 Tetracyclin 37.5
Biểu đồ 3.19. Mức độ Nhận xét: Tuy không có ch sung nhưng có 0,8% số chủng giảm nhạy cảm vớ 3.3.4. So sánh mức độ đ Bảng 3.21. So sánh mức Kháng sinh 2 Penicillin 1 Ceftriaxon 0 30 60 90 120 Az 99 Nh Tỷ lệ % 78 ứ độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm bổ sung chủng nào đề kháng với 2 kháng sinh thuộc ố chủng giảm nhạy cảm với azithromycin ả với cefotaxim. độ đề kháng trong ba năm 2005-2006-200 ức độ đề kháng trong ba năm 2005-2006-2 Tổng kháng (R+I) (%) 2005 (n=162) 2006 (n=212) 20 100 (61,7%) 115 (54,2%) 5 0 0 Azithromycin Cefotaxime 9.2 96.9 0.8 3.1 0 0 Nh¹y c¶m Trung gian §Ò kh¸ng ng năm 2007 ộc nhóm bổ in và 3,1% số 007 2007 2007 (n=129) 54 (41,9%) 0
Ciprofloxacin 1 Spectinomycin Tetracyclin Azithromycin Cefotaxim Biểu đồ 3.20. So sán Nhận xét: trong ba nă penicillin có xu hướng 54,2% và 41,9%). Với lên (80,9%; 82,1% và 8 3.4. đột biến gen liên qu 3.4.1. Kết quả điện di sả 1 2 0 20 40 60 80 100 Penicillin 61.7 54.2 41.9 Tỷ lệ % 79 131 (80,9%) 174 (82,1%) 1 0 0 16 (9,9%) 35 (16,5%) 4 9 (5,6%) 4 (1,9%) 2 (1,2%) 2 (0,9%) sánh mức độ đề kháng trong ba năm 2005-2 năm 2005-2006-2007 sự đề kháng của vi ớng giảm dần (với mức tổng kháng lần l ới ciprofloxacin, xu hướng này lại có chiề 89,1%). quan đến kháng ciprofloxacin sản phẩm PCR xác định đoạn gen gyrA 3 4 5 6 7 8 9 Ciprofloxacin Tetracycline Azithromycin 80.9 9.9 5.6 82.1 16.5 1.9 .9 89.1 37.5 0.8 2005 2006 2007 115 (89,1%) 0 48 (37,5%) 1 (0,8%) 4 (3,1%) 2006-2007 i khuẩn lậu với ầ lượt là 61,7%, hiều hướng tăng 10 in Cefotaxim 1.2 0.9 3.1
80 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen gyrA Giếng 1: chứng âm; Giếng 2: chứng dương, Giếng 3: thang ADN 100 bp Giếng 4 đến 10: kết quả dương tính 3.4.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen parC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen parC Giếng 1: chứng âm; Giếng 2: chứng dương, Giếng 3: thang ADN 100 bp Giếng 4 đến 10: kết quả dương tính 279 bp 255 bp
81 3.4.3. Kết quả giải trình tự nucleotid đoạn gen gyrA chứa đột biến Hình 3.4. Trình tự nucleotid của đoạn gen gyrA chứa đột biến 77
82 Hình 3.5. Trình tự nucleotid của đoạn gen gyrA chứa đột biến 3.4.4. Kết quả giải trình tự nucleotid đoạn gen parC chứa đột biến 78
83 Hình 3.6. Trình tự nucleotid của đoạn gen parC chứa đột biến Hình 3.7. Trình tự nucleotid của đoạn gen parC chứa đột biến 79
84 80
85 3.4.5. Phân tích trình tự đoạn ADN thường xảy ra đột biến dẫn tới kháng ciprofloxacin Bảng 3.22. Phân tích trình tự đoạn ADN thường xảy ra đột biến dẫn tới kháng ciprofloxacin (n=71) Chủng MIC (µg/ml) GyrA ParC ATCC 49226 0,001 Ser-91 Asp-95 Asp-86 Ser-87 Glu-91 63 0,002 27 0,060 67 1 Phe Ala Asn 69 1 Phe Ala 73 1 Phe Ala Asn 21 1,5 Phe Ala 28 1,5 Phe Gly Asn 47 1,5 Phe Gly 75 1,5 Phe Ala 2 2 Phe Ala 20 2 Phe Gly 23 2 Phe Gly Arg 26 2 Phe Ala 39 2 Phe Ala Asn 45 2 Phe Ala Asn 56 2 Phe Ala 60 2 Phe Ala 62 2 Phe Ala 64 2 Phe Ala 15 3 Phe Ala Arg 33 3 Phe Ala Asn 34 3 Phe Ala Asn 36 3 Phe Ala Asn 37 3 Phe Gly Asn 40 3 Phe Ala Asn 41 3 Phe Ala Arg 11 4 Phe Gly Asn 12 4 Phe Ala Asn 13 4 Phe Ala Asn 46 4 Phe Ala Asn 54 4 Phe Ala Asn 8 6 Phe Gly Asn 9 6 Phe Ala Asn 17 6 Phe Ala Asn
86 19 6 Phe Ala Asn 24 6 Phe Ala Asn 42 6 Phe Ala Asn 43 6 Phe Ala Asn 66 6 Phe Ala Asn 4 12 Phe Ala Asn 32 12 Phe Ala Asn 38 12 Phe Ala Asn 49 12 Phe Ala Asn 51 12 Phe Ala Asn 53 12 Phe Gly Arg 55 12 Phe Ala Asn 61 12 Phe Ala Asn 68 12 Phe Ala Asn 71 12 Phe Ala Asn 30 16 Phe Ala Gln 1 32 Phe Asn Ile 5 32 Phe Gly Arg 6 32 Phe Asn Ile 10 32 Phe Asn Ile 16 32 Phe Gly Gln 18 32 Phe Gly Gln 22 32 Phe Gly Gln 25 32 Phe Gly Arg 29 32 Phe Asn Ile 35 32 Phe Gly Arg 44 32 Phe Gly Arg 48 32 Phe Gly Arg 52 32 Phe Asn Ile 57 32 Phe Gly Gln 58 32 Phe Gly Arg 59 32 Phe Ala Ile 65 32 Phe Ala Arg 70 32 Phe Gly Arg 72 32 Phe Ala Asn 74 32 Phe Asn Ile 14 32 Phe Ala Asn Ghi chú: Ô trống là giống với chủng chuẩn. Nhận xét: chủng vi khuẩn lậu số 27 và 63 là những chủng nhạy cảm với
87 ciprofloxacin. Những chủng còn lại là những chủng đề kháng với ciprofloxacin được xếp theo MIC. 3.4.6. Số lượng đột biến trên 2 gen gyrA và parC theo mức độ kháng ciprofloxacin Bảng 3.23. Số lượng đột biến trên 2 gen gyrA và parC theo mức độ kháng ciprofloxacin (n=69) MIC (µg/ml) Số chủng (n = 69) Tỷ lệ (%) Số lượng đột biến Tổng số Trên gyrA Trên parC 1 3 4,3 2 0-1 2-3 1,5 4 5,8 2 0-1 2-3 2 10 14,5 2 0-1 2-3 3 7 10,1 2 1 3 4 5 7,2 2 1 3 6 8 11,6 2 1 3 12 10 14,5 2 1 3 16 1 1,4 2 1 3 32 21 30,4 2 1 3 Tổng 69 100 18 6-9 24-27 Nhận xét: trong 71 chủng nghiên cứu, có 2 chủng nhạy cảm với ciprofloxacin và 69 chủng kháng với ciprofloxacin. Những chủng đề kháng với MIC ≤ 2 µg/ml có 2 hoặc 3 đột biến trên 2 gen gyrA và parC, những chủng đề kháng với MIC ≥ 3 µg/ml đều có 3 đột biến trên 2 gen nói trên. Như vậy, mức độ đề kháng có liên quan đến số lượng các đột biến.
88 3.4.7. Phân tích các đột biến trên gen gyrA Bảng 3.24. Phân tích các đột biến trên gen gyrA của 69 chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin (n=69) Loại đột biến (n=69) Số chủng (%) MIC trung bình (µg/ml) Ser-91 → Phe 69 (100) 14,4 Asp-95 → Ala 44 (63,8) 9,5 Asp-95 → Gly 19 (27,5) 20,2 Asp-95 → Asn 6 (8,7) 32,0 Nhận xét: Tất cả 69 chủng đề kháng ciprofloxacin đều có đột biến Ser-91 thành Phe. Trong khi đó 2 chủng nhạy cảm với ciprofloxacin không mang đột biến này. Ngoài ra, trên gen gyrA còn phát hiện đột biến tại Asp-95 ở tất cả các chủng kháng ciprofloxacin với 3 kiểu đột biến là Asp-95 thành Ala, Asp-95 thành Asn và Asp-95 thành Gly. Hai đột biến ở Ser-91 và Asp-95 ở gen gyrA được thấy ở tất cả các chủng kháng ciprofloxacin. Đột biến ở Ser-91 luôn được chuyển thành Phe. ở Asp-95 có 3 dạng thay đổi và 3 kiểu đột biến này có liên quan đến mức độ đề kháng (MIC) của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin.
89 3.4.8. Phân tích các đột biến trên gen parC Bảng 3.25. Phân tích các đột biến trên gen parC của 69 chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin (n=69) Loại đột biến (n=69) Số chủng (%) MIC trung bình (µg/ml) Không đột biến 11 (15,9%) 1,77 Asp-86 → Asn 3 (4,3%) 4,33 Ser-87 → Asn 31 (44,9%) 10,24 Ser-87 → Arg 12 (17,4%) 23,00 Ser-87 → Ile 7 (10,1%) 32,00 Glu-91 → Gln 5 (7,2%) 28,80 Nhận xét: Sự xuất hiện đột biến và kiểu đột biến quyết định đến mức độ đề kháng của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin. - Những chủng mang đột biến Asp-86 thành Asn hoặc không có đột biến thì có mức đề kháng thấp - Những chủng mang đột biến Ser-87 thành Asn có mức đề trung bình - Những chủng có mức đề kháng cao là những chủng mang các đột biến: Ser-87 thành Arg, Glu-91 thành Gln và Ser-87 thành Ile.
90 3.4.9. Phối hợp giữa các đột biến trên 2 gen Bảng 3.26. Phối hợp giữa các đột biến trên 2 gen (n=44) Các chủng mang đột biến Ser91→Phe và Asp95→Ala trên gen gyrA (n=44) Số chủng (%) MIC trung bình (µg/ml) Không kèm đột biến trên parC 9 (20,5) 1,78 Kèm đột biến trên parC 35 (79,5) 11,49 Nhận xét: Qua phân tích, tôi thấy có 1 số sự kết hợp đáng chú ý sau: - Cả 4 chủng mang 2 đột biến Ser-91 thành Phe và Asp-95 thành Asn trên gen gyrA đều có đột biến Ser-87 thành Ile trên gen parC. Các chủng này đều có mức đề kháng cao với ciprofloxacin. - Trong các đột biến trên gen gyrA thì đột biến phối hợp giữa Ser-91 thành Phe và Asp-95 thành Ala chiếm tỷ lệ cao nhất (44/69 = 63,8%). Tuy nhiên mức độ kháng kháng sinh của 44 chủng này không đồng đều. - Nếu có thêm đột biến trên gen parC thì làm tăng mức độ đề kháng ciprofloxacin.
91 3.4.10. Mối liên quan giữa MIC và đột biến Bảng 3.27: Mối liên quan giữa MIC và đột biến (n=71) MIC (µg/ml) Số chủng (%) Số lượng đột biến 0,002-0,060 2 (2,8) 0 1-2 11 (15,5) 2 1-2 6 (8,5) 3 3-32 52 (73,2) 3 Tổng 71 (100) Nhận xét: Trong tổng số 71 chủng nghiên cứu, có 2 chủng nhạy cảm với ciprofloxacin có MIC 0,002-0,060 µg/ml (tỷ lệ 2,8%) không mang đột biến. Có 11 chủng đề kháng có MIC 1-2 µg/ml (tỷ lệ 15,5%) mang 2 đột biến trên gen gyrA và không mang đột biến trên gen parC. Có 6 chủng đề kháng có MIC 1-2 µg/ml (tỷ lệ 8,5%) mang 3 đột biến trên cả 2 gen gyrA và parC và 52 chủng đề kháng có MIC 3-32 µg/ml (tỷ lệ 73,2%) mang 3 đột biến trên cả 2 gen gyrA và parC.
92 Chương iv Bàn luận 4.1. tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu quốc gia từ năm 2005-2007 4.1.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu từ năm 2005 đến năm 2007 - Tỷ lệ phân lập chung Từ 2005 đến 2007, trong tổng số 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia được thực hiện các xét nghiệm: nhuộm soi trực tiếp, nuôi cấy phân lập và đã phát hiện được 503 chủng vi khuẩn lậu chiếm tỷ lệ 9,9%. Kết quả nghiên cứu của tôi thấp hơn nghiên cứu của Nguyễn Văn Huân và cộng sự (1998) ở Quảng Ninh là 17,12% và tương đương với kết quả của Diệp Xuân Thanh khi nghiên cứu tại Viện Da liễu Quốc Gia (1998), tỷ lệ này là 10,05% [11], [16]. Sở dĩ có sự khác nhau về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là do mẫu nghiên cứu của tôi lớn, thời gian nghiên cứu dài. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu cao hay thấp còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh hay chưa sử dụng kháng sinh, kinh nghiệm và kỹ năng của xét nghiệm viên, chất lượng của các phòng xét nghiệm, trình độ hiểu biết về bệnh tật của bệnh nhân... Trên thế giới, tùy theo từng khu vực, từng nước, thậm chí từng vùng mà tỷ lệ phân lập vi khuẩn lậu dương tính chênh lệch nhau rõ rệt. Theo nghiên cứu của Creighton và cộng sự (2003) tại Khoa Hoa liễu bệnh viện Hoàng gia Anh cho biết tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đây là 18,8% [41]. Nghiên cứu của Adaskevich, trường Đại học y Belarus (2001) cho biết tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đối tượng bệnh nhân bị bệnh LTQĐTD là 18% [22]. Trong khi đó ở một số nước khác lại thông báo tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu thấp hơn nhiều. Nghiên
93 cứu của Van der Pol (2001) tại Uganda tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đây là 3,4% [114]. Tại một số thành phố lớn ở Mexico (2001), tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu trong số 1.199 bệnh nhân nam và nữ có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo là 1,2% [139]. Khu vực Bắc Âu như Thụy Điển có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là 6,6/100.000 dân (2001) [33]. Nghiên cứu của Lassau tại Paris (Pháp) tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở Paris giảm nhanh chóng: từ 1.599 ca phát hiện năm 1985 đến năm 1997 còn 43 ca, tăng nhẹ vào năm 1999 là 64 ca và năm 2000 là 76 ca. Theo tác giả thì sự giảm số ca nhiễm vi khuẩn lậu một cách nhanh chóng như thông báo là do có tư vấn trong vấn đề an toàn tình dục trong phòng chống lây nhiễm HIV/AIDS và các bệnh LTQĐTD [89]. Theo Massari và cộng sự (2002) tại Pháp, tỷ lệ mắc các bệnh viêm niệu đạo giảm rõ rệt từ 1989 đến 1995, tăng nhẹ vào năm 1996 sau đó ổn định, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là 13% [98]. Tại khu vực châu á Thái Bình Dương, WHO ước tính tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở các nước trong khu vực 14%. Samoa và Vanuatu là hai nước trong khu vực có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đối tượng bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo thấp 3,4% và 5,9% [152]. Kết quả nghiên cứu của tôi thấp hơn kết quả của Creighton tại Anh, Adaskevich tại Belarus và cao hơn so với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới như Van der Pol tại Uganda và Teran tại Mexico. Nhưng theo báo cáo của ngành da liễu: các bệnh LTQĐTD nói chung và bệnh Lậu nói riêng hiện nay ngành Da liễu ước tính số lượng bệnh nhân còn cao hơn gấp 10-15 lần. Vì bệnh nhân bị bệnh có thể tự mua thuốc tự điều trị hoặc đến các phòng khám tư nhân và những bệnh nhân trên không được thông báo hàng năm [9]. - Kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp Trong 3 năm, nghiên cứu 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo được tôi tiến hành kỹ thuật nhuộm soi, phát hiện được 471 bệnh
94 nhân nhiễm vi khuẩn lậu chiếm tỷ lệ 9,3%. Nuôi cấy phát hiện được 503 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn lậu chiếm tỷ lệ 9,9%. Nếu mang kết quả nhuộm soi để so sánh với kết quả nuôi cấy (471/503 x 100) thì tỷ lệ phát hiện bệnh của phương pháp nhuộm soi với nuôi cấy là 93,6%. Do mẫu nghiên cứu của tôi lớn và làm liên tục trong thời gian 3 năm từ năm 2005 đến năm 2007, kết quả của kỹ thuật nhuộm soi là đáng tin cậy. Như vậy kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp đơn giản, không tốn kém, cho kết quả nhanh và rất có giá trị đối với những nơi chưa có điều kiện triển khai kỹ thuật nuôi cấy hoặc các kỹ thuật hiện đại khác. ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Hoài kết quả nhuộm soi trực tiếp có tỷ lệ dương tính là 95% và nghiên cứu của các tác giả nước ngoài như Van der Pol cho biết: bằng kỹ thuật nhuộm Gram lấy mủ từ niệu đạo của bệnh nhân bị bệnh Lậu cho kết quả dương tính là 96,4%. Như vậy, kết quả nghiên cứu của tôi tương đương với kết quả nghiên cứu của Đỗ Ngọc Hoài. Sự khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) và thấp hơn nghiên cứu của Van der Pol [10], [114]. 4.1.2. Những yếu tố có liên quan đến tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu - Thể bệnh Thể bệnh cũng là một yếu tố rất quan trọng có liên quan đến tỷ lệ phân lập vi khuẩn lậu cao hay thấp. Ngày nay xu hướng thể bệnh, lậu mạn tính ngày càng gia tăng, nguyên nhân là do bệnh nhân tự điều trị và sử dụng thuốc không đủ liều quy định. Hơn nữa dịch vụ y tế tư nhân khá phát triển, những cơ sở y tế này lại không có đủ kiến thức về chuyên môn, không có kinh nghiệm điều trị chuyên sâu, chưa quản lý bệnh chặt chẽ hoặc không quan tâm đến biến chứng của bệnh và không tuân thủ đúng quy trình điều trị. Nghiên cứu của tôi cho thấy ở bệnh nhân cấp tính số lượng phân lập được vi khuẩn lậu cao hơn ở bệnh nhân mạn tính (93,0% và 14,7%). Kết quả của tôi cao hơn kết quả nghiên cứu của Đỗ Ngọc Hoài (71,85% và 27,4%) [10] và của Diệp
95 Xuân Thanh (76,26% và 22,14%) [16]. Vì tôi đã áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán và có chương trình tuyên truyền, giáo dục y tế và tư vấn về nguy cơ lây nhiễm HIV/AIDS/STD nên khi có triệu chứng khác thường là bệnh nhân đến để được xét nghiệm và điều trị sớm. Vì vậy mà tỷ lệ phân lập vi khuẩn lậu ở thể cấp tính cao hơn rất nhiều so với thể mạn tính. Điều đó đã góp phần ngăn chặn kịp thời nguồn lây cho cộng đồng và tránh được các biến chứng đáng tiếc có thể xảy ra. - Giới tính Các nghiên cứu ở Việt Nam cũng như ở các nước trên thế giới đều cho thấy nam giới bị bệnh Lậu cao hơn nữ giới. Kết quả nghiên cứu của tôi là số bệnh nhân nam bị bệnh Lậu cao hơn số bệnh nhân nữ bị bệnh Lậu (30,4% và 24,5%). Nghiên cứu của Diệp Xuân Thanh tại Viện Da liễu Quốc Gia cho thấy nam giới bị bệnh Lậu chiếm tỷ lệ 12,28% và nữ giới là 6,34% [16]. Nghiên cứu của Đặng Hoàng Anh tại thành phố Hồ Chí Minh cho biết, tỷ lệ nữ giới có thai nhiễm vi khuẩn lậu là 12,17% [1]. Các tác giả trên thế giới như Alves tại Brazil cho biết tỷ lệ bệnh nhân nữ bị bệnh Lậu được phát hiện ở phòng khám bệnh LTQĐTD là 57% và nam giới là 42,3% [24]. Theo nghiên cứu của Bakare tại Nigeria, nam giới bị bệnh Lậu chiếm tỷ lệ 75,2% và nữ giới là 24,8% [29]. Tại thị trấn Thyolo, Malawi, trong tổng số 114 bệnh nhân nam xét nghiệm đã phát hiện 80% số bệnh nhân bị bệnh Lậu [164]. Nghiên cứu của Bachman và cộng sự tại khoa cấp cứu trường đại học Alabama, Birmingham cho biết, tỷ lệ nam giới nhiễm vi khuẩn lậu là 20% và nữ giới là 16% [27]. Trong khi đó ở Nam Phi, Fehler cho biết, tỷ lệ nam giới nhiễm vi khuẩn lậu là 3,2% và ở nữ giới là 7,9% [54]. Kết quả nghiên cứu của tôi cao hơn kết quả nghiên cứu của Bachman về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở nam giới và cao hơn thông báo của Fehler. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở nữ giới trong kết quả nghiên cứu của tôi cũng cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Fehler,
96 của Diệp Xuân Thanh tại Viện Da liễu Quốc Gia, thông báo của Đặng Hoàng Anh và Bachman. Nếu so sánh kết quả nghiên cứu của tôi về tỷ lệ nam và nữ nhiễm vi khuẩn lậu với Alves tại Brazil, Bakare tại Nigeria thì kết quả nghiên cứu của tôi thấp hơn nhiều. Một vấn đề cần đề cập đến ở đây là nam giới bị bệnh LTQĐTD nói chung và nhiễm vi khuẩn lậu nói riêng phần lớn đều có tỷ lệ cao hơn nữ giới. Phải chăng hiện nay nam giới đa số đều làm chủ về kinh tế và họ dễ dàng có nhiều bạn tình và có thể quan hệ tình dục tự do theo ý muốn, hơn nữa họ thường chưa chú ý đến vấn đề tình dục an toàn nên khả năng bị bệnh chiếm tỷ lệ cao. Ngoài ra sự biểu hiện bệnh lý ở đường tiết niệu sinh dục nam giới rầm rộ hơn nên bắt buộc họ phải đến các cơ sở y tế để khám và điều trị. Biểu hiện lâm sàng về nhiễm trùng sinh dục do vi khuẩn lậu ở nam giới điển hình chiếm tỷ lệ > 90%. Trong khi đó ở nữ giới có triệu chứng lâm sàng về nhiễm trùng sinh dục do vi khuẩn lậu chỉ chiếm tỷ lệ 50%-60%. Đây là một trong những lý do làm cho tỷ lệ phát hiện bệnh Lậu ở nữ giới thấp hơn ở nam giới [30], [44], [144]. Một yếu tố cũng góp phần làm cho tỷ lệ nữ giới bị bệnh Lậu thấp hơn nam giới tại Viện Da liễu Quốc Gia là do số nữ giới bị bệnh còn được khám, xét nghiệm và điều trị tại các phòng khám sản phụ khoa, các trung tâm kế hoạch hoá gia đình. - Tuổi Đối với các bệnh LTQĐTD, tuổi là yếu tố quan trọng nói lên sự lây lan của bệnh. Thông thường, tuổi trẻ có tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn. Theo kết quả nghiên cứu của tôi, tỷ lệ bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo được xét nghiệm tập trung vào nhóm lứa tuổi 21-30 tuổi, chiếm tỷ lệ 47%, từ 31-40 tuổi (32,8%). ở lứa tuổi 21-30, qua nghiên cứu 235 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo, tôi phân lập được 75 bệnh nhân dương tính chiếm tỷ lệ 31,9%. Lứa tuổi 31-40 qua nghiên cứu 164 bệnh nhân có hội
97 chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo, tôi phân lập được 38 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 23,2%. Các nhóm tuổi khác do mẫu nghiên cứu nhỏ nên tỷ lệ dương tính có thể cao hoặc thấp sẽ ít có ý nghĩa thống kê. Từ năm 2005 đến năm 2007 trong tổng số 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo, một vấn đề cần đề cập ở đây là trẻ em lứa tuổi mẫu giáo cũng bị nhiễm vi khuẩn lậu đường sinh dục. Kết quả nghiên cứu của tôi cho thấy có 21 trường hợp bị viêm âm hộ và đã phát hiện 5 trường hợp vi khuẩn lậu dương tính, có 3 trường hợp viêm kết mạc mắt do lậu. Nguyên nhân của các trường hợp viêm âm hộ do vi khuẩn lậu là lây từ bố mẹ (4 trường hợp) và có 1 trường hợp không khai thác được nguồn lây. Nghiên cứu của Diệp Xuân Thanh cho biết tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở trẻ em dưới 10 tuổi là 1,09% và những trường hợp này cũng có nguồn lây từ bố mẹ và bà [16]. Nghiên cứu của Anfield tại bệnh viện Hoàng gia London cho biết 12,5% trẻ em từ 3-11 tuổi nhiễm vi khuẩn lậu là do cưỡng dâm [25]. ở Việt Nam cũng như các nước trên thế giới tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu tập trung vào nhóm lứa tuổi hoạt động tình dục mạnh. ở Việt Nam, nghiên cứu của Đỗ Ngọc Hoài (1998) tại Hà Nội cho biết tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở nhóm lứa tuổi 21-30 tuổi là 75,57% [10]. Nghiên cứu của Diệp Xuân Thanh (1998) tại Viện Da liễu Quốc Gia cũng ở lứa tuổi trên tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là 65,21% [16]. Nghiên cứu của Nguyễn Đình Thắng và cộng sự (2002) tại Lâm Đồng cho thấy, tỷ lệ các bệnh nhiễm trùng LTQĐTD nói chung và bệnh Lậu nói riêng ở nhóm lứa tuổi 21-30 tuổi là 48,6% và 31-40 tuổi là 30,2% [17]. Nghiên cứu của Bakare tại Nigeria cho thấy lứa tuổi bị bệnh Lậu chiếm tỷ lệ cao tập trung vào nhóm tuổi từ 20-29 tuổi là 57% ở nam và 52% ở nữ [29]. Nghiên cứu của Hayakawa tại bệnh viện Nagoya Nhật Bản cho biết nam giới ở lứa tuổi hoạt động tình dục mạnh có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là 49,8% [68]. Kết quả nghiên cứu của tôi thấp hơn kết quả nghiên cứu của Diệp
98 Xuân Thanh tại Viện Da liễu Quốc Gia, Bakare tại Nigeria, thông báo của Nguyễn Đình Thắng tại Lâm Đồng và Hayakawa tại bệnh viện Nagoya Nhật Bản, thông báo của Đỗ Ngọc Hoài tại Hà Nội. Một điều đáng nói ở đây là lứa tuổi trẻ ở Việt Nam cũng như các nước khác trên thế giới đều có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu cũng như các bệnh LTQĐTD khác khá cao. Đây là lứa tuổi có nhiều đóng góp cho xã hội về vấn đề phát triển khoa học, kỹ thuật cũng như làm giàu cho đất nước.Vì vậy mục tiêu phòng chống các bệnh nhiễm trùng LTQĐTD tập trung vào lứa tuổi trẻ, tuyên truyền giáo dục y tế cần đẩy mạnh để tuổi trẻ có những hiểu biết nhất định về các bệnh LTQĐTD và biết cách phòng tránh, có như vậy mới làm giảm tỷ lệ lây lan các bệnh nhiễm trùng LTQĐTD trong cộng đồng và hạ thấp được tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS. - Nghề nghiệp Nghề nghiệp cũng là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ nhiễm các bệnh nhiễm trùng LTQĐTD nói chung và bệnh Lậu nói riêng. Sự nghèo nàn, lạc hậu, không nghề nghiệp và sự đô thị hoá nhanh chóng cũng là yếu tố làm cho bệnh LTQĐTD gia tăng ở các nước đang phát triển [134]. Thông tin về nghề nghiệp được tôi chia làm bẩy nhóm và thống kê theo bệnh nhân khai. Kết quả nghiên cứu của tôi cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở các nhóm nghề nghiệp là lái xe 34,5%, công nhân 30,6%, nghề khác (gồm nhiều ngành nghề như nhân viên bán hàng, kinh doanh buôn bán, nhân viên phục vụ...) 30,2%, học sinh-sinh viên 28,6%, nghề tự do 26,6%, cán bộ 25,5%, nông dân 25,4%. Tỷ lệ phân lập dương tính cao ở các nghiên cứu khác thường tập trung vào những nghề như buôn hàng chuyến, lái xe, nghề tự do... Đặc biệt trong nghiên cứu về nghề nghiệp của tôi, qua nghiên cứu 110 người với nghề nghiệp là cán bộ có tỷ lệ phân lập dương tính là 28 người chiếm tỷ lệ 25,5%, phải chăng cán bộ ngày nay hay phải đi công tác, giao lưu với nhiều người và khả năng tiếp cận về bệnh tật sẽ lớn hay là cán bộ có dân trí cao hiểu biết rõ
99 hơn về tác hại của bệnh Lậu nên đến ngay cơ sở có uy tín, độ tin cậy cao để điều trị kịp thời nên tỷ lệ phát hiện được vi khuẩn lậu cao. Một vấn đề đặt ra là vấn đề trung thực trong khai báo nghề nghiệp với thầy thuốc. Theo thông báo của một số tác giả trong nước thì tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đối tượng này thấp hơn nghiên cứu của tôi rất nhiều. Các tác giả trên thế giới chưa thấy đề cập đến đối tượng là cán bộ làm việc hưởng lương nhà nước. Một đối tượng mà xã hội cũng như y tế cộng đồng cần quan tâm là học sinh-sinh viên. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở các đối tượng này là 28,6%. Vì vậy chúng ta cần có biện pháp giáo dục giới tính trong các trường trung học, cao đẳng và đại học, tuyên truyền giáo dục y tế và tư vấn cách phòng tránh các bệnh LTQĐTD cho đối tượng này. Có như vậy mới tạo ra được những lớp người thừa kế và làm chủ đất nước trong tương lai khoẻ mạnh và tràn đầy sức sống phục vụ và làm giàu đẹp cho tổ quốc. Một số công trình nghiên cứu ở nước ngoài cũng cho biết: tại Nigeria tỷ lệ mắc bệnh ở người buôn bán 33,8%, người phục vụ 29,5% và sinh viên 26,7% [29]. Nghiên cứu của Paz-Bailey tại Thái Lan cho thấy tỷ lệ sinh viên-học sinh, từ 15-21 tuổi nhiễm vi khuẩn lậu ở nam là 0,3% và nữ là 6,1% [110]. Theo nghiên cứu của Nguyễn Đình Thắng tại Lâm Đồng tỷ lệ bị bệnh LTQĐTD ở đối tượng công nhân rất cao (48,32%), cán bộ (19,89%) và nghề khác là 16,79% [17]. Nghiên cứu của Diệp Xuân Thanh tại Hà Nội thì tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu cao ở đối tượng nghề tự do (36,78%), cán bộ (14,61%), các đối tượng nghề khác (dưới 10%) [16]. Một đối tượng nghề nghiệp có liên quan đến tỷ lệ mắc bệnh cao là nghề tự do và nghề mại dâm. Kết quả nghiên cứu của tôi cho thấy có tới 26,6% các trường hợp bị bệnh Lậu làm nghề tự do. Đây là một công việc không ổn định, làm theo thời vụ, thu nhập thấp, thất thường. Đây là một vấn đề xã hội lớn mà không chỉ riêng ngành y tế phải quan tâm. Đối tượng thứ hai là gái mại dâm. ở Việt Nam pháp luật không cho
100 phép coi nghề mại dâm là một nghề chính đáng. Vì vậy khi điều tra về nghề nghiệp chắc chắn sẽ không có ai tự nhận mình làm nghề mại dâm nên sẽ không có số liệu chính xác về vấn đề này. ở các nước khác trên thế giới, nhà nước và bộ y tế đã công nhận mại dâm cũng là một nghề nên số liệu về tỷ lệ mắc bệnh LTQĐTD nói chung và bệnh Lậu nói riêng ở các đối tượng này đã được nhiều tác giả đề cập đến. Một nghiên cứu tại Indonesia số phụ nữ hành nghề mại dâm nhiễm vi khuẩn lậu chiếm tỷ lệ 29,9%. Nghiên cứu tại Anh và một số nước khác cho thấy gái mại dâm nhiễm vi khuẩn lậu tới 64% [43], [71], [129]. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu thuộc các trung tâm phục hồi nhân phẩm cho biết tỷ lệ gái mại dâm nhiễm các bệnh nhiễm trùng LTQĐTD cao (trên 30%) [7]. - Nguồn lây Điều tra về yếu tố nguồn lây trong nghiên cứu của tôi cũng chỉ dựa vào lời khai của bệnh nhân và rất tế nhị có thể bệnh nhân ngại hoặc ngượng nên kết quả của tôi cũng rất khiêm tốn: tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu cao có nguồn lây từ bạn tình nam hoặc nữ chiếm tỷ lệ 32,14%. Vi khuẩn lậu chỉ lây bệnh từ người này sang người khác nên tỷ lệ bạn tình của 2 giới đều phải từ 2 bạn tình trở lên. Theo thông báo của Hardick và cộng sự tại trung tâm kiểm soát bệnh tật Mỹ thì tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở nam và nữ có nhiều bạn tình là 92% và 27% [67]. Gái mại dâm cũng là một điều đáng quan tâm trong vấn đề làm gia tăng tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu cũng như các bệnh LTQĐTD và HIV/AIDS. Trong nghiên cứu của tôi thì tỷ lệ lây nhiễm vi khuẩn lậu từ gái mại dâm là 28,9%. Theo thông báo của Nguyễn Đình Thắng số bệnh nhân tại Lâm Đồng có quan hệ với gái mại dâm tới 41,4% [17], cao hơn kết quả nghiên cứu của tôi. Tỷ lệ lây nhiễm vi khuẩn lậu giữa vợ chồng chiếm tỷ lệ cao 22,3%. Ngày nay quan niệm về sống chung thuỷ một vợ một chồng đã ít được quan tâm ở Việt Nam cũng như ở các nước khác trong khu vực châu á Thái Bình Dương. Ngược lại
101 tuổi trẻ châu Âu có xu hướng sống chung thuỷ như truyền thống của các nước châu á xưa [5]. Vấn đề này ngành y tế không thể giải quyết một sớm, một chiều mà phải có sự quan tâm của xã hội nhất là vai trò của hội phụ nữ, thanh niên các cấp. Trong nghiên cứu của tôi tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu từ nhóm bệnh nhân có nguồn lây là nghề khác (có thể bệnh nhân không muốn khai hoặc thật sự không biết, hoặc mới quen trong công việc, hoặc đồng tính nam...) chiếm tỷ lệ 38,5% trong nhóm nguồn lây này, nghiên cứu của tôi tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu của bệnh nhân nam giới quan hệ với người không quen biết là 12,2%. Những trường hợp này khi được phỏng vấn đều trả lời do “quá chén” tại các nhà hàng, khách sạn và họ đều chưa được tiếp cận với cơ sở tư vấn về bệnh tật cũng như khuyến cáo sử dụng bao cao su khi có nhu cầu tình dục. Nhóm nguồn lây từ bạn tình chiếm 32,1%, vợ chồng chiếm 24,3%, mại dâm là 28,9%. Đặc biệt trong nghiên cứu của tôi về nguồn lây khi nghiên cứu 196 bệnh nhân có nguồn lây từ bạn tình, tôi phân lập được 63 bệnh nhân dương tính chiếm tỷ lệ 32,1%. Nghiên cứu của tôi đã phát hiện được 1 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn lậu là đối tượng đồng tính luyến ái nam, chiếm tỷ lệ 3,9%. Nghiên cứu của Benn tại khoa tiết niệu trường đại học y London cho biết tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân nam đồng tính luyến ái năm 2001 là 16,5% [31]. Đến năm 2007 tỷ lệ này chỉ còn là 16% [32]. Nghiên cứu của Lassau cho biết tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân đồng tính luyến ái nam là 13% [89]. Kết quả nghiên cứu của tôi thấp hơn nhiều so với kết quả của Ben lại London và của Lassau tại Pháp. ở Việt Nam chưa có thông báo về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đối tượng đồng tính luyến ái nam và nữ. Có lẽ đây là vấn đề tế nhị nên công việc phỏng vấn của thầy thuốc gặp rất nhiều khó khăn và chưa đưa ra được con số thực sự về tỷ lệ bị bệnh LTQĐTD nói chung và bệnh Lậu nói riêng ở đối tượng này. - Trình độ học vấn
102 Nhiều tác giả trong nước cũng như ngoài nước đều cho rằng tỷ lệ nhiễm bệnh cao hay thấp đều liên quan đến sự thất học và nghèo nàn [134]. Nghiên cứu của tôi về trình độ học vấn liên quan đến tỷ lệ nhiễm bệnh cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân có trình độ học vấn tiểu học là 19,5%, trung học cơ sở là 34,6%, trung học phổ thông là 33%, cao đẳng và đại học là 22,9%, trên đại học là 11,1%. Một số công trình nghiên cứu ở trong nước đều cho kết quả về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu dương tính đều tập trung vào đối tượng bệnh nhân thất học hoặc trình độ văn hoá thấp. Theo nghiên cứu của Nguyễn Đình Thắng tại Lâm Đồng tỷ lệ nhiễm bệnh LTQĐTD nói chung và bệnh Lậu nói riêng đều tập trung vào đối tượng không biết chữ hoặc trình độ học vấn thấp [17]. Nghiên cứu của Uribe-Salas tại biên giới Guatemala-Mexico cho biết tỷ lệ nữ có trình độ văn hóa thấp nhiễm vi khuẩn lậu là 11,6% [142]. Nghiên cứu của Kent tại trường trung học Sanfransisco cho thấy: tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đối tượng học sinh trung học là 0,7% [82]. Nghiên cứu của Alves tại Brazil cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đối tượng bệnh nhân có trình độ văn hoá phổ thông cơ sở là 4,5% [24]. Theo nghiên cứu của tôi tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu cao lại tập trung ở đối tượng bệnh nhân có trình độ học vấn cấp 2 và cấp 3, đại học. Vì vậy cần tuyên truyền, giáo dục y tế cho các đối tượng này vì có lẽ họ chưa được tư vấn đầy đủ về bệnh tật, sự nguy hại biến chứng của bệnh LTQĐTD nói chung và bệnh Lậu nói riêng cũng như hiểm họa về HIV/AIDS. 4.2. So sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, nhuộm soi và nuôi cấy Các kỹ thuật sinh học phân tử đã được áp dụng rộng rãi trên thế giới từ nhiều năm nay. Đặc biệt, kể từ sau khi kỹ thuật PCR ra đời (nửa đầu những
103 năm 1980), sinh học phân tử đã có những bước tiến vượt bậc. Người ta đã có thể thao tác với các vật liệu di truyền như ADN, ARN trong phòng thí nghiệm [58], [95], [120]. Thêm nữa, việc tổng hợp ra các vật liệu di truyền trên với số lượng lớn đã không còn là một vấn đề khó khăn. Nhiều dự án giải trình tự bộ gen của nhiều động vật, thực vật và vi sinh vật đã và đang được tiến hành [69], [163]. Một trong những công trình nghiên cứu lớn trong y sinh học là ‘‘Dự án Gen người’’ [105]. ở Việt Nam, việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong các lĩnh vực khoa học nói chung và y sinh học nói riêng cũng mới được triển khai trong vòng hơn 20 năm. Nhiều đề tài và dự án nghiên cứu đã và đang được triển khai nhằm áp dụng các tiến bộ của khoa học vào nghiên cứu, sản xuất, chẩn đoán và điều trị hoặc nghiên cứu phục vụ sản xuất thuốc, chế phẩm sinh học, vacxin đã và đang được triển khai [45], [64], [91], [106], [130], [147]. Trong lĩnh vực Y học PCR có rất nhiều ứng dụng trong việc xác định căn nguyên của các bệnh nhiễm trùng như Chlamydia đường sinh dục, phong, lao...[2], [3]. Trong số 500 bệnh nhân được chọn ngẫu nhiên từ tổng số 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo được tôi tiến hành đồng thời ba kỹ thuật nhuộm soi, nuôi cấy và PCR. Kỹ PCR phát hiện có 141 bệnh nhân dương tính chiếm tỷ lệ là 28,2%, nuôi cấy phát hiện có 65 bệnh nhân dương tính chiếm tỷ lệ là 13% và nhuộm soi phát hiện có 53 bệnh nhân dương tính chiếm tỷ lệ là 10,6%. Trong số 65 bệnh nhân dương tính bằng kỹ thuật nuôi cấy và thử đầy đủ các tính chất sinh vật hóa học thì kỹ thuật PCR chỉ cho kết quả dương tính với 64 bệnh nhân, còn một bệnh nhân kỹ thuật PCR lại cho kết quả âm tính. Mẫu này đã được làm đi làm lại nhưng kết quả PCR vẫn không thay đổi. Có thể giải thích là chủng vi khuẩn lậu này không có plasmid pJD1 nên không có sản phẩm trong quá trình khuếch đại, và điều này cũng
104 phù hợp với nhiều tác giả khác trên thế giới khi nghiên cứu về loại plasmid pJD1 này đều có chung một nhận xét: plasmid pJD1 chỉ có ở 96% số chủng vi khuẩn lậu [70], [136]. Theo thông báo của Gaydos và cộng sự thuộc trường Đại học Y Johns Hopkins và trường Đại học Công cộng và vệ sinh ở Baltimore, Maryland, tác giả tiến hành xét nghiệm PCR dịch âm đạo cho 793 phụ nữ quân nhân ở lứa tuổi hoạt động tình dục mạnh đến khám tại phòng khám STD đã phát hiện 3,3% số nữ quân nhân nhiễm vi khuẩn lậu, trong khi đó nuôi cấy chỉ phát hiện 2,1% [60]. Boel và Van Herk tại phòng xét nghiệm vi sinh thuộc Bệnh viện Catharina, Veldhoven và Khoa Da liễu ở Eindhoven, Hà Lan cho biết: khi nghiên cứu 765 bệnh nhân nam và nữ được lấy bệnh phẩm ở sinh dục và hầu họng để xét nghiệm PCR chẩn đoán vi khuẩn lậu, có 229 bệnh phẩm được khẳng định dương tính chiếm tỷ lệ 30% [34]. Để so sánh về tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của kỹ thuật PCR, kỹ thuật nhuộm soi và kỹ thuật nuôi cấy, tôi tiến hành đồng thời ba kỹ thuật trên 500 bệnh nhân và được chia làm hai nhóm. Nhóm 1 là nhóm bệnh nhân được chẩn đoán là viêm niệu đạo, âm đạo cấp (cấp tính) tỷ lệ phát hiện bệnh là: 93%, 58,1% và 66,3% nhưng cũng không thấy có sự khác biệt nhiều giữa ba kỹ thuật này. Sự khác biệt đặc biệt rõ ở nhóm 2: nhóm bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo (mạn tính) nhưng bằng kỹ thuật PCR vẫn phát hiện được 61 (14,7%) bệnh nhân dương tính trong khi đó kỹ thuật cổ điển như nuôi cấy chỉ phát hiện được 8(1,9%) và nhuộm soi thì tỷ lệ phát hiện lại quá thấp chỉ phát hiện được 3 (0,7%) bệnh nhân. Như vậy tỷ lệ phát hiện bệnh bằng kỹ thuật PCR cho kết quả rất cao (gấp trên 20 lần kỹ thuật nhuộm soi và hơn 7 lần kỹ thuật nuôi cấy). Vì vậy kỹ thuật PCR nên được khuyến cáo trong các trường hợp lậu mạn tính hoặc khi các kỹ thuật khác không phát hiện được mà bệnh nhân vẫn có triệu chứng lâm sàng. Nếu áp dụng thuật toán thống kê để nghiên cứu về nhóm thứ hai này, sẽ
105 cho kết quả như sau: - Với kỹ thuật PCR và kỹ thuật nuôi cấy: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,001 và χ2 =44,4. - Với kỹ thuật PCR và nhuộm soi: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,001 và χ2 =56,9. - Với kỹ thuật nhuộm soi và nuôi cấy: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P = 0,12 và χ2 =2,3. Điều này giúp các bác sỹ lâm sàng lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm hợp lý. Với kỹ thuật nhuộm soi và nuôi cấy, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê nên chỉ cần chọn phương pháp nhuộm soi để đơn giản, có kết quả nhanh, ít tốn kém và đỡ gây phiền hà cho bệnh nhân mà khả năng phát hiện bệnh cũng không khác biệt nhiều so với nuôi cấy. Chính vì vậy, khi chẩn đoán một bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo được chẩn đoán là bệnh Lậu mạn tính thì chỉ cần làm xét nghiệm nhuộm soi và làm thêm xét nghiệm PCR nếu nghi ngờ. Không nên lựa chọn đồng thời cả ba kỹ thuật trong chẩn đoán bệnh Lậu mạn sẽ gây rất nhiều phiền hà cho bệnh nhân và tốn kém. Nhưng điều này lại hạn chế đối với các nhà giám sát kháng kháng sinh muốn khoanh vùng hoặc cô lập đối với những chủng vi khuẩn lậu kháng thuốc để thông báo trong nước và quốc tế về tình hình kháng kháng sinh của chúng từ đó có những biện pháp can thiệp hữu hiệu. Với tình hình sử dụng kháng sinh tuỳ tiện không theo một chỉ định điều trị nào như hiện nay thì kỹ thuật PCR là một kỹ thuật lý tưởng được áp dụng để phát hiện vi khuẩn lậu ở mọi giai đoạn. Tuy mẫu nghiên cứu với số lượng chưa lớn nhưng cũng phần nào cũng đánh giá đúng về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu hiện nay ở nước ta trên những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo. Nói tóm lại, PCR có rất nhiều lợi thế: cho kết quả nhanh, chính xác vì
106 kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao thường trên 97%. Giá trị chẩn đoán bệnh của PCR đặc biệt trong những trường hợp vi sinh vật không nuôi cấy được hoặc nuôi cấy rất khó khăn, tốn kém, hoặc ở những bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi vào viện, PCR không nhất thiết đòi hỏi phải có vi sinh vật sống. 4.3. kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu từ năm 2005-2007 Khi theo dõi về sự kháng kháng sinh của những chủng vi khuẩn lậu phân lập được trong ba năm 2005, 2006, 2007 số chủng hàng năm (n) là: năm 2005 là 162 chủng, năm 2006 là 212 chủng và năm 2007 là 162 chủng. Tôi phân tích về tỷ lệ kháng với những kháng sinh được khuyến cáo dùng trong điều trị bệnh Lậu như sau: 4.3.1. Tỷ lệ kháng kháng sinh - Penicillin Penicillin đã được sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh Lậu trong nhiều năm. Trước đây N. gonorrhoeae rất nhạy cảm penicillin, điều trị 150.000 đv đã có hiệu quả ở phần lớn các trường hợp N. gonorrhoeae giảm nhạy cảm in vitro [116]. Tuy nhiên trong những năm gần đây hiệu lực đã bắt đầu giảm [40]. Tăng liều penicillin được khuyến nghị đã làm giảm tạm thời các dấu hiệu lâm sàng do nhiễm các chủng này, nhưng hầu như mức độ kháng kháng sinh vẫn tăng và nhiều trường hợp điều trị thất bại lại xuất hiện, ngay cả với phác đồ liều cao. Cho đến năm 1976 những chủng vi khuẩn lậu kháng penicillin có PPNG là những mốc đánh dấu sự thất bại hoàn toàn của loại kháng sinh này trong vấn đề điều trị bệnh Lậu [89]. Cho đến nay penicillin không được khuyến cáo điều trị bệnh Lậu ở những nước có tỷ lệ kháng penicillin cao. Theo nghiên cứu của tôi thì tỷ lệ kháng penicillin: 35,19% (năm 2005), 31,13% (năm 2006), 37,21% (năm 2007). Nhìn chung tỷ lệ vi
107 khuẩn lậu kháng penicillin vẫn ở mức cao (trên 30%). Tại Viện Da liễu Quốc Gia năm 2000 và 2001 tỷ lệ kháng pencillin của các chủng vi khuẩn lậu phân lập được 47,77% và 36,14%. Theo nghiên cứu của Ye S. và cộng sự tại Trung Quốc từ năm 1993-1998 có 3186 chủng vi khuẩn lậu được thử tính nhạy cảm và kháng lại các kháng sinh, tỷ lệ kháng penicillin là 66,7% [161]. Theo thông báo của WHO tỷ lệ kháng lại penicillin ở các nước trong khu vực châu á Thái Bình Dương như Philippines và Hàn Quốc > 90%, Trung Quốc 80%, Singapore 60% [155], [156]. Tại vùng Caribê, nghiên cứu của Llanes tại Cuba cho biết tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng penicillin ở Cuba là 70% [93]. Nghiên cứu của Leutscher tại Madagasca tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng penicillin 70% [92]. ở châu Âu, nghiên cứu của Young và cộng sự tại Scoland tỷ lệ kháng Penicillin của các chủng vi khuẩn lậu là 6% [162]. Theo thông báo của WHO, một số nước có tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng penicillin thấp hơn là: Nhật Bản 3%; Fiji trên 8% [155], [156]. Theo thông báo của WHO (2008): chương trình giám sát kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu tại khu vực Châu á Thái Bình Dương năm 2006 khi phân lập được 8.374 chủng tại 16 quốc gia, tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh thuộc nhóm penicillin như sau: Philippines 78,5%, Hàn Quốc 74,5%, Brunei 64,2%, Hồng Kông 62,7%, Singapore 59,4%. Như vậy kết quả của tôi thấp hơn nhiều so với thông báo của WHO. Sự đề kháng penicillin do gen nằm trên plasmid mã hoá ra enzym õ- lactamase TEM-1. Enzym này thủy phân vòng õ-lactam của penicillin và bất hoạt chúng. Ngược với sự gia tăng chậm tính đề kháng do thay đổi trên nhiễm sắc thể, sự đề kháng sẽ đạt mức cao nếu trên plasmid có sự thay đổi. N. gonorrhoeae sản sinh penicillinase (PPNG) được phát hiện trong cùng một thời điểm ở Anh và Mỹ. Các mẫu phân lập đầu tiên được du nhập, ở Anh là từ
108 châu Phi và ở Mỹ là từ vùng viễn Đông. Sự lan truyền gen đa đề kháng qua tiếp hợp còn có sự tham gia của các plasmid có PPNG được phân lập lần đầu ở châu á, nhưng cho đến năm 1981 vẫn không có trong các chủng châu Phi. Do đó, chủng châu á này lan truyền rộng hơn và nhanh hơn. Có thể thoạt đầu plasmid này được nhận từ các loài Haemophilus [78]. Sự sản sinh lactamase (PPNG) và những thay đổi nhiễm sắc thể (CMRNG) có thể cùng tồn tại trong một chủng phân lập được. Điều này là xác đáng vì trên lâm sàng có việc sử dụng penicillin kết hợp với chất ức chế õ-lactamase. Những chất này, như acid clavulanic và sulbactam, ngăn cản õ- lactamase bất hoạt penicillin. Phối hợp amoxycillin/acid clavulanic được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng khác. Theo lý thuyết và đôi khi trong thực tế phác đồ uống hiệu quả đối với các nhiễm trùng nói chung nhưng thất bại không ít trong điều trị bệnh Lậu. Điều này có lẽ là do các chủng PPNG kháng penicillin tự nhiên hoặc qua trung gian nhiễm sắc thể với tần suất cao [132]. Giảm nhạy cảm với cephalosporin, tetracyclin và các kháng sinh khác cũng do cơ chế nhiễm sắc thể [127]. Từ các nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước cùng với chính nghiên cứu của mình, tôi nhận thấy tỷ lệ vi khuẩn lậu đề kháng với penicillin đang giảm dần qua từng năm. Có lẽ do penicillin ít được sử dụng điều trị bệnh Lậu và các nhiễm khuẩn khác nên vi khuẩn lậu đã giảm tính đề kháng với kháng sinh này qua từng năm: 61,7% (2005), 54,2% (2006) và 41,9% (2007). - Tetracyclin Tetracyclin thường không được khuyến nghị để điều trị bệnh Lậu vì kháng sinh phải được dùng với nhiều liều trong vài ngày, làm tăng khả năng kém tuân thủ điều trị và liều không đúng. Tuy nhiên, kháng sinh rẻ và do đó được sử dụng rộng rãi, nhất là trong lĩnh vực y tế không chính quy. Cả hai cơ chế đề kháng do nhiễm sắc thể và do plasmid đều tồn tại
109 trong vi khuẩn lậu và sau đó thì trở thành đề kháng ở mức cao. Kháng tetracyclin mức cao trong vi khuẩn lậu (TRNG) là do có yếu tố quyết định tetM và được báo cáo lần đầu vào năm 1986. TetM trong N. gonorrhoeae tồn tại ở cả 2 týp "Hà Lan" và "Mỹ"; chúng khác nhau chút ít và nằm trên plasmid tự truyền. Một nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của gen tetM qua PCR cho thấy týp Hà Lan có thể có nguồn gốc từ Viễn Đông và týp Mỹ có nguồn gốc từ lục địa châu Phi. Plasmid tetM được phân bố rộng rãi trong quần thể vi hệ bình thường ở đường sinh dục. Khả năng lan truyền của plasmid và áp lực chọn lọc do dùng tetracyclin để điều trị các bệnh LTQĐTD khác đã góp phần phát tán rộng rãi các chủng TRNG [75], [96]. Trong nghiên cứu của tôi tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại tetracyclin là 9,88% năm 2005, năm 2006 là 16,51%, năm 2007 là 37,5%. Tại Viện Da liễu Quốc Gia tỷ lệ TRNG năm 2000, 2001 là 42,7% và 40,47% [13], [14]. Một số nước trong khu vực châu á Thái Bình Dương tỷ lệ TRNG dao động từ 25%-70%. ở Trung Quốc tỷ lệ TRNG gia tăng năm 1998 (3%); năm 1999 (15%), năm 2000-2001 (25%). Tại Cuba tỷ lệ TRNG là 40% [93], [154], [155], [156]. Theo nghiên cứu của Su X. tại miền bắc Sumatra, Indonesia tỷ lệ TRNG là 28% [129]. Tonga là nước chưa phân lập được chủng vi khuẩn lậu nào kháng tetracyclin ở mức độ cao [156]. Kết quả nghiên cứu của tôi tương đương với kết quả nghiên cứu ở Trung Quốc năm 2000-2001; thấp hơn rất nhiều so với thông báo của Lê Thị Phương năm 2000, 2001 và của Llanes tại Cuba. Mặc dù tetracyclin không được khuyến cáo trong phác đồ điều trị bệnh Lậu nhưng nó đã được áp dụng đa liều trị liệu với sự nhiễm trùng kết hợp viêm niệu đạo, cổ tử cung do vi khuẩn lậu và Chlamydia trachomatis [134]. - Cephalosporin Độ nhạy cảm của vi khuẩn lậu thay đổi với kháng sinh cephalosporin là
110 do nhiễm sắc thể và chính những thay đổi này giải thích cho sự giảm nhạy cảm với penicillin [74]. Có sự đề kháng chéo giữa penicillin và cephalosporin thế hệ 2 như cefuroxime [117]. Tuy nhiên, điều này không xảy ra với cephalosporin thế hệ sau như ceftriaxon và cefixim. Ceftriaxon và cefotaxim thuộc nhóm cephalosporin thế hệ III cũng được sử dụng để điều trị các bệnh LTQĐTD, nhất là ceftriaxon. May mắn là cho đến nay các nước trong khu vực châu á Thái Bình Dương chưa phát hiện được chủng vi khuẩn lậu nào kháng lại ceftriaxon. Thông báo của các tác giả trên thế giới như Van Dyck tại Kigali Wranda, Llanes tại Cuba, Leutscher tại Madagasca, Berglund tại Thụy Điển, Karlovsky tại Mỹ chưa phân lập được chủng vi khuẩn lậu nào kháng lại ceftriaxon [33], [80], [92], [93], [114]. Trong nghiên cứu của Ye S. từ 1993-1998 cho biết có 0,57% số chủng vi khuẩn lậu phân lập được kháng lại ceftriaxon [161]. Nghiên cứu của tôi cho thấy 100% số chủng vi khuẩn lậu phân lập được đều nhạy cảm với ceftriaxon. Tỷ lệ giảm nhạy cảm đối với cefotaxim là 1,23% năm 2005, 0,94% năm 2006, 3,11% năm 2007. Tôi chọn cefotaxim và nhóm bổ xung vì giá thành của cefotaxim thấp hơn nhiều so với ceftriaxon và cũng thuộc nhóm cephalosporin thế hệ thứ 3. Dùng trong điều trị bệnh Lậu thấy kết quả tương đối tốt nhưng gần đây đã dần dần gia tăng những chủng giảm nhạy cảm với kháng sinh này. Một số nghiên cứu của các tác giả trên thế giới không thấy đề cập đến tình hình nhạy cảm cũng như kháng lại kháng sinh này. - Spectinomycin ở N. gonorrhoeae đề kháng spectinomycin hoặc aminoglycosid thường xảy ra do đột biến nhiễm sắc thể một bước, dẫn đến kháng kháng sinh ở mức độ cao. Các gen ribosomal tham gia vào quyết định đề kháng spectinomycin hoặc aminoglycosid có liên quan với nhau. Tuy nhiên, MIC với gentamicin
111 hơi cao cũng được ghi nhận trong một số mẫu phân lập và trong tương lai vi khuẩn lậu sẽ nhận được gen nằm trên plasmid (hiện có trong nhiều loài vi khuẩn khác) nó sẽ mã hoá ra những emzym làm bất hoạt kháng sinh aminoglycosid [78], [94]. Spectinomycin thuộc nhóm kháng sinh aminoglycosid. Gần đây có nhiều tài liệu công bố về tính đề kháng của các chủng vi khuẩn lậu với Spectinomycin, tuy nhiên chỉ ở mức độ thấp: 0,3% năm 1996; 0,045% năm 1997; 5,3% năm 1998-1999 và năm 2000 [155], [156]. Kết quả nghiên cứu của tôi không thấy có chủng vi khuẩn lậu nào kháng lại kháng sinh spectinomycin. Như vậy kháng sinh spectinomycin vẫn là 1 kháng sinh có tác dụng rất tốt trong điều trị vi khuẩn lậu tại Việt Nam với liều sử dụng duy nhất 2 g tiêm bắp. - Azithromycin Azithromycin là kháng sinh được WHO khuyến cáo trong phác đồ điều trị bệnh Lậu kết hợp với Chlamydia trachomatis. Nghiên cứu của tôi trong những năm qua cho thấy số chủng vi khuẩn lậu đã giảm nhạy cảm với azithromycin: 5,56% năm 2005, 1,89% năm 2006, 0,81% năm 2007. Thông báo của Ng. L. K và cộng sự tại Canada tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng azithromycin với MIC dao động từ 2-60 mcg/ml [108]. Indonesia và Cuba chưa phát hiện được chủng nào kháng lại azithromycin [73], [93]. - Ciprofloxacin Kháng sinh nhóm quinolon được sử dụng nhiều nhất trong điều trị lậu là ciprofloxacin và ofloxacin. Giống như sự phát triển đề kháng penicillin do cơ chế nhiễm sắc thể, sự đề kháng những kháng sinh này đã tiến triển nhanh và có nhiều thay đổi trên nhiễm sắc thể trong những năm qua. Sự tiếp cận của quinolon tới đích tác động đã giảm do thay đổi tính thấm tế bào và có thể do
112 cơ chế bơm đẩy. Những yếu tố này gây nên đề kháng quinolon ở mức thấp. Đích của quinolon là ADN gyrase và topoisomerase IV. Đề kháng ở mức cao trên lâm sàng là do sự thay đổi đích tác động, ban đầu bởi đột biến ở gen gyrA. Nhiều thay thế acid amin đã được mô tả, khi chúng kết hợp lại sẽ gây kháng kháng sinh ở mức cao. Nhiều đột biến cũng xảy ra trên gen parC mã hóa topoisomerase IV, đích thứ hai của quinolon trong vi khuẩn lậu và liên quan tới kháng kháng sinh mức cao. Những thay đổi trong parC dường như làm tăng biểu hiện đột biến tác động tới gyrA. Quinolon mới nhất (thứ hệ 4) có hiệu quả hơn trong việc chống lại các chủng có parC thay đổi, nhưng ít có hiệu quả chống lại các biến chủng có đột biến gyrA. Do đó, theo giả thiết này, những kháng sinh thế hệ 4 có hiệu quả với một số chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin (mà không phải tất cả) [76]. Ciprofloxacin là kháng sinh được cả bác sỹ và bệnh nhân tin dùng đối với các bệnh nhiễm trùng nói chung và bệnh Lậu nói riêng, được sử dụng trong nhiều năm nhưng đến những năm gần đây sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu đã gia tăng nhanh chóng đối nhóm kháng sinh này. Theo thông báo của Lê Thị Phương năm 2001, tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin là 42,7% [14]. Thông báo của Lê Văn Hưng năm 2003 cho biết, tỷ lệ vi khuẩn lậu đã kháng lại ciprofloxacin là 60,87%. Theo thông báo của WHO, tỷ lệ này ở Trung Quốc là 85,2%; Hồng Kông 79,5% và Nhật Bản 40% [155], [156]. Một số nước khác trên thế giới như Anh là 4,89%; Scotland 7,8%; Papua New Guinea (0,9%) [41], [152], [162]. Theo thông báo của Trees ở Thái Lan tỷ lệ kháng ciprofloxacin là 13,8% năm 1998 và 25,4% năm 1999-2000 [141]. Tại Kyrghyzstan tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin là 25%, úc 17,5% [46], [108]. Một số nước chưa phân lập được chủng vi khuẩn lậu nào kháng lại ciprofloxacin như Indonesia, Madagasca, Cuba và Rwanda [73], [92], [93], [143].
113 Theo thông báo của WHO (2008), chương trình giám sát kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu tại khu vực Châu á Thái Bình Dương, tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh thuộc nhóm quinolon vẫn ở mức cao: Trung Quốc 99,6%, Hồng Kông 97,8%, Hàn Quốc 89,4%, Nhật Bản 83,4%, Brunei 81,7%, Philippines 69%... Kết quả nghiên cứu của tôi về tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin: năm 2005 là 80,86%, năm 2006 là 82,07%, năm 2007 là 89,14%, cao hơn thông báo của Lê Thị Phương năm 2001 và tương đương với thông báo của một số nước trong khu vực. Vì vậy ciprofloxacin cũng không nên đưa vào danh mục các kháng sinh sử dụng điều trị bệnh Lậu ở Việt Nam. Khi nghiên cứu về sự kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu phân lập được tại Viện Da liễu Quốc Gia, những hiểu biết về cơ chế đề kháng và cơ chế di truyền của sự đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn đã giúp được rất nhiều cho các thầy thuốc lâm sàng trong công tác điều trị. Vi khuẩn lậu kháng kháng sinh chủ yếu là do đột biến trên nhiễm sắc thể đã làm xuất hiện chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh trong chính quần thể vi khuẩn nhạy cảm, đặc biệt là khi liều điều trị thấp, không đạt nồng độ tiêu diệt vi khuẩn thì sự có mặt của kháng sinh trở thành một chất chọn lọc, giữ lại vi khuẩn đề kháng. Sự đề kháng do nhận được gen đề kháng có thể thông qua các hình thức: tiếp hợp-khi hai vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với nhau hoặc là biến nạp khi vi khuẩn bị ly giải và giải phóng ra ADN tự do hoặc do thành phần di truyền di động (transposons). Transposons có thể là nguyên nhân hàng đầu trong việc lan truyền một số gen đề kháng [49], [90]. Hình thức tiếp hợp giữ vài trò quan trọng vì R-plasmid (những plasmid mang đặc tính đề kháng) được tìm thấy ở rất nhiều tác nhân gây bệnh, kể cả vi khuẩn lậu. Một số plasmid, kể cả tự truyền và không tự truyền, có thể tồn tại ở nhiều loài vi khuẩn cũng đóng vai trò quan trọng trong sự bảo tồn và lan
114 truyền gen đề kháng [21], [119]. Sự đề kháng của vi khuẩn lậu do gen mã hoá nằm trên plasmid gặp ở hầu hết các nhóm kháng sinh khác nhau. Các plasmid này luôn ổn định trong tế bào chủ thông qua sự truyền dọc cùng với sự phát triển của vi khuẩn và nó có thể lan truyền ngang do lan truyền từ chủng này sang chủng khác. Vì vậy, tính kháng thuốc có thể được truyền dọc qua các thế hệ và truyền ngang giữa các chủng, thậm chí giữa các loài gây khó khăn cho công tác điều trị. Do nhận được R-plasmid, có những chủng vi khuẩn trở thành đề kháng nhiều thuốc kháng sinh khác nhau, mặc dù trước đó chưa hề tiếp xúc lần nào với kháng sinh này. Theo WHO (1995) điều trị bằng kháng sinh phải xem xét cả 2 nguồn thông tin: kết qủa thống kê độ nhạy cảm (in vitro) của vi khuẩn ở địa phương và hiệu quả điều trị trên lâm sàng. Ví dụ WHO (1995) khuyến cáo: với những nhiễm trùng ở đường tình dục và hậu môn không có biến chứng nên dùng một liều duy nhất tiêm bắp 250 mg ceftriaxon hoặc 2 g spectinomycin hoặc uống 500 mg ciprofloxin hoặc với viêm kết mạc mắt do lậu (gonococal conjunctivitis) cũng dùng liều duy nhất như trên. Nhưng hiện nay ở Việt Nam, số chủng vi khuẩn lậu đề kháng với ciprofloxacin lớn hơn 80% thì vấn đề dùng ciprofloxacin trong điều trị bệnh Lậu cần được giám sát chặt chẽ như phải tuân thủ theo kết quả nuôi cấy và làm kháng sinh đồ. Còn những nơi không nuôi cấy và làm kháng sinh đồ được thì không nên dùng ciprofloxacin trong điều trị bệnh lậu [12]. 4.3.2. Các yếu tố liên quan tới kháng kháng sinh - Sử dụng và lạm dụng kháng sinh Không ngạc nhiên khi N. gonorrhoeae kháng kháng sinh ở những nơi có dịch vụ y tế không chính quy và việc sử dụng kháng sinh không được kiểm soát tốt. Kháng kháng sinh qua nhiễm sắc thể và qua trung gian plasmid, được
115 lan rộng từ Nam sang Đông á [26]. Gần đây, kháng quinolon đã xuất hiện và lan rộng từ khu vực này sang khu vực khác. Sự lan rộng của TRNG ở châu Phi và những nơi khác, cũng là hậu quả rõ rệt của việc sử dụng và lạm dụng tetracyclin rẻ tiền, dễ sử dụng [148]. ở những vùng trên, người dân rất dễ tiếp cận với kháng sinh tại một dịch vụ y tế không chính quy [87]. Trong một nghiên cứu ở Ghana, khoảng 75% số người đến khám tại khoa điều trị các bệnh LTQĐTD đã tự dùng kháng sinh trước khi khám. Kháng sinh được lấy từ nhiều nguồn khác nhau và dùng với liều không thích hợp, thường kết hợp với các kháng sinh khác. 70- 95% vi khuẩn lậu được xét nghiệm tại khoa đều kháng với những kháng sinh được dùng phổ biến. Những báo cáo mang tính giai thoại cho biết gái mại dâm ở châu á đã cung cấp cho khách hàng quinolon đường uống như là một cách "dự phòng", việc tự kê đơn kháng sinh dự phòng trong gái mại dâm ở Philippines là một yếu tố góp phần tăng tính kháng kháng sinh tại quốc gia này. Việc sử dụng nhiều loại kháng sinh tại dịch vụ y tế không chính quy đã dẫn đến sự phát triển nhiều loài vi khuẩn và kí sinh trùng đề kháng với nhiều kháng sinh [23]. Gần 30 năm trước, Willcox [158] cho biết "ở các nước không hỗn loạn về xã hội và chính trị, ít gái mại dâm và phổ biến các dịch vụ khám chữa bệnh và xét nghiệm, nơi mà không thể mua được kháng sinh nếu không có đơn của bác sĩ, thì việc tự điều trị bệnh Lậu mà không được chẩn đoán là rất hiếm; ngược lại nơi mà các kháng sinh hiệu quả, đắt tiền, dễ dàng mua được để tự điều trị bệnh Lậu thì tình trạng kháng kháng sinh rất khó kiểm soát". - Yếu tố môi trường và xã hội: Vi khuẩn lậu có khả năng biến đổi cao, do nhận được ADN của các loài có quan hệ mật thiết và cũng trải qua nhiều thay đổi, dần dần biến đổi về kiểu hình và kiểu gen. Một chủng đề kháng trở thành một chủng gây dịch địa
116 phương (endemic) khi một số lượng lớn cá thể bị nhiễm chủng này, thường là gắn liền với nhóm lây truyền chủ đạo (core transmitters) như gái mại dâm (CSWs-commercial sex workers). Thoạt đầu, đề kháng quinolon ở mức thấp 2-3%, được du nhập bởi các khách du lịch chỉ gây dịch nhỏ hoặc không thành dịch. Kiểu cách này kéo dài vài năm, với những dịch nhỏ hoặc không lan truyền thứ phát nhưng MIC của các chủng đề kháng đã tăng dần và tỷ lệ phân lập sẽ tăng cao ở CSWs và khách hàng của họ [133]. Tóm lại, để ngăn ngừa sự gia tăng vi khuẩn lậu kháng thuốc, cần phải giám sát vi khuẩn lậu và tính kháng kháng sinh của chúng. Mỗi cơ sở y tế đều phải tham gia, tuỳ theo khả năng của mình. Ví dụ, ở tuyến huyện, quận cần phải chẩn đoán/xét nghiệm tốt bằng phương pháp nhuộm soi trực tiếp bệnh phẩm tìm vi khuẩn lậu. ở tuyến tỉnh cần phải nuôi cấy được vi khuẩn theo chương trình của quốc gia. Tuyến trung ương phải hỗ trợ các tuyến dưới thực hiện quy trình xét nghiệm chuẩn tìm vi khuẩn và xác định độ nhạy cảm với kháng sinh. Đồng thời với việc hỗ trợ và giám sát tuyến dưới tuyến trung ương còn phải cập nhật thường xuyên những quy trình kỹ thuật chuẩn mới của quốc tế. Thực hiện tốt những công việc trên, chúng ta sẽ giám sát được vi khuẩn lậu và tính kháng kháng sinh của chúng. 4.4. đột biến gen liên quan đến kháng ciprofloxacin Muốn xác định được điểm đột biến gen ta phải giải trình tự đoạn gen liên quan đó rồi so sánh với đoạn gen gốc. Trình tự của ADN mã hóa các protein cần thiết để cho các cơ thể sống có thể tồn tại và tái sản sinh. Vì tính chất quan trọng của ADN đối với sự sống, hiểu biết về trình tự ADN là hữu ích với các nghiên cứu sinh học và ứng dụng.
117 Hai phương pháp xác định trình tự chính là phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert (1977) và phương pháp kết thúc chuỗi của Sanger và cộng sự (1977). Dù rất khác nhau về nguyên tắc, hai phương pháp này có một số điểm chung: hình thành một tập hợp nhiều oligonucleotid có chiều dài khác nhau, mỗi oligonucleotid có xác xuất xuất hiện bằng nhau trong phản ứng. Các trình tự này sau đó được phân tách dựa vào kích thước của oligonucleotid bằng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamid có khả năng phân tách hai trình tự chỉ cách nhau 1 nucleotid. Với việc sử dụng kháng sinh tùy tiện như hiện nay ở nước ta cũng như một số nước trên thế giới đã làm gia tăng tính kháng thuốc của vi khuẩn lậu; nguy hại hơn là nhiều gen kháng những kháng sinh khác nhau đã được tìm thấy ở vi khuẩn lậu. Mặc dù bệnh Lậu ở nước ta chiếm một tỷ lệ tương đối cao, nhưng việc nghiên cứu một cách có hệ thống về sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu vẫn còn hạn chế. Khoa Xét nghiệm Viện Da liễu Quốc Gia thống kê hàng năm: mức độ đề kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu phân lập năm 2007 là 89,15% (MIC lên tới 32 µg/ml). Theo thông báo của WHO (2008), tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh thuộc nhóm quinolon năm 2006 vẫn ở mức độ cao: Trung Quốc là 99,6%, Hồng Kông 97,8%, Hàn Quốc 89,4%, Nhật Bản 83,4%, Brunei 81,7%, Philippines 69%, Việt Nam 82,1% [157]. Như vậy sự đề kháng ciprofloxacin trên diện rộng ở châu á là đáng báo động. ở Việt Nam đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về đột biến gen kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu. Khi nghiên cứu về sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu trong ba năm tôi nhận thấy mức độ đề kháng với ciprofloxacin không chênh lệch nhiều vì vậy trong tổng số 503 chủng phân lập được. Tôi chọn ngẫu nhiên được 71 chủng vi khuẩn lậu trong đó có 2
118 chủng nhạy cảm với ciprofloxacin và 69 chủng kháng ciprofloxacin, tôi tiến hành giải trình tự tại Khoa Xét nghiệm-Viện các bệnh nhiễm trùng Quốc gia, Nhật Bản để xác định điểm đột biến liên quan đến sự đề kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu. Kết quả như sau: đối với chủng nhạy cảm tôi không thấy có điểm đột biến nào. Phân tích 69 chủng đề kháng, tôi nghiên cứu đột biến trong mối liên quan với MIC có nồng độ từ 1-32 µg/ml nhận thấy: các chủng đề kháng đều có những thay đổi trên gen gyrA và parC. Các chủng đề kháng đều có đột biến Ser-91 thành Phe. Trong khi 2 chủng nhạy cảm với ciprofloxacin thì không mang đột biến này. Ngoài ra, trên gen gyrA còn phát hiện đột biến tại Asp-95 ở tất cả các chủng kháng ciprofloxacin với 3 kiểu đột biến là Asp-95 thành Ala (chiếm 63,8%), Asp-95 thành Gly (chiếm 27,5%) và Asp-95 thành Asn (chiếm 8,7%). Những đột biến trên gen gyrA và parC dẫn đến những thay đổi axit amin ở protein GyrA (đặc biệt tại Ser-91 và Asp-95) và protein ParC liên quan mật thiết với tính kháng ciprofloxacin. Nghiên cứu của tôi cũng tương tự U. Chaudhry và cộng sự, nhưng tác giả này nhận thấy đột biến hay gặp nhất trên gen gyrA là Ser-91 thành Phe và Asp-95 thành Asn (chiếm 83%) [38]. Trong nghiên cứu của tôi, phối hợp hay gặp nhất là Ser91 thành Phe và Asp-95 thành Ala (chiếm 63,8%), còn phối hợp Ser-91 thành Phe và Asp-95 thành Asn chỉ chiếm 8,7%. U. Chaudhry còn nhận thấy đột biến Asp-95 thành Gly đi kèm đột biến Ser-91 thành Phe gây nên mức đề kháng cao, nhưng trong nghiên cứu của tôi, mức đề kháng cao nhất được thấy ở sự kết hợp giữa Ser-91 thành Phe và Asp95 thành Asn. Theo nghiên cứu của Masatoshi Tanaka và cộng sự ở Nhật Bản, ở các chủng đề kháng ở mức trung gian có 1 đến 3 đột biến trên 2 gen và ở các chủng đề kháng cao có 3 đến 4 đột biến trên 2 gen [131]. Về số lượng đột biến trên 2 gen gyrA và parC trong nghiên của tôi: ở những chủng đề kháng yếu (MIC ≤ 2 µg/ml) có 2 đột biến trên gen gyrA và có thể có hoặc không có đột biến trên gen parC, những
119 chủng MIC ≥ 3 µg/ml đều có 3 đột biến trên 2 gen nói trên; như vậy mức độ kháng ciprofloxacin có liên quan đến số lượng các đột biến điều này cũng giống một số nghiên cứu khác trên thế giới. Về các đột biến trên gen parC, nghiên cứu của tôi cho thấy: sự xuất hiện đột biến và kiểu đột biến có liên quan mật thiết đến mức độ đề kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu; cụ thể là 3 chủng có đột biến Asp-86 thành Asn có mức đề kháng thấp. Những chủng mang đột biến Ser-87 thành Asn có mức đề trung bình. Những chủng có mức đề kháng cao là những chủng mang các đột biến Glu-91 thành Gln và Ser-87 thành Ile; các đột biến trên gen parC luôn đi kèm với đột biến trên gen gyrA, không có đột biến đơn độc trên parC, đặc biệt là thấy đột biến đơn mà không thấy đột biến kép trên parC trong nghiên cứu của tôi cũng giống với nghiên cứu của Tiffany R. Shultz và cộng sự tại Sydney, úc nhưng lại khác với các nghiên cứu khác là ở codon 91 trên gyrA, ngoài đột biến Ser-91 thành Phe, tác giả còn thấy đột biến Ser-91 thành Tyr [125], trong khi đó tôi chỉ thấy một kiểu đột biến Ser-91 thành Phe. Như vậy có thể là những chủng mà tôi đang nghiên cứu có nguồn gốc từ một chủng hoặc chủng phổ biến cho khu vực. Tôi nghiên cứu 69 chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh ciprofloxacin về đột biến sắp xếp theo nồng độ MIC, số lượng đột biến trên 2 gen gyrA và parC theo mức độ kháng ciprofloxacin, phân tích các đột biến trên gen gyrA và parC và sự phối hợp giữa các đột biến trên 2 gen gyrA và parC. Kết quả nghiên cứu cho thấy: tất cả những chủng kháng kháng sinh ciprofloxacin đều có đột biến trên 2 gen gyrA và parC và số lượng đột biến cũng tăng theo nồng độ MIC. Trong tổng số 71 chủng tôi nghiên cứu, có 2 chủng nhạy cảm với ciprofloxacin có MIC từ 0,002-0,060 µg/ml (tỷ lệ 2,8%) thì không có một sự thay đổi nào trong trình tự ADN. Có 11 chủng đề kháng có MIC từ 1-2 µg/ml (tỷ lệ 15,5%) mang 2 đột biến trên gen gyrA và không mang đột biến trên gen
120 parC. Còn 6 chủng đề kháng có MIC từ 1-2 µg/ml (tỷ lệ 8,5%) mang 3 đột biến trên cả 2 gen gyrA và parC; 52 chủng đề kháng có MIC từ 3-32 µg/ml (tỷ lệ 73,2%) mang 3 đột biến gồm 2 đột biến ở vị trí Ser-91 và Asp-95 của gen gyrA, và 1 đột biến ở vị trí Ser-87 của gen parC. Như vậy, MIC cũng có mối liên quan với số lượng đột biến. Với MIC nhỏ, mang ít đột biến. MIC lớn mang nhiều đột biến hơn cũng giống như những nhận xét của các tác giả trên thế giới nhưng nghiên cứu của tôi lại khác những nhận xét của các tác giả trên thế giới là trên gen gyrA của những chủng kháng đều có đột biến Ser-91 thành Phe. Điều này có thể những chủng vi khuẩn lậu lây truyền hiện nay tại Việt Nam có nguồn gốc từ cùng một chủng và mang tính khu vực. Kết quả nghiên cứu của tôi đã chứng minh rằng sự đề kháng của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin, thuốc mà được xem như liệu pháp hàng đầu vào những năm 1990, đã tăng lên nhanh chóng với mức MIC cao đáng báo động với các đột biến mới ở vi khuẩn lậu. Nếu không có sự giám sát liên tục về sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu, với khuynh hướng ngày càng gia tăng những chủng đa đề kháng lan truyền trong cộng đồng, thì sự thất bại trong điều trị là không thể tránh được, dẫn tới sự lây nhiễm lan tràn và gây nhiều biến chứng làm ảnh hưởng đến xã hội, kinh tế, gia đình và giống nòi. Kết luận 1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005-2007. - Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu từ năm 2005-2007 là 9,9% (n=5.091).
121 - Tỷ lệ dương tính theo giới: 30,5% nam giới và 24,5% nữ giới. - Tỷ lệ dương tính theo nhóm tuổi: 21-30 là cao nhất 31,9%; 31-40 là 23,2%. - Tỷ lệ dương tính theo nghề nghiệp: lái xe là cao nhất 34,5%; cán bộ là 25,5%; học sinh-sinh viên là 28,6%. - Tỷ lệ dương tính theo nguồn lây: bạn tình là cao nhất 32,1%; mại dâm là 28,9%; vợ chồng là 22,3%. - Tỷ lệ dương tính theo trình độ học vấn: cấp 2 là cao nhất 34,6%; cấp 3 là 33,0%; cao đẳng-đại học là 22,9%. 2. So sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, nhuộm soi và nuôi cấy - Tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu bằng kỹ thuật PCR cho kết quả cao nhất (28,2%), rồi đến kỹ thuật nuôi cấy (13,0%) và kỹ thuật nhuộm soi (10,6%). - Đặt biệt ở nhóm mạn tính thì tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu bằng kỹ thuật PCR cho kết quả những (14,7%), trong khi đó kỹ thuật nuôi cấy và kỹ thuật nhuộm soi chỉ là 1,9 và 0,7%. 3. kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu phân lập được tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005-2006-2007. Ciprofloxacin có xu hướng tăng dần lần lượt là 80,9% - 82,1% - 89,2%. Nhưng penicillin lại có xu hướng giảm xuống là 61,7% - 54,2% - 41,9%. Đặc biệt đã xuất hiện những chủng giảm nhạy cảm với kháng sinh : azithromycin là 5,6% - 1,9% - 0,8%. Cefotaxim là 1,2% - 0,9% - 3,1%. 4. đột biến gen liên quan đến kháng ciprofloxacin - Đột biến gen kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu trên gen gyrA: + 100% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Ser-91 thành Phe. + 63,8% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Asp-95 thành Ala. + 27,5% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Asp-95 thành Gly. + 8,7% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Asp-95 thành Asn.
122 - Đột biến gen kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu trên gen parC: + 15,9% số chủng kháng ciprofloxacin không có đột biến. + 4,3% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Asp-86 thành Asn. + 44,9% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Ser-87 thành Asn. + 17,4% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Ser-87 thành Arg. + 10,1% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Ser-87 thành Ile. + 7,2% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Glu-91 thành Gln. - Mối liên quan giữa MIC và đột biến: Các chủng nhạy cảm (MIC 0,002-0,060 µg/ml) không có đột biến. MIC càng cao càng thấy xuất hiện nhiều đột biến trên gen gyrA và parC. Sự phối hợp đột biến trên gen gyrA và parC làm gia tăng sự đề kháng của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin.
123 Khuyến cáo 1. Phải tuyên truyền giáo dục y tế thường xuyên trên các phương tiện thông tin đại chúng cho các đối tượng thanh thiếu niên, cán bộ và nhân dân về an toàn trong quan hệ tình dục để phòng ngừa các bệnh LTQĐTD nói chung và nhiễm HIV/AIDS nói riêng. 2. Nên áp dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán những trường hợp lậu mạn, lậu ngoài đường tiết niệu sinh dục hoặc những trường hợp đã thực hiện bằng các xét nghiệm thông thường không thấy. 3. Thường xuyên giám sát kháng kháng sinh để thông báo trong nước và quốc tế về tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu từ đó có biện pháp khoanh vùng đối với những chủng đa kháng thuốc. 4. Giám sát những gen kháng thuốc để phục vụ chiến lược sử dụng kháng sinh hợp lý trong từng giai đoạn cụ thể.

More Related Content

PDF
Sổ tay phòng chống hội chứng viêm đường hô hấp vùng Trung Đông do vi rút Coro...
Huy Hoang
 
PDF
Hbv gentype md_1013
Huy Hoang
 
PDF
Tình trạng nhiễm HIV, HBV, HCV và yếu tố liên quan ở một số nhóm nguy cơ cao ...
Huy Hoang
 
PDF
Tỷ lệ nhiễm và mang gen kháng Cephalosporin thế hệ 3 và Quinolon của các chủn...
Huy Hoang
 
DOC
Phage hay thực khuẩn thể một loại virus đặc biệt
skipbeat168
 
PDF
Di truyen y học ebook byt
Huy Hoang
 
DOC
Trắc nghiiệm KST DHY (ĐA)
Nguyễn Phượng
 
PDF
Trac nghiem vi sinh dhy duoc hue
Huy Hoang
 
Sổ tay phòng chống hội chứng viêm đường hô hấp vùng Trung Đông do vi rút Coro...
Huy Hoang
 
Hbv gentype md_1013
Huy Hoang
 
Tình trạng nhiễm HIV, HBV, HCV và yếu tố liên quan ở một số nhóm nguy cơ cao ...
Huy Hoang
 
Tỷ lệ nhiễm và mang gen kháng Cephalosporin thế hệ 3 và Quinolon của các chủn...
Huy Hoang
 
Phage hay thực khuẩn thể một loại virus đặc biệt
skipbeat168
 
Di truyen y học ebook byt
Huy Hoang
 
Trắc nghiiệm KST DHY (ĐA)
Nguyễn Phượng
 
Trac nghiem vi sinh dhy duoc hue
Huy Hoang
 

What's hot(19)

DOC
Chuyên đề: Cấu tạo và sinh lý vi khuẩn
visinhyhoc
 
DOC
đề Cương vi sinh
Bui Nhu
 
DOCX
Đề Cương Vi Sinh 100 Câu
VuKirikou
 
DOC
09 vi sinh vat trong tu nhien va ki sinh o nguoi. cac duong truyen benh da
Le Tran Anh
 
DOC
14 cac xoan khuan gay benh da
Le Tran Anh
 
DOC
06 nhiem trung va doc luc cua vi sinh vat da
Le Tran Anh
 
PDF
Ky sinh trung
Huy Hoang
 
DOC
01 doi tuong nghien cuu va lich su phat trien cua vi sinh vat hoc da
Le Tran Anh
 
DOC
19 enterovirus rotavirus - da
Le Tran Anh
 
DOC
02b sinh ly cua vi khuan da
Le Tran Anh
 
PDF
Trắc Nghiệm Vi Sinh Có Đáp Án
nataliej4
 
PDF
250 cau trac nghiem sinh hoc
Việt Đinh
 
PDF
Thực tập sinh lý i
Thịnh NguyễnHuỳnh
 
DOCX
Bài tập ôn luyện Vi Sinh Vật Y Học
VuKirikou
 
PDF
Trắc nghiệm sinh học đại cương
Thịnh NguyễnHuỳnh
 
DOC
21 paramyxoviridae da
Le Tran Anh
 
DOC
ký sinh trùng
Nguyễn Phượng
 
DOC
20 virus cum da
Le Tran Anh
 
PDF
Vi sinh ký sinh trùng CĐHĐ
TS DUOC
 
Chuyên đề: Cấu tạo và sinh lý vi khuẩn
visinhyhoc
 
đề Cương vi sinh
Bui Nhu
 
Đề Cương Vi Sinh 100 Câu
VuKirikou
 
09 vi sinh vat trong tu nhien va ki sinh o nguoi. cac duong truyen benh da
Le Tran Anh
 
14 cac xoan khuan gay benh da
Le Tran Anh
 
06 nhiem trung va doc luc cua vi sinh vat da
Le Tran Anh
 
Ky sinh trung
Huy Hoang
 
01 doi tuong nghien cuu va lich su phat trien cua vi sinh vat hoc da
Le Tran Anh
 
19 enterovirus rotavirus - da
Le Tran Anh
 
02b sinh ly cua vi khuan da
Le Tran Anh
 
Trắc Nghiệm Vi Sinh Có Đáp Án
nataliej4
 
250 cau trac nghiem sinh hoc
Việt Đinh
 
Thực tập sinh lý i
Thịnh NguyễnHuỳnh
 
Bài tập ôn luyện Vi Sinh Vật Y Học
VuKirikou
 
Trắc nghiệm sinh học đại cương
Thịnh NguyễnHuỳnh
 
21 paramyxoviridae da
Le Tran Anh
 
ký sinh trùng
Nguyễn Phượng
 
20 virus cum da
Le Tran Anh
 
Vi sinh ký sinh trùng CĐHĐ
TS DUOC
 

Similar to Xac dinh vi khuan lau va phat hien gen dot bien khang ciprofloxacin bang ky thuat sinh hoc phan tu(20)

PDF
Tạp chí Life Balance | No.14 | OSHE Magazine
PMC WEB
 
PPTX
Bài giảng chuyên đêt cuối khóa sinh viên tự làn
quinejeny600
 
PDF
Tạp chí Life Balance | No.6 | OSHE Magazine
PMC WEB
 
DOCX
Dac diem dich te hoc benh soi tai ha noi giai doan 2006 2015 va tinh trang kh...
Luanvanyhoc.com-Zalo 0927.007.596
 
PDF
Luận án: Thực trạng nhiễm sán lá truyền qua cá trên người, HAY
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
DOCX
Dac diem lam sang, can lam sang va tinh hinh vi khuan khang thuoc o benh nhan...
Luanvanyhoc.com-Zalo 0927.007.596
 
DOC
Luận án: Nghiên cứu dịch tễ học lâm sàng về bệnh rubella bẩm sinh
Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
DOC
Luận án: Nghiên cứu dịch tễ học lâm sàng bệnh rubella bẩm sinh
Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
PPT
9.8_tuberculosis.ppt
SuongSuong16
 
DOCX
Nghien cuu viec lua chon cac dung dich tiem truyen trong dieu tri benh sot xu...
Luanvanyhoc.com-Zalo 0927.007.596
 
PPT
Rhinosporidiosis
Tý Cận
 
PPT
Bai 1 bs duy phong benh lay truyen dv sang nguoi moi noi va tai noi_may 2018
Tran My Phuc
 
DOCX
Nghien cuu phuong phap choc oi realtime pcr de chan doan thai nhi bi nhiem ru...
Luanvanyhoc.com-Zalo 0927.007.596
 
PDF
Bệnh sốt xuất huyết dengue (giáo trình bệnh nhiễm)
nataliej4
 
PDF
BỆNH LAO PHỔI _ CHẨN ĐOÁN VÀ ĐIỀU TRỊ
SoM
 
PDF
Đề tài: Nghiên cứu đột biến gen RB1 và mối liên quan đến đặc điểm lâm sàng tr...
Dịch vụ viết thuê Khóa Luận - ZALO 0932091562
 
PDF
Luận án: Đặc điểm lâm sàng trên bệnh nhân U nguyên bào võng mạc
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
PDF
Tạp chí Life Balance | No.2 | OSHE Magazine
PMC WEB
 
PPTX
Hội chứng hô hấp vùng trung đông - bệnh truyền lây giữa người và động vật
HngLinh66
 
PPT
Viêm Phổi - PGS Trần Hoàng Thành
M. Hùng Trương
 
Tạp chí Life Balance | No.14 | OSHE Magazine
PMC WEB
 
Bài giảng chuyên đêt cuối khóa sinh viên tự làn
quinejeny600
 
Tạp chí Life Balance | No.6 | OSHE Magazine
PMC WEB
 
Dac diem dich te hoc benh soi tai ha noi giai doan 2006 2015 va tinh trang kh...
Luanvanyhoc.com-Zalo 0927.007.596
 
Luận án: Thực trạng nhiễm sán lá truyền qua cá trên người, HAY
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Dac diem lam sang, can lam sang va tinh hinh vi khuan khang thuoc o benh nhan...
Luanvanyhoc.com-Zalo 0927.007.596
 
Luận án: Nghiên cứu dịch tễ học lâm sàng về bệnh rubella bẩm sinh
Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
Luận án: Nghiên cứu dịch tễ học lâm sàng bệnh rubella bẩm sinh
Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864
 
9.8_tuberculosis.ppt
SuongSuong16
 
Nghien cuu viec lua chon cac dung dich tiem truyen trong dieu tri benh sot xu...
Luanvanyhoc.com-Zalo 0927.007.596
 
Rhinosporidiosis
Tý Cận
 
Bai 1 bs duy phong benh lay truyen dv sang nguoi moi noi va tai noi_may 2018
Tran My Phuc
 
Nghien cuu phuong phap choc oi realtime pcr de chan doan thai nhi bi nhiem ru...
Luanvanyhoc.com-Zalo 0927.007.596
 
Bệnh sốt xuất huyết dengue (giáo trình bệnh nhiễm)
nataliej4
 
BỆNH LAO PHỔI _ CHẨN ĐOÁN VÀ ĐIỀU TRỊ
SoM
 
Đề tài: Nghiên cứu đột biến gen RB1 và mối liên quan đến đặc điểm lâm sàng tr...
Dịch vụ viết thuê Khóa Luận - ZALO 0932091562
 
Luận án: Đặc điểm lâm sàng trên bệnh nhân U nguyên bào võng mạc
Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864
 
Tạp chí Life Balance | No.2 | OSHE Magazine
PMC WEB
 
Hội chứng hô hấp vùng trung đông - bệnh truyền lây giữa người và động vật
HngLinh66
 
Viêm Phổi - PGS Trần Hoàng Thành
M. Hùng Trương
 

More from Huy Hoang(20)

PDF
Vi sinh - ki sinh trung y hoc
Huy Hoang
 
PDF
Nấm da
Huy Hoang
 
PDF
Tổng hợp các câu trắc nghiệm vi sinh đại cương
Huy Hoang
 
PDF
Cap nhat-chan-doan-va-xu-tri-soc-phan-ve-2014 1 (1)
Huy Hoang
 
PDF
ỨNG DỤNG MIC CỦA KHÁNG SINH TRONG LÂM SÀNG
Huy Hoang
 
PDF
Khao sat mrsa
Huy Hoang
 
PDF
Giun móc, giun lươn
Huy Hoang
 
PDF
Đại cương muỗi, muỗi sốt rét
Huy Hoang
 
PDF
Giun chỉ, giun soắn, giun lạc chỗ
Huy Hoang
 
PDF
Đại cương đơn bào, trùng amip, trùng lông
Huy Hoang
 
PDF
Đại cương kí sinh trùng
Huy Hoang
 
PDF
dai cuong giun san
Huy Hoang
 
PPT
Các cơ chế miễn dịch
Huy Hoang
 
PDF
Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định chủng độc lực Bacilluc anthracis ...
Huy Hoang
 
PDF
Kst benhsotret
Huy Hoang
 
PPT
Tong quan mers co v
Huy Hoang
 
PDF
Qui trinh xn chuyên nganh vi sinh -Bộ Y tế
Huy Hoang
 
PDF
Huong dan su dung medcalc
Huy Hoang
 
PDF
đạI cương vi nấm y học
Huy Hoang
 
PDF
Microbiology handbook
Huy Hoang
 
Vi sinh - ki sinh trung y hoc
Huy Hoang
 
Nấm da
Huy Hoang
 
Tổng hợp các câu trắc nghiệm vi sinh đại cương
Huy Hoang
 
Cap nhat-chan-doan-va-xu-tri-soc-phan-ve-2014 1 (1)
Huy Hoang
 
ỨNG DỤNG MIC CỦA KHÁNG SINH TRONG LÂM SÀNG
Huy Hoang
 
Khao sat mrsa
Huy Hoang
 
Giun móc, giun lươn
Huy Hoang
 
Đại cương muỗi, muỗi sốt rét
Huy Hoang
 
Giun chỉ, giun soắn, giun lạc chỗ
Huy Hoang
 
Đại cương đơn bào, trùng amip, trùng lông
Huy Hoang
 
Đại cương kí sinh trùng
Huy Hoang
 
dai cuong giun san
Huy Hoang
 
Các cơ chế miễn dịch
Huy Hoang
 
Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định chủng độc lực Bacilluc anthracis ...
Huy Hoang
 
Kst benhsotret
Huy Hoang
 
Tong quan mers co v
Huy Hoang
 
Qui trinh xn chuyên nganh vi sinh -Bộ Y tế
Huy Hoang
 
Huong dan su dung medcalc
Huy Hoang
 
đạI cương vi nấm y học
Huy Hoang
 
Microbiology handbook
Huy Hoang
 

Recently uploaded(20)

DOCX
Phẫu thuật Móng trong Thực hành Da liễu Bs Đạo-2025.docx
Dao Truong
 
PPTX
Bệnh án Lao phổi nặng khoa hồi sức cấp cứu
ThuHng826811
 
PDF
ĐỀ NHI SIÊU TOONGR HỢP KHOA Y ĐHQGHCM.
btlanhy20221
 
PDF
Share _VIÊM KHỚP DẠNG THẤP. Trường đại học tây nguyênpdf
dtduy0903536319
 
DOCX
Nghiên cứu tình hình sử dụng thuốc chống viêm trong điều trị bệnh gút trên bệ...
lamluanvan.net Viết thuê luận văn
 
PDF
Phẫu Thuật Trong Bệnh Phong: Giải Áp Thần Kinh, Phục Hồi Chức Năng & Tái Tạo ...
Dao Truong
 
PDF
S2.1 - LEC9 - Cung cấp thông tin với người bệnh, gia đình người bệnh.pdf
HongNguynNguyn5
 
PDF
Bệnh Phong: Viêm Thần Kinh, Phản Ứng Đảo Nghịch, Hồng Ban Nút Phong
Dao Truong
 
PPTX
CHẨN ĐOÁN VÀ ĐIỀU TRỊ ĐAU LƯNG THEO Y HỌC CỔ TRUYỀN.pptx
buibaruy
 
PDF
Chăm Sóc Vết Thương & Biến Chứng Sau Phẫu Thuật Da | BS Trương Lê Đạo – BV Da...
Dao Truong
 
PPTX
Chóng mặt - Chẩn đoán và điều trị 2022.pptx
Tống Nguyễn Bình
 
PPTX
Vận Động Trị Liệu.pptx Vận Động Trị Liệu.pptx
haiphuongly117
 
PDF
PHẪU THUẬT UNG THƯ TẾ BÀO ĐÁY VÙNG MẶT | Kỹ Thuật, Vạt Da & Nguyên Tắc Phục H...
Dao Truong
 
PPTX
DINH DƯỠNG CHO BỆNH NHÂN THỞ MÁY.pptx
HngTrNguyn21
 
PDF
Bài giảng bệnh lý Viêm phổi Trường Đại học Nguyễn Tất Thành
lanhphiphi2011991
 
DOCX
NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH SỬ DỤNG THUỐC CHỐNG VIÊM KHÔNG STEROID TRÊN NGƯỜI BỆNH T...
lamluanvan.net Viết thuê luận văn
 
DOCX
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ CẬN LÂM SÀNG Ở SẢN PHỤ DƯỚI 18 TUỔI ĐẺ TẠI TR...
lamluanvan.net Viết thuê luận văn
 
PDF
Bài giảng bệnh lý Hen phế quản Trường Đại học Nguyễn Tất Thành
lanhphiphi2011991
 
PDF
Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính 2024
ThuHng826811
 
PDF
Biến Chứng Sau Phẫu Thuật Da & Cách Xử Trí | BSCKII Trương Lê Đạo – BV Da Liễ...
Dao Truong
 
Phẫu thuật Móng trong Thực hành Da liễu Bs Đạo-2025.docx
Dao Truong
 
Bệnh án Lao phổi nặng khoa hồi sức cấp cứu
ThuHng826811
 
ĐỀ NHI SIÊU TOONGR HỢP KHOA Y ĐHQGHCM.
btlanhy20221
 
Share _VIÊM KHỚP DẠNG THẤP. Trường đại học tây nguyênpdf
dtduy0903536319
 
Nghiên cứu tình hình sử dụng thuốc chống viêm trong điều trị bệnh gút trên bệ...
lamluanvan.net Viết thuê luận văn
 
Phẫu Thuật Trong Bệnh Phong: Giải Áp Thần Kinh, Phục Hồi Chức Năng & Tái Tạo ...
Dao Truong
 
S2.1 - LEC9 - Cung cấp thông tin với người bệnh, gia đình người bệnh.pdf
HongNguynNguyn5
 
Bệnh Phong: Viêm Thần Kinh, Phản Ứng Đảo Nghịch, Hồng Ban Nút Phong
Dao Truong
 
CHẨN ĐOÁN VÀ ĐIỀU TRỊ ĐAU LƯNG THEO Y HỌC CỔ TRUYỀN.pptx
buibaruy
 
Chăm Sóc Vết Thương & Biến Chứng Sau Phẫu Thuật Da | BS Trương Lê Đạo – BV Da...
Dao Truong
 
Chóng mặt - Chẩn đoán và điều trị 2022.pptx
Tống Nguyễn Bình
 
Vận Động Trị Liệu.pptx Vận Động Trị Liệu.pptx
haiphuongly117
 
PHẪU THUẬT UNG THƯ TẾ BÀO ĐÁY VÙNG MẶT | Kỹ Thuật, Vạt Da & Nguyên Tắc Phục H...
Dao Truong
 
DINH DƯỠNG CHO BỆNH NHÂN THỞ MÁY.pptx
HngTrNguyn21
 
Bài giảng bệnh lý Viêm phổi Trường Đại học Nguyễn Tất Thành
lanhphiphi2011991
 
NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH SỬ DỤNG THUỐC CHỐNG VIÊM KHÔNG STEROID TRÊN NGƯỜI BỆNH T...
lamluanvan.net Viết thuê luận văn
 
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ CẬN LÂM SÀNG Ở SẢN PHỤ DƯỚI 18 TUỔI ĐẺ TẠI TR...
lamluanvan.net Viết thuê luận văn
 
Bài giảng bệnh lý Hen phế quản Trường Đại học Nguyễn Tất Thành
lanhphiphi2011991
 
Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính 2024
ThuHng826811
 
Biến Chứng Sau Phẫu Thuật Da & Cách Xử Trí | BSCKII Trương Lê Đạo – BV Da Liễ...
Dao Truong
 

Xac dinh vi khuan lau va phat hien gen dot bien khang ciprofloxacin bang ky thuat sinh hoc phan tu

  • 1.
    1 Đặt vấn đề BệnhLậu là một trong những bệnh lây truyền qua đường tình dục (LTQĐTD) phổ biến hiện nay ở nước ta và nhiều nước trên Thế giới. Bệnh không gây tử vong nhưng nếu điều trị không kịp thời, không đúng phác đồ sẽ để lại nhiều biến chứng và di chứng làm ảnh hưởng không những đối với bản thân mà còn đến xã hội, kinh tế, gia đình và giống nòi [6], [9]. Căn nguyên gây bệnh Lậu là vi khuẩn lậu. Đây là song cầu bắt màu Gram (-) có tên khoa học là Neisseria gonorrhoeae, được Neisser mô tả năm 1879. Theo thông báo của WHO, hàng năm trên thế giới có khoảng 333 triệu người bị bệnh LTQĐTD, trong đó có 62 triệu người bị bệnh Lậu. ở khu vực châu á Thái Bình Dương, hàng năm có tới 30 triệu người bị bệnh LTQĐTD, trong đó 5,4 triệu người bị bệnh Lậu. Trong số này, 80% là phụ nữ; 70% người bị bệnh Lậu không có triệu chứng. Điều này dẫn đến mầm bệnh không được phát hiện, làm gia tăng khả năng lây bệnh cho cộng đồng [134], [151]. ở Việt Nam, theo báo cáo của Phòng Chỉ đạo chuyên khoa Viện Da liễu Quốc Gia năm 2007 có 211.476 người bị bệnh LTQĐTD trong đó có 5.491 người bị bệnh Lậu. Vi khuẩn lậu, ngoài gây viêm niệu đạo, âm đạo, còn có khả năng gây viêm kết mạc, hay gặp là viêm kết mạc mắt trẻ sơ sinh, viêm khớp, hội chứng Reiter và những biến chứng ngoài tiết niệu sinh dục. Các kỹ thuật chẩn đoán thông thường như nhuộm soi, nuôi cấy thường không phát hiện được các trường hợp này. Vì vậy, bổ sung phương pháp chẩn đoán mới, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với các phương pháp kinh điển là cần thiết, để đánh giá đúng hơn về tình hình bệnh Lậu hiện nay. Một trong những kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng hiện nay là PCR. Theo thông báo của WHO (2008) về chương trình giám sát kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu ở khu vực châu á Thái Bình Dương năm 2006, đã phân lập 7.954 chủng tại 14 quốc gia. Tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng
  • 2.
    2 kháng sinh thuộcnhóm quinolon đang ở mức độ cao: Trung Quốc là 99,6%; Hồng Kông 97,8%; Hàn Quốc 89,4%; Nhật Bản 83,4%; Brunei 81,7%; Philippines 69%; Việt Nam 82,1%... [157]. ở Việt Nam, tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng penicillin có xu hướng giảm dần từ 75,26% (1996) xuống 47,77% (2000), nhưng tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng các kháng sinh nhóm quinolon và đặc biệt là ciprofloxacin có xu hướng gia tăng một cách rõ rệt từ 10,75% (1996) lên 42,67% (2000) [13], [14], [15]. Ciprofloxacin là một kháng sinh mới được đưa vào điều trị bệnh Lậu trong những năm gần đây với một liều uống duy nhất (500 mg) đã điều trị được bệnh Lậu cấp; vì vậy đây là kháng sinh được cả thầy thuốc và bệnh nhân rất ưa chuộng. Chính vì thế, việc lạm dụng kháng sinh này đã dẫn tới tốc độ đề kháng đang tăng nhanh. Người ta lo ngại rằng, nếu không có biện pháp can thiệp hữu hiệu, ciprofloxacin có thể trở thành kháng sinh không có tác dụng đối với vi khuẩn lậu trong thời gian tới. Tuy vậy, cơ chế đề kháng của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin vẫn còn chưa rõ ràng. Với những lý do nêu trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định vi khuẩn lậu và phát hiện đột biến gen kháng ciprofloxacin bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007” Nhằm mục tiêu: 1. Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007. 2. So sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật: PCR, nhuộm soi và nuôi cấy. 3. Tìm hiểu sự kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu phân lập được tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007. 4. Phát hiện đột biến gen liên quan đến kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu.
  • 3.
    3 Chương I Tổng quan 1.1.bệnh lậu 1.1.1. Lịch sử Bệnh Lậu là một trong những bệnh được loài người biết đến sớm nhất và đã được người Ai Cập cổ đại mô tả từ năm 1550 trước công nguyên [5]. Có nhiều bài tổng quan về lịch sử bệnh Lậu, một trong những bài tổng quan xuất sắc là chuyên khảo của R.S. Morton [104]. Bệnh Lậu được biết tới từ rất lâu và đã được cảnh báo về sự lây truyền qua tiếp xúc với người nhiễm bệnh. Sách "The Book of Leviticus" mô tả: người bị tiết dịch niệu đạo phải tự tránh xa bạn tình trong 7 ngày, điều này cho thấy họ đã biết khả năng lây bệnh trong những ngày này là rất lớn. Vào thế kỷ thứ IV và V trước Công nguyên, Hippocrates đã viết rất nhiều về bệnh Lậu. Ông gọi bệnh Lậu cấp là “chứng đái són đau” (strangury) và hiểu rằng bệnh là kết quả “khoái lạc của Thần Vệ nữ” (the pleasures of Vernus) [84]. Celsus, một thầy thuốc La Mã, có những hiểu biết sâu rộng về bệnh Lậu, các biến chứng của nó và ông cũng biết cách "thông tiểu" (catheterize) cho bệnh nhân bị hẹp niệu đạo. Vào thế kỷ thứ II, Galen (năm 130 sau Công nguyên) đã đặt ra từ gonorrhea, hàm ý là “dòng chảy của tinh dịch” (flow of semen). Các thầy thuốc Hy Lạp-La Mã khác đã mô tả các cách khác nhau để điều trị bệnh Lậu, bao gồm kiêng quan hệ tình dục đối với người lớn và rửa mắt đối với trẻ sơ sinh. ở châu Âu, những hiểu biết về bệnh Lậu và các bệnh LTQĐTD khác còn rất ít cho tới cuối thời kỳ Trung cổ. Thuật ngữ "clap" lần đầu tiên xuất hiện trên các ấn phẩm vào năm 1378. Thuật ngữ này thường được dùng để chỉ bệnh Lậu, tuy chưa biết rõ về nguồn gốc của từ "clap" nhưng có thể đây là từ ám chỉ quận Les Clapier thuộc Paris, nơi trú ngụ của gái mại dâm thời Trung
  • 4.
    4 cổ. Có thểcó những nguồn gốc khác của thuật ngữ "clap", nhưng cho dù có nguồn gốc là gì đi nữa thì trong các tài liệu của châu Âu vào cuối thời Trung cổ, người ta đều biết rõ bệnh có liên quan tới quan hệ tình dục. Sau khi bệnh Giang mai lan tới châu Âu vào cuối thế kỷ XV, có sự nhầm lẫn đáng kể về mối liên quan giữa bệnh Lậu và bệnh Giang mai. Các nhà phẫu thuật lớn như Ambroise Paré (thế kỷ XVI) và John Hunter (thế kỷ XVIII) coi bệnh Giang mai và bệnh Lậu là những biểu hiện khác nhau của cùng một bệnh. Kết luận của Hunter là kết quả của một thí nghiệm nổi tiếng, ông tiêm cho chính mình chất lấy từ một bệnh nhân bị bệnh Lậu. Hậu quả là ông bị bệnh giang mai vì bệnh nhân này mắc cả bệnh Lậu và bệnh Giang mai [55]. Trong suốt thế kỷ thứ XIX vấn đề này vẫn không được giải quyết. Cho tới khi nhà hoa liễu học người Pháp, Philippe Ricord (1799 - 1889), phân biệt được hai bệnh này bằng một loạt các thực nghiệm [42]. Hiểu biết thực sự về căn nguyên gây bệnh Lậu chỉ đạt được sau mô tả của Neisser (1855 - 1916) về Neisseria gonorrhoeae vào năm 1879 và nuôi cấy được vi khuẩn lần đầu tiên trên môi trường nhân tạo của Leistikow và Loeffler vào năm 1882. Năm 1962, môi trường Thayer-Martin ra đời đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc chẩn đoán bệnh Lậu và làm tăng tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu bằng nuôi cấy [124]. Từ giữa những năm 1960, những hiểu biết về cấu trúc phân tử của vi khuẩn lậu, vật chủ và dịch tễ học bệnh Lậu đã tăng lên đáng kể nhờ những tiến bộ vượt bậc của khoa học-công nghệ. 1.1.2. Tình hình bệnh Lậu trên thế giới - Theo thống kê của WHO, hàng năm trên thế giới có hơn 60 triệu người bị bệnh Lậu. Riêng ở Mỹ hàng năm, có khoảng 2 triệu người mới mắc, tỷ lệ phụ nữ có thai nhiễm vi khuẩn lậu là 6%. ở London (Anh), theo dõi 516 thai phụ, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là 0,4% [67], [103], [134].
  • 5.
    5 - ở châuPhi, tỷ lệ viêm kết mạc mắt ở trẻ sơ sinh do vi khuẩn lậu là 5-10/1000 trẻ sơ sinh sống, trong khi đó ở Mỹ, tỷ lệ này là 0,1-0,6/1000 [151]. - Matsumoto (2008) cho biết, tại Nhật Bản: tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis tăng trên toàn thế giới, trong khi đó tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu lại giảm, trừ những nước thuộc châu á [99]. Khi nghiên cứu về tình hình bệnh Lậu trên thế giới tôi nhận thấy: bệnh Lậu có xu hướng giảm đi ở các nước phát triển và các nước đang phát triển thì không. 1.1.3. Tình hình bệnh Lậu ở Việt Nam Sau ngày giải phóng miền Nam, bệnh hoa liễu nói chung và bệnh Lậu nói riêng lan tràn khắp nơi. Năm 1977, phòng khám khoa Da liễu bệnh viện Bạch Mai điều trị cho 276 người bị lậu. Theo thống kê của ngành Da liễu từ năm 1999 đến năm 2007 số bệnh nhân bị bệnh Lậu mỗi năm là: Năm 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Số bệnh nhân 6.747 6.375 5.581 5.699 6.740 6.409 5.233 5.526 5.491 Về tình hình bệnh Lậu ở Việt Nam, tôi nhận thấy số lượng bệnh nhân mắc bệnh Lậu hầu như không giảm trong khoảng mười năm qua. Có những lúc bệnh Lậu tưởng chừng đã giảm nhưng lại tăng ngay trong những năm tiếp theo, ví dụ: năm 2001 số bệnh nhân mắc bệnh Lậu là 5.581 người nhưng lại tăng ngay sau năm 2003 lên 6.740 người. Tình hình bệnh Lậu mắt ở trẻ sơ sinh: Năm 1996 1998 2000 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Số bệnh nhân 140 66 21 22 18 10 04 13 13 Theo dõi về tình hình bệnh Lậu mắt ở trẻ sơ sinh trong khoảng hơn mười năm qua cho thấy: nhìn chung số lượng bệnh nhân có giảm. Điều này nói lên công tác tuyên truyền về giáo dục y tế và sức khỏe sinh sản những năm gần đây có tiến bộ. Nhưng số liệu này có thể chưa phản ánh đúng thực tế vì chỉ do ngành Da liễu cung cấp, cần có thêm số liệu của Viện Mắt, bệnh
  • 6.
    6 viện Phụ Sảnvà các trung tâm khám chữa bệnh tư nhân. 1.2. vi khuẩn lậu Vi khuẩn lậu, Neisseria gonorrhoeae, thuộc họ Neisseriaceae, giống Neisseria. Trong giống Neisseria, có loài gây bệnh, có loài hoại sinh, chúng khác biệt nhau về một số tính chất sinh vật hoá học (lên men đường glucose, không sinh hơi). Dựa vào tính chất này, người ta phân biệt vi khuẩn lậu với một số Neisseria hoại sinh khác [28]. 1.2.1. Hình thể của vi khuẩn lậu Trên tiêu bản lấy mủ từ bệnh nhân bị bệnh Lậu và nhuộm Gram, vi khuẩn lậu là những cầu khuẩn, hình hạt cà phê, đứng thành đôi, hai mặt dẹt quay vào nhau, bắt mầu Gram (-), có kích thước 0,6 µm x 0,8 µm, khoảng cách giữa hai cầu khuẩn bằng 1/5 chiều rộng. Khi ở trong tế bào bạch cầu đa nhân trung tính, vi khuẩn lậu là loại vi khuẩn độc chiếm tế bào (có nó thì không có loại vi khuẩn nào sống trong tế bào). Người ta có thể gặp một cặp, hai cặp, bốn cặp hoặc nhiều hơn nữa, có khi xếp lèn chặt trong lòng tế bào bạch cầu đa nhân trung tính. Vi khuẩn lậu không sinh nha bào, không có lông, không có tiêm mao (fibria), một số chủng có pili. Hình thể, tính chất bắt mầu, vị trí nằm trong lòng bạch cầu đa nhân trung tính của vi khuẩn lậu có giá trị lớn trong chẩn đoán xác định bệnh Lậu khi kết hợp với tiền sử bệnh nhân và triệu chứng lâm sàng [4], [28]. 1.2.2. Một số đặc điểm về siêu cấu trúc của vi khuẩn lậu - Cấu trúc màng Khi quan sát vi khuẩn lậu cắt ngang dưới kính hiển vi điện tử dẫn truyền (Transmission electron microscopy - TEM), người ta thấy có một màng ngoài điển hình của vi khuẩn Gram (-) phủ lên lớp peptidoglycan tương đối mỏng và màng tế bào chất. Não mô cầu chứa một vỏ polysaccharid thực, rất quan trọng đối với độc tính, trong khi vi khuẩn lậu không có cấu trúc này.
  • 7.
    7 Thông thường, cóthể nhìn thấy các bọng hoặc các bướu nhỏ ở màng ngoài qua kính hiển vi điện tử dẫn truyền. Không giống Escherichia coli và nhiều vi khuẩn đường ruột khác, vi khuẩn lậu thường giải phóng các mảnh vỡ của màng vào môi trường xung quanh và các mảnh kháng nguyên gắn vào kháng thể vật chủ [35], [56]. - Pili Những phần quan trọng nhất của vi khuẩn lậu trong bệnh nguyên có liên quan tới các phân tử bề mặt bao gồm sự bám dính, xâm nhập hay gây tổn thương vật chủ hoặc liên quan tới cơ chế tạo miễn dịch của vật chủ. Một trong số các phân tử bề mặt được nghiên cứu kỹ nhất là pili. Nhìn dưới kính hiển vi điện tử, pili xếp thành từng sợi hoặc tập hợp sợi và hầu như che phủ toàn bộ bề mặt tế bào bên ngoài vi khuẩn. Thực tế, pili là các polymer được tạo nên bởi hàng nghìn cấu trúc dưới mức phân tử, kích thước khoảng 18 kDa [35]. Hiện nay, người ta biết nhiều về cấu trúc dưới phân tử của pili, khi đánh giá bằng nghiên cứu cấu trúc tinh thể [56]. Pili làm tăng sự bám dính vào các mô của vật chủ. Cơ chế bám dính: hai cấu trúc bám dính quan trọng đã được chứng minh là pili và Opa. Pili của vi khuẩn lậu gắn tốt hơn vào tế bào biểu mô hình trụ của người so với tế bào sừng và gắn tốt hơn vào tế bào của người so với tế bào không phải của người. Pili biểu hiện khả năng gắn chọn lọc với những tế bào đặc biệt trong những điều kiện nhất định [88]. Các kháng thể kháng pili làm giảm sự bám dính của vi khuẩn lậu vào tế bào biểu mô. Sự thay đổi kháng nguyên của cả pili và Opa có thể là ưu điểm sinh học không chỉ đối với việc thoát khỏi các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu mà còn cung cấp những cấu trúc bám dính đặc hiệu để gắn với những vị trí khác nhau in vivo. Gần đây, protein tế bào CD66 được xác định là thụ thể tế bào chủ đối với Opa [145], [146]. - Lipo Oligo Saccharid (LOS) Tất cả vi khuẩn lậu đều có LOS trên bề mặt tế bào, tương tự
  • 8.
    8 lipopolysacharid (LPS) củacác vi khuẩn Gram (-) khác. LOS của vi khuẩn lậu chứa một nửa là lipid A và một nửa là polysacharid lõi gồm ketodeoxy octanoic acid (KDO), heptose, glucose, galactose và glucosamin hoặc galactosamin. Như vậy LOS của vi khuẩn lậu rõ ràng nhỏ hơn LPS điển hình của các vi khuẩn Gram (-) khác. Những đường cốt lõi của LOS tạo nên kháng nguyên của vi khuẩn, do vậy nó có vai trò quan trọng đối với phản ứng miễn dịch diệt khuẩn. Những kiểu hình khác nhau của cấu trúc kháng nguyên có vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của vi khuẩn. Quả thực, nhiều chứng cứ cho rằng, vi khuẩn lậu với LOS "ngắn" thì nhạy cảm với huyết thanh nhưng lại có thể xâm nhập tế bào chủ. Những vi khuẩn lậu với những LOS "dài" thì đề kháng huyết thanh và không xâm nhập được [62], [63]. 1.2.3. Tính chất nuôi cấy Vi khuẩn lậu khó nuôi cấy, khi ra khỏi cơ thể, chúng dễ chết. Sức đề kháng của vi khuẩn lậu rất kém, dễ bị bất hoạt khi ở điều kiện ngoại cảnh. Chúng ký sinh bắt buộc ở vật chủ duy nhất là người, vi khuẩn chết rất nhanh ở 550 C, chỉ sau 5 phút. Trong điều kiện khô và giàu oxy, vi khuẩn lậu chết sau 1-2 giờ. Với các dung dịch sát khuẩn phenol 1%, formol 0,1%, sublime 0,1%, vi khuẩn chết sau 1-5 phút tiếp xúc [4]. Nuôi cấy vi khuẩn lậu trên môi trường chọn lọc Thayer-Martin có chất tăng sinh Isovitalex và chất ức chế V-C-N. Chất tăng sinh (Isovitalex) gồm rất nhiều các axít amin, để kích thích sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, chất ức chế Vancomycin-Colistin-Nystatin (V-C-N) để ức chế các cầu khuẩn Gram(+), trực khuẩn Gram(-) và nấm nhưng không làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lậu. Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp là 35-360 C, độ ẩm > 70%, khí trường CO2 từ 3-10%, pH 7,3. Sau 24 giờ nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc 0,5-1 mm, tròn, lồi, bờ khuẩn lạc đều, nhầy và có màu hơi xám, óng ánh như giọt sương.
  • 9.
    9 Sau 48 giờnuôi cấy, vi khuẩn lậu tự dung giải nhanh chóng, thông thường khuẩn lạc to ra; khi nhuộm Gram, người ta thấy những song cầu khuẩn phình to hơn. Nếu để 48-72 giờ, khuẩn lạc có kích thước tới 3 mm. 1.2.4. Tính chất sinh vật hóa học - Test Oxidase: dương tính - Test Neisseria 4H: dương tính với glucose 1.2.5. Định týp vi khuẩn Để nghiên cứu dịch tễ học, cần phải định týp vi khuẩn. Có nhiều kỹ thuật đã được triển khai và áp dụng thành công cho mục đích này. - Týp dinh dưỡng Một hệ thống tương đối phức tạp để phân biệt các chủng vi khuẩn lậu dựa vào khả năng phát triển trên môi trường xác định đã được phát triển. Ban đầu, hệ thống này được B.W. Catlin triển khai và phân loại dựa vào khả năng vi khuẩn có thể phát triển được trong môi trường không có một số acid amin, purin hoặc pyrimidin, hay các chất dinh dưỡng đặc trưng khác [36]. Một chủng không mọc trên môi trường dinh dưỡng nếu không có prolin được gọi là Pro- và một chủng không mọc trong môi trường dinh dưỡng nếu không có arginin được gọi là Arg- . Vi khuẩn lậu phân lập từ người bệnh biểu hiện tính đa dạng rõ rệt về khả năng sinh tổng hợp, có thể phản ánh môi trường giầu dinh dưỡng của vật chủ, cung cấp cho vi khuẩn phần lớn các hợp chất cần thiết cho sự phát triển của chúng. Týp dinh dưỡng thường liên quan tới nhiều đặc tính khác nhau như xu hướng gây nhiễm trùng niệu đạo nam không triệu chứng, tăng khả năng gây nhiễm khuẩn huyết và các đặc tính khác [48]. Do sự phức tạp của một hệ thống môi trường với từng hóa chất riêng biệt và thời gian bảo quản ngắn, kỹ thuật định týp dinh dưỡng thường không được áp dụng rộng rãi trong các phòng xét nghiệm lâm sàng.
  • 10.
    10 - Týp huyếtthanh Các nhà nghiên cứu đã cố gắng phát triển một hệ thống định týp huyết thanh trong nhiều thập kỷ. Hiện tại, kỹ thuật đang được dùng phổ biến nhất cho mục đích này là dựa vào kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các epitope khác nhau trên protein P.I hoặc Por của màng ngoài (outer membrane) [85]. Por xuất hiện trong 2 nhóm huyết thanh khác nhau về hóa miễn dịch: PorA và PorB. Dùng một bộ kháng thể đơn dòng kháng PorA và một bộ khác kháng PorB. Có thể phân nhỏ mỗi nhóm huyết thanh thành một loạt các serovar khác nhau (ví dụ P.IA-6, P.IA-1); chúng khác nhau về khả năng phản ứng với những thành phần nhất định của một bộ (panel) kháng thể đơn dòng. Hàng loạt serovar đặc hiệu đã được xác định bằng kỹ thuật này [85]. - Xác định kiểu gen Việc định týp vi khuẩn có thể dựa vào xác định ADN trên cơ sở những khác biệt rõ rệt trong cấu trúc ADN giữa các chủng. Sẽ không thực tế nếu muốn lập bản đồ toàn bộ bộ gen, hoặc xác định trình tự một hay một vài gen, song có thể dùng kỹ thuật sinh học phân tử để đánh giá nhanh sự khác biệt trong trình tự ADN. Kỹ thuật đầu tiên là dùng enzyme giới hạn endonuclease, dựa vào phân tích kiểu cách các băng ADN trên gel agarose [51], [112]. Một kỹ thuật khác được gọi là PCR (polymerase chain reaction), ở đây các đoạn mồi (ADN) ngắn được dùng để gắn vào vị trí đặc hiệu để tạo thành sản phẩm ADN trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase. Có lẽ được sử dụng nhiều nhất cho mục đích dịch tễ là kỹ thuật định týp Opa: dùng đoạn mồi PCR cho Opa để tạo ADN từ mỗi gen của khoảng 11 gen Opa. Những đoạn ADN này sau đó được cắt bởi enzyme giới hạn và kết quả của kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP) được dùng để so sánh các chủng. Phối hợp với những hệ thống định týp khác, xác định kiểu gen đã góp phần giải quyết hiệu quả việc định týp vi khuẩn [113].
  • 11.
    11 1.2.6. Hệ thốngdi truyền Có hai hệ thống chủ yếu để tiến hành phân tích chất liệu di truyền của vi khuẩn lậu là biến nạp và tiếp hợp (transformation and conjugation). Người ta chưa tìm thấy phage và vai trò lớn của transposon đối với sự đề kháng ở vi khuẩn lậu. Đến nay, có những transposon gây những biến đổi trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn lậu. Vì vậy, Seifertso và cộng sự đã triển khai một hệ thống đột biến gen "con thoi" rất hữu ích cho nghiên cứu di truyền, trong đó gen chloramphenicol acetyltransferase (cat) (hoặc một gen kháng kháng sinh khác) thế chỗ β-lactamase (penicilinase) trên transposon Tn3 [122]. Các hệ thống đột biến gen "con thoi" tạo ra những đột biến ở một đoạn trên ADN của vi khuẩn lậu được nhân bản ở E. coli và dùng hệ thống này chuyển ADN đã được nhân bản có chứa đột biến quay trở lại nhiễm sắc thể vi khuẩn lậu bằng biến nạp, nhưng những thử nghiệm này đòi hỏi phải nhân bản đoạn gen quan tâm ở vật chủ E. coli trước. 1.2.7. Plasmid - Plasmid là một thành phần mang các thông tin di truyền ngoài nhiễm sắc thể (NST). Tương tự ADN, NST, plasmid là những phân tử ADN xoắn kép dạng vòng khép kín, có khả năng tự sao chép, với kích thước thay đổi từ 1,5-400 Kb, kích thước các plasmid thay đổi đáng kể nhưng luôn nhỏ hơn nhiều so với NST. Plasmid được coi như yếu tố cộng sinh của vi khuẩn. Nhìn chung, các plasmid mang những gen không thiết yếu cho sự sống của tế bào chủ, trong khi NST mang tất cả các gen này, vì thế khi mất các plasmid, các tế bào chủ vẫn có thể sống. Một số plasmid nhỏ, ẩn, kín, cuộn chặt, có thể tích hợp vào NST. - Các plasmid được chia thành 2 nhóm chính: + Các plasmid tiếp hợp (tự truyền): là những plasmid lớn (60-120 Kb), ví dụ các R-factor, F-factor. Plasmid tiếp hợp mang bộ gen tra (transfer gene) tạo ra bộ máy tiếp hợp, giúp cho việc truyền các gen của plasmid từ vi khuẩn
  • 12.
    12 này sang vikhuẩn khác (có thể cùng loài hoặc khác loài) khi chúng tiếp xúc trực tiếp với nhau. + Các plasmid không tiếp hợp (không tự truyền) là những plasmid nhỏ (1,5-15Kb), ví dụ plasmid mang một số gen sinh bacteriocin, một số quyết định đề kháng. Các plasmid không tiếp hợp không có khả năng tự truyền (do không có bộ gen tra). Tuy nhiên, chúng có thể được dẫn truyền (mobilisation) nếu trong cấu trúc có hai vùng mob và nic-bom. Gen mob (mobilisation) tạo ra một protein gọi là protein dẫn truyền; nic-bom (nic=nicking, bom=basis of mobilisation) là nơi tạo ra điểm gãy trên sợi ADN giúp nó gắn vào một plasmid tự truyền tra+ hay F-plasmid cùng nằm trong nguyên tương của tế bào vi khuẩn. Một số plasmid nhỏ khác không có gen tra (tra- ), cũng không có gen mob (mob- ) có thể hoà nhập vào một plasmid tự truyền nào đó, hình thành nên một plasmid hợp nhất tra+ , do đó các gen của plasmid tra- mob- lại có thể được truyền sang vi khuẩn khác qua tiếp hợp. - Mỗi loại plasmid được duy trì số lượng bản sao (copy number) đặc trưng so với NST của một loài vi khuẩn nhất định và luôn ổn định qua các thế hệ. Các plasmid lớn thường có từ 1-4 bản sao, trái lại các plasmid nhỏ thường có số lượng bản sao lớn hơn (10-20 bản sao). - Vi khuẩn lậu chứa một plasmid tự truyền (tiếp hợp), có trọng lượng phân tử 36 kb. Các dẫn xuất lớn hơn một chút của plasmid 36 kb đã được phân lập, có chứa transposon tetM kháng tetracyclin [102]. Nhiều plasmid mang gen kháng β-lactamase (kháng penicilin) khác nhau của vi khuẩn lậu đã được phân lập và xác định đặc điểm. Hai plasmid hay gặp nhất là loại có kích cỡ khoảng 5,3 hoặc 7,2 kb. Phần lớn vi khuẩn lậu chứa một plasmid 4,2 kb (cryptic plasmid) nhưng chưa rõ chức năng. ADN của plasmid này đã được giải trình tự hoàn toàn. Đôi khi có thể phân lập được vi khuẩn lậu không chứa plasmid 4,2 kb sao chép tự do này nhưng chúng vẫn có vẻ bình thường về các đặc tính sinh học [111].
  • 13.
    13 Plasmid có khảnăng tự nhân lên, nên trong một vi khuẩn sẽ có rất nhiều những bản sao, do đó nếu chọn primer nhằm khuếch đại một đoạn gen nào trên plasmid thì độ nhạy sẽ cao hơn khi đoạn gen đó nằm trên nhiễm sắc thể. Tuy nhiên sẽ bỏ sót những chủng vi khuẩn lậu không có plasmid. Nhưng những chủng vi khuẩn lậu không có plasmid chỉ chiếm một tỉ lệ rất nhỏ và chỉ có ở một số nơi trên thế giới. Nên trong nghiên cứu này đã chọn primer HO1 và HO3 của hãng Invitrogen, Tokyo, Nhật Bản nhằm vào gen cppB trên plasmid pJD1 mà gen cppB lại rất ổn định trên plasmid pJD1. Các tác giả khác trên thế giới khi nghiên cứu về plasmid pJD1 này đã khảng định rằng có tới trên 96% số chủng vi khuẩn lậu chứa plasmid pJD1 [70], [136]. 1.2.8. Khả năng gây bệnh của vi khuẩn lậu - ở người lớn Vi khuẩn lậu có một vật chủ duy nhất là người. Bệnh liên quan chặt chẽ với hoạt động tình dục. Vi khuẩn lậu gây viêm niệu đạo cho cả nam và nữ. Triệu chứng điển hình là đái mủ, đái khó, chảy mủ niệu đạo. Nhưng cũng có khoảng 1/5 số người không có triệu chứng điển hình [30], [54], [77]. ở phụ nữ, triệu chứng phức tạp hơn bao gồm: tiết dịch niệu đạo, âm đạo. Vị trí bị bệnh của phụ nữ thường ở niệu đạo, cổ tử cung, tuyến Skène, tuyến Bartholin, có khi tới cả tử cung, vòi trứng, buồng trứng [71], [97]. Viêm trực tràng thường gặp ở những người đồng tính luyến ái nam. Triệu trứng viêm trực tràng do vi khuẩn lậu thường không điển hình. Nhiễm vi khuẩn lậu ở họng thường gặp ở bệnh nhân đồng tính luyến ái nam và quan hệ đường miệng [31], [32]. - ở trẻ em Thường biểu hiện bệnh ở mắt do lây vi khuẩn lậu từ mẹ trong thời kỳ sinh con, phổ biến nhất là chảy mủ kết mạc sau đẻ 1-7 ngày. Nếu không được điều trị kịp thời, có thể dẫn tới mù loà. Có thể gặp viêm âm hộ, âm đạo, niệu
  • 14.
    14 đạo do vikhuẩn lậu ở các bé gái do dùng chung khăn và chậu với bố mẹ bị bệnh Lậu vì sức đề kháng của trẻ em còn thấp nên khi tiếp xúc với những vật dùng có nhiễm vi khuẩn lậu sẽ dễ bị lây. - Nhiễm trùng lan tỏa Bệnh thường gặp ở những người bị bệnh Lậu nhưng không được điều trị kịp thời, đúng phác đồ. Hầu hết nhiễm vi khuẩn lậu lan toả xảy ra ở phụ nữ. Biểu hiện của bệnh như: viêm khớp, viêm gan, viêm cơ tim, viêm nội tâm mạc, viêm màng não, nhiễm vi khuẩn lậu trên da [5]. - Xâm nhập Nghiên cứu mảnh sinh thiết từ bệnh nhân bị bệnh Lậu cho thấy, vi khuẩn lậu chui một phần vào trong bề mặt tế bào. Cũng có thể thấy vi khuẩn lậu trong các tế bào biểu mô, đôi khi bị bao quanh bởi màng tế bào. Shaw và Falkow đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy liên tục một tế bào ung thư biểu mô nội mạc tử cung của người để nghiên cứu những biến cố ảnh hưởng đến sự xâm nhập của vi khuẩn lậu trên in vitro và thấy rằng, sự xâm nhập tăng lên khi vi khuẩn lậu được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung sắt [123]. Nghiên cứu trên ống dẫn trứng của người trong nuôi cấy nội tạng đã góp phần đáng kể vào việc tìm hiểu cơ chế của sự bám dính và xâm nhập. Vi khuẩn lậu bám dính chọn lọc vào tế bào tiết nhày không có nhung mao của ống dẫn trứng và dần dần được nhấn chìm vào tế bào biểu mô theo cơ chế ẩm bào. Vi khuẩn lậu nhân lên và phân chia trong tế bào, mặc dù chúng không xâm nhập giữa các tế bào [100]. Cuối cùng, một số vi khuẩn lậu đi ra từ bề mặt đáy của tế bào nhờ một quá trình gọi là xuất bào ra khỏi tế bào (exocytosis) [101]. Khi đã ở trong tế bào biểu mô, vi khuẩn lậu không bị tấn công của kháng thể, bổ thể, bạch cầu trung tính; khả năng sống sót ở một mức độ nhất định trong tế bào biểu mô cho thấy có thể xem chúng như "những vật ký sinh nội bào tùy ý" (facultative intracellular parasites).
  • 15.
    15 - Các hệthống mô hình thực nghiệm Các nghiên cứu về sự phát sinh bệnh trở nên phức tạp bởi không có mô hình động vật phù hợp. Nhiều mô hình động vật khác nhau đã được triển khai, mỗi mô hình đều có ứng dụng nhất định, nhưng không có mô hình động vật nào tái tạo đầy đủ hình ảnh bệnh mắc phải tự nhiên ở người. Người ta đã thu được những bằng chứng đáng kể về sự thay đổi kháng nguyên và các tương tác với bạch cầu trung tính khi chủng dưới da ở chuột lang hoặc các động vật khác. Tế bào nuôi cấy cũng là một cách để nghiên cứu sự bám dính và xâm nhập. Mô hình tốt nhất cho nhiều nghiên cứu in vitro là nuôi cấy mô của người, nhất là hệ thống ống dẫn trứng đã được McGee và cộng sự sử dụng thành công [100]. 1.2.9. Chẩn đoán phòng xét nghiệm 1.2.9.1. Kỹ thuật nhuộm soi: lấy mủ hoặc dịch tiết của bệnh nhân, dàn tiêu bản, nhuộm Gram, để khô, soi kính hiển vi và nhận định kết quả. - Ưu điểm: đơn giản, cho kết quả nhanh chỉ sau 15-20 phút, không cần nhiều trang thiết bị hiện đại, đắt tiền. - Nhược điểm: dễ nhầm với các loài thuộc họ Neisseriaceae khác; độ nhạy và độ đặc hiệu thấp; ít có giá trị chẩn đoán trong những trường hợp lậu mạn tính và những biến trứng ngoài tiết niệu sinh dục; gây phiền hà cho bệnh nhân (phải cởi quần để bộc lộ bộ phận sinh dục). - ứng dụng hiện tại: là một kỹ thuật được áp dụng rộng rãi khắp cho các tuyến cơ sở, nơi không có điều kiện nuôi cấy hoặc không co điều kiện áp dụng được các kỹ thuật chẩn đoán hiện đại khác. 1.2.9.2. Kỹ thuật nuôi cấy: lấy mủ hoặc dịch tiết của bệnh nhân, cấy trên môi trường thạch Thayer-Martin với nhiệt độ 36-370 C, nồng độ CO2 3-10%, độ ẩm > 70%, để 18-24 giờ thực hiện các kỹ thuật xác định vi khuẩn lậu. - Ưu điểm: cho kết quả chính xác; là một trong những tiêu chuẩn để chẩn đoán và xác định bệnh Lậu; cho biết sự kháng kháng sinh của vi khuẩn
  • 16.
    16 lậu, từ đócó thể có biện pháp can thiệp hữu hiệu trong những trường hợp vi khuẩn lậu đa kháng thuốc. - Nhược điểm: chậm có kết quả, phải cần ít nhất 72 giờ để phân lập vi khuẩn; gây phiền hà cho bệnh nhân; cần có nhiều trang thiết bị hiện đại, nhiều sinh phẩm và hóa chất đắt tiền. - ứng dụng hiện tại: là kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đối cao, được áp dụng cho tuyến tỉnh và trung ương. 1.2.9.3. Chẩn đoán huyết thanh Các xét nghiệm huyết thanh được triển khai để phát hiện kháng thể kháng N. gonorrhoeae hoặc các thành phần của nó thông qua phản ứng kết hợp bổ thể, tủa miễn dịch, tiêu vi khuẩn, miễn dịch huỳnh quang, ngưng kết hồng cầu, ngưng kết mủ, hấp phụ miễn dịch liên quan tới enzyme và các kỹ thuật khác. Nhiều phương pháp được xác nhận là có giá trị trong các nghiên cứu đáp ứng miễn dịch và bệnh sinh của bệnh Lậu. Tuy nhiên, phần lớn các xét nghiệm chẩn đoán huyết thanh được báo cáo có độ nhạy khoảng 70% và độ đặc hiệu khoảng 80% đối với bệnh nhân lậu không biến chứng và do đó không có giá trị trong sàng lọc, xét nghiệm, hoặc chẩn đoán [72]. - Ưu điểm: thực hiện một lúc số lượng lớn các xét nghiệm; kết quả nhanh. - Nhược điểm: cần nhiều thiết bị và sinh phẩm đắt tiền, tốn kém cho bệnh nhân; độ nhạy và độ đặc hiệu không cao. - ứng dụng hiện tại: ít được ứng dụng trong thực tế, thường được áp dụng trong các phòng nghiên cứu. 1.2.9.4. Một số kỹ thuật sinh học phân tử thường dùng * PCR Năm 1985, nhà khoa học người Mỹ, Kary B. Mullis đã phát triển “phản ứng chuỗi polymerase’’ (Polymerase Chain Reaction - PCR). Kỹ thuật này cho phép nhân bất kỳ một đoạn vật liệu di truyền nào (ADN hoặc ARN) lên
  • 17.
    17 hàng tỉ lầntrong một thời gian ngắn [50], [52], [64], [79], [83], [115], [126]. Nguyên lý của phản ứng PCR hoàn toàn dựa theo sự sao chép của ADN trong tế bào, trong đó, ADN được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn. Từ một phân tử ADN chuỗi kép ban đầu, chúng được tách ra làm hai chuỗi đơn, mỗi chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp sợi ADN mới. Kỹ thuật PCR được thực hiện với một cặp mồi đặc hiệu, mồi này có khả năng bắt cặp, bổ sung vào hai đầu của hai sợi ADN khuôn theo chiều 5’ đến 3’ dưới tác dụng của enzym Taq ADN polymerase. Đoạn mồi sẽ được kéo dài về phía đầu 3’ của mồi để hình thành mạch ADN mới với các nucleotide bổ sung với các nuclotide trên sợi ADN khuôn. Qua mỗi chu kỳ nhiệt, số lượng đoạn ADN cần tổng hợp sẽ tăng gấp đôi. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ 940 -950 C, đoạn ADN duỗi xoắn và tách hoàn toàn thành hai sợi đơn. - Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ được hạ xuống 500 -650 C các nucleotide trên mỗi đoạn mồi xuôi và mồi ngược sẽ gắn theo nguyên tắc bổ sung với các nucleotide ở hai đầu (trên hai sợi) của đoạn gen cần tổng hợp. - Giai đoạn kéo dài mồi: nhờ hoạt động của enzyme Taq ADN polymerase, các dNTPs được gắn vào đầu 3’ của đoạn mồi theo trình tự và bổ sung với các nucleotide trên sợi ADN khuôn mẫu. Giai đoạn này được thực hiện ở 720 C. * Tách, tạo dòng gen Mục đích của việc tạo dòng là nhằm thu được một lượng lớn bản sao của một trình tự ADN xác định. Chính xác hơn, tạo dòng chính là chọn lọc trong một thư viện gen, dòng vi khuẩn tái tổ hợp cần tìm, tức là tập hợp ADN cùng bắt nguồn từ một tế bào vi khuẩn ban đầu có mang vector tái tổ hợp cần tìm. * Giải trình tự gen Trong thuật ngữ di truyền học, xác định trình tự ADN là quá trình xác định thứ tự nucleotide của một đoạn ADN. Hiện nay, hầu hết mọi xác định
  • 18.
    18 trình tự ADNđều sử dụng phương pháp phân tích trình tự (sequencing) được phát triển bởi Frederick Sanger. Kỹ thuật này dùng phân tách trình tự cụ thể của một phản ứng tổng hợp ADN trong ống nghiệm dùng nucleotide đã được chỉnh sửa. Ưu điểm của kỹ thuật sinh học phân tử: - Thực hiện được một số lượng lớn xét nghiệm cùng lúc. - Kết quả nhanh, chính xác. Có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao. - Không gây phiền hà cho bệnh nhân (có thể lấy nước tiểu, dịch...mà bệnh nhân không cần đến bệnh viện có thể gửi mẫu bệnh phẩm qua các dịch vụ y tế) Nhược điểm của kỹ thuật sinh học phân tử: - Kỹ thuật viên phải có trình độ khoa học kỹ thuật cao. - Chi phí cho sinh phẩm, hóa chất và máy móc cao, trong quá trình thao tác dễ nhiễm tạp, gây dương tính giả. - Giá thành xét nghiệm cao. - Không biết sự có mặt của căn nguyên gây bệnh còn sống hay đã chết. - Không giám sát được tính kháng kháng sinh của vi khuẩn. ứng dụng hiện tại: được ứng dụng tương đối rộng rãi trong các labo chẩn đoán và nghiên cứu từ tuyến tỉnh đến trung ương. 1.3. Nghiên cứu Sinh học phân tử ở vi khuẩn lậu Vi khuẩn lậu là vi khuẩn chỉ gây bệnh ở người. Trình tự gen trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn lậu FA1090 đã được giải và số lượng nucleotide là 2.153.922 (GenBank accession No NC 004969). Các chủng vi khuẩn lậu có một số plasmid quan trọng có vai trò trong cơ chế chuyển hoá, kháng kháng sinh của vi khuẩn. Cho tới nay, việc xác định vi khuẩn lậu vẫn chủ yếu dựa vào kết quả
  • 19.
    19 nhuộm soi, nuôicấy phân lập và xác định vi khuẩn đối với các bệnh phẩm trên lâm sàng. Kỹ thuật nhuộm soi cho kết quả nhanh, đơn giản, rẻ tiền và khá đặc hiệu. Tuy nhiên, nó cũng có những khó khăn với các bệnh phẩm lấy từ họng hoặc trực tràng. Ngoài ra, những trường hợp nhiễm trùng không triệu chứng thì việc phát hiện vi khuẩn qua nhuộm soi cũng gặp nhiều khó khăn. Nuôi cấy, phân lập bệnh phẩm tìm vi khuẩn lậu vẫn là tiêu chuẩn vàng trong việc chẩn đoán bệnh Lậu. Tuy nhiên, để có kết quả tốt, cần phải tối ưu các khâu lấy bệnh phẩm, sử dụng môi trường vận chuyển hợp lý và mang bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt. Ngoài ra, việc chọn môi trường nuôi cấy, phân lập phù hợp và điều kiện nuôi cấy tối ưu là đặc biệt quan trọng. Trong điều kiện đã được tối ưu, việc nuôi cấy xác định vi khuẩn lậu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao và thực hiện được với hầu hết các loại bệnh phẩm. Ngoài ra, nuôi cấy phân lập còn cung cấp chủng vi khuẩn thuần cho thử nghiệm kháng sinh đồ. Vi khuẩn lậu là một vi khuẩn dễ bị chết khi ra ngoài môi trường. Ngoài ra, điều kiện nuôi cấy cũng đòi hỏi những điều kiện ngặt nghèo về chất dinh dưỡng, khí trường… Trong trường hợp bệnh nhân bị bệnh Lậu mạn tính hoặc đã điều trị, lượng vi khuẩn trong bệnh phẩm rất ít, làm cho việc nuôi cấy, phân lập gặp rất nhiều khó khăn. Các kỹ thuật sinh học phân tử đã khắc phục được các nhược điểm này của các kỹ thuật thông thường vì các kỹ thụât sinh học phân tử được sử dụng để phát hiện trực tiếp sự có mặt của vật liệu di truyền của vi khuẩn lậu trong bệnh phẩm thông qua quá trình khuếch đại vật liệu di truyền. Các kỹ thuật này rất nhạy nên chỉ cần có một số lượng rất ít vi khuẩn, về lý thuyết chỉ cần có 1 CFU là phản ứng có thể cho kết quả dương tính. Kết quả dương tính này cho phép kết luận sự có mặt của vi khuẩn lậu trong bệnh phẩm. Các kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong chẩn đoán vi khuẩn lậu đã
  • 20.
    20 được phát triểntừ những năm 1990, các kỹ thuật này đã được sử dụng thường qui. Chúng bao gồm kỹ thuật lai, khuếch đại acid nucleic, giải trình tự gen [37], [39], [66], [86], [121], [137], [135], [149]. 1.3.1. Kỹ thuật lai Các mẫu dò đặc hiệu được lai trực tiếp với đoạn acid nucleic của vi khuẩn lậu có mặt trong bệnh phẩm. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy, kỹ thụât này có độ nhạy và độ đặc hiệu đôi khi thấp hơn so với kỹ thuật nuôi cấy, phân lập thông thường [149]. Kỹ thuật lai ADN sử dụng các mẫu dò ADN là một phương tiện có hiệu quả để xác định vi khuẩn lậu trong các bệnh phẩm từ đường sinh dục, tiết niệu. Các mẫu dò sử dụng trình tự các nucleotid của các gen qui định cho đặc điểm cấu trúc, chuyển hoá của vi khuẩn cũng đã được nghiên cứu và áp dụng như gen cho enzyme phân huỷ protein IgAl, ARN của ribosom hay plasmid ... Kỹ thuật lai có độ đặc hiệu cao nhưng có độ nhạy thấp. 1.3.2. Kỹ thuật khuếch đại ADN Kỹ thuật khuếch đại acid nucleic có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao. Nhìn chung, kỹ thuật này có khá nhiều ưu điểm. Trước hết, độ nhạy được cải thiện rất nhiều so với kỹ thuật nuôi cấy, phân lập thông thường. Khi so sánh với kỹ thuật khuếch đại acid nucleic, kỹ thuật nuôi cấy, phân lập có độ nhạy từ 85% đến 90% đối với trường hợp bị lậu cấp và chỉ có 50% đối với trường hợp lậu mạn tính. Các kỹ thuật khuếch đại cũng có những hạn chế của nó. Đó là giá thành đầu tư cho trang thiết bị, sinh phẩm, khả năng bị nhiễm trong quá trình thao tác, sản phẩm không đặc hiệu, hay không thể cho biết thông tin về tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn. Ngoài ra, trong một số trường hợp đặc biệt, những trình tự nucleotide là đích của quá trình khuếch đại có thể không có mặt trong một số chủng vi khuẩn hoặc là chúng xuất hiện ở cả những chủng Neisseria thường có mặt trong đường sinh dục, tiết niệu. Điều
  • 21.
    21 này dẫn đếnkhả năng bị âm tính hoặc dương tính giả tuỳ từng trường hợp. 1.3.3. Kỹ thuật giải trình tự phát hiện các gen kháng thuốc Vi khuẩn lậu là một trong các căn nguyên quan trọng nhất gây nhiễm trùng LTQĐTD. Tỷ lệ mắc bệnh không thể ước tính được, bởi vì rất ít báo cáo của các nước nêu lên được tỷ lệ bị bệnh thực sự ở nước mình. Tỷ lệ hiện mắc giảm chậm ở các nước phát triển. Sự gia tăng tính kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu đã làm cho vấn đề điều trị bệnh Lậu gặp rất nhiều khó khăn. Có rất nhiều cơ chế gây nên sự kháng kháng sinh như sự đề kháng penicillin qua trung gian plasmid (TEM-1 β-lactamase) và qua trung gian nhiễm sắc thể. Trong khi tỷ lệ kháng penicillin của vi khuẩn lậu có β-lactamase (penicillinase-producing N. gonorrhoeae-PPNG) giảm xuống một cách có ý nghĩa trong những năm 1991 đến 1998 thì tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng lại penicillin qua trung gian nhiễm sắc thể (chromosomally mediated resistant N. gonorrhoeae-CMRNG) lại gia tăng [118]. Cơ chế kháng kháng sinh qua trung gian nhiễm sắc thể là do đột biến gen ponA, gen mã hoá mối liên kết penicillin - Binding protein 1 - PBP1 (patricia). Sự kháng lại ciprofloxacin của vi khuẩn lậu là do đột biến gen gyrA và parC [131]. Để phát hiện các gen đột biến, người ta sử dụng PCR để nhân lên các đoạn gen đích này và xác định trình tự đoạn gen (sequencing) để tìm ra điểm đột biến. 1.3.4. Một số kỹ thuật sinh học phân tử khác - Phân tích plasmid. - Giải trình tự theo phương pháp của Sanger đối với các mảnh đa hình của gen porB. - Kỹ thuật phân tích trình tự đa kháng nguyên của vi khuẩn lậu phân tích các mảnh của gen porB và gen qui định cho protein B gắn chuyển sắt. - Phân tích tính đa hình của đoạn nucleotide được khuếch đại. - Định týp đoạn ADN đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên.
  • 22.
    22 - Phân tíchtoàn bộ gen của vi khuẩn lậu sau khi cắt liên tục bằng các enzyme hạn chế và điện di trên gel polyacrylamide [57]. 1.3.5. Một số gen liên quan đến đề kháng của vi khuẩn - Tất cả Neisseria gây bệnh đều có một protein Rmp mang tính kháng nguyên (gọi là protein III hoặc P.III) với trọng lượng phân tử thay đổi từ 30- 36 kDa trên SDS-PAGE ở trạng thái khử. Protein này rất được quan tâm đối với sinh bệnh học vì rất nhiều kháng thể có hoạt tính diệt khuẩn trong huyết thanh chống lại kháng nguyên này. Cấu trúc gen Rmp đã được tạo dòng gen và giải trình tự. Cấu trúc ban đầu của protein porin (Por) đã được xác định bằng giải trình tự ADN. Cấu trúc này giống với các Por ở các vi khuẩn Gram-âm khác. So sánh trình tự của protein PorA và PorB phát hiện có một số vùng, ở cả 2 loại protein và một số vùng có sự khác biệt thay đổi lớn [61]. Những thay đổi khác biệt này có thể là biểu hiện cho tính đa dạng của kháng nguyên. Gen porA và porB là hai allen của một vị trí (locus). Như vậy, Por thực hiện nhiều chức năng đối với vi khuẩn lậu, trong đó có việc tạo ra một đặc hiệu anion qua màng ngoài giầu lipid. Por tồn tại trong 2 lớp hóa học và miễn dịch quan trọng riêng được gọi là PorA và PorB. Một chủng nhất định chỉ có PorA hoặc PorB và không bao giờ có cả hai. Chúng biểu hiện nhiều kháng nguyên của 2 lớp Por quan trọng này [85]. - Về sự đột biến trên nhiễm sắc thể. Đích của các thuốc õ-lactam là protein gắn penicillin (PBPs)-enzym nằm trên màng tế bào tham gia vào sinh tổng hợp vách tế bào. Những thay đổi trong PBP-2 và PBP-1 làm giảm ái lực của chúng với penicillin và do đó làm giảm độ nhạy cảm của vi khuẩn [47]. PBP-2 được mã hóa bởi vị trí penA. Những thay đổi ở các vị trí (locus) khác như mtr và penB sẽ gây ra các
  • 23.
    23 tác dụng phụ.Vị trí mtr quyết định sự đề kháng nhiều kháng sinh và chất sát khuẩn qua hệ thống bơm chủ động [65]. Đột biến ở vị trí penB, tác động tới porin, dẫn tới giảm tính thấm của màng ngoài tế bào với kháng sinh ưa nước và các hợp chất khác. Vi khuẩn lậu cũng có "gen giả" porA nhưng không được biểu hiện [53]. Tác động phối hợp của các đột biến penA và tăng biểu hiện mtr là làm tăng MIC của penicillin lên 120 lần [78]. - Đề kháng qua trung gian nhiễm sắc thể liên quan tới những biến đổi mtr và penB cũng làm giảm độ nhạy với penicillin [78]. - Các tác giả trên thế giới: Xiahong Su và Inga Lind; Tiffany R. Shultz; U. Chaudhry; Masatoshi Tanaka...nghiên cứu về đề kháng quinolon của vi khuẩn lậu lại có chung một nhận xét là những chủng vi khuẩn lậu đề kháng với quinolon thì đều có những đột biến trên gen gyrA, gen parC và số lượng đột biến cũng tăng theo nồng độ MIC [38], [125], [128], [131]. Vậy, những gen quyết định sự đề kháng của vi khuẩn như: gen gyrA, parC, gyrB, parE, penA, penB, mtr...những gen này trên nhiễm sắc thể và plasmid dẫn tới sự đề kháng rõ rệt trên lâm sàng. Do hạn chế về thời gian, kinh tế và đã theo dõi những nghiên cứu đi trước của các tác giả trên thế giới nên tôi chỉ chọn gen gyrA và parC để nghiên cứu về sự đề kháng của vi khuẩn lậu với kháng sinh ciprofloxacin và những gen khác ít được đề cập, mặt khác tôi cũng muốn giành cho nghiên cứu lần sau. Gen gyrA có độ dài 2.751 nucleotid mã hoá 916 axít amin, vùng quyết định đề kháng quinolon dài khoảng 279 nucleotid mã hoá 93 axít amin. Gen parC có độ dài 2.307 nucleotid mã hoá 768 axít amin, vùng quyết định đề kháng quinolon dài khoảng 255 nucleotid mã hoá 85 axít amin. 1.4. kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu 1.4.1. Trên thế giới
  • 24.
    24 Việc sử dụngpenicillin trong điều trị bệnh Lậu lần đầu tiên được khuyến cáo vào thập niên 40. Bệnh nhân bị bệnh Lậu được điều trị bằng penicillin cho kết quả tốt. Năm 1950, bắt đầu xuất hiện những chủng vi khuẩn lậu kháng lại penicillin. Mức độ kháng lại penicillin ngày càng gia tăng với tốc độ khác nhau tùy từng vùng và từng khu vực trên thế giới. Cho đến năm 1976, lần đầu tiên người ta đã phát hiện ra các chủng vi khuẩn lậu kháng penicillin có β-lactamase ở Anh, Mỹ, Tây Phi, châu á (Philippines) và vùng Cận Đông [40], [134]. Theo WHO (2001), tỷ lệ kháng nhóm quinolon của vi khuẩn lậu: Trung Quốc là 54,2% (1997, 1998) tăng lên 85,2% (2000); ở Nhật Bản tỷ lệ này là 40%, Hàn Quốc 16%, Brunei 12%, Singapore 19%, Philippines 37,9% [156]. Nghiên cứu của Olsen (2005), cho biết ở Thụy Điển: khi phân lập 180 chủng, 100% nhạy cảm với cefixim, ceftriaxon và spectinomycin; kháng azithromycin 2%, ciprofloxacin 50% và ampicillin 75% [109]. Tapsall J. W (1997 - 2006) cho biết tại úc: khi nghiên cứu 36.000 chủng vi khuẩn lậu, nhận thấy có sự gia tăng đề kháng với ciprofloxacin, penicillin và tetracyclin. Khoảng một nửa số chủng phân lập ở những thành phố lớn có sự đề kháng với penicillin và ciprofloxacin, tỷ lệ đề kháng ở mức cao mặc dù penicillin ít được dùng còn ciprofloxacin thì gần như là không được sử dụng [138]. Thông báo của WHO (2008), cho biết tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại kháng sinh thuộc nhóm quinolon năm 2006 ở khu vực châu á Thái Bình Dương: Trung Quốc là 99,6%; Hồng Kông 97,8%; Hàn Quốc 89,4%; Nhật Bản 83,4%; Việt Nam 82,1%; Brunei 81,7%; Singapore 70%; Philippines 69%; Malaysia 62%; Australia 38,7%; New Zealand 13,7% và tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng tetracyclin ở mức độ cao: Singapore 76,8%; Hong Kong 48,9%;
  • 25.
    25 Trung Quốc 35,2%;Philippines 31%; New Zealand 25%; Việt Nam 16,2%; Australia 12% [137]. Garcia S. (2008) ở Argentina từ 2005-2007, nghiên cứu 595 người có quan hệ đồng tính nam và 571 người có quan hệ với nữ giới, nhận thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu trong 2 nhóm này là 0,91%, trong nhóm quan hệ đồng tính có 20% vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin và 3,8% ở nhóm quan hệ khác giới [59]. Matsumoto (2008), cho biết: tại Nhật Bản, vi khuẩn lậu kháng hầu hết các kháng sinh như penicillin, tetracyclin, các kháng sinh thuộc nhóm quinolon và cephalosporin ngoại trừ ceftriaxon và cefodizim [99]. Zhang T. (2009) nghiên cứu 80 chủng vi khuẩn lậu ở Thượng Hải, Trung Quốc nhận thấy: 95% kháng ciprofloxacin, 95% kháng ofloxacin và 97,5% kháng lomefloxacin. Chỉ có một chủng là nhạy cảm với ciprofloxacin [165]. Khi nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu trên thế giới tôi nhận thấy tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu tăng cao, đặc biệt với ciprofloxacin không những tăng cao mà còn tăng dần theo thời gian, như thông báo của WHO năm 1997-1998 tỷ lệ này ở Trung Quốc là 54,2% nhưng đến năm 2006 thì tỷ lệ này là 99,6% và ở Nhật Bản là 40% tăng lên 83,4%. 1.4.2. Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu ở Việt Nam Trong tình hình kinh tế thị trường thời mở cửa, xã hội Việt Nam cũng có những biến đổi tiêu cực nhất định, trong đó nổi lên các vấn đề tệ nạn xã hội mà nạn mại dâm là một vấn đề đáng báo động. Một trong những hậu quả của hành nghề mại dâm là các bệnh LTQĐTD, đặc biệt là bệnh lậu, phát sinh và phát triển. Do việc sử dụng kháng sinh không được kiểm soát mà vi khuẩn lậu ngày nay đã kháng lại các kháng sinh thông thường; vì vậy các thầy thuốc lâm sàng phải thay thế bằng những kháng sinh thế hệ mới mà sự đề kháng những
  • 26.
    26 kháng sinh nàycủa vi khuẩn lậu hiện nay chưa xuất hiện hoặc tỷ lệ đề kháng còn thấp. ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về mức độ nhạy cảm của vi khuẩn lậu đối với kháng sinh như: - Theo Lê Tử Vân và cộng sự (1978-1981): tỷ lệ vi khuẩn lậu nhạy cảm với penicillin là 59,04%; tetracyclin 60,08%; erythromycin 63,05% [20]. - Theo Đào Việt Hải và cộng sự nghiên cứu tại Đắc Lắc (1991): tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại penicillin là 88%; cephalothin 18,25%; tetracyclin 88,35%; cloramphenicol 39,47% và erythromycin 38,64% [8]. - Theo Nguyễn Văn Thục tại thành phố Hồ Chí Minh (1994): tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại penicillin là 94,67%; tetracyclin 5,33%; gentamicin 15,38%; chloramphenicol 1,33%; nalidixic acid 1,33% [18]. - Theo Lê Thị Phương (1996-2000), tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng penicillin là 65,46%; nalidixic acid 41,75%; tetracyclin 40,50%; ciprofloxacin 35,60%; erythomycin 2,06%. Năm 2001 tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng nalidixic acid là 56,68%; penicillin 47,47%; tetracyclin 44,52%; ciprofloxacin 42,67%; Spectinomycin 0,64% [14]. - Theo Lê Văn Hưng (từ 4.1997 đến 3.1998), tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại penicillin là 80,43%; tetracyclin 31,52%; nalidixic acid 12,3%; ciprofloxacin 5,43%. - Năm 2003, các tỷ lệ này là ciprofloxacin 60,87%; penicillin 27,39%; tetracyclin 23%; erythomycin 13,48%; spectinomycin 3,93%. - Năm 2005, các tỷ lệ này là ciprofloxacin 59,62%; tetracyclin 9,88%, penicillin 35,18%. - Năm 2006, tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng penicillin là 31,1%, ciprofloxacin 56,6%; tetracyclin 16,5%; erythromycin 3,8%; giảm nhạy cảm với azithromycin 1,9% và cefotaxim 0,9%. Qua nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu tại Việt
  • 27.
    27 Nam, tôi cónhững nhận định như sau: cũng giống như tình hình kháng kháng sinh trên thế giới, tỷ lệ vi khuẩn lậu không những ngày càng kháng lại nhiều loại kháng sinh mà còn gia tăng mức độ đề kháng, đặc biệt với ciprofloxacin, như thông báo của Lê Thị Phương năm 1996-2000 tỷ lệ này là 35,6% nhưng đến năm 2006 theo thông báo của Lê Văn Hưng thì tỷ lệ này là 56,6% và giảm nhạy cảm 25,5% nâng mức tổng kháng 82,1%. 1.4.3. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu Kháng kháng sinh có thể là do thay đổi đích tác dụng của kháng sinh, loại bỏ kháng sinh ra khỏi tế bào hoặc phá hủy phân tử kháng sinh đó. Việc xuất hiện và lan truyền sự đề kháng kháng sinh trong vi khuẩn lậu chủ yếu là do nhận được ADN mới thông qua hình thức tiếp hợp hoặc biến nạp. Các quyết định đề kháng này có thể nằm trên nhiễm sắc thể hoặc trên plasmid- ngoài nhiễm sắc thể. Nếu vi khuẩn lậu có cả gen đề kháng trên nhiễm sắc thể và plasmid thì có thể kháng nhiều loại kháng sinh. Biến đổi trên nhiễm sắc thể tác động tới khả năng thẩm thấu, đồng thời làm giảm độ nhạy cảm với penicilin, tetracyclin và macrolide. Plasmid thường có quyết định đề kháng cho cả penicilin và tetracyclin mức độ cao. Vi khuẩn lậu, cũng như những vi khuẩn khác, ban đầu nhạy cảm cao với kháng sinh [116], nhưng dần dần thích nghi trong môi trường bất lợi mà ở đó có kháng sinh. Các cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu có thể chia thành hai nhóm: nhóm làm giảm sự tiếp cận của kháng sinh tới vị trí đích và nhóm tự làm thay đổi vị trí đích. Sự tiếp cận của kháng sinh tới vị trí đích có thể bị hạn chế bởi: giảm tính thấm của màng tế bào do những thay đổi trong protein porin; hoạt tính đẩy kháng sinh khỏi tế bào như hệ thống bơm đẩy và phân hủy kháng sinh trước khi nó có thể tác động tới vị trí đích. Những thay đổi ở các vị trí (locus) như mtr và penB sẽ gây ra các tác dụng phụ. Vị trí mtr quyết
  • 28.
    28 định sự đềkháng nhiều kháng sinh và chất sát khuẩn nhờ hệ thống bơm chủ động [65]. Sự thay đổi vị trí đích của kháng sinh sẽ làm giảm ái lực của nó với kháng sinh và triệt tiêu đích tác động làm mất tác dụng của kháng sinh. Về mặt di truyền, những biến đổi này có thể được quyết định bởi các yếu tố di truyền nằm trên nhiễm sắc thể hoặc ngoài nhiễm sắc thể (plasmid). Nhiều yếu tố quyết định kháng kháng sinh có thể cùng tồn tại trong một vi khuẩn khiến mức độ kháng kháng sinh có thể tăng lên rất nhiều và một chủng đơn thuần có thể kháng với nhiều kháng sinh khác nhau. Kháng kháng sinh qua trung gian plasmid, được lan truyền qua hình thức tiếp hợp. Quá trình này đòi hỏi sự có mặt của plasmid tiếp hợp toa+ để vận chuyển plasmid mang yếu tố quyết định kháng kháng sinh. Plasmid tiếp hợp được là plasmid có bộ gen toa (toa+ ). Bộ gen toa giúp cho tế bào có nó tiếp xúc được với tế bào khác và truyền (transfer) chất liệu di truyền trên plasmid sang tế bào nhận. Vì không phải tất cả các chủng đều có plasmid tiếp hợp nên tỷ lệ lan truyền gen kháng kháng sinh có thể hạn chế ở một mức độ nhất định. Tuy nhiên, các tiếp hợp cũng có thể biến đổi trong quá trình sống, vì vậy một số chủng nhận sau này có thể trở thành chủng cho [78]. 1.4.4. Ciprofloxacin và kháng ciprofloxacin Kháng sinh ciprofloxacin thuộc nhóm quinolon thế hệ thứ hai, là một kháng sinh bán tổng hợp, có phổ kháng khuẩn rộng, được chỉ định để điều trị các bệnh: nhiễm trùng máu, nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, nhiễm khuẩn đường hô hấp, nhiễm khuẩn xương khớp và nhiễm khuẩn đường sinh dục tiết niệu... Điều trị tất cả các vi khuẩn Gram (-) và Gram (+). Vì thế, đây là một kháng sinh được cả bệnh nhân và thầy thuốc ưa chuộng, đặc biệt được đưa vào điều trị bệnh Lậu ngay từ khi thuốc được đưa ra thị trường vào những năm 1980 với liều uống duy nhất 500 mg đã có thể điều trị được bệnh Lậu cấp. Chính vì vậy, sự lựa chọn kháng sinh đường uống trong những giai đoạn 1980 đến
  • 29.
    1990 là mộtlựa chọn đ cũng như những nước đ thường là dấu bệnh ít k tự sử dụng kháng sinh khuẩn lậu kháng kháng nói riêng. Andrew Si ciprofloxacin rất hiếm vùng sâu vùng xa thì kh đề cảnh báo ". 1.4.4.1. Công thức hóa Công thức hóa họ http://en.wikipedia.org/ Hình 1. 1.4.4.2. Dược lý và cơ c Hoạt động bình thường 29 ọn đúng đắn và duy nhất. Nhưng, bệnh nh ớc đang phát triển khi bị các bệnh nhiễm tr khi đi khám để chẩn đoán đúng bệnh ngay nh nên đã làm lan truyền và gia tăng nh ng sinh nói chung và kháng với kháng sinh Simor đã viết: "Cách đây trên 15 năm, vi ếm gặp, giờ đây, ngoài những cộng đồng d kháng với ciprofloxacin tại bệnh viện đang óa học học: g/wiki/Chemical_formulaC17H18FN3O3 1.1. Công thức phân tử của ciprofloxacin ơ chế tác dụng ờng của vi khuẩn: Enzyme DNA gyrase Gỡ xoắn ADN ADN nhân lên nhân ở nước ta trùng LTQĐTD ay từ đầu mà lại những chủng vi nh ciprofloxacin vi khuẩn kháng dân cư sống ở đ ng trở thành vấn
  • 30.
    30 Tế bào vikhuẩn nhân lên Cơ chế tác động khi có quinolon: - Quinolon phong bế DNA-gyrase làm cho nó không hoạt động bình thường được, dẫn tới vi khuẩn không nhân lên được (vi khuẩn nhạy với kháng sinh này). Gen gyrase kiểm soát cấu trúc không gian của protein Gyrase. Cấu tạo Gyrase gồm hai tiểu phần GyrA và GyrB do gen gyrA và gyrB quy định. Tương tự topoisomerase IV cũng tham gia vào mở xoắn ADN. Cấu tạo topoisomerase IV gồm hai tiểu phần ParC và ParE do gen parC và parE quy định. - Khi enzyme DNA-gyrase bị thay đổi (do đột biến gen), nó không tương tác với quinolon nữa. Vì vậy, vi khuẩn vẫn nhân lên bình thường khi có mặt của quinolon (vi khuẩn kháng quinolon). Ciprofloxacin là kháng sinh bán tổng hợp, có phổ kháng khuẩn rộng, thuộc nhóm quinolon, còn được gọi là các chất ức chế DNA-gyrase. Do ức chế enzym DNA-gyrase, nên thuốc ngăn sự sao chép của chromosom khiến cho vi khuẩn không sinh sản được. Ciprofloxacin có tác dụng tốt với các vi khuẩn kháng lại kháng sinh thuộc các nhóm khác (aminoglycosid, cephalosporin, tetracyclin, penicilin...) và được coi là một trong những kháng sinh có tác dụng mạnh nhất trong nhóm fluoroquinolon. Ciprofloxacin hấp thu nhanh và dễ dàng ở ống tiêu hóa. Khi có thức ăn và các thuốc chống toan, hấp thu thuốc bị chậm lại nhưng không bị ảnh hưởng một cách đáng kể. Thuốc được phân bố rộng khắp và có nồng độ cao ở những nơi bị nhiễm khuẩn (các dịch cơ thể, các mô), nói chung thuốc dễ ngấm vào mô. Nồng độ trong mô thường cao hơn nồng độ trong huyết thanh, đặc biệt là ở các nhu mô, cơ, mật và tuyến tiền liệt. Nồng độ trong dịch bạch huyết và dịch ngoại bào cũng gần bằng nồng độ trong huyết thanh. Khoảng 40 - 50% liều uống đào thải dưới dạng không đổi qua nước
  • 31.
    31 tiểu nhờ lọcở cầu thận và bài tiết ở ống thận. Khoảng 75% liều tiêm tĩnh mạch đào thải dưới dạng không đổi qua nước tiểu và 15% theo phân. Hai giờ đầu tiên sau khi uống liều 250 mg, nồng độ ciprofloxacin trong nước tiểu có thể đạt tới trên 200 mg/lít và sau 8 - 12 giờ là 30 mg/lít. Các đường đào thải khác là chuyển hóa ở gan, bài xuất qua mật, và thải qua niêm mạc vào trong lòng ruột (đây là cơ chế đào thải bù trừ ở người bệnh bị suy thận nặng). Thuốc được đào thải hết trong vòng 24 giờ [19]. 1.4.4.3. Liều lượng và cách dùng Muốn thuốc hấp thu nhanh, nên uống thuốc 2 giờ sau bữa ăn. Người bệnh cần được dặn uống nhiều nước và không uống thuốc chống toan dạ dày trong vòng 2 giờ sau khi uống thuốc. Chỉ định dùng Liều lượng cho 24 giờ Nhiễm khuẩn đường tiết niệu dưới 100 mg x 2 Nhiễm khuẩn đường tiết niệu trên 250 -500 mg x 2 Lậu không có biến chứng 500 mg, liều duy nhất Viêm tuyến tiền liệt mạn tính 500 mg x 2 Nhiễm khuẩn ở da, mô mềm, xương 500 - 700 mg x2 Viêm ruột nhiễm khuẩn nặng: Liều điều trị Liều dự phòng 500 mg x 2 500 mg x 1 Phòng các bệnh do não mô cầu: Người lớn và trẻ em trên 20 kg Trẻ em dưới 20 kg 500 mg, liều duy nhất 250 mg, liều duy nhất hoặc 20mg/kg Phòng nhiễm khuẩn Gram (-) ở người bệnh bị suy giảm miễn dịch 250 - 500 mg x 2
  • 32.
    32 Nhiễm khuẩn bệnhviện năng, nhiễm khuẩn huyết, điều trị nhiễm khuẩn ở người bị bệnh suy giảm miễn dịch 500 - 750 mg x 2 1.4.4.4. Phổ kháng khuẩn Ciprofloxacin có phổ kháng khuẩn rất rộng, bao gồm phần lớn các mầm bệnh quan trọng. Phần lớn các vi khuẩn Gram (+), kể cả Pseudomonas và Enterobacter đều nhạy cảm với thuốc. Các vi khuẩn gây bệnh đường ruột như Salmonella, Shigella, Yersina và Vibrio cholerae thường nhạy cảm cao. Tuy nhiên, với việc sử dụng ngày càng nhiều và lạm dụng thuốc, đã có báo cáo về tăng tỷ lệ kháng kháng sinh của Salmonella. Các vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp như Haemophilus và Legionella thường nhạy cảm, Mycoplasma và Chlamydia chỉ nhạy cảm vừa phải với kháng sinh. Neisseria thường rất nhạy cảm với kháng sinh. Do cơ chế tác dụng đặc biệt của thuốc nên ciprofloxacin không có tác dụng chéo với các kháng sinh khác như aminoglycosid, cephalosporin, tetracyclin, penicilin... Nói tóm lại ciprofloxacin thuộc thế hệ thứ 2 của nhóm quinolon là một kháng sinh bán tổng hợp, có phổ kháng khuẩn rộng, được chỉ định điều trị rộng rãi trong các bệnh nhiễm trùng, có ít tác dụng phụ hơn thế hệ 1 và 3, 4. Thuốc được cả bệnh nhân và thầy thuốc ưa chuộng, nhưng bệnh nhân ở nước ta lại lạm dụng kháng sinh này dẫn tới kháng kháng sinh là điều đã được khẳng định. Song điều gây ngạc nhiên cho các nhà khoa học là tại sao chúng lại hình thành kháng thuốc ciprofloxacin trong khi quần thể này chưa bao giờ phơi nhiễm với kháng sinh đó, đây là lời nhận xét của đồng tác giả Michael Silverman, một chuyên gia bệnh truyền nhiễm ở mạng lưới y tế Lakeridge Health Network tại Ontario. Quả thật, E.coli kháng với kháng sinh ciprofloxacin đã lan rộng khắp trên thế giới từ vùng sâu vùng xa và cả ở các
  • 33.
    33 khoa hồi sứctích cực của Mỹ. Cũng giống như E.coli, vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin ngay cả trên bệnh nhân bị lậu mà bệnh nhân đó chưa dùng ciprofloxacin bao giờ. Chính vì lẽ đó mà tôi chọn ciprofloxacin là để đại diện cho quinolon với hy vọng góp phần tìm hiểu vấn đề này. 1.4.5. Các nghiên cứu về đột biến gen liên quan đến kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu trên thế giới Theo nghiên cứu của David L. Trees và cộng sự (1998), 65 chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin tại Trung tâm phòng chống bệnh Atlanta, Mỹ có 5 chủng đột biến ở gen parC: 3 chủng chứa 2 đột biến Ser-87 thành Ile và Glu-91 thành Gly, 1 chủng chứa 2 đột biến Gly-85 thành Cys và Arg-116 thành Leu) và 1 chủng chứa 1 đột biến Arg-116 thành Leu [140]. Masatoshi Tanaka và cộng sự nghiên cứu 502 mẫu phân lập tại Nhật Bản về sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu từ năm 1993-1998. Họ đã chọn những chủng kháng ciprofloxacin và phân tích những đột biến ở vùng QRDR (Quinolone-Resistant Determining Region) trên gen gyrA và parC. So sánh với chủng nhạy cảm các tác giả nhận thấy rằng, những chủng kháng ciprofloxacin chứa 3 hoặc 4 axit amin bị thay thế trong vùng QRDR ở protein gyrA và parC [131]. Theo nghiên cứu của Xiahong Su và Inga Lind (2001) trên 40 chủng vi khuẩn lậu tại Đan Mạch, có 35 chủng kháng ciprofloxacin. Giải trình tự vùng QRDR của gen gyrA và parC, 32 chủng (91%) có sự thay đổi tại Ser-91 và Asp-95 ở gen gyrA và sự thay đổi đơn hoặc đôi ở gen parC. Sự thay đổi Ser- 91 thành Phe và Asp-95 thành Gly trong gen gyrA được tìm thấy trong 28 chủng (80%). Có 19 chủng (54%) có sự thay đổi Asp-86 thành Asn trong gen parC [128]. Tiffany R. Shultz và cộng sự (2001) khi nghiên cứu 174 chủng vi
  • 34.
    34 khuẩn lậu phânlập được tại Sedney, úc, thấy rằng 84 chủng ít nhạy cảm và đề kháng với nhóm quinolon, đại diện là ciprofloxacin, có MIC từ 0,12-16 µg/ml. 18 chủng kháng quinolon được giải trình tự và có những thay đổi trên gen gyrA: Ser-91 thành Phe, Ser-91 thành Tyr, Asp-95 thành Gly và Asp-95 thành Asn. Sự biến đổi của gen parC được thấy trong những mẫu mà có sự biến đổi của gen gyrA và bao gồm cả sự thay đổi các axit amin Asp-86 thành Asn, Ser-87 thành Asn, Ser-87 thành Arg, Ser-88 thành Pro, Glu-91 thành Lys, Glu-91 thành Gln [125]. U. Chaudhry và cộng sự (2002) nghiên cứu 63 mẫu vi khuẩn lậu phân lập trên bệnh nhân ở Delhi, ấn Độ có 5 mẫu (6%) nhạy cảm với ciprofloxacin (MIC < 0,06 µg/ml). Phân tích trình tự ADN của gen gyrA và parC cho thấy: tất cả các mẫu kháng ciprofloxacin (58 chủng) đều có sự đột biến ở đoạn gen gyrA và parC. GyrA (Ser91 thành Phe, Asp-95 thành Asn, Val-120 thành Leu) [38]. Cũng về vấn đề này, Xie P. và cộng sự (2003) cho biết: 20 chủng đề kháng và 20 chủng nhạy cảm với kháng sinh nhóm quinolon tại tỉnh Wusu, Trung Quốc đều có những đột biến điểm ở Asp-95 của gen gyrA và Asp-86, Ser-87, Ser-88, Glu-91 của gen parC [159]. Liên quan đến giá trị MIC và số lượng các đột biến, Xu J. S. và cộng sự (2006) nghiên cứu 18 chủng kháng ciprofloxacin ở tỉnh Jiangsu, Trung Quốc và phát hiện những đột biến tại gen gyrA và parC kết luận rằng những chủng có MIC cao thì có nhiều điểm đột biến [160]. Trong nghiên cứu của Karunakaran R và cộng sự (2007), khi phân tích 18 chủng vi khuẩn lậu đề kháng và 4 chủng nhạy cảm với ciprofloxacin tại một Bệnh viện thực hành ở Kuala Lumpur, Malaysia, các tác giả nhận thấy 19 trong tổng số 22 chủng bao gồm cả các chủng nhạy cảm đều có đột biến câm (còn gọi là đột biến trung tính, thường xảy ra ở vị trí thứ 3, làm codon bị biến đổi nhưng vẫn mã hóa cùng 1 axit amin, vì vậy mạch peptit không đổi), cụ thể
  • 35.
    35 ở gen parCtại codon 131 (CTC thành CTG) cùng mã hoá Leu. Chỉ có 1 chủng nhạy cảm là không có đột biến câm, có 1 sự thay thế đơn ở gen gyrA. Một đột biến câm khác ở gen parC tại codon 141 (TAT thành TAC) cùng mã hoá Tyr được thấy ở 1 chủng. Các chủng đề kháng có ít nhất 2 đột biến tại gen gyrA và ít nhất 1 đột biến tại gen parC ngoại trừ 1 chủng không có đột biến ở gen parC và tác giả này đã nhận xét: những đột biến tại gen gyrA là cần thiết cho sự đề kháng quinolon, trong khi những đột biến tại gen parC chỉ có tính chất bổ sung. Vì thế, không có những chủng đề kháng nào chỉ mang riêng đột biến tại gen parC [81]. Zhang T. (2009) khi nghiên cứu 80 chủng vi khuẩn lậu ở Thượng Hải, Trung Quốc nhận thấy: 95% kháng ciprofloxacin, 95% kháng ofloxacin và 97,5% kháng lomefloxacin. Chỉ có 1 chủng là nhạy cảm với ciprofloxacin. Tất cả các chủng đề kháng hoặc giảm nhạy cảm đều có đột biến đôi ở gyrA (Ser-91, Ala-92, Asp-95). MIC của các chủng liên quan mật thiết đến những đột biến ở gyrA và parC. Điều này chỉ ra rằng những đột biến ở vùng QRDR của gyrA và parC đều là nguyên nhân gây ra sự đề kháng nhóm quinolon [165]. Qua nhiều nghiên cứu trên thế giới, các tác giả đều có chung nhận xét rằng, đột biến gen gyrA và parC có liên quan đến sự đề kháng của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin. Chương II Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
  • 36.
    36 2.1. Đối tượngnghiên cứu 2.1.1. Bệnh nhân Từ tháng 1/2005 - 12/2007 tôi thực hiện đồng thời hai kỹ thuật nhuộm soi và nuôi cấy tại Khoa xét nghiệm Viện Da liễu Quốc Gia cho 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo, cổ tử cung, được các bác sĩ lâm sàng chẩn đoán nghi nhiễm vi khuẩn lậu, đây là những kỹ thuật thường quy tại Khoa Xét nghiệm. 2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân - Có triệu chứng lâm sàng Đối với bệnh nhân nam giới: Lậu cấp: miệng sáo đỏ, sưng, có mủ hoặc dịch tiết ở niệu đạo có màu trắng đục, vàng hoặc hơi xanh, khi đi tiểu thấy nóng buốt, đôi khi có lẫn máu, bệnh nhân có thể bị sốt nhẹ. Lậu mạn tính: các triệu chứng không rầm rộ, không điển hình như lậu cấp, đi tiểu ít nóng hơn, mủ ít hơn, có khi chỉ tiết dịch vào buổi sáng. Đối với bệnh nhân nữ giới: Hội chứng tiết dịch âm đạo có thể thấy đi tiểu buốt hoặc khó tiểu tiện. Khám tuyến Skène, Bartholin, niệu đạo, cổ tử cung có mủ vàng hoặc hơi xanh. Bệnh nhân có cảm giác đau bụng, nóng rát khi đi tiểu, có viêm đỏ lỗ niệu đạo, đôi khi có sốt nhẹ. - Đồng ý tham gia vào nghiên cứu của tôi. 2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân - Đang dùng thuốc kháng sinh tại thời điểm lấy bệnh phẩm 7 ngày. - Bệnh nhân AIDS. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu của kỹ thuật nhuộm soi - Kính hiển vi.
  • 37.
    37 - Que tămbông, que cấy nhựa sử dụng một lần của hãng Human (Đức) hoặc công ty TNHH Nam Khoa (Việt Nam). - Thuốc nhuộm Gram của công ty TNHH Nam Khoa (Việt Nam). - Lam kính. 2.2.2. Vật liệu nghiên cứu của kỹ thuật nuôi cấy - Trang thiết bị và hoá chất + Lam kính. + Nước muối sinh lý 0,9%. + Các giá đựng ống nghiệm. + Que tăm bông, que cấy nhựa sử dụng một lần của hãng Human (Đức) hoặc công ty TNHH Nam Khoa (Việt Nam). + Thuốc nhuộm Gram của công ty TNHH Nam Khoa (Việt Nam). + Thước đo để làm kháng sinh đồ của Thụy Điển. + Kính hiển vi. + Tủ nuôi cấy điều chỉnh được CO2 của hãng Sanyo (Nhật Bản). + Hốt phân lập vi khuẩn của hãng Sanyo (Nhật Bản). - Môi trường phân lập vi khuẩn lậu: môi trường Thayer-Martin đông khô. + Môi trường Thayer-Martin và cách pha chế: Thạch GC chứa 10% Hemoglobin Powder của hãng BBL (Mỹ). Pha chế môi trường: dung dịch 1: lấy 36 g GC Agar Base hòa tan 500 ml nước cất 2 lần (pH=7,3). Đun cách thủy cho tan hết thạch, hấp ướt 1210 C trong 15 phút. Lắc đều và để nguội xuống 500 C. Dung dịch 2: lấy 10 g bột máu bò khô cho vào 100 ml nước cất 2 lần (pH=7,3) hòa tan, thêm nước cất cho đủ 500 ml. Hấp ướt 1210 C trong 15 phút. Lắc đều và để nguội xuống 500 C.
  • 38.
    38 Trộn đều dungdịch 1 và 2, sau đó cho thêm 1% chất tăng sinh và 1% chất ức chế, lắc đều phân phối ra các hộp petri. Bảo quản môi trường trong tủ lạnh 4-80 C, sử dụng trong vòng 10 ngày. + Chất tăng sinh và chất ức chế: chất tăng sinh Isovitalex của BBL (Mỹ) bao gồm các acid amin giàu dinh dưỡng tạo điều kiện cho vi khuẩn lậu phát triển. Chất ức chế V-C-N của BBL (Mỹ) là chất ức chế vi khuẩn Gram (+), trực khuẩn Gram (-) và nấm nhưng không ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lậu. + Môi trường Thayer-Martin dùng cho thử nghiệm kháng sinh đồ. Cách pha chế môi trường: Dung dịch 1: 36 g thạch GC Agar Base hoà với 500 ml nước cất 2 lần, đun sôi cho thạch tan hết, hấp ướt 1210 C trong 15 phút, lấy ra để nguội xuống 500 C, cho vào môi trường 1% chất tăng sinh, lắc đều. Dung dịch 2: 10 g bột máu bò khô cho vào 500 ml nước cất 2 lần. Khuấy đều cho đến khi tan hoàn toàn, hấp ướt 1210 C trong 15 phút. Lắc đều và để nguội xuống 500 C. Trộn đều dung dịch 1 và 2, đổ vào hộp petri (đường kính 9 cm) 25 ml thạch. Để thạch nguội ở nhiệt độ phòng và lấy 3-5% số đĩa thạch để vào tủ ấm 370 C trong thời gian từ 18-24 giờ để kiểm tra độ vô khuẩn. Bảo quản môi trường trong tủ lạnh 4-80 C, sử dụng trong vòng 10 ngày. - Test sinh vật hoá học Neisseria 4H của hãng Bio-rad (Mỹ) Oxidase - Các thanh giấy E-test Của hãng AB-BIODISK-Thụy Điển - Chủng chuẩn vi khuẩn lậu N. gonorrhoeae: ATCC 49226 Do WHO cung cấp ký hiệu các chủng: QA1, QA2, QA3, QA4, QA5, QA6.
  • 39.
    39 - Các khoanhgiấy kháng sinh bao gồm 2 nhóm khoanh giấy: Bảng 2.1. Các khoanh giấy kháng sinh thuộc nhóm chính [150]. Tên kháng sinh Ký hiệu Lượng kháng sinh/khoanh Hãng sản xuất UI µg Ceftriaxon CRO 30 Bio-rad Ciprofloxacin CIP 5 -- Penicillin PG 10 -- Spectinomycin SPT 100 -- Tetracyclin TE 30 -- Bảng 2.2. Các khoanh giấy kháng sinh thuộc nhóm bổ sung Tên kháng sinh Ký hiệu Lượng kháng sinh/khoanh (µg) Hãng sản xuất Azithromycin AZM 15 Bio-rad Cefotaxim CTX 30 -- 2.2.3. Dụng cụ và sinh phẩm cho kỹ thuật PCR - Máy ly tâm của hãng SIGMA (Đức). - Máy luân nhiệt i-Cycler Bio-rad (Mỹ) - Hoá chất: của hãng Bio-rad (Mỹ) Dung dịch đệm 10x dNTP 10 mM MgCl2 50 mM
  • 40.
    40 Taq ADN polymerase5 UI/µl Mồi xuôi HO1 và mồi ngược HO3 của hãng Invitrogen, Tokyo, Nhật Bản Trình tự mồi (5'-3') như sau: HO1: GCT ACG CAT ACC CGC GTT GC HO3: CGA AGA CCT TCG AGC AGA CA Cặp mồi này nhân lên một đoạn ADN dài 390 cặp base của gen trên plasmid pJD1 (GenBank: M10316.1, 3141-3530) của vi khuẩn lậu [70]. Mồi để xác định gen kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu: - Mồi phát hiện và giải trình tự gen gyrA (Invitrogen, Tokyo, Nhật Bản) Mồi xuôi: (5'-3') CGG CGC GTA CTG TAC GCG ATG CA Mồi ngược: (5'-3') AAT GTC TGC CAG CAT TTC ATG TGA GA Cặp mồi này nhân lên một đoạn ADN dài 279 cặp base. - Mồi phát hiện và giải trình tự gen parC (Invitrogen, Tokyo, Nhật Bản) Mồi xuôi: (5'-3') ATG CGC GAT ATG GGT TTG AC Mồi ngược: (5'-3') GGA CAA CAG CAA TTC CGC AA Cặp mồi này nhân lên một đoạn ADN dài 255 cặp base. 2.2.4. Dụng cụ và sinh phẩm cho kỹ thuật giải trình tự gen - MinElute PCR Purification Kit của hãng Qiagen (Đức). - Máy ly tâm 20.000 vòng/phút của hãng SIGMA (Đức). - Mồi giải trình tự (Invitrogen, Tokyo, Nhật Bản). - ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit của hãng Applied Biosystem (Mỹ). - Máy ABI PRISM 310 của hãng Applied Biosystem (Mỹ).
  • 41.
    41 2.3. Phương phápnghiên cứu Nghiên cứu của tôi được thực hiện trên tất cả những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia từ năm 2005-2007 với số mẫu 5.091 bệnh nhân, để tôi: xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu và tìm hiểu sự kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu phân lập được ở đối tượng này. Trong tổng số 5.091 bệnh nhân, tôi chọn ngẫu nhiên lấy 500 bệnh nhân để: so sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, nhuộm soi và nuôi cấy tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu: mô tả cắt ngang. Phân tích các trình tự nucleotide và acid amin tôi sử dụng phương pháp kết thúc chuỗi của Sanger và cộng sự (1977). Cỡ mẫu dùng cho nghiên cứu : áp dụng công thức : p . (1-p) n = Z2 .(ỏ/2). d2 Trong đó: - p: tỷ lệ phân lập vi khuẩn dương tính là 12% (căn cứu vào kết quả phân lập vi khuẩn dương tính của khoa xét nghiệm Viện Da liễu Quốc Gia hàng năm) Với ngưỡng xác suất 95% ; α = 0,05 ; - Z2 .α/2 = 1,962 ; sai số là 3%. - d = 0,03. Theo công thức trên cỡ mẫu nghiên cứu của chúng tôi là: 0,12 . 0,88 n = 1,962 . 0,032 n = 450 Trong thực tế chúng tôi nghiên cứu 500 bệnh nhân.
  • 42.
    42 2.3.1. Thiết kếnghiên cứu Bệnh nhân Sơ đồ Mục tiêu Tình hình nhiễm vi khuẩn lậu So sánh Kháng kháng sinh Nhuộm soi Nuôi cấy PCR Kháng sinh đồ Ciprofloxacin Nhạy cảm Đề kháng MIC ≥ 1 µg/mlMIC ≤ 0,06 µg/ml Giải trình tự So với chủng gốc Không đột biến Có đột biến Tìm hiểu cơ chế đề kháng Tách chiết ADN PCR
  • 43.
    43 2.3.2. Kỹ thuậtlấy bệnh phẩm Theo qui trình kỹ thuật lấy bệnh phẩm của WHO (1999) [153]. + ở nữ giới - Cổ tử cung: làm ẩm mỏ vịt bằng nước cất vô trùng, đặt mỏ vịt để bộc lộ cổ tử cung, dùng tăm bông vô trùng đưa sâu vào trong cổ tử cung 2-3 cm, để 5-10 giây cho dịch ngấm vào tăm bông, dàn mỏng trên tiêu bản. - 2 bên của tuyến Skène - 2 bên của tuyến Bartholin - Niệu đạo: dùng que cấy hoặc tăm bông vô trùng loại nhỏ đưa sâu vào niệu đạo khoảng 1,5-2 cm rồi xoay nhẹ tăm bông, để khoảng 5-10 giây. Rút tăm bông ra một cách nhẹ nhàng và dàn mỏng lên tiêu bản. + ở nam giới Lậu cấp tính (xem phụ lục 1) Yêu cầu bệnh nhân bộc lộ bộ phận sinh dục, vuốt từ gốc dương vật lên dùng bông có thấm nước cất vô trùng, lau bỏ phần mủ ngoài trước khi lấy bệnh phẩm, dùng tăm bông đưa sâu vào niệu đạo 1,5-2 cm, xoay tròn, để tăm bông 5−10 giây cho dịch thấm vào tăm bông rồi rút ra một cách nhẹ nhàng, dàn mỏng trên tiêu bản. Lậu mạn tính Nhất thiết phải hướng dẫn bệnh nhân nhịn đi tiểu ít nhất là 2-3 giờ trước khi thực hiện xét nghiệm. Các bước tiến hành lấy bệnh phẩm cũng như trường hợp lậu cấp tính. + Dịch rỉ ở mắt trẻ sơ sinh (xem phụ lục 2)
  • 44.
    44 Đeo găng tayvô trùng, dùng ngón tay cái và ngón trỏ ấn nhẹ vào mí mắt trẻ sơ sinh, mủ ở kết mạc chảy ra, dùng tăm bông vô trùng để lấy bệnh phẩm, để 5−10 giây cho mủ ngấm vào tăm bông. 2.3.3. Kỹ thuật nhuộm soi hình thể Sau khi phết bệnh phẩm lên lam kính, để khô tự nhiên, cố định trên ngọn lửa đèn cồn với sức nóng vừa phải. Tiến hành nhuộm Gram, nhuộm đơn theo thường qui của WHO năm 1999. Để khô tự nhiên. Nhận định kết quả: khi quan sát dưới kính hiển vi ta thấy vi khuẩn có hình hạt cà phê 2 mặt dẹt úp vào nhau, bắt màu Gram (-), vị trí nằm trong hay ngoài bạch cầu đa nhân trung tính thoái hóa, có thể kết luận là có song cầu khuẩn Gram (-) (nghĩ tới vi khuẩn lậu). 2.3.4. Kỹ thuật nuôi cấy (xem phụ lục 2) Bệnh phẩm được ria trên môi trường Thayer-Martin bằng những đường dích dắc hoặc kỹ thuật cấy phân vùng. Để đĩa thạch đã cấy vào tủ ấm nhiệt độ 35-360 C, có 3-10% khí CO2, độ ẩm > 70%. Sau 18-24 giờ, quan sát khuẩn lạc. Nếu chưa thấy vi khuẩn mọc để thêm 24 giờ nữa. 2.3.5. Xác định vi khuẩn lậu - Nhuộm Gram: Sau 18-24 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc vi khuẩn lậu có đường kính từ 0,5-1 mm, tròn, bờ khuẩn lạc đều, lồi, nhầy, óng ánh và có màu hơi xám (xem phụ lục 3). Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc dàn lên tiêu bản, cố định tiêu bản và tiến hành nhuộm Gram, soi trực tiếp dưới kính hiển vi quang học để xác định hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn. - Test Oxidase (xem phụ lục 3) Dùng đầu Pipette Pasteur uốn cong trên ngọn lửa đèn cồn, lấy khuẩn lạc nghi ngờ phết lên dải giấy thấm Whatman No1 kích thước 2,5 x 0,5 cm đã
  • 45.
    45 được làm ẩmbằng 2-3 giọt thuốc thử: tetramethyl P-phenylendiamin hydrochloride 1%. Phản ứng dương tính: phết vi khuẩn lên dải giấy thấm Whatman No1, trong vòng 5 giây chỗ phết vi khuẩn từ màu đỏ hồng chuyển sang màu tím đậm vì những vi khuẩn có men oxidase khi tiếp xúc với thuốc thử tetramethyl P-phenylendiamin hydrochloride 1% và sự có mặt của oxy ngoài không khí sẽ chuyển màu. - Kỹ thuật phân hủy đường nhanh [153] Sử dụng môi trường Neisseria 4H. Môi trường này gồm 4 loại đường: Glucose, Maltose, Fructose, Saccharose (xem phụ lục 4). + Chuẩn bị: - Để hộp kit ở nhiệt độ phòng khoảng 15-20 phút. - Phiến thử (Well microplates), nắp nhựa đậy phiến thử. - Dung dịch trộn vi khuẩn (Suspen solution) - 2ml. - Dung dịch Mc Farland của kit - 1ml. - Micropipette nhỏ giọt. - Que cấy. - Chủng vi khuẩn lậu cần thử. + Các bước tiến hành: theo đúng thường quy hướng dẫn của kit - Chuẩn bị huyền dịch: dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc vi khuẩn lậu nuôi cấy sau 18-24 giờ. Hoà đều vi khuẩn lậu vào dung dịch có sẵn của kit. - So sánh với độ đục Mc Farland số 3 của kit. - Dùng micropipette nhỏ vào mỗi giếng 100 µl canh khuẩn trộn đều. - Đậy nắp và ủ ở tủ ấm 370 C không có CO2. - Đọc kết quả sau 4 giờ. + Cách đọc kết quả: - Kết quả được so sánh với giếng chứng.
  • 46.
    46 - Phản ứngâm tính: màu đỏ giữ nguyên. - Phản ứng dương tính: dung dịch từ màu đỏ chuyển sang màu vàng vì vi khuẩn lậu đã chuyển hoá đường glucose thành các acid amin nên môi trường chuyển thành acid, vì vậy sẽ làm mất màu của đỏ phenol. Các tiêu chuẩn chẩn đoán xác định vi khuẩn lậu: - Soi trực tiếp: có song cầu khuẩn Gram (-) hình hạt cà phê nằm trong và ngoài bạch cầu đa nhân trung tính. - Nuôi cấy: thấy khuẩn lạc dạng S, lấp lánh như giọt sương và có màu hơi xám. Lấy khuẩn lạc nhuộm Gram thấy song cầu hình hạt cà phê bắt màu Gram (-) đa hình thái. - Test Oxidase (+). - Test phân giải đường nhanh: glucose (+). Đủ những tiêu chuẩn trên kết luận: Neisseria gonorrhoeae (+) 2.3.6. Kỹ thuật kháng sinh đồ Cả hai kỹ thuật kháng sinh đồ (khuếch tán trên thạch và E-test xác định MIC) được thử nghiệm song song với chủng chuẩn quốc tế (do WHO cung cấp) một tuần một lần. + Kỹ thuật khuếch tán trên thạch (xem phụ lục 4) Tiến hành theo kỹ thuật khuếch tán trên thạch của WHO khuyến cáo cho chương trình giám sát kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu khu vực châu á Thái Bình Dương [153]. - Sử dụng môi trường Thayer-Martin không có chất ức chế: lấy khuẩn lạc vi khuẩn lậu nuôi cấy 18-24 giờ, hoà đều với nước muối sinh lý 0,9%, so với độ đục tiêu chuẩn Mc Farland 0,5 (tương đương với 3 x108 vi khuẩn/1ml).
  • 47.
    47 Dùng pipette Pasteurhút huyền dịch láng đều lên bề mặt đĩa thạch có đường kính 9 cm với độ dày 4 mm. Hút bỏ huyền dịch thừa trên mặt đĩa thạch. - Để khô mặt thạch ở nhiệt độ phòng. - Đặt các khoanh giấy kháng sinh lên mặt đĩa thạch (đường kính 9 cm, đặt 6 khoanh). Khoanh giấy cách thành đĩa thạch 1 cm. - Để khoảng 10 phút cho kháng sinh khuếch tán đều. - ủ tủ ấm 35-360 C, 3-10% CO2, độ ẩm > 70%. Đọc kết quả sau 18-24 giờ, đo đường kính vùng ức chế tính bằng mm. *Kỹ thuật làm chứng kháng sinh đồ Sử dụng vi khuẩn lậu (chủng chuẩn quốc tế) áp dụng mỗi tuần một lần song song với các chủng thử nghiệm. Đọc kết quả và so sánh với độ nhạy của chủng chuẩn. Từ đó đánh giá chất lượng môi trường và chất lượng khoanh giấy kháng sinh và kỹ thuật của người làm thử nghiệm. Đánh giá kết quả: Phân loại mức độ nhạy cảm của vi khuẩn lậu thành 3 mức theo bảng giới hạn cho chủng mẫu: S (Susceptible): nhạy cảm; I (Intermediate): trung gian; R (Resistant): đề kháng. Bảng 2.3. Giới hạn đường kính vùng ức chế xếp loại mức độ nhạy cảm (tính bằng mm) [107]. Các kháng sinh Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Ký hiệu Đề kháng Trung gian Nhạy cảm Azithromycin AZM ≤ 13 14-17 ≥ 18 Cefotaxim CTX − − > 31 Ceftriaxon CRO − − ≥ 35 Ciprofloxaxin CIP ≤ 27 28-40 ≥ 41 Penicillin G PG ≤ 26 27-46 ≥ 47
  • 48.
    48 Spectinomycin SPT ≤14 15-17 ≥ 18 Tetracyclin TE ≤ 30* 31-37 ≥ 38 (*: TRNG đường kính vùng ức chế thường < 20 mm) Tất cả các lần thử nghiệm, kết quả đường kính vùng ức chế của các khoanh giấy kháng sinh trên chủng mẫu đều nằm trong giới hạn cho phép; chứng tỏ các yếu tố kỹ thuật đảm bảo chất lượng, từ đó tôi có thể khảng định rằng kết quả kháng sinh đồ ở các chủng vi khuẩn lậu phân lập được là chính xác. + Kỹ thuật xác định MIC của vi khuẩn lậu (E-test) (xem phụ lục 5) [150]. Nguyên lý của kỹ thuật: các thanh giấy E-test của hãng AB-BIODISK Thụy Điển đã thấm kháng sinh từ nồng độ cao xuống nồng độ thấp. Nồng độ kháng sinh nhỏ nhất ức chế được sự phát triển của vi khuẩn (biểu hiện là vi khuẩn không mọc được) thì đó là MIC. Nhất thiết phải kiểm tra kết quả MIC của các chủng mẫu quốc tế với kết quả đã biết trước. Nếu kết quả của các chủng mẫu không đúng theo quy định, thí nghiệm sẽ được thực hiện lại. Tiến hành theo kỹ thuật thường quy của WHO. Các bước tiến hành: - Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc vi khuẩn lậu nuôi cấy 18-24 giờ. - Hoà đều vi khuẩn với nước muối sinh lý 0,9%. - So với độ đục tiêu chuẩn Mc Farland 0,5. - Dùng tăm bông vô khuẩn nhúng vào huyền dịch, ép tăm bông vào thành trong của ống huyền dịch, loại bỏ huyền dịch thừa. - Ria tăm bông lên bề mặt môi trường sao cho các đường ria liền nhau. - Để khô mặt thạch ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút. - Đặt các thanh giấy kháng sinh E-test. Để khoảng 10-15 phút ở nhiệt độ phòng cho kháng sinh ở các thanh giấy khuyếch tán đều. - Để vào tủ ấm nhiệt độ 35-36o C, nồng độ CO2 3-10%, độ ẩm >70%.
  • 49.
    49 - Sau 18-24đọc kết quả. Cách đọc kết quả: - Khi vùng ức chế 2 bên thanh thử rõ ràng, kết quả MIC được đánh giá ứng với nồng độ kháng sinh in trên thanh thử tại góc bị ức chế. - Khi vùng ức chế 2 bên thanh thử không đều nhau, kết quả được đánh giá ở phía vùng ức chế có giá trị nồng độ kháng sinh cao hơn. - Khi vùng ức chế vi khuẩn thấp hơn giá trị nhỏ nhất của thanh thử, kết quả được đánh giá là nhỏ hơn giá trị thấp nhất của nồng độ kháng sinh in trên thanh thử. - Khi vi khuẩn phát triển dọc theo 2 bên thanh thử, kết quả được đánh giá ở giá trị nồng độ kháng sinh cao nhất. Bảng 2.4. Giới hạn MIC của một số kháng sinh với vi khuẩn lậu xếp loại theo mức độ nhạy cảm [107]. Tên kháng sinh Nhạy cảm (µg/ml) Trung gian (µg/ml) Đề kháng (µg/ml) Ceftriaxon ≤ 0,25 − − Penicillin ≤ 0,06 − ≥ 2 Spectinomycin ≤ 32 − ≥ 128 Ciprofloxacin ≤ 0,06 − ≥ 1 Tetracyclin ≤ 0,25 < 2 ≥ 2 2.4. Kĩ thuật PCR 2.4.1. Sinh phẩm và hóa chất Kit chiết tách: “QIAamp DNA Mini and Blood Mini Kit” của hãng Qiagen. 2.4.2. Kỹ thuật PCR phát hiện vi khuẩn lậu trong bệnh phẩm Quy trình kỹ thuật PCR phát hiện vi khuẩn lậu trong bệnh phẩm được thực hiện theo hướng dẫn của hãng Quiagen. 2.4.2.1. Quy trình tách chiết ADN
  • 50.
    50 + Cắt đầutăm bông cho vào tuýp ly tâm 1,5 ml. + Thêm 200 µl PBS. + Thêm 20 µl proteinase K, trộn đều bằng pipet. + Thêm 200 µl buffer AL, trộn đều 10 giây. + ủ 560 C trong 10 phút, ly tâm ngắn. + Thêm 200 µl cồn tuyệt đối, trộn đều 10 giây, ly tâm ngắn. + Hút tất cả dịch vào cột chiết tách. + Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần dịch lọc, chuyển sang tuýp thu dịch rửa khác. + Thêm 500 µl buffer rửa AW1, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ phần dịch lọc, chuyển sang tuýp thu dịch rửa khác. + Thêm 500 µl buffer rửa AW2, ly tâm 15.000 vòng/phút trong 3 phút, bỏ phần dịch lọc, chuyển sang tuýp ly tâm 1,5 ml. + Thêm 20 µl buffer AE vào chính giữa cột chiết tách. + Để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút. + Giữ ở -200 C. 2.4.2.2. Quy trình chạy PCR (Khuếch đại ADN) - Các thành phần tham gia phản ứng gồm Dung dịch đệm 10x 5 µl dNTPs 10 mM 1 µl MgCl2 50 mM 1,5 µl Taq polymerase 5UI/µl 0,5 µl Dung dịch ADN 5 µl Mồi xuôi HO1 10 µM 2,5 µl Mồi ngược HO3 10 µM 2,5 µl
  • 51.
    51 Nước khử ion32 µl Tổng thể tích cho 1 lần chạy PCR là 50 µl - Chu kỳ nhiệt: biến tính ADN ở 940 C trong 2 phút. Sau đó thực hiện 38 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: giai đoạn biến tính ADN ở 940 C trong 30 giây, giai đoạn gắn mồi ở 550 C trong 1 phút, giai đoạn kéo dài mồi ở 720 C trong 30 giây. Sau khi hoàn thành 38 chu kỳ, kết thúc phản ứng ở 720 C trong 5 phút. - Phát hiện sản phẩm khuếch đại gen: điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose 1,5% trong dung dịch đệm TBE 1x. Bản thạch sau khi chạy điện di được ngâm trong dung dịch ethidium bromide 0,5 µg/ml trong 30 phút, rửa qua
  • 52.
    52 nước cất. Xemvà chụp ảnh bản thạch trong buồng tối dưới ánh sáng cực tím, các băng ADN sẽ phát sáng. So sánh kích cỡ của sản phẩm với thang ADN chuẩn để kết luận sản phẩm có đặc hiệu cho vi khuẩn lậu hay không. 2.5. Quy trình giải trình tự gen 2.5.1. Quy trình PCR đối với gen gyrA và gen parC Quy trình PCR đối với gen gyrA và gen parC được thực hiện theo quy trình hướng dẫn của hãng Bio-Rad với trình tự mồi của gen gyrA và parC đã đề cập ở mục 2.2.3. Các hoá chất (hãng Bio-Rad) (Mỹ) - Taq polymerase 5 U/µl - dNTPs 10 mM - MgCl2 50 mM - Dung dịch đệm PCR 10x - Nước khử ion dùng trong sinh học phân tử Máy luân nhiệt: máy luân nhiệt i-Cycler (Bio-Rad, Mỹ). Chạy PCR (khuếch đại ADN): các thành phần tham gia phản ứng gồm Dung dịch đệm 10x 5 µl dNTP 10 mM 1 µl MgCl2 50 mM 1,5 µl Taq polymerase 5 UI/µl 0,5 µl Dung dịch ADN 5 µl Mồi xuôi 10 µM * 2,5 µl Mồi ngược 10 µM * 2,5 µl Nước khử ion 32 µl Tổng thể tích cho 1 lần chạy PCR là 50 µl. - Chu kỳ nhiệt Biến tính ADN ở 930 C trong 3 phút. Sau đó thực hiện 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: giai đoạn biến tính ADN ở 930 C trong 30 giây, giai * Xem trang 39: "Mồi để xác định gen kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu"
  • 53.
    53 đoạn gắn mồiở 520 C trong 1 phút, giai đoạn kéo dài mồi ở 720 C trong 1 phút. Sau khi hoàn thành 35 chu kỳ, kết thúc phản ứng ở 720 C trong 5 phút. - Phát hiện sản phẩm khuếch đại gen Điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose 1,5% trong dung dịch đệm TBE 1x. Bản thạch sau khi chạy điện di được ngâm trong dung dịch ethidium bromid 0,5 µg/ml trong 30 phút, rửa qua nước cất. Xem và chụp ảnh bản thạch trong buồng tối dưới ánh sáng cực tím, các băng ADN sẽ phát sáng. Xác định PCR bằng cách so sánh kích cỡ của băng ADN với băng ADN của chứng dương (gyrA và parC). Sản phẩm PCR được dùng để giải trình tự. 2.5.2. Quy trình giải trình tự gen Quy trình giải trình tự đoạn gen có thể chứa đột biến được thực hiện theo quy trình hướng dẫn của hãng. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng MinElute PCR Purification Kit - Thêm 200 µl buffer PB vào 40 µl sản phẩm PCR, trộn đều bằng pipet. - Cho toàn bộ dịch vào cột chiết tách. - Ly tâm 13.000 vòng phút trong 1 phút. - Hút bỏ phần dịch lọc. - Thêm 750 µl buffer PE, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. - Hút bỏ dịch lọc. - Ly tâm thêm 20.000 vòng/phút trong 1 phút. - Chuyển cột chiết tách sang ống ly tâm 1,5 ml. - Thêm 20 µl Buffer EB vào chính giữa cột chiết tách. - Để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút. - Giữ ở -200 C. Pha hỗn hợp giải trình tự - Mồi giải trình tự là mồi xuôi và mồi ngược của PCR. - Giải trình tự bằng ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit.
  • 54.
    54 - Pha Premix:mỗi phản ứng cần 8 µl premix với các thành phần sau:
  • 55.
    55 5X sequencing buffer4 µl dNTP mix 1 µl A dye terminator 0,5 µl C dye terminator 0,5 µl G dye terminator 0,5 µl T dye terminator 0,5 µl AmpliTaq 1 µl - Pha hỗn hợp phản ứng: Mỗi phản ứng có lượng là 20 µl, gồm các thành phần sau: Premix 8 µl Sản phẩm PCR sau tinh sạch: 5 µl Mồi * 3,2 pmol Nước cất vừa đủ 20 µl - Chạy phản ứng: 960 C trong 10 giây 960 C trong 10 giây 500 C trong 5 giây 600 C trong 4 phút 40 C trong 1 phút - Tinh sạch sản phẩm sau khi làm phản ứng giải trình tự gen (sequencing reaction): Thêm vào 20 µl sản phẩm sequencing: 3 µl KCH3COO 3M pH=7,0 14,5 µl nước cất 62,5 µl cồn 100% Để nhiệt độ phòng 15 phút. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút. Hút bỏ dịch nổi. * Xem trang 39: "Mồi để xác định gen kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu" 25 chu kỳ
  • 56.
    56 Thêm 200 µlcồn 70%. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút. Làm khô. Hoà tan bằng 25 µl Final Buffer. - Đọc kết quả bằng máy ABI PRISM 310 của hãng Applied Biosystem. Trình tự các nucleotide ở các mẫu nghiên cứu được so sánh với trình tự nucleotide của gen gyrA và parC của các chủng vi khuẩn lậu gốc để tìm ra các điểm khác nhau với chủng gốc. 2.6. Y đức trong nghiên cứu - Tư vấn cho bệnh nhân: lấy dịch tiết chỉ để phục vụ cho việc chẩn đoán định hướng điều trị và có lợi cho bệnh nhân. - Tuyệt đối giữ bí mật: tất cả những thông tin về bệnh nhân như tên, tuổi, địa chỉ, nghề nghiệp... bằng cách đánh mã, số cho từng bệnh nhân. - Được sự đồng ý của Hội đồng Y đức. 2.7. địa điểm nghiên cứu - Khoa xét nghiệm Viện Da liễu Quốc Gia: thực hiện các kỹ thuật: nhuộm soi, nuôi cấy và làm kháng sinh đồ, kỹ thuật PCR phát hiện vi khuẩn lậu trên các mẫu bệnh phẩm, kỹ thuật PCR xác định đoạn gen gyrA và parC. - Labo trung tâm trường Đại học Y Hà Nội: so sánh, đối chiếu với kỹ thuật PCR với Viện Da liễu Quốc Gia: những lần so sánh đều trùng khớp. - Khoa xét nghiệm Viện các bệnh Truyền nhiễm Quốc Gia - Nhật Bản: giải trình tự đoạn gen gyrA và parC chứa đột biến. 2.8. Xử lý số liệu Số liệu xử lý theo chương trình SPSS 16.0 và Whonet 5. Sự khác biệt giữa hai tỷ lệ được phân tích bằng test χ2 giá trị P < 0,05 được coi là khác biệt có ý nghĩa thống kê. Các trình tự nucleotide và acid amin được phân tích bằng phần mềm Bioedit verson 7.0.9.0.
  • 57.
    57 chương III kết quảnghiên cứu 3.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005-2007 3.1.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu từ năm 2005 đến năm 2007 Từ năm 2005 đến năm 2007, tất cả những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia, được tôi tiến hành chẩn đoán bằng các kỹ thuật xét nghiệm nuôi cấy và nhuộm soi. Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu từ năm 2005 đến năm 2007 (n=5.091) Kết quả Nhuộm soi Nuôi cấy Số bệnh nhân Tỷ lệ (%) Số bệnh nhân Tỷ lệ (%) Dương tính 471 9,3 503 9,9 Âm tính 4.620 90,7 4.588 90,1 Tổng số 5.091 100 5.091 100 Giá trị P 0,29 Nhận xét: Tỷ lệ phát hiện được vi khuẩn lậu bằng phương pháp nhuộm soi là 9,3% và bằng phương pháp nuôi cấy là 9,9%. Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). 3.1.2. Những yếu tố liên quan đến tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu
  • 58.
    Trong tổng số5.0 được bác sĩ lâm sàng c liễu Quốc Gia từ năm 2 để tiến hành điều tra về 3.1.2.1. Thể bệnh Bảng 3.2. Kết quả phát h ệ Thể bệnh n Cấp tính 86 Mạn tính 414 Tổng số 500 Biểu đồ 3.1 Nhận xét: Tỷ lệ phát hiện đ niệu đạo, âm đạo cấp tí đoán là hội chứng tiết dị Sự khác biệt có ý nghĩa thố 0 40 80 120 Tỷ lệ % 58 ố 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệ g chẩn đoán nhiễm vi khuẩn lậu đến khám ă 2005 đến năm 2007, tôi chọn ngẫu nhiên 5 về thông tin cá nhân. t hiện vi khuẩn lậu theo thể bệnh (n=141) Dương tính Tỷ lệ (%) 80 93,0 61 14,7 141 28,2 ồ .1. Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu theo thể bện ệ được vi khuẩn lậu ở bệnh nhân được chẩn ấ tính chiếm tỷ lệ 93,0% và những bệnh nh ết dịch niệu đạo, âm đạo (mạn tính) chiếm tỷ ĩ thống kê (P < 0,05). CÊp tÝnh M¹n tÝnh 93.0 14.7 niệu đạo, âm đạo ám tại Viện Da n 500 bệnh nhân P < 0,05 ể ệnh ẩn đoán là viêm nhân được chẩn ế tỷ lệ 14,7%.
  • 59.
    3.1.2.2. Theo giới Bảng3.3. Số lượng bện Giới tính Nam giới Nữ giới Tổng số Biểu đồ Nhận xét: Số lượng bệnh nh chiếm tỷ lệ cao (64,4%) dễ tự phát hiện hơn. C chậm hơn, triệu chứng k Sự khác biệt có ý 59 ệnh nhân phân bố theo giới (n=500) Số bệnh nhân Tỷ lệ (%) 312 62,4 188 37,6 500 100 đồ 3.2. Tỷ lệ bệnh nhân phân bố theo giới nhân nam giới có hội chứng tiết dịch niệu đ %) vì những triệu chứng lâm sàng ở nam g ớ ơ . Còn ở bệnh nhân nữ, triệu chứng lâm s ứ g không rõ ràng nên tỷ lệ thấp hơn (37,6%) ý nghĩa thống kê (P < 0,05). 62.4% 37.6% Nam giíi N÷ giíi P < 0,05 ệu đạo đến khám giới, bệnh nhân sàng tiến triển ).
  • 60.
    Bảng 3.4. Kếtquả phát Giới tính Âm Nam giới 217 (6 Nữ giới 142 (7 Tổng số 359 (7 Biểu đồ 3.3. Kế Nhận xét: Tỷ lệ phát hiện đ so với 24,5%). Sự khác biệt khôn 0 8 16 24 32 40 Tỷ lệ % 60 át hiện vi khuẩn lậu phân bố theo giới (n=1 tính Dương tính Tổng cộng (69,6%) 95 (30,4%) 312 (100%) (75,5%) 46 (24,5%) 188 (100%) (71,8%) 141 (28,2%) 500 (100%) Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố the ệ được vi khuẩn lậu ở nam giới cao hơn ở nữ hông có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Nam giíi N÷ giíi 30.4 24.5 n=141) P 0,14 ố heo giới ở nữ giới (30,4%
  • 61.
    3.1.2.3. Nhóm tuổi Bảng3.5. Số lượng bện Lứa tuổi 0-15 16-20 21-30 31-40 41-50 > 51 Tổng số Biểu đồ 3.4 Nhận xét: Số lượng bệnh n (47,0%) và 31-40 (32,8 0 20 40 60 0-15 0.2 Tỷ lệ % 61 ệnh nhân phân bố theo nhóm tuổi (n=500) Số bệnh nhân Tỷ ệ 1 16 235 4 164 3 66 1 18 500 ồ 3.4. Tỷ lệ bệnh nhân phân bố theo nhóm tuổ ệ nhân đến khám bệnh tập trung vào nhó ,8%), vì đây là lứa tuổi hoạt động tình dục 16-20 21-30 31-40 41-50 >50 3.2 47.0 32.8 13.2 3. ỷ lệ (%) 0,2 3,2 47,0 32,8 13,2 3,6 100 tuổi hóm tuổi 21-30 ục mạnh. 50 3.6
  • 62.
    Bảng 3.6. Kếtquả phát Lứa tuổi Âm t 0-15 0 16-20 11 21-30 16 31-40 12 41-50 50 >51 12 Biểu đồ 3.5. Kết q Nhận xét: Tỷ lệ phát hiện đ 40 cao (31,9% và 23,2 không có ý nghĩa thống 0 20 40 16-2 31.3 Tỷ lệ % 62 át hiện vi khuẩn lậu phân bố theo nhóm tuổ tính Dương tính Tỷ lệ (%) 0 1 11 5 31,3 160 75 31,9 126 38 23,2 50 16 24,2 12 6 33,3 ết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo n ệ được vi khuẩn lậu ở nhóm tuổi 21-30 và n ,2%). Lứa tuổi 0-15 chỉ có 1 bệnh nhân. ống kê (P > 0,05). 20 21-30 31-40 41-50 >50 .3 31.9 23.2 24.2 33. uổi (n=141) P > 0,05 nhóm tuổi à nhóm tuổi 31- n. Sự khác biệt 3.3
  • 63.
    3.1.2.4. Nghề nghiệp Bảng3.7. Số lượng bện Nghề nghiệp Học sinh, sinh viên Tự do Nông dân Công nhân Cán bộ Lái xe Khác Tổng số Biểu đồ 3.6. Nhận xét: Số lượng bệnh nhâ (22,0%) do có trình độ 0 10 20 30 HSSV 7.0 Tỷ lệ % 63 ệnh nhân phân bố theo nghề nghiệp (n=500 Số bệnh nhân Tỷ ệ 35 79 1 59 1 49 110 2 29 139 2 500 .6. Tỷ lệ bệnh nhân phân bố theo nghề nghiệ hân có thông tin nghề nghiệp là cán bộ ch ộ nhận thức về bệnh LTQĐTD. Nghề khá Tù do N«ng d©n C«ng nh©n C¸n bé L¸i xe 15.8 11.8 9.8 22.0 5.8 500) ỷ lệ (%) 7 15,8 11,8 9,8 22,0 5,8 27,8 100 hiệp ộ chiếm tỷ lệ cao ề hác cũng chiếm Kh¸c 27.8
  • 64.
    tỷ lệ cao(27,8%). Bảng 3.8. Kết quả phát Nghề nghiệp Học sinh, sinh viên Tự do Nông dân Công nhân Cán bộ Lái xe Khác Tổng số Biểu đồ 3.7. Kết quả Nhận xét 0 10 20 30 40 HSSV 28.6 Tỷ lệ % 64 át hiện vi khuẩn lậu phân bố theo nghề ngh ệ N n (%) Âm tính Dương tính 35 25 (71,4) 10 (28,6) 79 58 (73,4) 21 (26,6) 59 44 (74,6) 15 (25,4) 49 34 (69,4) 15 (30,6) 110 82 (74,6) 28 (25,5) 29 19 (65,5) 10 (34,5) 139 97 (69,8) 42 (30,2) 500 359 (71,8) 141 (28,2) ế quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo ng Tù do N«ng d©n C«ng nh©n C¸n bé L¸i xe 26.6 25.4 30.6 25.5 34.5 ghiệp (n=141) P > 0,05 nghề nghiệp Kh¸c 4.5 30.2
  • 65.
    Tỷ lệ pháthiện đ nghề có thông tin là cán biệt không có ý nghĩa thố 3.1.2.5. Nguồn lây Bảng 3.9. Số lượng bện Nguồn lây Bạn tình Vợ chồng Mại dâm Khác Tổng số Biểu đồ 3.8 Nhận xét: Số lượng bệnh nhân 0 16 32 48 B¹n t× 39.2 Tỷ lệ % 65 ệ được vi khuẩn lậu theo nghề nghiệp tập tr án bộ 25,5%, lái xe 34,5% và công nhân 30 ĩ thống kê (P > 0,05). ệnh nhân phân bố theo nguồn lây (n=500) Số bệnh nhân Tỷ ệ 196 3 188 3 90 1 26 500 ồ 3.8. Tỷ lệ bệnh nhân phân bố theo nguồn lâ ân có nguồn lây từ bạn tình và vợ chồng c ×nh Vî chång M¹i d©m Kh¸c .2 37.6 18.0 5.2 ậ trung vào nhóm n 30,6%. Sự khác ỷ lệ (%) 39,2 37,6 18,0 5,2 100 ồn lây g chiếm tỷ lệ cao
  • 66.
    (39,2% và 37,6%). Bảng3.10. Kết quả phá Nguồn lây N Bạn tình 19 Vợ chồng 18 Mại dâm 90 Khác 26 Tổng số 50 Biểu đồ 3.9. Kết q Nhận xét: Tỷ lệ phát hiện đ 0 16 32 48 B¹n t×n 32.1 Tỷ lệ % 66 ả hát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo nguồn lâ N n (%) Âm tính Dương tính 196 133 (67,9) 63 (32,1) 188 146 (77,7) 42 (22,3) 90 64 (71,1) 26 (28,9) 26 16 (61,5) 10 (38,5) 500 359 (71,8) 141 (28,2) ết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo n ệ được vi khuẩn lậu theo nguồn lây vào nh nh Vî chång M¹i d©m Kh¸c 22.3 28.9 38 ồ lây (n=141) P > 0,05 nguồn lây nhóm nguồn lây ¸c 8.5
  • 67.
    là bạn tìnhvà vợ chồng thống kê (P > 0,05). 3.1.2.6. Trình độ học vấ Bảng 3.11. Số lượng bệ Học vấn Tiểu học Trung học cơ sở (T Trung học phổ thông Cao đẳng - Đại Trên đại học Tổng số Biểu đồ 3.10. T Nhận xét: 0 16 32 48 TiÓu häc 8.2 Tỷ lệ % 67 ồng cao (32,1% và 22,3%). Sự khác biệt khô ọc vấn bệnh nhân phân bố theo trình độ học vấn (n Số bệnh nhân Tỷ lệ 41 8 ở (THCS) 81 16 ng (THPT) 194 38 ại học 175 35 ọc 9 1 500 1 Tỷ lệ bệnh nhân phân bố theo trình độ họ THCS THPT C§-§H T 16.2 38.8 35.0 hông có ý nghĩa (n=500) ỷ lệ (%) 8,2 16,2 38,8 35,0 1,8 100 ọc vấn Trªn ®¹i häc 1.8
  • 68.
    Số lượng bệnhn nhóm trình độ học vấn phản ánh đúng về mặt bằ Bảng 3.12. Kết quả ph (n=141) Học vấn Tiểu học Trung học cơ sở (TH Trung học phổ thôn (THPT) Cao đẳng - Đại họ Trên đại học Tổng số 0 13 26 39 TiÓu häc 19.5 Tỷ lệ % 68 nhân có triệu chứng lâm sàng đến khám ấn THPT (38,8%) và Cao đẳng - Đại học ặt bằng trình độ học vấn của xã hội nước ta ả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo trìn N n (%) Âm tính Dương tín 41 33 (80,5) 8 (19,5) HCS) 81 53 (65,4) 28 (34,6) ông 194 130 (67,0) 64 (33,0) ạ học 175 135 (77,1) 40 (22,9) 9 8 (88,9) 1 (11,1) 500 359 (71,8) 141 (28,2) THCS THPT C§-§H Trªn ®¹i h 34.6 33.0 22.9 11.1 m tập trung vào ọc (35,0%) cũng ta hiện nay. ình độ học vấn P ính > 0,05 ) ) ) ,2) häc .1
  • 69.
    69 Biểu đồ 3.11.Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu phân bố theo trình độ học vấn Nhận xét: Tỷ lệ phát hiện được vi khuẩn lậu theo học vấn tập trung vào nhóm học vấn THPT (33,0%) và Cao đẳng-Đại học (22,9%), sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). 3.2. So sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, nhuộm soi và nuôi cấy 3.2.1. Kết quả PCR xác định vi khuẩn lậu của các bệnh nhân Marker 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Marker Hình 3.1. Kết quả PCR xác định vi khuẩn lậu của 8 bệnh nhân từ giếng 3-10 Thang ADN mẫu (marker): 100 bp Giếng 1: chứng âm. Giếng 2: chứng dương. Giếng 5 và 10: bệnh nhân có kết quả dương tính. Giếng 3, 4, 6, 7, 8 và 9: bệnh nhân có kết quả âm tính. 100 bp 390 bp 400 bp
  • 70.
    3.2.2. Kết quảphát hiệ nuôi cấy Trong thời gian ừ bệnh nhân có hội chứng đoán nghi nhiễm vi khuẩ kỹ thuật nhuộm soi, nuô Bảng 3.13. Kết quả ph nuôi cấy (n=500) Kết quả Kỹ thuật Nhuộm soi Nuôi cấy PCR 0 12 24 36 Nhué 10 Tỷ lệ % 70 hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, n n từ năm 2005 đến năm 2007, tôi chọn ngẫ ứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo được bác sĩ l huẩn lậu, xét nghiệm tìm vi khuẩn lậu đồn uôi cấy và PCR. ả phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, uả Dương tính Âm Số bệnh nhân % Số bệnh nh 53 10,6 447 65 13,0 435 141 28,2 359 uém soi Nu«i cÊy PCR 10.1 13.0 28.2 , nhuộm soi và ọn ngẫu nhiên 500 sĩ lâm sàng chẩn đồng thời bằng 3 R, nhuộm soi và tính nhân % 89,4 87,0 71,8
  • 71.
    Biểu đồ của 3 Nhậnxét: Tỷ lệ phát hiện đ thuật nuôi cấy là 13,0% 3.2.3. Kết quả xét ngh ệ soi, nuôi cấy trên nhóm Nhóm 1: Bệnh nhân đư Nhóm 2: Bệnh nhân đư (mạn tính). Bảng 3.14. Tỷ lệ phát hiệ cấy ở 2 nhóm (n=500) Nhóm nghiên cứu Số bệnh nhân Dươ tí Nhóm 1 86 5 Nhóm 2 414 P (nhóm 1 và 2) 0 40 80 120 Nhué 58.1 Tỷ lệ % 71 ể đồ 3.12. Kết quả phát hiện vi khuẩn lậu ủ 3 kỹ thuật PCR, nhuộm soi và nuôi cấy ệ được vi khuẩn lậu của kỹ thuật nhuộm so %. Đặc biệt kỹ thuật PCR đã phát hiện đượ ghiệm tìm vi khuẩn lậu của ba kỹ thuật óm 1 và nhóm 2 ược chẩn đoán là viêm niệu đạo, âm đạo c được chẩn đoán là hội chứng tiết dịch niệu đạ hiện vi khuẩn lậu bằng kỹ thuật PCR, nhuộm Nhuộm soi Nuôi cấy ương tính % Dương tính % Dươ tín 50 58,1 57 66,3 8 3 0,7 8 1,9 6 < 0,05 < 0,05 ém soi Nu«i cÊy PCR 66.3 93.0 0.7 1.9 14.7 Nh Nh soi là 10,6%, kỹ ợc 28,2%. ật PCR, nhuộm cấp (cấp tính). ệu đạo, âm đạo ộm soi và nuôi PCR ương tính % 80 93,0 61 14,7 < 0,05 hãm 1 hãm 2
  • 72.
    72 Biểu đồ 3.13.Tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu bằng kỹ thuật PCR, nhuộm soi và nuôi cấy ở 2 nhóm Nhận xét: tỷ lệ phát hiện được vi khuẩn lậu bằng kỹ thuật PCR ở nhóm 1 là 93,0%. ở nhóm 2 kỹ thuật PCR đã phát hiện được 14,7% bệnh nhân trong khi đó kỹ thuật nuôi cấy chỉ phát hiện được 1,9% bệnh nhân và kỹ thuật nhuộm soi phát hiện 0,7% bệnh nhân. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P <0,05). 3.3. kết quả kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu năm 2005-2007 3.3.1. Mức độ nhạy cảm với kháng sinh năm 2005 Bảng 3.15. Mức độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm chính năm 2005 (n=162) Tên kháng sinh n (%) Nhạy cảm Trung gian Đề kháng Penicillin 62 (38,3%) 43 (26,5%) 57 (35,2%) Ceftriaxon 162 (100%) 0 0 Ciprofloxacin 31 (19,1%) 35 (21,6%) 96 (59,3%) Spectinomycin 162 (100%) 0 0 Tetracyclin TRNG: 16 (9,9%) Tỷ lệ %
  • 73.
    Biểu đồ 3.14.Mức đ Nhận xét: Vi khuẩn lậu kh Không thấy sự đề kháng Bảng 3.16. Mức độ n (n=162) Tên kháng sinh Azithromycin Cefotaxim 0 40 80 120 Penicillin 38.3 26.5 35.2 Tỷ lệ % 73 ức độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm chính ậ kháng ciprofloxacin cao nhất (tổng khán áng với ceftriaxon và spectinomycin. độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm bổ su n (%) Nhạy cảm Trung gian Đ 153 (94,4%) 9 (5,6%) 160 (98,8%) 2 (1,2%) Ciprofloxacin 100 19.1 100 0 21.6 0 .2 0 59.3 0 Nh¹y c¶m Trung gian §Ò kh¸ng nh năm 2005 áng là 80,9%). ổ sung năm 2005 Đề kháng 0 0 Tetracyclin 9.9
  • 74.
    Biểu đồ 3.15.Mức độ Nhận xét: Tuy không có ch sung nhưng có 5,6% số và 1,2% số chủng giảm 3.3.2. Mức độ nhạy cảm Bảng 3.17. Mức độ nhạ Tên kháng sinh Penicillin Ceftriaxon Ciprofloxacin Spectinomycin Tetracyclin 0 20 40 60 80 100 120 Az 94 Nh Tỷ lệ % 74 ứ độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm bổ sung chủng nào đề kháng với 2 kháng sinh th ố chủng giảm nhạy cảm (trung gian) với ảm nhạy cảm với cefotaxim. ảm với kháng sinh năm 2006 hạy cảm với kháng sinh nhóm chính năm 2 n (%) Nhạy cảm Trung gian Đ 97 (45,8%) 49 (23,1%) 66 212 (100%) 0 38 (17,9%) 54 (25,5%) 12 212 (100%) 0 TRNG: 35 (16,5%) Azithromycin Cefotaxime 4.4 98.8 5.6 1.20 0 h¹y c¶m Trung gian §Ò kh¸ng ng năm 2005 nh thuộc nhóm bổ ới azithromycin ă 2006 (n=212) Đề kháng 66 (31,1%) 0 120 (56,6%) 0
  • 75.
    Biểu đồ 3.16.Mức đ Nhận xét: Mức độ đề khán hơn năm 2005, nâng m đề kháng nào với ceftria Bảng 3.18. Mức độ n (n=212) Tên kháng sinh Azithromycin Cefotaxim 0 40 80 120 Penicillin 45.8 23.1 31 Tỷ lệ % 75 ức độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm chính áng với ciprofloxacin của vi khuẩn lậu nă mức tổng kháng lên 82,1%. Tôi vẫn khôn triaxon và spectinomycin. độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm bổ su n (%) Nhạy cảm Trung gian Đ 208 (98,1%) 4 (1,9%) 210 (99,1%) 2 (0,9%) Ceftriaxone Ciprofloxacin Spectinomyci 100 17.9 100 0 25.5 0 31.1 0 56.6 0 Nh¹y cam Trung gian §Ò kh¸ng nh năm 2006 ậ năm 2006 tăng ông tìm thấy sự ung năm 2006 Đề kháng 0 0 cin Tetracyclin 16.5
  • 76.
    Biểu đồ 3.17.Mức độ Nhận xét: tuy không có sung nhưng có 1,9% số chủng giảm nhạy cảm vớ 3.3.3. Mức độ nhạy cảm Bảng 3.19. Mức độ nhạ Tên kháng sinh Penicillin Ceftriaxon Ciprofloxacin Spectinomycin 0 30 60 90 120 Az 98 Nh 76 ứ độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm bổ sung có chủng nào đề kháng với 2 kháng sinh th ố chủng giảm nhạy cảm với azithromycin ả với cefotaxim. ảm với kháng sinh năm 2007 hạy cảm với kháng sinh nhóm chính năm 2 n (%) Nhạy cảm Trung gian Đ 75 (58,1%) 6 (4,7%) 48 129 (100%) 0 14 (10,8%) 45 (34,9%) 70 129 (100%) 0 Azithromycin Cefotaxime 8.1 99.1 1.9 0.9 0 0 Nh¹y c¶m Trung gian §Ò kh¸ng ng năm 2006 nh thuộc nhóm bổ in và 0,9% số ă 2007 (n=129) Đề kháng 48 (37,2%) 0 70 (54,3%) 0
  • 77.
    Tetracyclin Biểu đồ 3.18: Mức đ Nhận xét: mức độ đề tăng hơn năm 2006, nân sự đề kháng nào với cef Bảng 3.20. Mức độ n (n=129) Tên kháng sinh Azithromycin Cefotaxim 0 40 80 120 Penicillin 57.1 4.7 37 Tỷ lệ % 77 TRNG: 48 (37,5%) (n=128) ức độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm chính ề kháng với ciprofloxacin của vi khuẩn ậ âng mức tổng kháng lên 89,2%. Tôi vẫn k ceftriaxon và spectinomycin. độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm bổ su n (%) Nhạy cảm Trung gian Đ 128 (99,2%) 1 (0,8%) 125 (96,9%) 4 (3,1%) Ciprofloxacin 100 10.8 100 0 34.9 0 37.2 0 54.3 0 Nh¹y c¶m Trung gian §Ò kh¸ng nh năm 2007 ẩn lậu năm 2007 ẫn không tìm thấy ung năm 2007 Đề kháng 0 0 Tetracyclin 37.5
  • 78.
    Biểu đồ 3.19.Mức độ Nhận xét: Tuy không có ch sung nhưng có 0,8% số chủng giảm nhạy cảm vớ 3.3.4. So sánh mức độ đ Bảng 3.21. So sánh mức Kháng sinh 2 Penicillin 1 Ceftriaxon 0 30 60 90 120 Az 99 Nh Tỷ lệ % 78 ứ độ nhạy cảm với kháng sinh nhóm bổ sung chủng nào đề kháng với 2 kháng sinh thuộc ố chủng giảm nhạy cảm với azithromycin ả với cefotaxim. độ đề kháng trong ba năm 2005-2006-200 ức độ đề kháng trong ba năm 2005-2006-2 Tổng kháng (R+I) (%) 2005 (n=162) 2006 (n=212) 20 100 (61,7%) 115 (54,2%) 5 0 0 Azithromycin Cefotaxime 9.2 96.9 0.8 3.1 0 0 Nh¹y c¶m Trung gian §Ò kh¸ng ng năm 2007 ộc nhóm bổ in và 3,1% số 007 2007 2007 (n=129) 54 (41,9%) 0
  • 79.
    Ciprofloxacin 1 Spectinomycin Tetracyclin Azithromycin Cefotaxim Biểu đồ3.20. So sán Nhận xét: trong ba nă penicillin có xu hướng 54,2% và 41,9%). Với lên (80,9%; 82,1% và 8 3.4. đột biến gen liên qu 3.4.1. Kết quả điện di sả 1 2 0 20 40 60 80 100 Penicillin 61.7 54.2 41.9 Tỷ lệ % 79 131 (80,9%) 174 (82,1%) 1 0 0 16 (9,9%) 35 (16,5%) 4 9 (5,6%) 4 (1,9%) 2 (1,2%) 2 (0,9%) sánh mức độ đề kháng trong ba năm 2005-2 năm 2005-2006-2007 sự đề kháng của vi ớng giảm dần (với mức tổng kháng lần l ới ciprofloxacin, xu hướng này lại có chiề 89,1%). quan đến kháng ciprofloxacin sản phẩm PCR xác định đoạn gen gyrA 3 4 5 6 7 8 9 Ciprofloxacin Tetracycline Azithromycin 80.9 9.9 5.6 82.1 16.5 1.9 .9 89.1 37.5 0.8 2005 2006 2007 115 (89,1%) 0 48 (37,5%) 1 (0,8%) 4 (3,1%) 2006-2007 i khuẩn lậu với ầ lượt là 61,7%, hiều hướng tăng 10 in Cefotaxim 1.2 0.9 3.1
  • 80.
    80 Hình 3.2. Kếtquả điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen gyrA Giếng 1: chứng âm; Giếng 2: chứng dương, Giếng 3: thang ADN 100 bp Giếng 4 đến 10: kết quả dương tính 3.4.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen parC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định đoạn gen parC Giếng 1: chứng âm; Giếng 2: chứng dương, Giếng 3: thang ADN 100 bp Giếng 4 đến 10: kết quả dương tính 279 bp 255 bp
  • 81.
    81 3.4.3. Kết quảgiải trình tự nucleotid đoạn gen gyrA chứa đột biến Hình 3.4. Trình tự nucleotid của đoạn gen gyrA chứa đột biến 77
  • 82.
    82 Hình 3.5. Trìnhtự nucleotid của đoạn gen gyrA chứa đột biến 3.4.4. Kết quả giải trình tự nucleotid đoạn gen parC chứa đột biến 78
  • 83.
    83 Hình 3.6. Trìnhtự nucleotid của đoạn gen parC chứa đột biến Hình 3.7. Trình tự nucleotid của đoạn gen parC chứa đột biến 79
  • 84.
  • 85.
    85 3.4.5. Phân tíchtrình tự đoạn ADN thường xảy ra đột biến dẫn tới kháng ciprofloxacin Bảng 3.22. Phân tích trình tự đoạn ADN thường xảy ra đột biến dẫn tới kháng ciprofloxacin (n=71) Chủng MIC (µg/ml) GyrA ParC ATCC 49226 0,001 Ser-91 Asp-95 Asp-86 Ser-87 Glu-91 63 0,002 27 0,060 67 1 Phe Ala Asn 69 1 Phe Ala 73 1 Phe Ala Asn 21 1,5 Phe Ala 28 1,5 Phe Gly Asn 47 1,5 Phe Gly 75 1,5 Phe Ala 2 2 Phe Ala 20 2 Phe Gly 23 2 Phe Gly Arg 26 2 Phe Ala 39 2 Phe Ala Asn 45 2 Phe Ala Asn 56 2 Phe Ala 60 2 Phe Ala 62 2 Phe Ala 64 2 Phe Ala 15 3 Phe Ala Arg 33 3 Phe Ala Asn 34 3 Phe Ala Asn 36 3 Phe Ala Asn 37 3 Phe Gly Asn 40 3 Phe Ala Asn 41 3 Phe Ala Arg 11 4 Phe Gly Asn 12 4 Phe Ala Asn 13 4 Phe Ala Asn 46 4 Phe Ala Asn 54 4 Phe Ala Asn 8 6 Phe Gly Asn 9 6 Phe Ala Asn 17 6 Phe Ala Asn
  • 86.
    86 19 6 PheAla Asn 24 6 Phe Ala Asn 42 6 Phe Ala Asn 43 6 Phe Ala Asn 66 6 Phe Ala Asn 4 12 Phe Ala Asn 32 12 Phe Ala Asn 38 12 Phe Ala Asn 49 12 Phe Ala Asn 51 12 Phe Ala Asn 53 12 Phe Gly Arg 55 12 Phe Ala Asn 61 12 Phe Ala Asn 68 12 Phe Ala Asn 71 12 Phe Ala Asn 30 16 Phe Ala Gln 1 32 Phe Asn Ile 5 32 Phe Gly Arg 6 32 Phe Asn Ile 10 32 Phe Asn Ile 16 32 Phe Gly Gln 18 32 Phe Gly Gln 22 32 Phe Gly Gln 25 32 Phe Gly Arg 29 32 Phe Asn Ile 35 32 Phe Gly Arg 44 32 Phe Gly Arg 48 32 Phe Gly Arg 52 32 Phe Asn Ile 57 32 Phe Gly Gln 58 32 Phe Gly Arg 59 32 Phe Ala Ile 65 32 Phe Ala Arg 70 32 Phe Gly Arg 72 32 Phe Ala Asn 74 32 Phe Asn Ile 14 32 Phe Ala Asn Ghi chú: Ô trống là giống với chủng chuẩn. Nhận xét: chủng vi khuẩn lậu số 27 và 63 là những chủng nhạy cảm với
  • 87.
    87 ciprofloxacin. Những chủngcòn lại là những chủng đề kháng với ciprofloxacin được xếp theo MIC. 3.4.6. Số lượng đột biến trên 2 gen gyrA và parC theo mức độ kháng ciprofloxacin Bảng 3.23. Số lượng đột biến trên 2 gen gyrA và parC theo mức độ kháng ciprofloxacin (n=69) MIC (µg/ml) Số chủng (n = 69) Tỷ lệ (%) Số lượng đột biến Tổng số Trên gyrA Trên parC 1 3 4,3 2 0-1 2-3 1,5 4 5,8 2 0-1 2-3 2 10 14,5 2 0-1 2-3 3 7 10,1 2 1 3 4 5 7,2 2 1 3 6 8 11,6 2 1 3 12 10 14,5 2 1 3 16 1 1,4 2 1 3 32 21 30,4 2 1 3 Tổng 69 100 18 6-9 24-27 Nhận xét: trong 71 chủng nghiên cứu, có 2 chủng nhạy cảm với ciprofloxacin và 69 chủng kháng với ciprofloxacin. Những chủng đề kháng với MIC ≤ 2 µg/ml có 2 hoặc 3 đột biến trên 2 gen gyrA và parC, những chủng đề kháng với MIC ≥ 3 µg/ml đều có 3 đột biến trên 2 gen nói trên. Như vậy, mức độ đề kháng có liên quan đến số lượng các đột biến.
  • 88.
    88 3.4.7. Phân tíchcác đột biến trên gen gyrA Bảng 3.24. Phân tích các đột biến trên gen gyrA của 69 chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin (n=69) Loại đột biến (n=69) Số chủng (%) MIC trung bình (µg/ml) Ser-91 → Phe 69 (100) 14,4 Asp-95 → Ala 44 (63,8) 9,5 Asp-95 → Gly 19 (27,5) 20,2 Asp-95 → Asn 6 (8,7) 32,0 Nhận xét: Tất cả 69 chủng đề kháng ciprofloxacin đều có đột biến Ser-91 thành Phe. Trong khi đó 2 chủng nhạy cảm với ciprofloxacin không mang đột biến này. Ngoài ra, trên gen gyrA còn phát hiện đột biến tại Asp-95 ở tất cả các chủng kháng ciprofloxacin với 3 kiểu đột biến là Asp-95 thành Ala, Asp-95 thành Asn và Asp-95 thành Gly. Hai đột biến ở Ser-91 và Asp-95 ở gen gyrA được thấy ở tất cả các chủng kháng ciprofloxacin. Đột biến ở Ser-91 luôn được chuyển thành Phe. ở Asp-95 có 3 dạng thay đổi và 3 kiểu đột biến này có liên quan đến mức độ đề kháng (MIC) của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin.
  • 89.
    89 3.4.8. Phân tíchcác đột biến trên gen parC Bảng 3.25. Phân tích các đột biến trên gen parC của 69 chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin (n=69) Loại đột biến (n=69) Số chủng (%) MIC trung bình (µg/ml) Không đột biến 11 (15,9%) 1,77 Asp-86 → Asn 3 (4,3%) 4,33 Ser-87 → Asn 31 (44,9%) 10,24 Ser-87 → Arg 12 (17,4%) 23,00 Ser-87 → Ile 7 (10,1%) 32,00 Glu-91 → Gln 5 (7,2%) 28,80 Nhận xét: Sự xuất hiện đột biến và kiểu đột biến quyết định đến mức độ đề kháng của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin. - Những chủng mang đột biến Asp-86 thành Asn hoặc không có đột biến thì có mức đề kháng thấp - Những chủng mang đột biến Ser-87 thành Asn có mức đề trung bình - Những chủng có mức đề kháng cao là những chủng mang các đột biến: Ser-87 thành Arg, Glu-91 thành Gln và Ser-87 thành Ile.
  • 90.
    90 3.4.9. Phối hợpgiữa các đột biến trên 2 gen Bảng 3.26. Phối hợp giữa các đột biến trên 2 gen (n=44) Các chủng mang đột biến Ser91→Phe và Asp95→Ala trên gen gyrA (n=44) Số chủng (%) MIC trung bình (µg/ml) Không kèm đột biến trên parC 9 (20,5) 1,78 Kèm đột biến trên parC 35 (79,5) 11,49 Nhận xét: Qua phân tích, tôi thấy có 1 số sự kết hợp đáng chú ý sau: - Cả 4 chủng mang 2 đột biến Ser-91 thành Phe và Asp-95 thành Asn trên gen gyrA đều có đột biến Ser-87 thành Ile trên gen parC. Các chủng này đều có mức đề kháng cao với ciprofloxacin. - Trong các đột biến trên gen gyrA thì đột biến phối hợp giữa Ser-91 thành Phe và Asp-95 thành Ala chiếm tỷ lệ cao nhất (44/69 = 63,8%). Tuy nhiên mức độ kháng kháng sinh của 44 chủng này không đồng đều. - Nếu có thêm đột biến trên gen parC thì làm tăng mức độ đề kháng ciprofloxacin.
  • 91.
    91 3.4.10. Mối liênquan giữa MIC và đột biến Bảng 3.27: Mối liên quan giữa MIC và đột biến (n=71) MIC (µg/ml) Số chủng (%) Số lượng đột biến 0,002-0,060 2 (2,8) 0 1-2 11 (15,5) 2 1-2 6 (8,5) 3 3-32 52 (73,2) 3 Tổng 71 (100) Nhận xét: Trong tổng số 71 chủng nghiên cứu, có 2 chủng nhạy cảm với ciprofloxacin có MIC 0,002-0,060 µg/ml (tỷ lệ 2,8%) không mang đột biến. Có 11 chủng đề kháng có MIC 1-2 µg/ml (tỷ lệ 15,5%) mang 2 đột biến trên gen gyrA và không mang đột biến trên gen parC. Có 6 chủng đề kháng có MIC 1-2 µg/ml (tỷ lệ 8,5%) mang 3 đột biến trên cả 2 gen gyrA và parC và 52 chủng đề kháng có MIC 3-32 µg/ml (tỷ lệ 73,2%) mang 3 đột biến trên cả 2 gen gyrA và parC.
  • 92.
    92 Chương iv Bàn luận 4.1.tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu quốc gia từ năm 2005-2007 4.1.1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu từ năm 2005 đến năm 2007 - Tỷ lệ phân lập chung Từ 2005 đến 2007, trong tổng số 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc Gia được thực hiện các xét nghiệm: nhuộm soi trực tiếp, nuôi cấy phân lập và đã phát hiện được 503 chủng vi khuẩn lậu chiếm tỷ lệ 9,9%. Kết quả nghiên cứu của tôi thấp hơn nghiên cứu của Nguyễn Văn Huân và cộng sự (1998) ở Quảng Ninh là 17,12% và tương đương với kết quả của Diệp Xuân Thanh khi nghiên cứu tại Viện Da liễu Quốc Gia (1998), tỷ lệ này là 10,05% [11], [16]. Sở dĩ có sự khác nhau về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là do mẫu nghiên cứu của tôi lớn, thời gian nghiên cứu dài. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu cao hay thấp còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh hay chưa sử dụng kháng sinh, kinh nghiệm và kỹ năng của xét nghiệm viên, chất lượng của các phòng xét nghiệm, trình độ hiểu biết về bệnh tật của bệnh nhân... Trên thế giới, tùy theo từng khu vực, từng nước, thậm chí từng vùng mà tỷ lệ phân lập vi khuẩn lậu dương tính chênh lệch nhau rõ rệt. Theo nghiên cứu của Creighton và cộng sự (2003) tại Khoa Hoa liễu bệnh viện Hoàng gia Anh cho biết tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đây là 18,8% [41]. Nghiên cứu của Adaskevich, trường Đại học y Belarus (2001) cho biết tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đối tượng bệnh nhân bị bệnh LTQĐTD là 18% [22]. Trong khi đó ở một số nước khác lại thông báo tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu thấp hơn nhiều. Nghiên
  • 93.
    93 cứu của Vander Pol (2001) tại Uganda tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đây là 3,4% [114]. Tại một số thành phố lớn ở Mexico (2001), tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu trong số 1.199 bệnh nhân nam và nữ có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo là 1,2% [139]. Khu vực Bắc Âu như Thụy Điển có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là 6,6/100.000 dân (2001) [33]. Nghiên cứu của Lassau tại Paris (Pháp) tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở Paris giảm nhanh chóng: từ 1.599 ca phát hiện năm 1985 đến năm 1997 còn 43 ca, tăng nhẹ vào năm 1999 là 64 ca và năm 2000 là 76 ca. Theo tác giả thì sự giảm số ca nhiễm vi khuẩn lậu một cách nhanh chóng như thông báo là do có tư vấn trong vấn đề an toàn tình dục trong phòng chống lây nhiễm HIV/AIDS và các bệnh LTQĐTD [89]. Theo Massari và cộng sự (2002) tại Pháp, tỷ lệ mắc các bệnh viêm niệu đạo giảm rõ rệt từ 1989 đến 1995, tăng nhẹ vào năm 1996 sau đó ổn định, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là 13% [98]. Tại khu vực châu á Thái Bình Dương, WHO ước tính tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở các nước trong khu vực 14%. Samoa và Vanuatu là hai nước trong khu vực có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đối tượng bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo thấp 3,4% và 5,9% [152]. Kết quả nghiên cứu của tôi thấp hơn kết quả của Creighton tại Anh, Adaskevich tại Belarus và cao hơn so với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới như Van der Pol tại Uganda và Teran tại Mexico. Nhưng theo báo cáo của ngành da liễu: các bệnh LTQĐTD nói chung và bệnh Lậu nói riêng hiện nay ngành Da liễu ước tính số lượng bệnh nhân còn cao hơn gấp 10-15 lần. Vì bệnh nhân bị bệnh có thể tự mua thuốc tự điều trị hoặc đến các phòng khám tư nhân và những bệnh nhân trên không được thông báo hàng năm [9]. - Kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp Trong 3 năm, nghiên cứu 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo được tôi tiến hành kỹ thuật nhuộm soi, phát hiện được 471 bệnh
  • 94.
    94 nhân nhiễm vikhuẩn lậu chiếm tỷ lệ 9,3%. Nuôi cấy phát hiện được 503 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn lậu chiếm tỷ lệ 9,9%. Nếu mang kết quả nhuộm soi để so sánh với kết quả nuôi cấy (471/503 x 100) thì tỷ lệ phát hiện bệnh của phương pháp nhuộm soi với nuôi cấy là 93,6%. Do mẫu nghiên cứu của tôi lớn và làm liên tục trong thời gian 3 năm từ năm 2005 đến năm 2007, kết quả của kỹ thuật nhuộm soi là đáng tin cậy. Như vậy kỹ thuật nhuộm soi trực tiếp đơn giản, không tốn kém, cho kết quả nhanh và rất có giá trị đối với những nơi chưa có điều kiện triển khai kỹ thuật nuôi cấy hoặc các kỹ thuật hiện đại khác. ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Hoài kết quả nhuộm soi trực tiếp có tỷ lệ dương tính là 95% và nghiên cứu của các tác giả nước ngoài như Van der Pol cho biết: bằng kỹ thuật nhuộm Gram lấy mủ từ niệu đạo của bệnh nhân bị bệnh Lậu cho kết quả dương tính là 96,4%. Như vậy, kết quả nghiên cứu của tôi tương đương với kết quả nghiên cứu của Đỗ Ngọc Hoài. Sự khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) và thấp hơn nghiên cứu của Van der Pol [10], [114]. 4.1.2. Những yếu tố có liên quan đến tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu - Thể bệnh Thể bệnh cũng là một yếu tố rất quan trọng có liên quan đến tỷ lệ phân lập vi khuẩn lậu cao hay thấp. Ngày nay xu hướng thể bệnh, lậu mạn tính ngày càng gia tăng, nguyên nhân là do bệnh nhân tự điều trị và sử dụng thuốc không đủ liều quy định. Hơn nữa dịch vụ y tế tư nhân khá phát triển, những cơ sở y tế này lại không có đủ kiến thức về chuyên môn, không có kinh nghiệm điều trị chuyên sâu, chưa quản lý bệnh chặt chẽ hoặc không quan tâm đến biến chứng của bệnh và không tuân thủ đúng quy trình điều trị. Nghiên cứu của tôi cho thấy ở bệnh nhân cấp tính số lượng phân lập được vi khuẩn lậu cao hơn ở bệnh nhân mạn tính (93,0% và 14,7%). Kết quả của tôi cao hơn kết quả nghiên cứu của Đỗ Ngọc Hoài (71,85% và 27,4%) [10] và của Diệp
  • 95.
    95 Xuân Thanh (76,26%và 22,14%) [16]. Vì tôi đã áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán và có chương trình tuyên truyền, giáo dục y tế và tư vấn về nguy cơ lây nhiễm HIV/AIDS/STD nên khi có triệu chứng khác thường là bệnh nhân đến để được xét nghiệm và điều trị sớm. Vì vậy mà tỷ lệ phân lập vi khuẩn lậu ở thể cấp tính cao hơn rất nhiều so với thể mạn tính. Điều đó đã góp phần ngăn chặn kịp thời nguồn lây cho cộng đồng và tránh được các biến chứng đáng tiếc có thể xảy ra. - Giới tính Các nghiên cứu ở Việt Nam cũng như ở các nước trên thế giới đều cho thấy nam giới bị bệnh Lậu cao hơn nữ giới. Kết quả nghiên cứu của tôi là số bệnh nhân nam bị bệnh Lậu cao hơn số bệnh nhân nữ bị bệnh Lậu (30,4% và 24,5%). Nghiên cứu của Diệp Xuân Thanh tại Viện Da liễu Quốc Gia cho thấy nam giới bị bệnh Lậu chiếm tỷ lệ 12,28% và nữ giới là 6,34% [16]. Nghiên cứu của Đặng Hoàng Anh tại thành phố Hồ Chí Minh cho biết, tỷ lệ nữ giới có thai nhiễm vi khuẩn lậu là 12,17% [1]. Các tác giả trên thế giới như Alves tại Brazil cho biết tỷ lệ bệnh nhân nữ bị bệnh Lậu được phát hiện ở phòng khám bệnh LTQĐTD là 57% và nam giới là 42,3% [24]. Theo nghiên cứu của Bakare tại Nigeria, nam giới bị bệnh Lậu chiếm tỷ lệ 75,2% và nữ giới là 24,8% [29]. Tại thị trấn Thyolo, Malawi, trong tổng số 114 bệnh nhân nam xét nghiệm đã phát hiện 80% số bệnh nhân bị bệnh Lậu [164]. Nghiên cứu của Bachman và cộng sự tại khoa cấp cứu trường đại học Alabama, Birmingham cho biết, tỷ lệ nam giới nhiễm vi khuẩn lậu là 20% và nữ giới là 16% [27]. Trong khi đó ở Nam Phi, Fehler cho biết, tỷ lệ nam giới nhiễm vi khuẩn lậu là 3,2% và ở nữ giới là 7,9% [54]. Kết quả nghiên cứu của tôi cao hơn kết quả nghiên cứu của Bachman về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở nam giới và cao hơn thông báo của Fehler. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở nữ giới trong kết quả nghiên cứu của tôi cũng cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Fehler,
  • 96.
    96 của Diệp XuânThanh tại Viện Da liễu Quốc Gia, thông báo của Đặng Hoàng Anh và Bachman. Nếu so sánh kết quả nghiên cứu của tôi về tỷ lệ nam và nữ nhiễm vi khuẩn lậu với Alves tại Brazil, Bakare tại Nigeria thì kết quả nghiên cứu của tôi thấp hơn nhiều. Một vấn đề cần đề cập đến ở đây là nam giới bị bệnh LTQĐTD nói chung và nhiễm vi khuẩn lậu nói riêng phần lớn đều có tỷ lệ cao hơn nữ giới. Phải chăng hiện nay nam giới đa số đều làm chủ về kinh tế và họ dễ dàng có nhiều bạn tình và có thể quan hệ tình dục tự do theo ý muốn, hơn nữa họ thường chưa chú ý đến vấn đề tình dục an toàn nên khả năng bị bệnh chiếm tỷ lệ cao. Ngoài ra sự biểu hiện bệnh lý ở đường tiết niệu sinh dục nam giới rầm rộ hơn nên bắt buộc họ phải đến các cơ sở y tế để khám và điều trị. Biểu hiện lâm sàng về nhiễm trùng sinh dục do vi khuẩn lậu ở nam giới điển hình chiếm tỷ lệ > 90%. Trong khi đó ở nữ giới có triệu chứng lâm sàng về nhiễm trùng sinh dục do vi khuẩn lậu chỉ chiếm tỷ lệ 50%-60%. Đây là một trong những lý do làm cho tỷ lệ phát hiện bệnh Lậu ở nữ giới thấp hơn ở nam giới [30], [44], [144]. Một yếu tố cũng góp phần làm cho tỷ lệ nữ giới bị bệnh Lậu thấp hơn nam giới tại Viện Da liễu Quốc Gia là do số nữ giới bị bệnh còn được khám, xét nghiệm và điều trị tại các phòng khám sản phụ khoa, các trung tâm kế hoạch hoá gia đình. - Tuổi Đối với các bệnh LTQĐTD, tuổi là yếu tố quan trọng nói lên sự lây lan của bệnh. Thông thường, tuổi trẻ có tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn. Theo kết quả nghiên cứu của tôi, tỷ lệ bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo được xét nghiệm tập trung vào nhóm lứa tuổi 21-30 tuổi, chiếm tỷ lệ 47%, từ 31-40 tuổi (32,8%). ở lứa tuổi 21-30, qua nghiên cứu 235 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo, tôi phân lập được 75 bệnh nhân dương tính chiếm tỷ lệ 31,9%. Lứa tuổi 31-40 qua nghiên cứu 164 bệnh nhân có hội
  • 97.
    97 chứng tiết dịchniệu đạo, âm đạo, tôi phân lập được 38 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 23,2%. Các nhóm tuổi khác do mẫu nghiên cứu nhỏ nên tỷ lệ dương tính có thể cao hoặc thấp sẽ ít có ý nghĩa thống kê. Từ năm 2005 đến năm 2007 trong tổng số 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo, một vấn đề cần đề cập ở đây là trẻ em lứa tuổi mẫu giáo cũng bị nhiễm vi khuẩn lậu đường sinh dục. Kết quả nghiên cứu của tôi cho thấy có 21 trường hợp bị viêm âm hộ và đã phát hiện 5 trường hợp vi khuẩn lậu dương tính, có 3 trường hợp viêm kết mạc mắt do lậu. Nguyên nhân của các trường hợp viêm âm hộ do vi khuẩn lậu là lây từ bố mẹ (4 trường hợp) và có 1 trường hợp không khai thác được nguồn lây. Nghiên cứu của Diệp Xuân Thanh cho biết tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở trẻ em dưới 10 tuổi là 1,09% và những trường hợp này cũng có nguồn lây từ bố mẹ và bà [16]. Nghiên cứu của Anfield tại bệnh viện Hoàng gia London cho biết 12,5% trẻ em từ 3-11 tuổi nhiễm vi khuẩn lậu là do cưỡng dâm [25]. ở Việt Nam cũng như các nước trên thế giới tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu tập trung vào nhóm lứa tuổi hoạt động tình dục mạnh. ở Việt Nam, nghiên cứu của Đỗ Ngọc Hoài (1998) tại Hà Nội cho biết tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở nhóm lứa tuổi 21-30 tuổi là 75,57% [10]. Nghiên cứu của Diệp Xuân Thanh (1998) tại Viện Da liễu Quốc Gia cũng ở lứa tuổi trên tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là 65,21% [16]. Nghiên cứu của Nguyễn Đình Thắng và cộng sự (2002) tại Lâm Đồng cho thấy, tỷ lệ các bệnh nhiễm trùng LTQĐTD nói chung và bệnh Lậu nói riêng ở nhóm lứa tuổi 21-30 tuổi là 48,6% và 31-40 tuổi là 30,2% [17]. Nghiên cứu của Bakare tại Nigeria cho thấy lứa tuổi bị bệnh Lậu chiếm tỷ lệ cao tập trung vào nhóm tuổi từ 20-29 tuổi là 57% ở nam và 52% ở nữ [29]. Nghiên cứu của Hayakawa tại bệnh viện Nagoya Nhật Bản cho biết nam giới ở lứa tuổi hoạt động tình dục mạnh có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu là 49,8% [68]. Kết quả nghiên cứu của tôi thấp hơn kết quả nghiên cứu của Diệp
  • 98.
    98 Xuân Thanh tạiViện Da liễu Quốc Gia, Bakare tại Nigeria, thông báo của Nguyễn Đình Thắng tại Lâm Đồng và Hayakawa tại bệnh viện Nagoya Nhật Bản, thông báo của Đỗ Ngọc Hoài tại Hà Nội. Một điều đáng nói ở đây là lứa tuổi trẻ ở Việt Nam cũng như các nước khác trên thế giới đều có tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu cũng như các bệnh LTQĐTD khác khá cao. Đây là lứa tuổi có nhiều đóng góp cho xã hội về vấn đề phát triển khoa học, kỹ thuật cũng như làm giàu cho đất nước.Vì vậy mục tiêu phòng chống các bệnh nhiễm trùng LTQĐTD tập trung vào lứa tuổi trẻ, tuyên truyền giáo dục y tế cần đẩy mạnh để tuổi trẻ có những hiểu biết nhất định về các bệnh LTQĐTD và biết cách phòng tránh, có như vậy mới làm giảm tỷ lệ lây lan các bệnh nhiễm trùng LTQĐTD trong cộng đồng và hạ thấp được tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS. - Nghề nghiệp Nghề nghiệp cũng là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ nhiễm các bệnh nhiễm trùng LTQĐTD nói chung và bệnh Lậu nói riêng. Sự nghèo nàn, lạc hậu, không nghề nghiệp và sự đô thị hoá nhanh chóng cũng là yếu tố làm cho bệnh LTQĐTD gia tăng ở các nước đang phát triển [134]. Thông tin về nghề nghiệp được tôi chia làm bẩy nhóm và thống kê theo bệnh nhân khai. Kết quả nghiên cứu của tôi cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở các nhóm nghề nghiệp là lái xe 34,5%, công nhân 30,6%, nghề khác (gồm nhiều ngành nghề như nhân viên bán hàng, kinh doanh buôn bán, nhân viên phục vụ...) 30,2%, học sinh-sinh viên 28,6%, nghề tự do 26,6%, cán bộ 25,5%, nông dân 25,4%. Tỷ lệ phân lập dương tính cao ở các nghiên cứu khác thường tập trung vào những nghề như buôn hàng chuyến, lái xe, nghề tự do... Đặc biệt trong nghiên cứu về nghề nghiệp của tôi, qua nghiên cứu 110 người với nghề nghiệp là cán bộ có tỷ lệ phân lập dương tính là 28 người chiếm tỷ lệ 25,5%, phải chăng cán bộ ngày nay hay phải đi công tác, giao lưu với nhiều người và khả năng tiếp cận về bệnh tật sẽ lớn hay là cán bộ có dân trí cao hiểu biết rõ
  • 99.
    99 hơn về táchại của bệnh Lậu nên đến ngay cơ sở có uy tín, độ tin cậy cao để điều trị kịp thời nên tỷ lệ phát hiện được vi khuẩn lậu cao. Một vấn đề đặt ra là vấn đề trung thực trong khai báo nghề nghiệp với thầy thuốc. Theo thông báo của một số tác giả trong nước thì tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đối tượng này thấp hơn nghiên cứu của tôi rất nhiều. Các tác giả trên thế giới chưa thấy đề cập đến đối tượng là cán bộ làm việc hưởng lương nhà nước. Một đối tượng mà xã hội cũng như y tế cộng đồng cần quan tâm là học sinh-sinh viên. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở các đối tượng này là 28,6%. Vì vậy chúng ta cần có biện pháp giáo dục giới tính trong các trường trung học, cao đẳng và đại học, tuyên truyền giáo dục y tế và tư vấn cách phòng tránh các bệnh LTQĐTD cho đối tượng này. Có như vậy mới tạo ra được những lớp người thừa kế và làm chủ đất nước trong tương lai khoẻ mạnh và tràn đầy sức sống phục vụ và làm giàu đẹp cho tổ quốc. Một số công trình nghiên cứu ở nước ngoài cũng cho biết: tại Nigeria tỷ lệ mắc bệnh ở người buôn bán 33,8%, người phục vụ 29,5% và sinh viên 26,7% [29]. Nghiên cứu của Paz-Bailey tại Thái Lan cho thấy tỷ lệ sinh viên-học sinh, từ 15-21 tuổi nhiễm vi khuẩn lậu ở nam là 0,3% và nữ là 6,1% [110]. Theo nghiên cứu của Nguyễn Đình Thắng tại Lâm Đồng tỷ lệ bị bệnh LTQĐTD ở đối tượng công nhân rất cao (48,32%), cán bộ (19,89%) và nghề khác là 16,79% [17]. Nghiên cứu của Diệp Xuân Thanh tại Hà Nội thì tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu cao ở đối tượng nghề tự do (36,78%), cán bộ (14,61%), các đối tượng nghề khác (dưới 10%) [16]. Một đối tượng nghề nghiệp có liên quan đến tỷ lệ mắc bệnh cao là nghề tự do và nghề mại dâm. Kết quả nghiên cứu của tôi cho thấy có tới 26,6% các trường hợp bị bệnh Lậu làm nghề tự do. Đây là một công việc không ổn định, làm theo thời vụ, thu nhập thấp, thất thường. Đây là một vấn đề xã hội lớn mà không chỉ riêng ngành y tế phải quan tâm. Đối tượng thứ hai là gái mại dâm. ở Việt Nam pháp luật không cho
  • 100.
    100 phép coi nghềmại dâm là một nghề chính đáng. Vì vậy khi điều tra về nghề nghiệp chắc chắn sẽ không có ai tự nhận mình làm nghề mại dâm nên sẽ không có số liệu chính xác về vấn đề này. ở các nước khác trên thế giới, nhà nước và bộ y tế đã công nhận mại dâm cũng là một nghề nên số liệu về tỷ lệ mắc bệnh LTQĐTD nói chung và bệnh Lậu nói riêng ở các đối tượng này đã được nhiều tác giả đề cập đến. Một nghiên cứu tại Indonesia số phụ nữ hành nghề mại dâm nhiễm vi khuẩn lậu chiếm tỷ lệ 29,9%. Nghiên cứu tại Anh và một số nước khác cho thấy gái mại dâm nhiễm vi khuẩn lậu tới 64% [43], [71], [129]. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu thuộc các trung tâm phục hồi nhân phẩm cho biết tỷ lệ gái mại dâm nhiễm các bệnh nhiễm trùng LTQĐTD cao (trên 30%) [7]. - Nguồn lây Điều tra về yếu tố nguồn lây trong nghiên cứu của tôi cũng chỉ dựa vào lời khai của bệnh nhân và rất tế nhị có thể bệnh nhân ngại hoặc ngượng nên kết quả của tôi cũng rất khiêm tốn: tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu cao có nguồn lây từ bạn tình nam hoặc nữ chiếm tỷ lệ 32,14%. Vi khuẩn lậu chỉ lây bệnh từ người này sang người khác nên tỷ lệ bạn tình của 2 giới đều phải từ 2 bạn tình trở lên. Theo thông báo của Hardick và cộng sự tại trung tâm kiểm soát bệnh tật Mỹ thì tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở nam và nữ có nhiều bạn tình là 92% và 27% [67]. Gái mại dâm cũng là một điều đáng quan tâm trong vấn đề làm gia tăng tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu cũng như các bệnh LTQĐTD và HIV/AIDS. Trong nghiên cứu của tôi thì tỷ lệ lây nhiễm vi khuẩn lậu từ gái mại dâm là 28,9%. Theo thông báo của Nguyễn Đình Thắng số bệnh nhân tại Lâm Đồng có quan hệ với gái mại dâm tới 41,4% [17], cao hơn kết quả nghiên cứu của tôi. Tỷ lệ lây nhiễm vi khuẩn lậu giữa vợ chồng chiếm tỷ lệ cao 22,3%. Ngày nay quan niệm về sống chung thuỷ một vợ một chồng đã ít được quan tâm ở Việt Nam cũng như ở các nước khác trong khu vực châu á Thái Bình Dương. Ngược lại
  • 101.
    101 tuổi trẻ châuÂu có xu hướng sống chung thuỷ như truyền thống của các nước châu á xưa [5]. Vấn đề này ngành y tế không thể giải quyết một sớm, một chiều mà phải có sự quan tâm của xã hội nhất là vai trò của hội phụ nữ, thanh niên các cấp. Trong nghiên cứu của tôi tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu từ nhóm bệnh nhân có nguồn lây là nghề khác (có thể bệnh nhân không muốn khai hoặc thật sự không biết, hoặc mới quen trong công việc, hoặc đồng tính nam...) chiếm tỷ lệ 38,5% trong nhóm nguồn lây này, nghiên cứu của tôi tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu của bệnh nhân nam giới quan hệ với người không quen biết là 12,2%. Những trường hợp này khi được phỏng vấn đều trả lời do “quá chén” tại các nhà hàng, khách sạn và họ đều chưa được tiếp cận với cơ sở tư vấn về bệnh tật cũng như khuyến cáo sử dụng bao cao su khi có nhu cầu tình dục. Nhóm nguồn lây từ bạn tình chiếm 32,1%, vợ chồng chiếm 24,3%, mại dâm là 28,9%. Đặc biệt trong nghiên cứu của tôi về nguồn lây khi nghiên cứu 196 bệnh nhân có nguồn lây từ bạn tình, tôi phân lập được 63 bệnh nhân dương tính chiếm tỷ lệ 32,1%. Nghiên cứu của tôi đã phát hiện được 1 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn lậu là đối tượng đồng tính luyến ái nam, chiếm tỷ lệ 3,9%. Nghiên cứu của Benn tại khoa tiết niệu trường đại học y London cho biết tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân nam đồng tính luyến ái năm 2001 là 16,5% [31]. Đến năm 2007 tỷ lệ này chỉ còn là 16% [32]. Nghiên cứu của Lassau cho biết tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân đồng tính luyến ái nam là 13% [89]. Kết quả nghiên cứu của tôi thấp hơn nhiều so với kết quả của Ben lại London và của Lassau tại Pháp. ở Việt Nam chưa có thông báo về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đối tượng đồng tính luyến ái nam và nữ. Có lẽ đây là vấn đề tế nhị nên công việc phỏng vấn của thầy thuốc gặp rất nhiều khó khăn và chưa đưa ra được con số thực sự về tỷ lệ bị bệnh LTQĐTD nói chung và bệnh Lậu nói riêng ở đối tượng này. - Trình độ học vấn
  • 102.
    102 Nhiều tác giảtrong nước cũng như ngoài nước đều cho rằng tỷ lệ nhiễm bệnh cao hay thấp đều liên quan đến sự thất học và nghèo nàn [134]. Nghiên cứu của tôi về trình độ học vấn liên quan đến tỷ lệ nhiễm bệnh cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân có trình độ học vấn tiểu học là 19,5%, trung học cơ sở là 34,6%, trung học phổ thông là 33%, cao đẳng và đại học là 22,9%, trên đại học là 11,1%. Một số công trình nghiên cứu ở trong nước đều cho kết quả về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu dương tính đều tập trung vào đối tượng bệnh nhân thất học hoặc trình độ văn hoá thấp. Theo nghiên cứu của Nguyễn Đình Thắng tại Lâm Đồng tỷ lệ nhiễm bệnh LTQĐTD nói chung và bệnh Lậu nói riêng đều tập trung vào đối tượng không biết chữ hoặc trình độ học vấn thấp [17]. Nghiên cứu của Uribe-Salas tại biên giới Guatemala-Mexico cho biết tỷ lệ nữ có trình độ văn hóa thấp nhiễm vi khuẩn lậu là 11,6% [142]. Nghiên cứu của Kent tại trường trung học Sanfransisco cho thấy: tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đối tượng học sinh trung học là 0,7% [82]. Nghiên cứu của Alves tại Brazil cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở đối tượng bệnh nhân có trình độ văn hoá phổ thông cơ sở là 4,5% [24]. Theo nghiên cứu của tôi tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu cao lại tập trung ở đối tượng bệnh nhân có trình độ học vấn cấp 2 và cấp 3, đại học. Vì vậy cần tuyên truyền, giáo dục y tế cho các đối tượng này vì có lẽ họ chưa được tư vấn đầy đủ về bệnh tật, sự nguy hại biến chứng của bệnh LTQĐTD nói chung và bệnh Lậu nói riêng cũng như hiểm họa về HIV/AIDS. 4.2. So sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, nhuộm soi và nuôi cấy Các kỹ thuật sinh học phân tử đã được áp dụng rộng rãi trên thế giới từ nhiều năm nay. Đặc biệt, kể từ sau khi kỹ thuật PCR ra đời (nửa đầu những
  • 103.
    103 năm 1980), sinhhọc phân tử đã có những bước tiến vượt bậc. Người ta đã có thể thao tác với các vật liệu di truyền như ADN, ARN trong phòng thí nghiệm [58], [95], [120]. Thêm nữa, việc tổng hợp ra các vật liệu di truyền trên với số lượng lớn đã không còn là một vấn đề khó khăn. Nhiều dự án giải trình tự bộ gen của nhiều động vật, thực vật và vi sinh vật đã và đang được tiến hành [69], [163]. Một trong những công trình nghiên cứu lớn trong y sinh học là ‘‘Dự án Gen người’’ [105]. ở Việt Nam, việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong các lĩnh vực khoa học nói chung và y sinh học nói riêng cũng mới được triển khai trong vòng hơn 20 năm. Nhiều đề tài và dự án nghiên cứu đã và đang được triển khai nhằm áp dụng các tiến bộ của khoa học vào nghiên cứu, sản xuất, chẩn đoán và điều trị hoặc nghiên cứu phục vụ sản xuất thuốc, chế phẩm sinh học, vacxin đã và đang được triển khai [45], [64], [91], [106], [130], [147]. Trong lĩnh vực Y học PCR có rất nhiều ứng dụng trong việc xác định căn nguyên của các bệnh nhiễm trùng như Chlamydia đường sinh dục, phong, lao...[2], [3]. Trong số 500 bệnh nhân được chọn ngẫu nhiên từ tổng số 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo được tôi tiến hành đồng thời ba kỹ thuật nhuộm soi, nuôi cấy và PCR. Kỹ PCR phát hiện có 141 bệnh nhân dương tính chiếm tỷ lệ là 28,2%, nuôi cấy phát hiện có 65 bệnh nhân dương tính chiếm tỷ lệ là 13% và nhuộm soi phát hiện có 53 bệnh nhân dương tính chiếm tỷ lệ là 10,6%. Trong số 65 bệnh nhân dương tính bằng kỹ thuật nuôi cấy và thử đầy đủ các tính chất sinh vật hóa học thì kỹ thuật PCR chỉ cho kết quả dương tính với 64 bệnh nhân, còn một bệnh nhân kỹ thuật PCR lại cho kết quả âm tính. Mẫu này đã được làm đi làm lại nhưng kết quả PCR vẫn không thay đổi. Có thể giải thích là chủng vi khuẩn lậu này không có plasmid pJD1 nên không có sản phẩm trong quá trình khuếch đại, và điều này cũng
  • 104.
    104 phù hợp vớinhiều tác giả khác trên thế giới khi nghiên cứu về loại plasmid pJD1 này đều có chung một nhận xét: plasmid pJD1 chỉ có ở 96% số chủng vi khuẩn lậu [70], [136]. Theo thông báo của Gaydos và cộng sự thuộc trường Đại học Y Johns Hopkins và trường Đại học Công cộng và vệ sinh ở Baltimore, Maryland, tác giả tiến hành xét nghiệm PCR dịch âm đạo cho 793 phụ nữ quân nhân ở lứa tuổi hoạt động tình dục mạnh đến khám tại phòng khám STD đã phát hiện 3,3% số nữ quân nhân nhiễm vi khuẩn lậu, trong khi đó nuôi cấy chỉ phát hiện 2,1% [60]. Boel và Van Herk tại phòng xét nghiệm vi sinh thuộc Bệnh viện Catharina, Veldhoven và Khoa Da liễu ở Eindhoven, Hà Lan cho biết: khi nghiên cứu 765 bệnh nhân nam và nữ được lấy bệnh phẩm ở sinh dục và hầu họng để xét nghiệm PCR chẩn đoán vi khuẩn lậu, có 229 bệnh phẩm được khẳng định dương tính chiếm tỷ lệ 30% [34]. Để so sánh về tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của kỹ thuật PCR, kỹ thuật nhuộm soi và kỹ thuật nuôi cấy, tôi tiến hành đồng thời ba kỹ thuật trên 500 bệnh nhân và được chia làm hai nhóm. Nhóm 1 là nhóm bệnh nhân được chẩn đoán là viêm niệu đạo, âm đạo cấp (cấp tính) tỷ lệ phát hiện bệnh là: 93%, 58,1% và 66,3% nhưng cũng không thấy có sự khác biệt nhiều giữa ba kỹ thuật này. Sự khác biệt đặc biệt rõ ở nhóm 2: nhóm bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo (mạn tính) nhưng bằng kỹ thuật PCR vẫn phát hiện được 61 (14,7%) bệnh nhân dương tính trong khi đó kỹ thuật cổ điển như nuôi cấy chỉ phát hiện được 8(1,9%) và nhuộm soi thì tỷ lệ phát hiện lại quá thấp chỉ phát hiện được 3 (0,7%) bệnh nhân. Như vậy tỷ lệ phát hiện bệnh bằng kỹ thuật PCR cho kết quả rất cao (gấp trên 20 lần kỹ thuật nhuộm soi và hơn 7 lần kỹ thuật nuôi cấy). Vì vậy kỹ thuật PCR nên được khuyến cáo trong các trường hợp lậu mạn tính hoặc khi các kỹ thuật khác không phát hiện được mà bệnh nhân vẫn có triệu chứng lâm sàng. Nếu áp dụng thuật toán thống kê để nghiên cứu về nhóm thứ hai này, sẽ
  • 105.
    105 cho kết quảnhư sau: - Với kỹ thuật PCR và kỹ thuật nuôi cấy: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,001 và χ2 =44,4. - Với kỹ thuật PCR và nhuộm soi: sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,001 và χ2 =56,9. - Với kỹ thuật nhuộm soi và nuôi cấy: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với P = 0,12 và χ2 =2,3. Điều này giúp các bác sỹ lâm sàng lựa chọn kỹ thuật xét nghiệm hợp lý. Với kỹ thuật nhuộm soi và nuôi cấy, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê nên chỉ cần chọn phương pháp nhuộm soi để đơn giản, có kết quả nhanh, ít tốn kém và đỡ gây phiền hà cho bệnh nhân mà khả năng phát hiện bệnh cũng không khác biệt nhiều so với nuôi cấy. Chính vì vậy, khi chẩn đoán một bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo được chẩn đoán là bệnh Lậu mạn tính thì chỉ cần làm xét nghiệm nhuộm soi và làm thêm xét nghiệm PCR nếu nghi ngờ. Không nên lựa chọn đồng thời cả ba kỹ thuật trong chẩn đoán bệnh Lậu mạn sẽ gây rất nhiều phiền hà cho bệnh nhân và tốn kém. Nhưng điều này lại hạn chế đối với các nhà giám sát kháng kháng sinh muốn khoanh vùng hoặc cô lập đối với những chủng vi khuẩn lậu kháng thuốc để thông báo trong nước và quốc tế về tình hình kháng kháng sinh của chúng từ đó có những biện pháp can thiệp hữu hiệu. Với tình hình sử dụng kháng sinh tuỳ tiện không theo một chỉ định điều trị nào như hiện nay thì kỹ thuật PCR là một kỹ thuật lý tưởng được áp dụng để phát hiện vi khuẩn lậu ở mọi giai đoạn. Tuy mẫu nghiên cứu với số lượng chưa lớn nhưng cũng phần nào cũng đánh giá đúng về tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu hiện nay ở nước ta trên những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo. Nói tóm lại, PCR có rất nhiều lợi thế: cho kết quả nhanh, chính xác vì
  • 106.
    106 kỹ thuật cóđộ nhạy và độ đặc hiệu rất cao thường trên 97%. Giá trị chẩn đoán bệnh của PCR đặc biệt trong những trường hợp vi sinh vật không nuôi cấy được hoặc nuôi cấy rất khó khăn, tốn kém, hoặc ở những bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi vào viện, PCR không nhất thiết đòi hỏi phải có vi sinh vật sống. 4.3. kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu từ năm 2005-2007 Khi theo dõi về sự kháng kháng sinh của những chủng vi khuẩn lậu phân lập được trong ba năm 2005, 2006, 2007 số chủng hàng năm (n) là: năm 2005 là 162 chủng, năm 2006 là 212 chủng và năm 2007 là 162 chủng. Tôi phân tích về tỷ lệ kháng với những kháng sinh được khuyến cáo dùng trong điều trị bệnh Lậu như sau: 4.3.1. Tỷ lệ kháng kháng sinh - Penicillin Penicillin đã được sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh Lậu trong nhiều năm. Trước đây N. gonorrhoeae rất nhạy cảm penicillin, điều trị 150.000 đv đã có hiệu quả ở phần lớn các trường hợp N. gonorrhoeae giảm nhạy cảm in vitro [116]. Tuy nhiên trong những năm gần đây hiệu lực đã bắt đầu giảm [40]. Tăng liều penicillin được khuyến nghị đã làm giảm tạm thời các dấu hiệu lâm sàng do nhiễm các chủng này, nhưng hầu như mức độ kháng kháng sinh vẫn tăng và nhiều trường hợp điều trị thất bại lại xuất hiện, ngay cả với phác đồ liều cao. Cho đến năm 1976 những chủng vi khuẩn lậu kháng penicillin có PPNG là những mốc đánh dấu sự thất bại hoàn toàn của loại kháng sinh này trong vấn đề điều trị bệnh Lậu [89]. Cho đến nay penicillin không được khuyến cáo điều trị bệnh Lậu ở những nước có tỷ lệ kháng penicillin cao. Theo nghiên cứu của tôi thì tỷ lệ kháng penicillin: 35,19% (năm 2005), 31,13% (năm 2006), 37,21% (năm 2007). Nhìn chung tỷ lệ vi
  • 107.
    107 khuẩn lậu khángpenicillin vẫn ở mức cao (trên 30%). Tại Viện Da liễu Quốc Gia năm 2000 và 2001 tỷ lệ kháng pencillin của các chủng vi khuẩn lậu phân lập được 47,77% và 36,14%. Theo nghiên cứu của Ye S. và cộng sự tại Trung Quốc từ năm 1993-1998 có 3186 chủng vi khuẩn lậu được thử tính nhạy cảm và kháng lại các kháng sinh, tỷ lệ kháng penicillin là 66,7% [161]. Theo thông báo của WHO tỷ lệ kháng lại penicillin ở các nước trong khu vực châu á Thái Bình Dương như Philippines và Hàn Quốc > 90%, Trung Quốc 80%, Singapore 60% [155], [156]. Tại vùng Caribê, nghiên cứu của Llanes tại Cuba cho biết tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng penicillin ở Cuba là 70% [93]. Nghiên cứu của Leutscher tại Madagasca tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng penicillin 70% [92]. ở châu Âu, nghiên cứu của Young và cộng sự tại Scoland tỷ lệ kháng Penicillin của các chủng vi khuẩn lậu là 6% [162]. Theo thông báo của WHO, một số nước có tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng penicillin thấp hơn là: Nhật Bản 3%; Fiji trên 8% [155], [156]. Theo thông báo của WHO (2008): chương trình giám sát kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu tại khu vực Châu á Thái Bình Dương năm 2006 khi phân lập được 8.374 chủng tại 16 quốc gia, tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh thuộc nhóm penicillin như sau: Philippines 78,5%, Hàn Quốc 74,5%, Brunei 64,2%, Hồng Kông 62,7%, Singapore 59,4%. Như vậy kết quả của tôi thấp hơn nhiều so với thông báo của WHO. Sự đề kháng penicillin do gen nằm trên plasmid mã hoá ra enzym õ- lactamase TEM-1. Enzym này thủy phân vòng õ-lactam của penicillin và bất hoạt chúng. Ngược với sự gia tăng chậm tính đề kháng do thay đổi trên nhiễm sắc thể, sự đề kháng sẽ đạt mức cao nếu trên plasmid có sự thay đổi. N. gonorrhoeae sản sinh penicillinase (PPNG) được phát hiện trong cùng một thời điểm ở Anh và Mỹ. Các mẫu phân lập đầu tiên được du nhập, ở Anh là từ
  • 108.
    108 châu Phi vàở Mỹ là từ vùng viễn Đông. Sự lan truyền gen đa đề kháng qua tiếp hợp còn có sự tham gia của các plasmid có PPNG được phân lập lần đầu ở châu á, nhưng cho đến năm 1981 vẫn không có trong các chủng châu Phi. Do đó, chủng châu á này lan truyền rộng hơn và nhanh hơn. Có thể thoạt đầu plasmid này được nhận từ các loài Haemophilus [78]. Sự sản sinh lactamase (PPNG) và những thay đổi nhiễm sắc thể (CMRNG) có thể cùng tồn tại trong một chủng phân lập được. Điều này là xác đáng vì trên lâm sàng có việc sử dụng penicillin kết hợp với chất ức chế õ-lactamase. Những chất này, như acid clavulanic và sulbactam, ngăn cản õ- lactamase bất hoạt penicillin. Phối hợp amoxycillin/acid clavulanic được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng khác. Theo lý thuyết và đôi khi trong thực tế phác đồ uống hiệu quả đối với các nhiễm trùng nói chung nhưng thất bại không ít trong điều trị bệnh Lậu. Điều này có lẽ là do các chủng PPNG kháng penicillin tự nhiên hoặc qua trung gian nhiễm sắc thể với tần suất cao [132]. Giảm nhạy cảm với cephalosporin, tetracyclin và các kháng sinh khác cũng do cơ chế nhiễm sắc thể [127]. Từ các nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước cùng với chính nghiên cứu của mình, tôi nhận thấy tỷ lệ vi khuẩn lậu đề kháng với penicillin đang giảm dần qua từng năm. Có lẽ do penicillin ít được sử dụng điều trị bệnh Lậu và các nhiễm khuẩn khác nên vi khuẩn lậu đã giảm tính đề kháng với kháng sinh này qua từng năm: 61,7% (2005), 54,2% (2006) và 41,9% (2007). - Tetracyclin Tetracyclin thường không được khuyến nghị để điều trị bệnh Lậu vì kháng sinh phải được dùng với nhiều liều trong vài ngày, làm tăng khả năng kém tuân thủ điều trị và liều không đúng. Tuy nhiên, kháng sinh rẻ và do đó được sử dụng rộng rãi, nhất là trong lĩnh vực y tế không chính quy. Cả hai cơ chế đề kháng do nhiễm sắc thể và do plasmid đều tồn tại
  • 109.
    109 trong vi khuẩnlậu và sau đó thì trở thành đề kháng ở mức cao. Kháng tetracyclin mức cao trong vi khuẩn lậu (TRNG) là do có yếu tố quyết định tetM và được báo cáo lần đầu vào năm 1986. TetM trong N. gonorrhoeae tồn tại ở cả 2 týp "Hà Lan" và "Mỹ"; chúng khác nhau chút ít và nằm trên plasmid tự truyền. Một nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của gen tetM qua PCR cho thấy týp Hà Lan có thể có nguồn gốc từ Viễn Đông và týp Mỹ có nguồn gốc từ lục địa châu Phi. Plasmid tetM được phân bố rộng rãi trong quần thể vi hệ bình thường ở đường sinh dục. Khả năng lan truyền của plasmid và áp lực chọn lọc do dùng tetracyclin để điều trị các bệnh LTQĐTD khác đã góp phần phát tán rộng rãi các chủng TRNG [75], [96]. Trong nghiên cứu của tôi tỷ lệ vi khuẩn lậu kháng lại tetracyclin là 9,88% năm 2005, năm 2006 là 16,51%, năm 2007 là 37,5%. Tại Viện Da liễu Quốc Gia tỷ lệ TRNG năm 2000, 2001 là 42,7% và 40,47% [13], [14]. Một số nước trong khu vực châu á Thái Bình Dương tỷ lệ TRNG dao động từ 25%-70%. ở Trung Quốc tỷ lệ TRNG gia tăng năm 1998 (3%); năm 1999 (15%), năm 2000-2001 (25%). Tại Cuba tỷ lệ TRNG là 40% [93], [154], [155], [156]. Theo nghiên cứu của Su X. tại miền bắc Sumatra, Indonesia tỷ lệ TRNG là 28% [129]. Tonga là nước chưa phân lập được chủng vi khuẩn lậu nào kháng tetracyclin ở mức độ cao [156]. Kết quả nghiên cứu của tôi tương đương với kết quả nghiên cứu ở Trung Quốc năm 2000-2001; thấp hơn rất nhiều so với thông báo của Lê Thị Phương năm 2000, 2001 và của Llanes tại Cuba. Mặc dù tetracyclin không được khuyến cáo trong phác đồ điều trị bệnh Lậu nhưng nó đã được áp dụng đa liều trị liệu với sự nhiễm trùng kết hợp viêm niệu đạo, cổ tử cung do vi khuẩn lậu và Chlamydia trachomatis [134]. - Cephalosporin Độ nhạy cảm của vi khuẩn lậu thay đổi với kháng sinh cephalosporin là
  • 110.
    110 do nhiễm sắcthể và chính những thay đổi này giải thích cho sự giảm nhạy cảm với penicillin [74]. Có sự đề kháng chéo giữa penicillin và cephalosporin thế hệ 2 như cefuroxime [117]. Tuy nhiên, điều này không xảy ra với cephalosporin thế hệ sau như ceftriaxon và cefixim. Ceftriaxon và cefotaxim thuộc nhóm cephalosporin thế hệ III cũng được sử dụng để điều trị các bệnh LTQĐTD, nhất là ceftriaxon. May mắn là cho đến nay các nước trong khu vực châu á Thái Bình Dương chưa phát hiện được chủng vi khuẩn lậu nào kháng lại ceftriaxon. Thông báo của các tác giả trên thế giới như Van Dyck tại Kigali Wranda, Llanes tại Cuba, Leutscher tại Madagasca, Berglund tại Thụy Điển, Karlovsky tại Mỹ chưa phân lập được chủng vi khuẩn lậu nào kháng lại ceftriaxon [33], [80], [92], [93], [114]. Trong nghiên cứu của Ye S. từ 1993-1998 cho biết có 0,57% số chủng vi khuẩn lậu phân lập được kháng lại ceftriaxon [161]. Nghiên cứu của tôi cho thấy 100% số chủng vi khuẩn lậu phân lập được đều nhạy cảm với ceftriaxon. Tỷ lệ giảm nhạy cảm đối với cefotaxim là 1,23% năm 2005, 0,94% năm 2006, 3,11% năm 2007. Tôi chọn cefotaxim và nhóm bổ xung vì giá thành của cefotaxim thấp hơn nhiều so với ceftriaxon và cũng thuộc nhóm cephalosporin thế hệ thứ 3. Dùng trong điều trị bệnh Lậu thấy kết quả tương đối tốt nhưng gần đây đã dần dần gia tăng những chủng giảm nhạy cảm với kháng sinh này. Một số nghiên cứu của các tác giả trên thế giới không thấy đề cập đến tình hình nhạy cảm cũng như kháng lại kháng sinh này. - Spectinomycin ở N. gonorrhoeae đề kháng spectinomycin hoặc aminoglycosid thường xảy ra do đột biến nhiễm sắc thể một bước, dẫn đến kháng kháng sinh ở mức độ cao. Các gen ribosomal tham gia vào quyết định đề kháng spectinomycin hoặc aminoglycosid có liên quan với nhau. Tuy nhiên, MIC với gentamicin
  • 111.
    111 hơi cao cũngđược ghi nhận trong một số mẫu phân lập và trong tương lai vi khuẩn lậu sẽ nhận được gen nằm trên plasmid (hiện có trong nhiều loài vi khuẩn khác) nó sẽ mã hoá ra những emzym làm bất hoạt kháng sinh aminoglycosid [78], [94]. Spectinomycin thuộc nhóm kháng sinh aminoglycosid. Gần đây có nhiều tài liệu công bố về tính đề kháng của các chủng vi khuẩn lậu với Spectinomycin, tuy nhiên chỉ ở mức độ thấp: 0,3% năm 1996; 0,045% năm 1997; 5,3% năm 1998-1999 và năm 2000 [155], [156]. Kết quả nghiên cứu của tôi không thấy có chủng vi khuẩn lậu nào kháng lại kháng sinh spectinomycin. Như vậy kháng sinh spectinomycin vẫn là 1 kháng sinh có tác dụng rất tốt trong điều trị vi khuẩn lậu tại Việt Nam với liều sử dụng duy nhất 2 g tiêm bắp. - Azithromycin Azithromycin là kháng sinh được WHO khuyến cáo trong phác đồ điều trị bệnh Lậu kết hợp với Chlamydia trachomatis. Nghiên cứu của tôi trong những năm qua cho thấy số chủng vi khuẩn lậu đã giảm nhạy cảm với azithromycin: 5,56% năm 2005, 1,89% năm 2006, 0,81% năm 2007. Thông báo của Ng. L. K và cộng sự tại Canada tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng azithromycin với MIC dao động từ 2-60 mcg/ml [108]. Indonesia và Cuba chưa phát hiện được chủng nào kháng lại azithromycin [73], [93]. - Ciprofloxacin Kháng sinh nhóm quinolon được sử dụng nhiều nhất trong điều trị lậu là ciprofloxacin và ofloxacin. Giống như sự phát triển đề kháng penicillin do cơ chế nhiễm sắc thể, sự đề kháng những kháng sinh này đã tiến triển nhanh và có nhiều thay đổi trên nhiễm sắc thể trong những năm qua. Sự tiếp cận của quinolon tới đích tác động đã giảm do thay đổi tính thấm tế bào và có thể do
  • 112.
    112 cơ chế bơmđẩy. Những yếu tố này gây nên đề kháng quinolon ở mức thấp. Đích của quinolon là ADN gyrase và topoisomerase IV. Đề kháng ở mức cao trên lâm sàng là do sự thay đổi đích tác động, ban đầu bởi đột biến ở gen gyrA. Nhiều thay thế acid amin đã được mô tả, khi chúng kết hợp lại sẽ gây kháng kháng sinh ở mức cao. Nhiều đột biến cũng xảy ra trên gen parC mã hóa topoisomerase IV, đích thứ hai của quinolon trong vi khuẩn lậu và liên quan tới kháng kháng sinh mức cao. Những thay đổi trong parC dường như làm tăng biểu hiện đột biến tác động tới gyrA. Quinolon mới nhất (thứ hệ 4) có hiệu quả hơn trong việc chống lại các chủng có parC thay đổi, nhưng ít có hiệu quả chống lại các biến chủng có đột biến gyrA. Do đó, theo giả thiết này, những kháng sinh thế hệ 4 có hiệu quả với một số chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin (mà không phải tất cả) [76]. Ciprofloxacin là kháng sinh được cả bác sỹ và bệnh nhân tin dùng đối với các bệnh nhiễm trùng nói chung và bệnh Lậu nói riêng, được sử dụng trong nhiều năm nhưng đến những năm gần đây sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu đã gia tăng nhanh chóng đối nhóm kháng sinh này. Theo thông báo của Lê Thị Phương năm 2001, tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin là 42,7% [14]. Thông báo của Lê Văn Hưng năm 2003 cho biết, tỷ lệ vi khuẩn lậu đã kháng lại ciprofloxacin là 60,87%. Theo thông báo của WHO, tỷ lệ này ở Trung Quốc là 85,2%; Hồng Kông 79,5% và Nhật Bản 40% [155], [156]. Một số nước khác trên thế giới như Anh là 4,89%; Scotland 7,8%; Papua New Guinea (0,9%) [41], [152], [162]. Theo thông báo của Trees ở Thái Lan tỷ lệ kháng ciprofloxacin là 13,8% năm 1998 và 25,4% năm 1999-2000 [141]. Tại Kyrghyzstan tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin là 25%, úc 17,5% [46], [108]. Một số nước chưa phân lập được chủng vi khuẩn lậu nào kháng lại ciprofloxacin như Indonesia, Madagasca, Cuba và Rwanda [73], [92], [93], [143].
  • 113.
    113 Theo thông báocủa WHO (2008), chương trình giám sát kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu tại khu vực Châu á Thái Bình Dương, tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh thuộc nhóm quinolon vẫn ở mức cao: Trung Quốc 99,6%, Hồng Kông 97,8%, Hàn Quốc 89,4%, Nhật Bản 83,4%, Brunei 81,7%, Philippines 69%... Kết quả nghiên cứu của tôi về tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin: năm 2005 là 80,86%, năm 2006 là 82,07%, năm 2007 là 89,14%, cao hơn thông báo của Lê Thị Phương năm 2001 và tương đương với thông báo của một số nước trong khu vực. Vì vậy ciprofloxacin cũng không nên đưa vào danh mục các kháng sinh sử dụng điều trị bệnh Lậu ở Việt Nam. Khi nghiên cứu về sự kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu phân lập được tại Viện Da liễu Quốc Gia, những hiểu biết về cơ chế đề kháng và cơ chế di truyền của sự đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn đã giúp được rất nhiều cho các thầy thuốc lâm sàng trong công tác điều trị. Vi khuẩn lậu kháng kháng sinh chủ yếu là do đột biến trên nhiễm sắc thể đã làm xuất hiện chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh trong chính quần thể vi khuẩn nhạy cảm, đặc biệt là khi liều điều trị thấp, không đạt nồng độ tiêu diệt vi khuẩn thì sự có mặt của kháng sinh trở thành một chất chọn lọc, giữ lại vi khuẩn đề kháng. Sự đề kháng do nhận được gen đề kháng có thể thông qua các hình thức: tiếp hợp-khi hai vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với nhau hoặc là biến nạp khi vi khuẩn bị ly giải và giải phóng ra ADN tự do hoặc do thành phần di truyền di động (transposons). Transposons có thể là nguyên nhân hàng đầu trong việc lan truyền một số gen đề kháng [49], [90]. Hình thức tiếp hợp giữ vài trò quan trọng vì R-plasmid (những plasmid mang đặc tính đề kháng) được tìm thấy ở rất nhiều tác nhân gây bệnh, kể cả vi khuẩn lậu. Một số plasmid, kể cả tự truyền và không tự truyền, có thể tồn tại ở nhiều loài vi khuẩn cũng đóng vai trò quan trọng trong sự bảo tồn và lan
  • 114.
    114 truyền gen đềkháng [21], [119]. Sự đề kháng của vi khuẩn lậu do gen mã hoá nằm trên plasmid gặp ở hầu hết các nhóm kháng sinh khác nhau. Các plasmid này luôn ổn định trong tế bào chủ thông qua sự truyền dọc cùng với sự phát triển của vi khuẩn và nó có thể lan truyền ngang do lan truyền từ chủng này sang chủng khác. Vì vậy, tính kháng thuốc có thể được truyền dọc qua các thế hệ và truyền ngang giữa các chủng, thậm chí giữa các loài gây khó khăn cho công tác điều trị. Do nhận được R-plasmid, có những chủng vi khuẩn trở thành đề kháng nhiều thuốc kháng sinh khác nhau, mặc dù trước đó chưa hề tiếp xúc lần nào với kháng sinh này. Theo WHO (1995) điều trị bằng kháng sinh phải xem xét cả 2 nguồn thông tin: kết qủa thống kê độ nhạy cảm (in vitro) của vi khuẩn ở địa phương và hiệu quả điều trị trên lâm sàng. Ví dụ WHO (1995) khuyến cáo: với những nhiễm trùng ở đường tình dục và hậu môn không có biến chứng nên dùng một liều duy nhất tiêm bắp 250 mg ceftriaxon hoặc 2 g spectinomycin hoặc uống 500 mg ciprofloxin hoặc với viêm kết mạc mắt do lậu (gonococal conjunctivitis) cũng dùng liều duy nhất như trên. Nhưng hiện nay ở Việt Nam, số chủng vi khuẩn lậu đề kháng với ciprofloxacin lớn hơn 80% thì vấn đề dùng ciprofloxacin trong điều trị bệnh Lậu cần được giám sát chặt chẽ như phải tuân thủ theo kết quả nuôi cấy và làm kháng sinh đồ. Còn những nơi không nuôi cấy và làm kháng sinh đồ được thì không nên dùng ciprofloxacin trong điều trị bệnh lậu [12]. 4.3.2. Các yếu tố liên quan tới kháng kháng sinh - Sử dụng và lạm dụng kháng sinh Không ngạc nhiên khi N. gonorrhoeae kháng kháng sinh ở những nơi có dịch vụ y tế không chính quy và việc sử dụng kháng sinh không được kiểm soát tốt. Kháng kháng sinh qua nhiễm sắc thể và qua trung gian plasmid, được
  • 115.
    115 lan rộng từNam sang Đông á [26]. Gần đây, kháng quinolon đã xuất hiện và lan rộng từ khu vực này sang khu vực khác. Sự lan rộng của TRNG ở châu Phi và những nơi khác, cũng là hậu quả rõ rệt của việc sử dụng và lạm dụng tetracyclin rẻ tiền, dễ sử dụng [148]. ở những vùng trên, người dân rất dễ tiếp cận với kháng sinh tại một dịch vụ y tế không chính quy [87]. Trong một nghiên cứu ở Ghana, khoảng 75% số người đến khám tại khoa điều trị các bệnh LTQĐTD đã tự dùng kháng sinh trước khi khám. Kháng sinh được lấy từ nhiều nguồn khác nhau và dùng với liều không thích hợp, thường kết hợp với các kháng sinh khác. 70- 95% vi khuẩn lậu được xét nghiệm tại khoa đều kháng với những kháng sinh được dùng phổ biến. Những báo cáo mang tính giai thoại cho biết gái mại dâm ở châu á đã cung cấp cho khách hàng quinolon đường uống như là một cách "dự phòng", việc tự kê đơn kháng sinh dự phòng trong gái mại dâm ở Philippines là một yếu tố góp phần tăng tính kháng kháng sinh tại quốc gia này. Việc sử dụng nhiều loại kháng sinh tại dịch vụ y tế không chính quy đã dẫn đến sự phát triển nhiều loài vi khuẩn và kí sinh trùng đề kháng với nhiều kháng sinh [23]. Gần 30 năm trước, Willcox [158] cho biết "ở các nước không hỗn loạn về xã hội và chính trị, ít gái mại dâm và phổ biến các dịch vụ khám chữa bệnh và xét nghiệm, nơi mà không thể mua được kháng sinh nếu không có đơn của bác sĩ, thì việc tự điều trị bệnh Lậu mà không được chẩn đoán là rất hiếm; ngược lại nơi mà các kháng sinh hiệu quả, đắt tiền, dễ dàng mua được để tự điều trị bệnh Lậu thì tình trạng kháng kháng sinh rất khó kiểm soát". - Yếu tố môi trường và xã hội: Vi khuẩn lậu có khả năng biến đổi cao, do nhận được ADN của các loài có quan hệ mật thiết và cũng trải qua nhiều thay đổi, dần dần biến đổi về kiểu hình và kiểu gen. Một chủng đề kháng trở thành một chủng gây dịch địa
  • 116.
    116 phương (endemic) khimột số lượng lớn cá thể bị nhiễm chủng này, thường là gắn liền với nhóm lây truyền chủ đạo (core transmitters) như gái mại dâm (CSWs-commercial sex workers). Thoạt đầu, đề kháng quinolon ở mức thấp 2-3%, được du nhập bởi các khách du lịch chỉ gây dịch nhỏ hoặc không thành dịch. Kiểu cách này kéo dài vài năm, với những dịch nhỏ hoặc không lan truyền thứ phát nhưng MIC của các chủng đề kháng đã tăng dần và tỷ lệ phân lập sẽ tăng cao ở CSWs và khách hàng của họ [133]. Tóm lại, để ngăn ngừa sự gia tăng vi khuẩn lậu kháng thuốc, cần phải giám sát vi khuẩn lậu và tính kháng kháng sinh của chúng. Mỗi cơ sở y tế đều phải tham gia, tuỳ theo khả năng của mình. Ví dụ, ở tuyến huyện, quận cần phải chẩn đoán/xét nghiệm tốt bằng phương pháp nhuộm soi trực tiếp bệnh phẩm tìm vi khuẩn lậu. ở tuyến tỉnh cần phải nuôi cấy được vi khuẩn theo chương trình của quốc gia. Tuyến trung ương phải hỗ trợ các tuyến dưới thực hiện quy trình xét nghiệm chuẩn tìm vi khuẩn và xác định độ nhạy cảm với kháng sinh. Đồng thời với việc hỗ trợ và giám sát tuyến dưới tuyến trung ương còn phải cập nhật thường xuyên những quy trình kỹ thuật chuẩn mới của quốc tế. Thực hiện tốt những công việc trên, chúng ta sẽ giám sát được vi khuẩn lậu và tính kháng kháng sinh của chúng. 4.4. đột biến gen liên quan đến kháng ciprofloxacin Muốn xác định được điểm đột biến gen ta phải giải trình tự đoạn gen liên quan đó rồi so sánh với đoạn gen gốc. Trình tự của ADN mã hóa các protein cần thiết để cho các cơ thể sống có thể tồn tại và tái sản sinh. Vì tính chất quan trọng của ADN đối với sự sống, hiểu biết về trình tự ADN là hữu ích với các nghiên cứu sinh học và ứng dụng.
  • 117.
    117 Hai phương phápxác định trình tự chính là phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert (1977) và phương pháp kết thúc chuỗi của Sanger và cộng sự (1977). Dù rất khác nhau về nguyên tắc, hai phương pháp này có một số điểm chung: hình thành một tập hợp nhiều oligonucleotid có chiều dài khác nhau, mỗi oligonucleotid có xác xuất xuất hiện bằng nhau trong phản ứng. Các trình tự này sau đó được phân tách dựa vào kích thước của oligonucleotid bằng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamid có khả năng phân tách hai trình tự chỉ cách nhau 1 nucleotid. Với việc sử dụng kháng sinh tùy tiện như hiện nay ở nước ta cũng như một số nước trên thế giới đã làm gia tăng tính kháng thuốc của vi khuẩn lậu; nguy hại hơn là nhiều gen kháng những kháng sinh khác nhau đã được tìm thấy ở vi khuẩn lậu. Mặc dù bệnh Lậu ở nước ta chiếm một tỷ lệ tương đối cao, nhưng việc nghiên cứu một cách có hệ thống về sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu vẫn còn hạn chế. Khoa Xét nghiệm Viện Da liễu Quốc Gia thống kê hàng năm: mức độ đề kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu phân lập năm 2007 là 89,15% (MIC lên tới 32 µg/ml). Theo thông báo của WHO (2008), tỷ lệ các chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh thuộc nhóm quinolon năm 2006 vẫn ở mức độ cao: Trung Quốc là 99,6%, Hồng Kông 97,8%, Hàn Quốc 89,4%, Nhật Bản 83,4%, Brunei 81,7%, Philippines 69%, Việt Nam 82,1% [157]. Như vậy sự đề kháng ciprofloxacin trên diện rộng ở châu á là đáng báo động. ở Việt Nam đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về đột biến gen kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu. Khi nghiên cứu về sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu trong ba năm tôi nhận thấy mức độ đề kháng với ciprofloxacin không chênh lệch nhiều vì vậy trong tổng số 503 chủng phân lập được. Tôi chọn ngẫu nhiên được 71 chủng vi khuẩn lậu trong đó có 2
  • 118.
    118 chủng nhạy cảmvới ciprofloxacin và 69 chủng kháng ciprofloxacin, tôi tiến hành giải trình tự tại Khoa Xét nghiệm-Viện các bệnh nhiễm trùng Quốc gia, Nhật Bản để xác định điểm đột biến liên quan đến sự đề kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu. Kết quả như sau: đối với chủng nhạy cảm tôi không thấy có điểm đột biến nào. Phân tích 69 chủng đề kháng, tôi nghiên cứu đột biến trong mối liên quan với MIC có nồng độ từ 1-32 µg/ml nhận thấy: các chủng đề kháng đều có những thay đổi trên gen gyrA và parC. Các chủng đề kháng đều có đột biến Ser-91 thành Phe. Trong khi 2 chủng nhạy cảm với ciprofloxacin thì không mang đột biến này. Ngoài ra, trên gen gyrA còn phát hiện đột biến tại Asp-95 ở tất cả các chủng kháng ciprofloxacin với 3 kiểu đột biến là Asp-95 thành Ala (chiếm 63,8%), Asp-95 thành Gly (chiếm 27,5%) và Asp-95 thành Asn (chiếm 8,7%). Những đột biến trên gen gyrA và parC dẫn đến những thay đổi axit amin ở protein GyrA (đặc biệt tại Ser-91 và Asp-95) và protein ParC liên quan mật thiết với tính kháng ciprofloxacin. Nghiên cứu của tôi cũng tương tự U. Chaudhry và cộng sự, nhưng tác giả này nhận thấy đột biến hay gặp nhất trên gen gyrA là Ser-91 thành Phe và Asp-95 thành Asn (chiếm 83%) [38]. Trong nghiên cứu của tôi, phối hợp hay gặp nhất là Ser91 thành Phe và Asp-95 thành Ala (chiếm 63,8%), còn phối hợp Ser-91 thành Phe và Asp-95 thành Asn chỉ chiếm 8,7%. U. Chaudhry còn nhận thấy đột biến Asp-95 thành Gly đi kèm đột biến Ser-91 thành Phe gây nên mức đề kháng cao, nhưng trong nghiên cứu của tôi, mức đề kháng cao nhất được thấy ở sự kết hợp giữa Ser-91 thành Phe và Asp95 thành Asn. Theo nghiên cứu của Masatoshi Tanaka và cộng sự ở Nhật Bản, ở các chủng đề kháng ở mức trung gian có 1 đến 3 đột biến trên 2 gen và ở các chủng đề kháng cao có 3 đến 4 đột biến trên 2 gen [131]. Về số lượng đột biến trên 2 gen gyrA và parC trong nghiên của tôi: ở những chủng đề kháng yếu (MIC ≤ 2 µg/ml) có 2 đột biến trên gen gyrA và có thể có hoặc không có đột biến trên gen parC, những
  • 119.
    119 chủng MIC ≥3 µg/ml đều có 3 đột biến trên 2 gen nói trên; như vậy mức độ kháng ciprofloxacin có liên quan đến số lượng các đột biến điều này cũng giống một số nghiên cứu khác trên thế giới. Về các đột biến trên gen parC, nghiên cứu của tôi cho thấy: sự xuất hiện đột biến và kiểu đột biến có liên quan mật thiết đến mức độ đề kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu; cụ thể là 3 chủng có đột biến Asp-86 thành Asn có mức đề kháng thấp. Những chủng mang đột biến Ser-87 thành Asn có mức đề trung bình. Những chủng có mức đề kháng cao là những chủng mang các đột biến Glu-91 thành Gln và Ser-87 thành Ile; các đột biến trên gen parC luôn đi kèm với đột biến trên gen gyrA, không có đột biến đơn độc trên parC, đặc biệt là thấy đột biến đơn mà không thấy đột biến kép trên parC trong nghiên cứu của tôi cũng giống với nghiên cứu của Tiffany R. Shultz và cộng sự tại Sydney, úc nhưng lại khác với các nghiên cứu khác là ở codon 91 trên gyrA, ngoài đột biến Ser-91 thành Phe, tác giả còn thấy đột biến Ser-91 thành Tyr [125], trong khi đó tôi chỉ thấy một kiểu đột biến Ser-91 thành Phe. Như vậy có thể là những chủng mà tôi đang nghiên cứu có nguồn gốc từ một chủng hoặc chủng phổ biến cho khu vực. Tôi nghiên cứu 69 chủng vi khuẩn lậu kháng kháng sinh ciprofloxacin về đột biến sắp xếp theo nồng độ MIC, số lượng đột biến trên 2 gen gyrA và parC theo mức độ kháng ciprofloxacin, phân tích các đột biến trên gen gyrA và parC và sự phối hợp giữa các đột biến trên 2 gen gyrA và parC. Kết quả nghiên cứu cho thấy: tất cả những chủng kháng kháng sinh ciprofloxacin đều có đột biến trên 2 gen gyrA và parC và số lượng đột biến cũng tăng theo nồng độ MIC. Trong tổng số 71 chủng tôi nghiên cứu, có 2 chủng nhạy cảm với ciprofloxacin có MIC từ 0,002-0,060 µg/ml (tỷ lệ 2,8%) thì không có một sự thay đổi nào trong trình tự ADN. Có 11 chủng đề kháng có MIC từ 1-2 µg/ml (tỷ lệ 15,5%) mang 2 đột biến trên gen gyrA và không mang đột biến trên gen
  • 120.
    120 parC. Còn 6chủng đề kháng có MIC từ 1-2 µg/ml (tỷ lệ 8,5%) mang 3 đột biến trên cả 2 gen gyrA và parC; 52 chủng đề kháng có MIC từ 3-32 µg/ml (tỷ lệ 73,2%) mang 3 đột biến gồm 2 đột biến ở vị trí Ser-91 và Asp-95 của gen gyrA, và 1 đột biến ở vị trí Ser-87 của gen parC. Như vậy, MIC cũng có mối liên quan với số lượng đột biến. Với MIC nhỏ, mang ít đột biến. MIC lớn mang nhiều đột biến hơn cũng giống như những nhận xét của các tác giả trên thế giới nhưng nghiên cứu của tôi lại khác những nhận xét của các tác giả trên thế giới là trên gen gyrA của những chủng kháng đều có đột biến Ser-91 thành Phe. Điều này có thể những chủng vi khuẩn lậu lây truyền hiện nay tại Việt Nam có nguồn gốc từ cùng một chủng và mang tính khu vực. Kết quả nghiên cứu của tôi đã chứng minh rằng sự đề kháng của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin, thuốc mà được xem như liệu pháp hàng đầu vào những năm 1990, đã tăng lên nhanh chóng với mức MIC cao đáng báo động với các đột biến mới ở vi khuẩn lậu. Nếu không có sự giám sát liên tục về sự kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu, với khuynh hướng ngày càng gia tăng những chủng đa đề kháng lan truyền trong cộng đồng, thì sự thất bại trong điều trị là không thể tránh được, dẫn tới sự lây nhiễm lan tràn và gây nhiều biến chứng làm ảnh hưởng đến xã hội, kinh tế, gia đình và giống nòi. Kết luận 1. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu ở bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005-2007. - Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lậu từ năm 2005-2007 là 9,9% (n=5.091).
  • 121.
    121 - Tỷ lệdương tính theo giới: 30,5% nam giới và 24,5% nữ giới. - Tỷ lệ dương tính theo nhóm tuổi: 21-30 là cao nhất 31,9%; 31-40 là 23,2%. - Tỷ lệ dương tính theo nghề nghiệp: lái xe là cao nhất 34,5%; cán bộ là 25,5%; học sinh-sinh viên là 28,6%. - Tỷ lệ dương tính theo nguồn lây: bạn tình là cao nhất 32,1%; mại dâm là 28,9%; vợ chồng là 22,3%. - Tỷ lệ dương tính theo trình độ học vấn: cấp 2 là cao nhất 34,6%; cấp 3 là 33,0%; cao đẳng-đại học là 22,9%. 2. So sánh tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu của 3 kỹ thuật PCR, nhuộm soi và nuôi cấy - Tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu bằng kỹ thuật PCR cho kết quả cao nhất (28,2%), rồi đến kỹ thuật nuôi cấy (13,0%) và kỹ thuật nhuộm soi (10,6%). - Đặt biệt ở nhóm mạn tính thì tỷ lệ phát hiện vi khuẩn lậu bằng kỹ thuật PCR cho kết quả những (14,7%), trong khi đó kỹ thuật nuôi cấy và kỹ thuật nhuộm soi chỉ là 1,9 và 0,7%. 3. kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn lậu phân lập được tại Viện Da liễu Quốc gia từ năm 2005-2006-2007. Ciprofloxacin có xu hướng tăng dần lần lượt là 80,9% - 82,1% - 89,2%. Nhưng penicillin lại có xu hướng giảm xuống là 61,7% - 54,2% - 41,9%. Đặc biệt đã xuất hiện những chủng giảm nhạy cảm với kháng sinh : azithromycin là 5,6% - 1,9% - 0,8%. Cefotaxim là 1,2% - 0,9% - 3,1%. 4. đột biến gen liên quan đến kháng ciprofloxacin - Đột biến gen kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu trên gen gyrA: + 100% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Ser-91 thành Phe. + 63,8% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Asp-95 thành Ala. + 27,5% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Asp-95 thành Gly. + 8,7% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Asp-95 thành Asn.
  • 122.
    122 - Đột biếngen kháng ciprofloxacin của vi khuẩn lậu trên gen parC: + 15,9% số chủng kháng ciprofloxacin không có đột biến. + 4,3% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Asp-86 thành Asn. + 44,9% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Ser-87 thành Asn. + 17,4% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Ser-87 thành Arg. + 10,1% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Ser-87 thành Ile. + 7,2% số chủng kháng ciprofloxacin có đột biến Glu-91 thành Gln. - Mối liên quan giữa MIC và đột biến: Các chủng nhạy cảm (MIC 0,002-0,060 µg/ml) không có đột biến. MIC càng cao càng thấy xuất hiện nhiều đột biến trên gen gyrA và parC. Sự phối hợp đột biến trên gen gyrA và parC làm gia tăng sự đề kháng của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin.
  • 123.
    123 Khuyến cáo 1. Phảituyên truyền giáo dục y tế thường xuyên trên các phương tiện thông tin đại chúng cho các đối tượng thanh thiếu niên, cán bộ và nhân dân về an toàn trong quan hệ tình dục để phòng ngừa các bệnh LTQĐTD nói chung và nhiễm HIV/AIDS nói riêng. 2. Nên áp dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán những trường hợp lậu mạn, lậu ngoài đường tiết niệu sinh dục hoặc những trường hợp đã thực hiện bằng các xét nghiệm thông thường không thấy. 3. Thường xuyên giám sát kháng kháng sinh để thông báo trong nước và quốc tế về tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn lậu từ đó có biện pháp khoanh vùng đối với những chủng đa kháng thuốc. 4. Giám sát những gen kháng thuốc để phục vụ chiến lược sử dụng kháng sinh hợp lý trong từng giai đoạn cụ thể.